CN115198026A - 唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种特异性新分子靶标及其快速检测方法 - Google Patents

唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种特异性新分子靶标及其快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种特异性新分子靶标及其快速检测方法，属于分子生物学与微生物检验技术领域。本发明的核苷酸序列组合作为被检测靶标在鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种中的应用，所述核苷酸序列组合如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。本发明无需经过生理生化鉴别即可检测到唐菖蒲伯克霍尔德菌，可弥补生化试验不能鉴定高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的缺陷，检测时间短、成本低、操作简单、特异性强；本发明可弥补现有分子检测与分子分型唐菖蒲伯克霍尔德菌特异性差和缺乏高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种方法的缺陷，检测结果更准确，结果判定更简单，实用性更强。

Description

唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种特异性新分子靶标及 其快速检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学与微生物检验技术领域，具体涉及唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种特异性新分子靶标及其快速检测方法
背景技术
唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)是一种广泛存在于空气和土壤中的革兰氏阴性菌，该菌种内菌株多样性复杂，既有产毒的食源性致病株(B.gladioli.pv.cocovenenans)，也有植物致病株(B.gladioli.pv.agaricicola、B.gladioli.pv.alliicola、B.gladioli.pv.gladioli)和环境分离株。近年来，有研究发现唐菖蒲伯克霍尔德菌与医院感染、囊性纤维化、角膜炎、骨髓炎肺部感染、新生儿的败血症和幼儿在医院感染的败血症有关，尤其是在免疫力缺陷/受抑制人群中，因此快速精确鉴定唐菖蒲伯克霍尔德菌显得尤为重要。
唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种(B.gladioli.pv.cocovenenans)，国内又称为椰毒假单胞菌酵米面亚种或椰毒假单胞菌，是唐菖蒲伯克霍尔德菌中能引起严重食物中毒的致病型，也是迄今我国发现的发病率和死亡率最高的食源性致病菌。唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种产生的米酵菌酸是引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢物，主要存在于黑木耳、银耳、发酵玉米面制品和其他的淀粉类制品中。以往由该菌引起的食物中毒多发生在老少边穷地区，近年来由唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种引发的食物中毒事件多次出现在经济发达地区，导致人们对它的关注度持续上升。因此，如何鉴定和防控唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种污染食品是降低米酵菌酸中毒的关键之一。
目前，唐菖蒲伯克霍尔德菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种检测主要利用国标规定的传统培养方法(GB 4789.29-2020)，该方法需要增菌培养，选择性分离纯化，然后对单克隆菌落进行生化鉴定，生化鉴定仅能到唐菖蒲伯克霍尔德菌，后续还需进行毒素培养5d，并利用高效液相色谱或超高效液相色谱- 质谱/质谱法进行毒素检测，才能鉴定到唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种。整个过程检测周期长，易受环境及人为因素的影响且灵敏度不高。在遇到突发疫情时，用传统的检测方法很难满足需求。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。
分子生物学检测方法的关键是其目的基因或序列是否具有待检细菌的特异性。目前用于检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的靶基因或靶序列非常有限，仅16S rRNA、 23S rRNA、16S-23SrRNA，唐菖蒲伯克霍尔德菌的4种致病变种在这些基因的序列上差异很小，就连与其临近的伯克霍尔德菌属的一些种也难区分，因此利用这些基因建立的分子检测方法特异性差，不能鉴定到唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种，即使能鉴定到唐菖蒲伯克霍尔德菌，也容易出现假阴性漏检或假阳性误检的结果。此外，管家基因recA、atpD、gltB、gyrB、lepA、phaC、trpB 也被用来唐菖蒲伯克霍尔德菌的分子分型，这些方法是利用几个管家基因进行PCR扩增、测序、构建进化树等步骤而获得分类鉴定结果，该方法也只能鉴定到唐菖蒲伯克霍尔德菌，不能鉴定到菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种，且操作复杂，成本高，需要较高的专业技能。因此，发掘唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的特异性新分子靶基因或序列，并在此基础上建立相应的快速分子检测方法是非常必要的。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌(B.gladioli)及其椰毒致病变种(B.gladioli.pv.cocovenenans) 的特异性新分子靶标及相应的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：核苷酸序列组合作为被检测靶标在鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种中的应用，所述核苷酸序列组合如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示；所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
通过比较基因组学分析得到唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种基因组的特异性序列片段；所述片段可作为鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的特异性新分子靶序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.3所示。通过检测待检测物是否含有相应的序列即可得到待检测物是否含有属于唐菖蒲伯克霍尔德菌或/和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的菌株。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述序列SEQIDNO.1～2用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌；所述序列SEQ ID NO.3用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种。
本发明还提供于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的引物组，所述引物组为根据所述核苷酸序列组合设计得到。
通过根据相应的核苷酸序列涉及对应的用于PCR与qPCR的引物组，每一个引物组包括一条正向引物和一条反向引物，对应检测一个核苷酸序列。所述引物组扩增产物对应如SEQ ID NO：1～3所示核苷酸序列的全部或部分序列。
作为本发明所述的引物组的优选实施方式，所述引物组的序列按5’到3’如SEQIDNO.4～9所示；其中：
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为对应SEQ ID NO.1序列的引物组；
SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为对应SEQ ID NO.2序列的引物组；
SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9为对应SEQ ID NO.3序列的引物组。
本发明还提供一种鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
本发明还提供一种非疾病诊断和治疗目的的鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的方法，所述方法包括PCR方法和定量qPCR方法。
作为本发明所述鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的方法的优选实施方式，所述PCR方法包括以下步骤：
S1：使用所述引物组对待测样品DNA进行PCR扩增；
S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
S3：观察引物组中各引物对对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明待测样品中含有对应的目标菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则待测样品中不含有对应的目标菌；所述目标菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌或唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种；所述S1中的PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、模板DNA、PCR聚合酶、dNTP、MgCl2、引物组和灭菌双蒸水。
一般地，一个PCR体系中仅含有一组引物；可通过设置多个PCR体系，同时对单个菌或两个菌的DNA使用不同引物进行扩增，提高检测效率。
作为本发明所述鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的方法的优选实施方式，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM MgCl2 2.0 μL，2.5mM dNTP1.0μL，模板DNA 1～2μL，5μM上下游引物各1μL，Taq酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL；所述S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性 5min；95℃变性30s；60～64℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30-35个循环；最后72℃延伸10min。
作为本发明所述鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的方法的优选实施方式，所述qPCR方法包括以下步骤：
S1：使用所述引物组中的其中一种对待测样品DNA在荧光定量扩增仪上进行PCR扩增；
S2：利用相应的荧光定量软件分析扩增结果是否符合预期，如果产生荧光信号，说明待测样品中含有目标菌；如果不产生荧光信号，说明待测样品中不含有对应的目标菌；所述目标菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌或唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种；所述S1中的qPCR扩增体系包括2×TB Green Premix、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。
一般地，一个qPCR体系中仅含有一组引物；可通过设置多个qPCR体系，同时对单个菌或两个菌的DNA使用不同引物进行扩增，提高检测效率。
作为本发明所述鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的方法的优选实施方式，所述qPCR扩增体系为：2×TB Green Premix反应液10μL，模板 DNA100ng，10μmol/L上下游引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL；所述S1中的qPCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性5s，62℃退火 60s，变性、退火共进行45个循环。
本发明的有益效果：本发明公开了用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的特异性核苷酸序列、相关的引物组及对应的PCR与定量qPCR检测方法。与现有技术相比，本发明无需经过生理生化鉴别即可检测到唐菖蒲伯克霍尔德菌，同时可弥补生化试验不能鉴定高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的缺陷，具有检测时间短、成本低、操作简单、特异性强的优点；同时本发明的检测方法可弥补现有分子检测与分子分型唐菖蒲伯克霍尔德菌特异性差和缺乏高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种方法的缺陷，检测结果更准确，结果判定更简单，实用性更强。
附图说明
图1为实施例3中根据保守序列SEQ ID NO.1设计的引物对SEQ ID NO.4-5 建立的PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图2为实施例3中根据保守序列SEQIDNO.2设计的引物对SEQIDNO.6-7 建立的PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图3为实施例4中高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图4为实施例5唐菖蒲伯克霍尔德菌qPCR检测方法灵敏度评价结果。
图5为实施例6中高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种qPCR检测方法灵敏度评价结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种特异性新分子靶标的挖掘
根据GenBank数据库及本团队自测的唐菖蒲伯克霍尔德菌全基因组DNA 序列，进行生物信息学分析；筛选得到唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示。
其中，所述序列SEQ ID NO.1～2用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌；所述序列 SEQ IDNO.3用于鉴别高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种。
实施例2唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的快速检测方法
1)引物设计
根据实施例1中的所述序列SEQIDNO.1～3设计特异性PCR扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表1。
表1特异性PCR检测引物组
Figure BDA0003682436530000061
2)鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的PCR方法，步骤如下：
S1DNA模板制备：将唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种菌株分别在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组 DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；
S2PCR扩增：使用所述引物组1～3中的其中一种对待测样品DNA进行PCR 扩增；
①PCR检测体系：
Figure BDA0003682436530000071
其中：
当模板DNA用于鉴别是否存在唐菖蒲伯克霍尔德菌时，引物为引物组1～2 中任一组引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种时，引物为引物组3的引物；
②PCR扩增程序：
Figure BDA0003682436530000072
S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳，观察各引物组对应产物大小的位置是否存在扩增条带。如果存在，说明样品中含有对应的目标菌；如果没有出现相应的扩增条带，则说明样品中不含有对应的目标菌。
3)鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的定量qPCR方法，步骤如下：
S1DNA模板制备：将唐菖蒲伯克霍尔德菌和高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种菌株分别在BHI液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组 DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；
S2 qPCR扩增：使用所述引物组1～3中的其中一种对待测样品DNA在荧光定量扩增仪上进行PCR扩增；
③qPCR检测体系：
Figure BDA0003682436530000081
其中：
当模板DNA用于鉴别是否存在唐菖蒲伯克霍尔德菌时，引物为引物组1～2 中任一组引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种时，引物为引物组3的引物；
④qPCR扩增程序：
Figure BDA0003682436530000082
S3：利用相应的荧光定量软件分析扩增结果是否符合预期。在空白对照不存在荧光信号前提下，如果产生荧光信号，说明样品中含有目标菌；如果不产生荧光信号，则样品中不含有对应的目标菌。通过判断体系中荧光信号强度定量检测体系中目标菌浓度。
实施例3唐菖蒲伯克霍尔德菌PCR检测方法的特异性评价
取127株唐菖蒲伯克霍尔德菌(其中56株唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种)，24株伯克霍尔德菌属菌株以及59株非伯克霍尔德菌属菌(包括铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌、粪肠球菌、阪崎克罗诺菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物组1～2 中任一组引物。
PCR扩增产物凝胶结果如图1，M为DL2000 DNA标准marker，1～127为唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株(其中56株唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种)， 128～211为非唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株，C为阴性对照。
各菌株及检测结果如下表2所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表2本发明唐菖蒲伯克霍尔德菌检测特异性评价试验结果
Figure BDA0003682436530000091
Figure BDA0003682436530000101
Figure BDA0003682436530000111
Figure BDA0003682436530000121
Figure BDA0003682436530000131
由图1、图2和表2可得，利用所述引物组对所有唐菖蒲伯克霍尔德菌均显示出特异性扩增条带，非唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例4高毒型唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种PCR检测方法的特异性评价
取取127株唐菖蒲伯克霍尔德菌，其中56株唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种，24株伯克霍尔德菌属菌株以及59株非伯克霍尔德菌属菌(包括铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌、粪肠球菌、阪崎克罗诺菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物组3 的引物。设置对照组，对照组的模板为不含基因组的水溶液。
PCR扩增产物凝胶结果如图3所示；其中M为DL2000 DNA标准marker， 1～127为唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株(其中56株唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种)，128～211为非唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株，C为阴性对照。
所用菌株及检测结果如下表3所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表3本发明唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种检测特异性评价试验结果
Figure BDA0003682436530000141
Figure BDA0003682436530000151
Figure BDA0003682436530000161
Figure BDA0003682436530000171
Figure BDA0003682436530000181
由图3和表3可得，所述引物组3的检测结果只有唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种显示出特异性扩增条带，非产毒株唐菖蒲伯克霍尔德菌与非唐菖蒲伯克霍尔德菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例5唐菖蒲伯克霍尔德菌qPCR检测方法的灵敏度评价
将培养至浓度为108CFU/mL的唐菖蒲伯克霍尔德菌标准菌株CICC 10574，使用去离子水按照10倍梯度稀释，得浓度为101，102，103，104，105，106，107， 108CFU/mL的菌株纯培养物，按照实施例2进行DNA模板的提取，即为唐菖蒲伯克霍尔德菌qPCR的检测标准品，按照实施例2进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。
绘制标准曲线：以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的 qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为唐菖蒲伯克霍尔德菌的标准曲线。
湿米粉采用紫外消毒后制备无菌样品，经NA营养琼脂平板培养后结果显示处理后的湿米粉样品中无微生物存在，保证后续实验中湿米粉样品中的微生物均来源于人工污染。
NA计数平板结果显示人工污染样品的唐菖蒲伯克霍尔德菌初始菌液浓度为4.6×108CFU/mL。使用0.85％的无菌生理盐水对人工污染样品的均质液进行 10倍梯度稀释，以制备含唐菖蒲伯克霍尔德菌菌浓度为101CFU/mL～108 CFU/mL的人工污染模拟样品。以各梯度均质液中提取的细菌基因组DNA为模板，以无菌蒸馏水为空白对照，按照实施例2进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。
由图4所示，所述唐菖蒲伯克霍尔德菌菌液浓度在102-108CFU/mL之间与 Ct值存在线性关系，所述引物组检测限为102CFU/ml。在加标样品中所述引物组检测限为103CFU/ml。
实施例6唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种qPCR检测方法的灵敏度评价
将培养至浓度为108CFU/mL的唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种标准菌株ATCC33664，使用去离子水按照10倍梯度稀释，得浓度为101，102，103， 104，105，106，107，108CFU/mL的菌株纯培养物，按照实施例2进行DNA模板的提取，即为唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种qPCR的检测标准品，按照实施例2进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。
绘制标准曲线：以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的 qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的标准曲线。
湿米粉采用紫外消毒后制备无菌样品，经NA营养琼脂平板培养后结果显示处理后的湿米粉样品中无微生物存在，保证后续实验中湿米粉样品中的微生物均来源于人工污染。
NA计数平板结果显示人工污染样品的唐菖蒲伯克霍尔德菌初始菌液浓度为3.9×108CFU/mL。使用0.85％的无菌生理盐水对人工污染样品的均质液进行 10倍梯度稀释，以制备含唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种菌浓度为101 CFU/mL～108CFU/mL的人工污染模拟样品。以各梯度均质液中提取的细菌基因组DNA为模板，以无菌蒸馏水为空白对照，按照实施例2进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。
由图5所示，所述唐菖蒲伯克霍尔德菌菌液浓度在102-108CFU/mL之间与 Ct值存在线性关系，所述引物组检测限为102CFU/ml。在加标样品中所述引物组检测限为103CFU/ml。
实施例7实际样品的检测
在广州当地的超市或农贸市场采集100份食品样品(包括米面淀粉制品、木耳与银耳)用于验证实施例2中的PCR检测方法的实际应用能力。所有样本经过GVC增菌液增菌培养18-24h，采用试剂盒法提取细菌基因组DNA进行唐菖蒲伯克霍尔德菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种检测。同时按照国家标准GB4789.29-2020方法检测同一样品中目标菌作为对照实验：所有样本经过 GVC增菌液增菌培养20-24h；挑取一环增菌液分别划线接种于mPDA与PCFA 平板，选择性分离培养24-48h；挑取单菌落接种于卵黄琼脂平板培养24-48h，挑取单菌落进行革兰氏染色及氧化酶实验，筛选革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性、卵磷脂酶阳性，带有虹彩环的单个菌落，接种与PDA纯化24h；挑取菌苔进行生化鉴定(该步骤鉴定到唐菖蒲伯克霍尔德菌)；将鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的菌株进行毒素培养5d，利用液质联用测定毒素，根据毒素结果鉴定到唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种。检测结果如表4。
表4食品样本唐菖蒲伯克霍尔德菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种检测
Figure BDA0003682436530000211
由表4可得，本发明方法从100份样品中共检出4份唐菖蒲伯克霍尔德菌阳性样品，阳性率为4％，按照食品类型分析，木耳、银耳及淀粉类样品的检出率分别为20％、14.29％、1.33％，面粉类样品则无检出。国标法4份阳性样本共分离出12株唐菖蒲伯克霍尔德菌，经产毒培养与毒素测定，1株(分离自木耳) 的米酵菌酸含量为14.9mg/L，其它菌株的含量均＜0.015mg/L。本发明方法对所述的唐菖蒲伯克霍尔德菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种检测结果与国标法一致，说明本发明方法的可靠性高，且与国标法相比，本发明可一次鉴定到唐菖蒲伯克霍尔德菌或/和唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种，检测时间短、成本低、操作简单、实用性强。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东环凯生物科技有限公司
<120> 唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种特异性新分子靶标及其快速检测方法
<130> 20220530
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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Claims (10)

1.核苷酸序列组合作为被检测靶标在鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种中的应用，其特征在于，所述核苷酸序列组合如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述序列SEQ ID NO.1～2用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌；所述序列SEQ ID NO.3用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种。
3.用于鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的引物组，其特征在于，所述引物组为根据权利要求1所述核苷酸序列组合设计得到。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述引物组的序列按5’到3’如SEQ IDNO.4～9所示；其中：
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为对应SEQ ID NO.1序列的引物组；
SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为对应SEQ ID NO.2序列的引物组；
SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9为对应SEQ ID NO.3序列的引物组。
5.一种鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的引物组。
6.一种非疾病诊断和治疗目的的鉴别唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病变种的方法，其特征在于，所述方法包括PCR方法和定量qPCR方法。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR方法包括以下步骤：
S1：使用如权利要求3或4所述引物组对待测样品DNA进行PCR扩增；
S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
S3：观察引物组中各引物对对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明待测样品中含有对应的目标菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则待测样品中不含有对应的目标菌；所述目标菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌或唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种；
所述S1中的PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、模板DNA、PCR聚合酶、dNTP、MgCl2、引物组和灭菌双蒸水。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM MgCl2 2.0μL，2.5mM dNTP 1.0μL，模板DNA 1～2μL，5μM上下游引物各1μL，Taq酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL；所述S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；60～64℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行30-35个循环；最后72℃延伸10min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述qPCR方法包括以下步骤：
S1：使用如权利要求3或4所述引物组中的其中一种对待测样品DNA在荧光定量扩增仪上进行PCR扩增；
S2：利用相应的荧光定量软件分析扩增结果是否符合预期，如果产生荧光信号，说明待测样品中含有目标菌；如果不产生荧光信号，说明待测样品中不含有对应的目标菌；所述目标菌为唐菖蒲伯克霍尔德菌或唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种；
所述S1中的qPCR扩增体系包括2×TB Green Premix、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述qPCR扩增体系为：2×TB GreenPremix反应液10μL，模板DNA100ng，10μmol/L上下游引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL；所述S1中的qPCR扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性5s，62℃退火60s，变性、退火共进行45个循环。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115725758A (zh) * 2022-10-25 2023-03-03 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 含特异分子靶标的唐菖蒲伯克霍尔德菌及其椰毒致病型标准菌株及其检测和应用
CN116555192A (zh) * 2023-06-08 2023-08-08 合肥工业大学 一种裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体及其应用

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CN116555192A (zh) * 2023-06-08 2023-08-08 合肥工业大学 一种裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体及其应用
CN116555192B (zh) * 2023-06-08 2024-01-30 合肥工业大学 一种裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体及其应用

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