CN111154900B

CN111154900B - 铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

Info

Publication number: CN111154900B
Application number: CN202010068197.8A
Authority: CN
Inventors: 吴清平; 王楚芳; 叶青华; 古其会; 张菊梅; 王涓; 吴慧清; 魏磊; 李滢; 丁郁
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111154900A

Abstract

本发明公开了铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法，本发明方法提供了用于鉴别铜绿假单胞菌的3个新特异性分子检测靶标，可根据靶标分子设计相应的引物组，并通过对待检物进行PCR，分析PCR产物的电泳结果即得到是否存在铜绿假单胞菌。与现有技术相比，本发明可用于检测某些生化反应不敏感的菌株，弥补生化鉴定的缺陷，更加具有实用性；同时本发明的检测方法具有操作简单、检测时间短、检测结果特异性好、结果判定简单、成本低等优点，对于铜绿假单胞菌识别具有重要意义。

Description

铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，具体涉及铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法。

背景技术

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）是假单胞菌属的模式菌株，是人类重要条件致病菌，该菌可产生多种致病因子，是烧伤、创伤及术后感染的主要病源菌，还可引起脓毒败血症、脑炎肠炎、肺炎和角膜炎等疾病，临床上铜绿假单胞菌感染非常常见，尤其是导致的肺炎致死率非常高，当机体免疫力低下时可引起多发感染、继发感染并导致并发症，是院内感染的第二大病原菌。此外铜绿假单胞菌产生的胞外酶、内毒素、毒性极强的外毒素等十余种致病因子也具有极大的危害性。因此，对铜绿假单胞菌建立健全快速准确的检测体系很有必要。

大部分监检机构现行的检测方法依旧是采用传统培养法。但传统生化鉴定需要约48h增菌，然后进行24~48 h显色培养基培养和进一步的生化鉴定，检验周期大约需要一周或者更长时间，检验步骤繁琐、耗时长，还有可能结果不准确，比如我国现行国家标准GB8538—2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》中依据产生蓝/绿色菌落判定为是铜绿假单胞菌，而在实际中恶臭假单胞菌在相同条件下也产生蓝/绿色，因此对可疑菌落产生色素进行判定计数可能出现假阳性；该标准中除了将产蓝/绿色、产荧光、红褐色之外的其他菌落判定为非铜绿假单胞菌，但是研究表明有少许铜绿假单胞菌不产色素，这就有可能出现阳性结果不够准确。此外应用生化试验鉴定铜绿假单胞菌，生化反应不稳定，鉴定结果重复性差，也容易造成误判。

随着分子生物学的发展，以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。现行标准SN/T2206.12-2014 《化妆品微生物检验方法第 12部分：绿脓杆菌PCR法》就是把铜绿假单胞菌的外毒素A基因保守片段为目标片段，设计PCR扩增引物，对化妆品中的铜绿假单胞菌进行快速检测。此外，国内外PCR检测方法对铜绿假单胞菌分子检测靶标及引物已有一些的报道，常见的特异性基因有SyrB、toxA、I6S-23S、l6SrDNA、oprl、oprL、fliC、ecfX、oprL、ecfX+gyrB、ETA、opr、exoU、exoS等，在实际应用中发现，随着临床治疗过程中铜绿假单胞菌变异菌株和耐药菌株的不断发现，基于原有的以毒力因子为检测靶点建立的分子检测方法因靶点易缺失、数量有限导致方法不够准确，此外铜绿假单胞菌分子靶标数量有限、特异性靶标少，使得铜绿假单胞菌的精准鉴定面临了巨大的挑战。寻找新型特异性靶标分子用于铜绿假单胞菌快速、精确检测具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供用于鉴别铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）的特异性新分子靶标及相应的PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明要求保护一组用于鉴别铜绿假单胞菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.3所示。

所述序列为通过生物信息学分析筛选得到，为铜绿假单胞菌菌株的特异性基因片段。

进一步地，本发明还要求保护用于鉴别铜绿假单胞菌的引物组，所述引物组为根据如SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.3所示核苷酸序列设计得到。

所述引物组对应的产物为SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.3所述核苷酸序列全部或部分序列。

通过根据相应的核苷酸序列设计对应的用于PCR的引物组，每一个引物组包括一条正向引物和一条反向引物，对应检测一个核苷酸序列。所述引物组扩增产物对应如SEQID NO.1 - SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的全部或部分序列。

作为本发明的优选实施方式，所述引物组的核苷酸序列按5’到3’如SEQIDNO.4~9所示；其中：

SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为对应SEQ ID NO.1序列的引物组；

SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为对应SEQ ID NO.2序列的引物组；

SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9为对应SEQ ID NO.3序列的引物组。

进一步地，本发明还要求保护所述引物组在鉴别铜绿假单胞菌中的应用。

本发明还提供了用所述引物组鉴别铜绿假单胞菌的方法，包括如下步骤：

S1：使用所述的引物组中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察扩增产物是否符合预期。

一般地，一个PCR体系中仅含有一组引物；可通过设置多个PCR体系，同时对单个菌的DNA使用不同引物进行扩增，提高检测效率。本发明的引物对应的产物特异性较好，通过观察扩增产物是否在预期位置即可判断是否存在所述铜绿假单胞菌。

作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、酶、MgCl₂、dNTP、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。

作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液 2.5 μL，25mMMgCl₂ 2μL，2.5mMdNTP 1μL，Tag酶1U，模板DNA100ng，5 μM引物各1 μL，灭菌双蒸水补足体积至25 μL。

作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增程序为：98℃预变性3 min；95℃变性30 s； 58℃退火30 s；72℃延伸60 s；变性、退火、延伸共进行35个循环；最后72℃延伸10 min。

本发明公开了用于识别铜绿假单胞菌的3种特异性分子靶标、相关的引物组，以及对应的PCR检测方法。与现有技术相比，本发明可用于检测某些生化反应不敏感的菌株，弥补生化鉴定的缺陷，更加具有实用性；同时本发明的检测方法具有操作简单、检测时间短、检测结果特异性好、结果判定简单、成本低等优点，对于铜绿假单胞菌识别具有重要意义。

附图说明

图1为实施例3中铜绿假单胞菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1铜绿假单胞菌特异性新分子靶标的挖掘

根据GenBank数据库及本团队自测的铜绿假单胞菌全基因组DNA序列，进行生物信息学分析；筛选得到铜绿假单胞菌菌株特有的3个非必需基因，并进一步分析筛选得到3个铜绿假单胞菌的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~3所示。

实施例2 铜绿假单胞菌的快速检测方法

1)引物设计

根据实施例1中的所述序列SEQIDNO.1~3设计特异性PCR扩增引物组（包括正向引物和反向引物），引物组序列如下表1。

表1特异性PCR检测引物组

2)鉴别铜绿假单胞菌的方法，步骤如下：

S1DNA模板制备：将待测菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2PCR扩增：使用所述的引物组1~3中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增

①PCR检测体系：

10×PCR反应缓冲液	2.5 μL
		25 mM MgCl2	2 μL
2.5 mM dNTP	1 μL
		模板DNA	100 ng
引物（5μM）	1 μL +1 μL
		Tag酶	1U
灭菌双蒸水	补足体积至25 μL

②

PCR扩增程序：

98℃	3 min；
		98℃	30 s；
58℃	30 s；
		72℃	60 s；
72℃	10 min。

S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳；

S4：观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在，说明样品中含有对应的铜绿假单胞菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有对应的铜绿假单胞菌。

实施例3PCR检测方法的特异性评价结果

取79株铜绿假单胞菌，5株其他假单胞菌（恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、产碱假单胞菌、门多萨假单胞菌等），金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌等18株非假单胞菌，按照实施例2的方法进行PCR检测，其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表2所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示（铜绿假单胞菌目标菌为79株，最后一个为空白对照；非目标菌为23株，最后一个为阳性对照；Marker大小为2000bp）。

表2本发明铜绿假单胞菌检测特异性评价试验结果

由图1和表2可得，3种检测方法均只有铜绿假单胞菌显示出特异性扩增条带，其他假单胞菌及非假单胞菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。

实施例4 铜绿假单胞菌疑似菌株的检测

利用实施例2中的3种铜绿假单胞菌PCR检测方法对57株本团队前期污染调查获得的铜绿假单胞菌疑似菌株进行检测，样品处理及疑似菌株的分离参见国标法；结果如表3。

表3本发明及16S rDNA对铜绿假单胞菌疑似菌株的鉴定结果

由表3可得，利用本发明方法，铜绿假单胞菌检出菌株数为57株，经16S rDNA、API20 NE鉴定方法是铜绿假单胞菌，三种方法相符合度为100%。通过本实施例说明本发明的3组不同引物PCR的检测方法可靠性高，可特异识别目标检测物中的铜绿假单胞菌。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省微生物研究所

<120> 铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

<130> 2020

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> pseudomonas aeruginosa

<400> 1

atgagcgttt ctctcctggt aaaagtcact ctggtgggcc tgttcgtcgc cagcgtcctg 60

ttcgtccatt tccgtgggcg cgcgcgcttg cccttcctgc gtcaactggt caaccactcc 120

gcctggttcg ccccctacaa ctcgctgatg tacctgttct ccagcgtccc ctcgaagccc 180

tatctggatc gcagccgttt tccggagctg gacgaactga agaacaattg gcaaaccatc 240

cgcgaagaag ccctcaacct gttcgacgag ggttatatcc gggctgccct gaacaacaac 300

gaagccggct tcggctcgtt cttcaagaaa ggctggaagc gcttctacct gacctggtac 360

gacggcccgc tgccctccgc ccagcagctc tgcccgaaga ccgtagagct ggtgagccgc 420

atccccaacg tcaagggcgc gatgttcacc ctgcttcccg gcggcagcca cctgaatccg 480

caccgcgacc ccttcggcgg ctcgctgcgc tatcacctcg gcctgtccac gccgaattcg 540

gacaactgcc gcatctacgt cgacggccag ccctacgcgt ggcgtgatgg cgaagacgtg 600

atgttcgacg aaaccttcgt ccactgggtg aagaacgaga ccgagcagac ccgggtgatt 660

ctcttctgcg atatcgagcg gccgctccgt tcccgcctgc tgacccggct caatcgctgg 720

atcagcggca ttctcgggcg tgcgaccgca ccgcagaacg tcgaaggcga acgcgtcggc 780

agcatcaacc aggcctactc ggtcgccatt cgcggcggca atgccatcgg cgcccaggtg 840

aagcgcttca aacgcgccta cccgaaggcc taccgaatcc tccgcccggt gctggcggtg 900

atcctgctgg tcatcctcta tcgttggatc ttcggctga 939

<210> 2

<211> 1425

<212> DNA

<213> pseudomonas aeruginosa

<400> 2

atgcataccc taaaacgctg tatggctgcg atggtggcct tgctggcctt gagcctggcg 60

atgacggccc gggcagaact gccggacttc acgcctttgg tcgaacaggc gtcgccggcg 120

gtggtgaata tcagtacgcg gcagaagctg ccggatcgcg ccatggcgcg cgggcagctg 180

tcgatccccg acctcgaagg gctgccgccg atgttccgcg acttcctcga gcgcagcatc 240

ccgcaggttc cgcgtaatcc gcgcggccag cagcgcgagg cgcaatcgct gggttccggc 300

ttcatcatct ccaacgacgg ctacatcctc accaacaatc acgtcgtggc cgatgccgac 360

gagatcctgg tgcgcctgtc cgaccgtagc gagcacaagg ccaagttgat cggcgcggac 420

ccgcgcagcg acgtggcggt gctgaagatc gaggcgaaga acctgccgac cctgaaactg 480

ggcgattcga acaagctgaa agtgggcgaa tgggtcctgg ccatcggttc gccgttcggc 540

ttcgatcact cggtcaccgc cggtatcgtc agtgccaagg ggcgtagcct gccgaacgag 600

agctacgtac ccttcatcca gaccgacgtg gcgatcaacc cgggtaactc cggcggtccg 660

ctgctgaacc tggagggcga agtggtcggc atcaactcgc agatcttcac ccgttccggc 720

ggcttcatgg gcctgtcctt cgccattccg atcgatgtcg cgctgaacgt cgccgaccag 780

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aaggatctcg ccgagtcctt cggcctcgac aagccgtccg gcgcgctggt ggcgcagttg 900

gtggaagacg gtccggcggc caagggcggc ctgcaggtgg gcgatgtgat cctcagcctg 960

aacggccagt cgatcaacga gtccgccgac ctgccgcacc tggtgggcaa catgaagccg 1020

ggcgacaaga tcaaccttga cgtgattcgc aacggccagc gcaagtcctt gagcatggcg 1080

gtaggcagcc ttccggacga cgacgaggaa atcgcctcga tgggcgctcc gggcgccgag 1140

cgcagcagca accgcctggg cgtgaccgtc gccgacctga ccgccgagca gcgcaagagc 1200

ctggatatcc agggcggcgt ggtgatcaag gaagtccagg acggtccggc cgcggtcatc 1260

ggcctgcgtc cgggcgatgt catcacccac ctggacaaca aggcggtgac ctcgaccaag 1320

gtcttcgccg acgtggccaa ggccctgccg aagaaccgtt cggtttcgat gcgggtattg 1380

cgccaggggc gcgccagctt catcaccttc aagctggccg aataa 1425

<210> 3

<211> 444

<212> DNA

<213> pseudomonas aeruginosa

<400> 3

atgaactacc ccgtgaatcc cgacctgatg cccgcgctga tggcggtctt ccagcatgta 60

cggacgcgca tccagagcga gctcgattgc cagcgactcg acctgacccc gcccgacgtc 120

catgtattga agcttatcga cgaacaacgc gggctgaacc tgcaggacct gggacgccag 180

atgtgccgcg acaaggcact gatcacccgg aagatccgcg agctggaggg aagaaacctg 240

gtccgccgcg agcgcaaccc cagcgaccag cgcagcttcc agctcttcct caccgacgag 300

gggctggcca tccaccagca tgcggaagcc atcatgtcac gcgtgcatga cgagttgttt 360

gccccgctca ccccggagga acaagccacc ctggtgcatc tcctcgacca atgcctggcc 420

gcgcaaccgc ttgaggatat ttaa 444

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgagcgttt ctctcctgg 19

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagccgaag atccaac 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcataccc taaaacgctg 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttattcggcc agcttgaa 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaactacc ccgtgaatcc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttaaatatcc tcaagcggtt g 21

Claims

1.核苷酸序列组合作为被检测靶标在非疾病诊断和治疗目的的鉴别铜绿假单胞菌的应用，其特征在于，所述核苷酸序列组合如SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.3所示。

2.用于鉴别铜绿假单胞菌的引物组，其特征在于，所述引物组为根据如权利要求1所述核苷酸序列组合设计得到；所述引物组的序列按5’到3’如SEQIDNO.4~9所示；其中：

SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为对应SEQ ID NO.1序列的引物对；

SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为对应SEQ ID NO.2序列的引物对；

SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9为对应SEQ ID NO.3序列的引物对。

3.如权利要求2所述引物组在非疾病诊断和治疗目的的鉴别铜绿假单胞菌中的应用。

4.用于鉴别铜绿假单胞菌的非疾病诊断和治疗目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：使用如权利要求2所述引物组对待测样品DNA进行PCR扩增；

S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；

S3：观察引物组中各引物对对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明待测样品中含有铜绿假单胞菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则待测样品中不含有铜绿假单胞菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、酶、MgCl₂、dNTP、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5 μL，25mM MgCl₂ 2μL，2.5mM dNTP 1μL，Tag酶1U，模板DNA100ng，5 μM上下游引物各1 μL，灭菌双蒸水补足体积至25 μL。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的PCR扩增程序为：98℃预变性3 min；95℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸60 s；变性、退火、延伸共进行35个循环；最后72℃延伸10 min。