CN116555192B - 一种裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体及其应用，属于噬菌体技术领域。本发明提供的裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体vB_BglM_WTB，保藏编号为CCTCCM2023525，为一种新型噬菌体。本发明噬菌体对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌具有强裂解作用，且具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，可高效消杀食品表面的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，为防治食品加工和环境中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌提供了新策略。

Description

一种裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体及其应用

技术领域

本发明属于噬菌体技术领域，尤其涉及一种裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体及其应用。

背景技术

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌是一类革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，最适生长温度37℃，最适pH 5-6，其在自然界中分布较为广泛，泥土、植物等自然环境和动物都可能是唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的污染来源，食品也存在污染，稻米和洋葱等也可能被该菌污染。尽管许多唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在环境保护方面无毒性，但某些物种可能会在动物和植物中引起疾病。目前研究发现该种菌有4个致病变种，其中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒变种(B.gladiolipv.cocovenenans)产米酵菌酸毒素，该致病变种存在于谷物类发酵制品、变质银耳和木耳等食品中，另外三个变种对植物有致病性。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒变种(B.gladiolipv.cocovenenans)是一种高致死性的食源性致病菌，其潜伏期一般为30分钟到12小时，少数长达1-2天。该菌种中毒有显著的地域特色，广西、云贵山区以及东北相关报道较多，这与当地居民食用银耳、木耳、吊浆粑、酵米面等食品习惯有关。2020年10月黑龙江鸡西市居民因食用被唐菖蒲伯克霍尔德氏菌污染的当地特色食物酸汤子而导致9人中毒并死亡，引起了社会高度关注。该菌产生的米酵菌酸是引起严重的中毒和死亡的主要原因，产该毒素最适合的温度为26℃-28℃。米酵菌酸是一种小分子脂肪酸，耐热性极强，100℃的开水煮沸或用高压锅蒸煮仍不能破坏其毒性，进食后即可引起中毒，对人体的肝、肾、心、脑等重要器官均能产生严重损害。

由于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌导致中毒率约为50％以上，其致死率高达80％以上，但至今没有相关文献报道可用于预防和治疗该感染的药物。因此，该菌及其毒素的控制是食品行业亟待解决的难题。

噬菌体是一种特殊的病毒，它能够专一性侵染细菌、真菌和放线菌等微生物。其特异性强，只针对特定的病原菌，不会破坏正常的微生态平衡。噬菌体侵染宿主菌，裂解宿主菌后会释放出大量子代噬菌体，并在宿主中具有指数的增殖能力，短时间内可达到消杀细菌效果。与物理防治和化学防治相比，噬菌体应用于食品防治细菌具有作用快、效果强且副作用小等优点。基于以上优势，噬菌体针对细菌防控具有广阔的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种专一性裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体菌株，能够有效抑制唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，对非唐菖蒲伯克霍尔德氏菌无裂解作用，同时不含耐药基因和毒力基因，安全可靠。

本发明的另一目的在于提供一种包括唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体的裂解液和制剂及其在防控唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种噬菌体，所述噬菌体为vB_BglM_WTB，保藏编号为CCTCC M2023525。

本发明中，所述噬菌体基因组全长为68541bp，不含毒力基因和耐药基因。

本发明中，所述噬菌体活性稳定的pH值为3-11，耐受温度为25℃-65℃。

本发明还提供了一种裂解液，为上述噬菌体的裂解液。

本发明还提供了一种制剂，所述制剂包括上述噬菌体或上述裂解液。

本发明还提供了一种上述噬菌体或上述裂解液或上述制剂在防控唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中的应用。

优选的，所述应用为防控食品中的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。

优选的，所述食品为木耳、银耳、香菇、金针菇。

优选的，所述噬菌体的感染复数为1:10000-1:100。

优选的，将所述噬菌体或裂解液或制剂与所述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌接触。

优选的，所述接触介质的pH值为3-11，接触时间至少为2h。

本发明的有益效果：

本发明以致病性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ATCC 33664为宿主菌分离得到了唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体vB_BglM_WTB，该噬菌体对木耳等食品中致病性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌具有强裂解效用。本发明中的噬菌体vB_BglM_WTB可以专一性裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，对非唐菖蒲伯克霍尔德氏菌无裂解作用。比较基因组分析与系统发育分析发现，该噬菌体与Burkholderia phage Maja的相似度最高，相似度为25.7％(<50％)，建议组成一个新的属。

本发明分离得到的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体vB_BglM_WTB是从自然界中分离的烈性噬菌体，该噬菌体不含毒力基因和耐药基因，安全可靠，具有良好的温度耐受性和pH稳定性，本发明未对该噬菌体进行任何遗传修饰。

本发明的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体vB_BglM_WTB，可以有效杀灭木耳等食品表面的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体vB_BglM_WTB对木耳等食品中的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌具有强裂解作用，在4℃条件下，6h的杀菌率达到99.94％，处理12h后，杀菌率仍可达到99.80％；在25℃条件下，2h的杀菌率即可达到99.90％，处理12h后，杀菌率仍可达到99.97％，可作为木耳等食品中有效的杀菌剂。本发明的作用形式可以为液体浸泡，尤其适用于木耳、银耳、香菇、金针菇等需要浸泡的食品。

生物保藏信息：

本发明唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体(Burkholderia gladioli phage)vB_BglM_WTB，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为：2023年04月12日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2023525。

附图说明

图1为噬菌体vB_BglM_WTB的电镜图；

图2为噬菌体vB_BglM_WTB对宿主菌ATCC 33664的裂解图；

图3为噬菌体vB_BglM_WTB的基因热图；

图4为对噬菌体vB_BglM_WTB、BcepF1和Maja基因组进行可视化分析图；

图5为噬菌体vB_BglM_WTB的主要衣壳蛋白系统发育树；

图6为噬菌体vB_BglM_WTB的一步生长曲线；

图7为噬菌体vB_BglM_WTB的酸碱稳定性示意图；

图8为噬菌体vB_BglM_WTB的热稳定性示意图；

图9为噬菌体vB_BglM_WTB在低温4℃及室温25℃对木耳中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑制效果图；其中，图9A为噬菌体vB_BglM_WTB在4℃下的抑菌效果图；图9B为噬菌体vB_BglM_WTB在25℃下的抑菌效果图。

具体实施方式

本发明提供了一种裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的噬菌体vB_BglM_WTB，所述噬菌体vB_BglM_WTB的保藏编号为CCTCC M2023525。

在本发明中，噬菌体vB_BglM_WTB分离自合肥市淮河路节流井污水处理厂采集所得污水样品中，于2023年04月12日保藏于中国典型培养物保藏中心。经鉴定，本发明的噬菌体vB_BglM_WTB头部呈正二十面体，头部直径约为69(±2)nm，尾部约108(±2)nm，属于Caudoviricetes，效价可达10⁹pfu/mL以上；本发明噬菌体基因组全长为68541bp，GC含量为60.04％，不含毒力基因和耐药基因，与BurkholderiaphageMaja的相似度最高，相似度为25.7％(<50％)，建议组成一个新的属。

在本发明中，噬菌体vB_BglM_WTB能够专一性裂解唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，且对非唐菖蒲伯克霍尔德氏菌无裂解作用。本发明噬菌体的感染复数优选为1:10000-1:100，最佳感染复数为1:10000，且具有良好的温度耐受性和pH稳定性，在pH值3-11的条件下效价稳定，在温度25-65℃的条件下效价稳定。

本发明还提供了上述噬菌体的裂解液。作为一种可实施的方式，将上述噬菌体于含有宿主菌的培养基中培养，去除宿主菌得到噬菌体裂解液。所述宿主菌的去除方式可选的为过滤除菌或离心除菌。所述宿主菌为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，所述培养基可选的为TSB肉汤培养基。

本发明还提供了一种制剂，所述制剂包括上述噬菌体或上述裂解液。

本发明的制剂中还可包括具有抑制或杀灭唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的其他抗菌活性成分，包括但不限于微生物、中药提取物或组合物、天然化合物、化学合成化合物或其组合物等。

本发明的制剂类型没有特殊限定，可以是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、气体制剂等。根据不同制剂类型，本发明的制剂中还包括制剂可接受的辅料。本发明对辅料种类没有特殊限定，包括但不限于载体、稀释剂、赋形剂、防腐剂、表面活性剂和抗氧化剂中的一种或几种。

本发明还提供了一种上述噬菌体、裂解液或上述制剂在防控唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中的应用。

本发明的防控包括预防和治理；本发明的噬菌体、裂解液或制剂通过与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌接触进行防控，可以通过各种形式使用，包括但不限于浸泡、涂抹、喷洒等施用于物体表面的方式，表面可以是污染部位或预期污染部位。

本发明的噬菌体、裂解液或制剂可以用于食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的防控，本发明对食品类型没有特殊限定，可以是木耳、银耳、香菇、金针菇等可浸泡的真菌食品。

本发明的噬菌体、裂解液或制剂用于防控唐菖蒲伯克霍尔德氏菌时，可以在冷藏或室温条件下使用，优选冷藏温度为3-8℃，高于冷藏温度的室温均可使用，优选的室温为18-38℃，进一步优选为23-28℃。本发明最快处理2h即可达到有效杀菌的效果，杀菌效果可持续至处理后的12h。在本发明中，一个优选的实施例，在4℃条件下，6h的杀菌率达到99.94％，处理12h后，杀菌率仍可达到99.80％；在25℃条件下，2h的杀菌率即可达到99.90％，处理12h后，杀菌率仍可达到99.97％。

本发明的噬菌体、裂解液或制剂在接触防控唐菖蒲伯克霍尔德氏菌时，优选接触介质的pH值为3-11，在上述pH范围内，噬菌体均能保持对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的高活性。由于噬菌体的耐受温度为25℃-65℃，因此本发明的噬菌体、裂解液或制剂在保存或使用时，温度应低于65℃。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体的分离及鉴定

(1)噬菌体分离及鉴定

本发明试验使用的污水样品为2022年从合肥市淮河路节流井污水处理厂中采集所得。

样品处理：将污水样品分装到50mL离心管中，10000rpm离心10min，以去除较大固体颗粒及部分细菌；再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后将其转至干净无菌的容器中，加入适量硫酸镁，充分搅拌混匀，静置15-20min；将硫酸镁混合液真空抽滤，弃上清，收集滤膜后剪碎放入干净无菌的烧杯中，加入适量洗脱液，超声5min后放入离心管中4000g离心2min，取上清，用0.45μm微孔过滤器过滤后转入新的无菌容器，此滤液即为噬菌体的原液；取500μL噬菌体原液、500μLTSB肉汤培养基和50μL的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌对数期菌液混合均匀，37℃振荡培养8h。将培养液4000g离心15-20min，用0.45μm微孔过滤器过滤至无菌的离心管中，即为噬菌体裂解液。然后以ATCC 33664作为宿主菌，采用斑点滴法鉴定是否有噬菌体，若有噬菌斑则有噬菌体，反之则表明未分离出噬菌体，需重新筛选。

噬菌体的纯化：初次分离的噬菌斑大小、形态不一致，需要进一步纯化。在有噬菌斑的双层平板上挑取单个独立、形态均匀、清晰透明的噬菌斑，置于1mL SM溶液中，4℃过夜后4000g离心15-20min，取上清液，用0.45μm微孔过滤器过滤，然后将滤液适当稀释后与ATCC 33664的对数期菌液铺双层平板，重复3-4次，待双层平板上各个噬菌斑大小、形态和清晰度一致时即为纯化的噬菌体。

(2)噬菌体效价的测定

将纯化好的噬菌体液适当稀释，取后3个稀释度的噬菌体稀释液100μL和对数期宿主菌液100μL，使用双层平板法测定噬菌体效价。噬菌体效价(pfu/mL)＝噬菌斑数×稀释倍数÷0.1。

结果表明，该噬菌斑形态、大小和清晰度一致，有典型的裂解性噬菌体特征。该噬菌体的效价可达10⁹pfu/mL以上。

(3)噬菌体的保存

将噬菌体增殖液与终浓度20％的聚乙二醇8000和终浓度0.5M氯化钠溶液按照1:1的比例混合均匀后，4℃过夜浓缩噬菌体；12000g离心浓缩液15-20min，弃上清，用SM溶液溶解沉淀，并与60％甘油1:1混合均匀后于-20℃保存。

实施例2

噬菌体的电镜观察

在铜网有膜的一面滴噬菌体液(效价10⁹pfu/mL)100μL，3-5min后用滤纸吸干液体，然后在铜网上滴一滴2％的磷钨酸(PTA)水溶液进行染色2-3min，用滤纸吸去染色液，电子显微镜观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照。

结果如图1所示，该噬菌体头部呈正二十面体，头部直径约为69(±2)nm，尾部约108(±2)nm，属于Caudoviricetes。

实施例3

噬菌体宿主谱测定

将TSA琼脂平铺到无菌的培养皿上，待其干燥。将100μL培养至对数期的菌液加入到5mL 0.4％的TSB半固体培养基中，混匀，平铺到已干燥的平板上，自然干燥使软琼脂凝固。将2μL噬菌体培养液用点样法加到软琼脂上，自然干燥后37℃培养12h，结果分为点样区清晰空斑(+)和点样区无空斑(-)。

选取实验室保存的13株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，其中ATCC 33664购买自北纳创联生物科技有限公司，剩余12株是2021-2022年在合肥市各个菜市场购买的黑木耳、金针菇、香菇中分离鉴定而来的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌；选取的10株副溶血性弧菌是由广东省微生物研究所从食品中分离而来；剩余的菌株由合肥工业大学保存而来。

表1噬菌体宿主谱

由表1可以看出，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌噬菌体vB_BglM_WTB对全部13株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均具有裂解作用，对非唐菖蒲伯克霍尔德氏菌无裂解作用。

实施例4

噬菌体基因组测序

通过对单株噬菌体的富集培养后，采用苯酚-氯仿-异戊醇法提取噬菌体基因组DNA。提取的DNA沉淀溶于无菌水中，-20℃保存备用。检测DNA溶液浓度和纯度达到标准后使用Illumina进行全基因组测序。

测序结果表明，噬菌体vB_BglM_WTB的基因组全长为68541bp，GC含量为60.04％。

从NCBI数据库中下载与噬菌体vB_BglM_WTB相似度较高的噬菌体全基因组序列，使用VIRIDIC在线工具做成如图3所示的热图，结果显示噬菌体vB_BglM_WTB与其它噬菌体的相似度均较低，其中与噬菌体Maja的相似度最高为25.7％(＜50％)。可见，此噬菌体为新种，建议组成一个新的属。

如图4所示为其蛋白可视化分析，噬菌体vB_BglM_WTB预测有112个ORF，其中39个ORF注释为功能蛋白，73个ORF注释为假定蛋白。所有的功能蛋白可以分为五个模块，包括DNA代谢模块、裂解模块、包装模块、结构模块和其它功能模块。图5为其主要衣壳蛋白系统发育树，该噬菌体单独在一个分支，与其他噬菌体的亲缘关系都较远，其与伯克霍尔德氏菌噬菌体可能有一个共同的祖先。

实施例5

最佳感染复数实验

按照感染复数为100:1、10:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000的比例将噬菌体增殖液和对数期宿主菌液加入TSB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃、200rpm振荡培养8h后，在4℃下12000g离心10-15min，使用双层平板法测定其效价。结果如表2所示。

表2感染复数

结果显示，噬菌体vB_BglM_WTB的最佳感染复数为1:10000。

实施例6

一步生长曲线的测定

将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌ATCC 33664培养至对数前期，使菌浓度为10⁸cfu/mL，按照最佳感染复数1:10000加入宿主菌和噬菌体培养液，37℃水浴5min后，12000rpm/min离心30s，弃上清。用TSB肉汤洗涤沉淀2次。加入30mL 37℃预热的TSB肉汤，37℃振荡培养。在0min时取样，并且前60min每隔10min取样，后续每隔30min取样一次，12000rpm/min离心30s，0.45μm滤头抽滤，测定每个时间点的噬菌体效价。以感染时间为横坐标，噬菌体效价为纵坐标，绘制一步生长曲线。

结果如图6所示，0-60min为噬菌体的潜伏期，60-210min为噬菌体的裂解期，210-480min为噬菌体的平稳期。

实施例7

酸碱稳定性的测定

用稀盐酸和稀氢氧化钠溶液调节TSB肉汤的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的TSB肉汤，将不同pH的TSB肉汤用0.45μm微孔过滤器过滤除菌，再用TSB肉汤将噬菌体稀释至10⁹pfu/mL，将稀释液在37℃下水浴1h，使用双层平板法测定效价。

结果如图7所示，vB_BglM_WTB在pH 3-11的环境下较稳定，效价在10⁸pfu/mL左右，当pH值高于11时，噬菌体效价开始下降，当pH值达到12时，噬菌体几乎不能存活。结果显示其最适生长pH为中性偏碱的环境。

实施例8

热稳定性的测定

将噬菌体原液(10⁹pfu/mL)分装到EP管中，分别在25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的条件下孵育60min，然后用TSB肉汤适当稀释后，使用双层平板法测定效价。

结果如图8所示，随温度的升高，噬菌体的活性越来越低。在65℃条件下作用60min后，效价仍可达到1.01×10⁶pfu/mL，表明噬菌体具有一定的温度耐受性，在80℃条件下作用60min后，噬菌体几乎不能存活。

实施例9

噬菌体在木耳中的杀菌作用

取若干干木耳在无菌水中浸泡10min，称取大小为0.5(±0.05)g的湿木耳，且其形状大小为2cm×2cm，将大小相同的木耳放入90℃的无菌水中水浴30min后，转入超净台中紫外灯照射2h，木耳每一面照射1h。将处理后的木耳浸泡在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌BG007的菌液里10min，菌液浓度为10⁸cfu/mL，风干后将木耳转入噬菌体原液(10⁹pfu/mL)中浸泡10min，室温风干后将木耳转入干净无菌的培养皿中，在0、2、4、6、8、10、12h时取样，木耳剪碎重悬于PBS中，连续稀释后测定菌量。

杀菌效率的计算公式是：(对照组唐菖蒲伯克霍尔德氏菌量-实验组唐菖蒲伯克霍尔德氏菌量)/对照组唐菖蒲伯克霍尔德氏菌量×100％。

结果如图9所示。由图9A可知，在4℃的条件下，经过噬菌体处理的木耳，6h后菌量降至最低，菌量为154cfu/mL，相比对照组降低了2.6×10⁵cfu/mL(5.42log)，此时噬菌体vB_BglM_WTB在木耳中的杀菌率达到99.94％；处理12h后，经过噬菌体处理的木耳的菌量有小幅上升，此时菌量达到1710cfu/mL，但相比于对照组仍能降低8.38×10⁵cfu/mL(5.92log)。由图9B可知，在25℃的条件下，经过噬菌体处理的木耳，2h后菌量降至最低，菌量仅有89cfu/mL，相比对照组降低了8.5×10⁴cfu/mL(4.93log)，杀菌效率99.90％；处理12h后，菌量有小幅上升，达1546cfu/mL，但相比于对照组仍能降低5.51×10⁶cfu/mL(6.71log)。

由图9A、9B图可知，对比两种温度的结果，25℃处理的效果更好，其在处理2h时菌量就能降至最低，且所存活的菌量更少。表明在25℃下消杀宿主菌的效果好且作用时间短，由于菌株存活量少且存活时间短，降低了毒素产生的可能性，增强了木耳等食品的食用安全。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为vB_BglM_WTB，保藏编号为CCTCCM2023525。

2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体基因组全长为68541bp，不含毒力基因和耐药基因。

3.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体活性稳定的pH值为3-11，耐受温度为25℃-65℃。

4.一种裂解液，其特征在于，为权利要求1～3任意一项所述噬菌体的裂解液。

5.一种制剂，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的噬菌体或权利要求4所述的裂解液。

6.根据权利要求1-3任意一项所述噬菌体或权利要求4所述裂解液或权利要求5所述制剂在防控唐菖蒲伯克霍尔德氏菌中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为防控食品中的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述噬菌体的感染复数为1:10000-1:100。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述噬菌体或裂解液或制剂与所述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌接触。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述接触介质的pH值为3-11，接触时间至少为2h。