CN113583972B - 一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体及其应用，其宿主为大肠杆菌，透过电镜观察，该噬菌体多面体立体对称，包裹着核酸，直径约61nm，无尾，保藏编号为CGMCC No.22493。大肠杆菌噬菌体RDP‑EC‑20059对禽类养殖环境中大肠杆菌具有强裂作用，具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，可以高效治疗该病原菌在禽类养殖中所引起的大肠杆菌疾病，以及可以作为消毒剂，为工业化、规模化、程序化生产噬菌体及治疗大肠杆菌引起的禽类养殖细菌病提供了噬菌体来源。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体及其在禽类养殖环境中大肠杆菌感染中的应用。
背景技术
禽大肠杆菌病是由某些致病性或条件致病性大肠杆菌引起，是危害养禽业最为严重的细菌性疾病之一，在疾病预防和治疗过程中最易产生耐药性，导致抗生素用量增加和禽类产品药物残留等一系列问题。该病一年四季均可发生，但以冬春季节和气温多变时期多发，给养禽业带来严重的经济损失。禽大肠杆菌病在临床上主要通过抗生素防治，但由于抗生素的盲目添加或过量使用，导致大肠杆菌的耐药菌株不断增多、耐药谱不断扩大，进而导致治疗效果下降，养殖效益降低，同时对食品安全构成威胁。在细菌耐药性日益突出的当下，全球养殖业已经全面掀起“禁抗”的热潮，2019年7月10日，农业农村部发布公告，自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，加快了我国进入“无抗时代”的脚步。
与传统抗生素相比，噬菌体疗法具有许多优势。噬菌体是能够抵抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的天然抗菌物质。噬菌体由于其无处不在并且在环境含量丰富的性质而可以快速分离，与抗生素相比降低了开发成本，在含有某种病原体的环境中，存在特定噬菌体的可能性很高。不同于抗生素，噬菌体可以在体内增殖，同时这种增殖又受到宿主细菌的存在与否及宿主细菌数量的限制。噬菌体的作用仅限于感染部位，而对周围的细胞(如真核细胞)没有影响。最近的一项研究发现，噬菌体杀死病原性大肠杆菌的速度比β-内酰胺类抗生素快，同时噬菌体治疗释放的内毒素更少。
抗生素与噬菌体共同使用，可显著提高抗生素敏感性，降低抗生素的使用量，并且可以有效降低大肠杆菌的耐药性。大量临床实验证明，噬菌体和抗生素同时使用可以有效治疗禽类大肠杆菌病，且维持时间长，避免大肠杆菌病的反复发生，在实际生产过程中，抗生素与噬菌体同时使用，可以在保证治疗效果的前提下，降低抗生素的使用量，符合国家减抗替抗的要求，提高养殖效益，保证食品健康安全。
本发明在于响应国家全面禁抗的号令，解决细菌耐药性，抗生素滥用的问题，提供一株治疗大肠杆菌的且可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体，扩充了噬菌体储备库为开发治疗大肠杆菌的抗生素替代品奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体，以替代抗生素在防治禽类养殖中的应用，并解决禽类动物发病急而治疗不及时，且因致病菌耐药性而导致用药无效等问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059，透过电镜观察，该噬菌体头部呈多面体立体对称，包裹着核酸，直径约61nm，无尾。该噬菌体于2021年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22493。
优选的，该大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)RDP-EC-20059对养殖环境中大肠杆菌具有强裂解作用。
本发明的第二个目的在于，提供该大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物中的用途。
本发明的第三个目的在于，提供大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的饲料中的用途。
本发明的第四个目的在于，提供一种用于防治大肠杆菌的杀菌组合物，包括有效量的本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)RDP-EC-20059。
本发明的第五个目的在于，提供一种大肠杆菌噬菌体的应用，该目的是通过将大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059用作为由大肠杆菌引起的细菌感染提供潜在的治疗药物或保健品来实现的。
本发明的第六个目的在于提供一种预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的添加剂，其有效成分包括本发明的大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)RDP-EC-20059。
本发明的第七个目的在于提供一种禽类养殖环境的清洁剂或消毒剂，其组成成分包括本发明的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059。
本发明的第八个目的在于提供该大肠杆菌噬菌体的应用，该目的是通过将大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)RDP-EC-20059用作于生物杀菌剂来实现的。
本发明的第九个目的在于提供该大肠杆菌噬菌体的应用，该目的是通过将大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)RDP-EC-20059用于治疗和预防因大肠杆菌引起的细菌感染的医疗器械来实现的。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明发现并分离了一株致病性大肠杆菌BE-20058，并以该致病性大肠杆菌BE-20058为宿主分离得到了大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059，该噬菌体RDP-EC-20059对禽类养殖环境中致病性大肠杆菌BE-20058具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于禽类养殖环境中致病性大肠杆菌BE-20058的防治提供了噬菌体来源；
(2)本发明所提供的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059是从自然界中分离的烈性噬菌体供试噬菌体不含毒力基因或不良基因；本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰；
(3)本发明提供的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059，当水体中加入大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059后，3小时内有明显的裂解效果，具有较强的裂解活性，表现出了良好的应用前景。
(4)本发明提供的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059，在pH为5-9中作用1小时，其效价较高，可在1011pfu/mL之上，适宜生长在中性偏弱酸性的环境中，效价较高，安全有效；
(5)本发明提供的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059在防控禽类动物致病性大肠杆菌弧菌中具有良好的应用前景。
(6)本发明所提供的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分。
(7)本发明大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、LB培养基、氯游离水等。
(6)本发明的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059，可以有效杀灭禽类表面的大肠杆菌并防治禽类在保存过程中大肠杆菌的污染，可作为禽类食品防护的各种产品的有效成分。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由大肠杆菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。
(7)本发明的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059，可用于制备组合物，试剂，或试剂盒；可应用于大肠杆菌的快速检测，其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的大肠杆菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度；
(8)本发明的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059可以单独或混合使用，用作为生物杀菌剂，饲料添加剂，或因大肠杆菌引起的细菌感染的治疗药物、保健品及医疗器械；大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059可应用于治疗或预防由大肠杆菌引起的感染性疾病；
(9)本发明的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059可以应用于工业生产，可由宿主菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，具有极好的推广前景。本领域技术人员可以根据本发明的记载及本领域常识将本发明所述大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059或其组合物制备成应用于医疗，检测，消毒及食品防护等方面的各种产品加以工业应用。产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、直肠、胸膜内部等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。
附图说明
本发明上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变得更加明显：
图1为本发明噬菌体RDP-EC-20059的电镜图；
图2为本发明噬菌体RDP-EC-20059热稳定性示意图。
图3为本发明噬菌体RDP-EC-20059的酸碱稳定性示意图；
图4为本发明噬菌体RDP-EC-20059遗传稳定试验示意图；
图5为本发明噬菌体RDP-EC-20059一步生长曲线示意图；
图6为本发明噬菌体RDP-EC-20059对宿主菌BE-20058的裂解曲线图；
图7为本发明噬菌体RDP-EC-20059和头孢曲松钠的协同作用示意图；
图8为本发明噬菌体RDP-EC-20059和头孢噻胯钠的协同作用示意图；
图9为本发明噬菌体RDP-EC-20059和氨苄青霉素的协同作用示意图；
图10为本发明噬菌体RDP-EC-20059和阿莫西林的协同作用示意图；
图11为本发明噬菌体制成冻干粉后的存储稳定性试验示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明使用从青岛即墨一养殖场的患病白羽肉鸡的肝脏部位分离大肠杆菌BE-20058，并通过实验确定了BE-20058的致病性和耐药性，以BE-20058为宿主，从养殖污水中分离得到一株裂解性大肠杆菌噬菌体，并通过全基因组序列确定了RDP-EC-20059的基因型。
实施例1病原菌及噬菌体的分离及鉴定
(1)致病性大肠杆菌BE-20058的分离及其鉴定
从山东青岛即墨发病养殖鸡场采样，无菌操作取病鸡肝脏，在选择性培养基(麦康凯琼脂培养基)上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定确定为大肠杆菌属，进一步通过血清鉴定确定其血清型为O78，O78具有较强的致病性，并且可以通过食物链等方法传播给人类，具有较强的致病感染力。根据实验室命名规则将其命名为BE-20058，并保存于-80℃冰箱。
(2)噬菌体分离及鉴定
本发明试验用污水样品为2020年从青岛即墨养殖户周边污水中采集，作为噬菌体分离的样品。
污水处理：从山东青岛即墨养殖场采取污水，10000rpm，5min离心，取上清液过0.22μm滤器，收集过滤清液备用。
制备混合菌悬液：取0.2mL菌悬液和0.3mL过滤液加入5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm，5min离心，取上清液过0.22μm滤器，收集过滤清液备用。
噬菌体分离：采用双平板法分离噬菌体，取混合菌悬液过滤液0.2mL和大肠杆菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，37℃培养8-12h后，观察结果。若有噬菌体，平板上会有透亮噬菌斑。挑取单个噬菌斑于1mL生理盐水中，37℃水浴30min后，10000rpm，5min离心，将上清液过0.22μm的滤器，取0.1mL过滤液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养8-12h纯化，照此步骤纯化3-4次，至噬菌斑大小均匀为止，得到一株噬菌体，将其命名为RDP-EC-20059。RDP-EC-20059在双平板形成的噬菌斑直径在1mm-2mm。
(3)噬菌体的保藏
将噬菌体增殖液与60％的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。
实施例2噬菌体的电镜观察
取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态。
由电镜照片图1可看出，噬菌体RDP-EC-20059有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约61nm，无尾。
实施例3噬菌体基因组测序
通过对单株噬菌体的富集培养后，在4℃条件下8000g离心15分钟，加入10％PEG8000和0.5M NaCl静置过夜，再加入等量氯仿混匀，静置分层后5000g下离心10min，去除氯仿层和PEG层后，加入限制性核酸内切酶消化处理，并采用梯度密度氯化铯条件下悬浮噬菌体，后期采用TM缓冲液透析3次，每次30min，送华大基因生物测序公司进行全基因组测序。结果如序列表所示。
实施例4：噬菌体热稳定性的测定
将噬菌体原液分装到50毫升灭菌离心管中，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃和90℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍梯度稀释后，铺双平板测定其效价。
由图2可知，随温度的升高和时间的延长，噬菌体效价逐渐下降，在55℃条件下处理30min和60min，噬菌体效价仅下降1个数量级，说明该噬菌体具有较好的耐高温性能。这在噬菌体的生产、运输和存储中有非常重要的参考价值。
实施例5噬菌体酸碱稳定性的测定
用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成PH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1*1012pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板测定效价。37℃倒置培养4-6h后统计结果。
由图3可知，在pH5-9的条件下，37℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，效价仍保持在1011pfu/mL以上，说明RDP-EC-20059有较好的耐酸碱性能。这在噬菌体治疗疾病过程中有很好的应用价值，噬菌体可以对酸碱有较好的耐受性，并且噬菌体的效价较高，这可以保证有足够数量的噬菌体通过消化道。
实施例6稳定性遗传实验
将RDP-EC-20059连续传代30次，每代培养基中加入等量的RDP-EC-20059和BE-20058，每代培养时间6h，然后铺双平板，测定其效价。
由图4可知，将RDP-EC-20059连续传30代后，测定其效价，其效价稳定在1011pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，在连续传代过程中，均保持较高的活性，这说明RDP-EC-20059适合工业化生产。
实施例7噬菌体的一步生长曲线试验
取对数生长期的大肠杆菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种大肠杆菌BE-20058和噬菌体RDP-EC-20059，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃200r/min的摇床中振荡培养并计时。定时取样测定其效价，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。
由图5可知，噬菌体感染宿主菌后的30min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约30min，感染后30-90min内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为60min。通过计算，噬菌体裂解量约为173PFU/感染细胞，表明噬菌体RDP-EC-20059具有潜伏期短、裂解力强和高复制的特点。
实施例8噬菌体对宿主裂解曲线
将培养6h的宿主菌悬液以2:100的比例接种到100mL LB培养基中，37℃200rpm振荡培养2h(OD约0.15，约5.0*108cfu/mL)将菌悬液分装在4个灭菌的锥形瓶中，以最佳感染复数，向其中3个加入噬菌体增殖液0.2mL(约3.6*1011pfu/mL，经0.22μm膜过滤)，同时以不加噬菌体的作为对照，取其平均值。
由图6可知，大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059加入到宿主菌BE-20058菌悬液中，因为噬菌体对宿主有较强的裂解作用，接入噬菌体后OD600吸光度逐渐下降，随着时间延长，未被裂解是宿主菌开始开始繁殖，OD600吸光度逐渐增大，直至6小时后，两者趋于一致。在3小时内，噬菌体可以有效抑制宿主菌的生长，这在动物疾病治疗中有非常重要的应用价值。
实施例9噬菌体与抗生素的协同作用试验
接种3％的宿主BE-20058至LB肉汤培养基中，按照抗生素的最低抑菌浓度加入相应的抗生素，然后再添加1*1011pfu/mL的噬菌体RDP-EC-20059，定时测定其OD600吸光度的变化。
由图7-图10可知，随着时间的延长，OD600值逐渐增大，只加入宿主BE-20058的一组，其OD600值迅速升高，并且随着时间的延长逐渐升高，加入噬菌体RDP-EC-20059和宿主BE-20058的一组，其OD600值也是迅速升高，但是始终低于只加入宿主的一组。添加抗生素和宿主BE-20058的一组，其OD值在120小时内缓慢增加，并且吸光度始终低于1.00，添加宿主BE-20058、噬菌体RDP-EC-20059和抗生素的一组，其OD600值始终最低，说明该噬菌体与抗生素组合可以有效抑制宿主的生长，混合使用优于单独使用的效果。该噬菌体和可以提高相应抗生素的敏感性，与抗生素混合使用可降低大肠杆菌的耐药性，在生产过程中可以降低抗生素的使用量。
实施例10RTD实验
在平板上划分区域，将一滴宿主菌(约100μL)滴加到区域中心处，晾干，将不同稀释度的一滴噬菌体液滴加到宿主菌的斑点上，晾干，37℃培养16-24h。根据宿主菌生长状况，凡是不能连片生长的，称为CL浓度(CL浓度是可以完全性裂解环境中宿主菌的浓度，可以用于指导生产实践的稀释方案)，结果发现，RDP-EC-20059在稀释106倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。
实施例11：裂解率实验
无菌条件下，分别取1mL样品和1mL宿主菌菌液(1×105CFU/mL)，37℃孵育15分钟，混匀后用生理盐水稀释至10-1-10-3个梯度，每个梯度取100μL涂布于LB琼脂平板上，置于37℃，培养24小时，每个梯度重复两次。同时取1mL生理盐水和1mL宿主菌菌液(1×105CFU/mL)作为空白对照，重复以上步骤。选取30-300个菌落数的平板进行计数。该试验重复3次，取其平均值。噬菌体裂解率＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％。
结果发现，RDP-EC-20059的裂解率达99％，对宿主有较好的裂解效果，适合在养殖过程中使用。
实施例12：最佳感染复数的测定
按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。结果如表1所示。
表1最佳感染复数试验
由表1可知，当感染复数为1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-EC-20059的最佳感染复数为1。
实施例13噬菌体工业化生产工艺
1、种子制备
(1)宿主种子制备：无菌环境下挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，将培养后的宿主菌以5％的接种量接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，再以5％的接种量接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，150rpm培养4-6h，培养好的宿主菌种子置于4℃冰箱备用。
(2)噬菌体种子制备:将保存的噬菌体种子适当稀释后，取200μL与200μL宿主菌置于上层培养基中，倒双层平板，37℃，培8-12h，选取噬菌斑呈现云雾状的平板，用5mL的LB液体培养基洗下上层培养基，然后12000rpm，10min离心，过0.22μm的滤膜，收集清液。
清液与宿主分别以2％的比例接种于5mL的LB培养基，37℃，200rpm培养4-8h(培养至增殖液变澄清或者出现絮状物为止)，将培养好的噬菌体和宿主各以2％的接种量同时接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，再将培养好的噬菌体和宿主各以2％的接种量同时接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，培养好的噬菌体种子置于4℃冰箱备用。
2、噬菌体增殖：
将制备好的宿主菌以3％的比例接种于种子发酵罐中，培养3-4h后，OD600值在0.7-0.9，将宿主菌通过移种管道接种于发酵罐，接种量为5％，宿主在种子罐中培养3-4h，OD在0.7-0.9时以最佳感染复数的接种量接入噬菌体，增殖2h后，以流加的方式加入增殖液体积10％的宿主菌，流加的宿主的种龄3-6h，流加时间控制是1-2h，然后再培养6-8h，待溶氧反升，pH趋于稳定，结束增值。
注：发酵罐参数：种子罐200-300rpm，37℃，通气1:0.6-0.8vvm。发酵罐：120-150pm，37℃，通气1：0.6-0.8vvm。
培养基成分：酵母浸粉3％，甘油0.3％，氯化钠0.8％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二钾0.2％，氯化镁20ppm，氯化镁20ppm。
3、噬菌体后处理工艺
(1)离心：将增殖完成的噬菌体，用碟式离心机离心，6000rpm，流速≤200L/H，去除未裂解的宿主和细菌碎片等，然后再用管式离心机离心，17000rpm，流速≤50L/H，进一步去除宿主菌菌和细胞碎片。
(2)采用600nm的陶瓷膜进一步过滤除菌。
(3)过滤除菌：浓缩后的噬菌体采用三级过滤(聚丙烯0.45μm，聚醚砜1μm，聚醚砜0.22μm)除菌。
(4)浓缩：采用200nm中空纤维膜进行浓缩，浓缩至原来体积1/2。
4、真空冷冻干燥
4.1噬菌体冻干
4.1.1样品前处理：按照10％脱脂奶粉，5％吡咯烷酮，5％海藻糖，0.5％维生素C添加至浓缩后的噬菌体液中，搅拌均匀。
4.1.2将搅拌均匀的噬菌体，平均放置在冻干机料盘中，开启冻干机，冻干程序如下表。
4.1.3冻干粉存储稳定性：将制备好的冻干粉和喷雾干燥粉分装，然后置4℃环境下存储，定期对噬菌体的效价进行测量，结果图11所示。
由图11可知，采用常规喷雾干燥制备的样品，效价由初始的10.71pfu/g降低到5.63pfu/g，在24个月内效价降低了6个数量级。冻干粉在存储24个月后，效价由最初的12.61pfu/g，降低到11.26pfu/g，存储稳定性好，说明该噬菌体可以采用该工艺生产，冻干曲线和冻干保护剂可以有效保证冻干粉在存储期间的活性。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
序列表
<110> 瑞科盟（青岛）生物工程有限公司
<120> 一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39427
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tgagaagaag atagctctgg ttctagatgg tgactatctg gtctactctt ctatggctgc 60
tgccgaggac gagacagact ggggcgatga catctggacc cttatctgcg accatgagaa 120
ggctcgtcgt atccttgaga acaccatcgc tgaaatcgtt aagaagcgca aggcgtggaa 180
agacgctaag attgtgatgt gctttactga cgataacaac tggcgtaagg acgttctgcc 240
tacctataag gccaaccgta aaggttctcg caagcctgta ggttacaaga agttcgtagc 300
agaagtgatg gctgacccac ggttcaacag cttccttcgt cctacgcttg agggtgatga 360
ctgtatgggt atcatcggga ccagacctca gattgtcgga tgtgaccatg cggtgctggt 420
gtcctgtgat aaggacttca agaccatccc gaactgcgag ttcttctggt taaccactgg 480
tgaaatcctg agtcatacga ctgccgaggc agactactgg cacatggagc agaccatcaa 540
gggtgacact acagatggct acggtggcat tccggggatg ggtgaggaca ccactcgtgc 600
gttccttgac gagccgtact acttcgtgca ggagagccgt gagcttaaga ctggcaagaa 660
caaaggccag attaagactg agtggaagaa gtatccgaag cgtgaagaca tgacgctgtg 720
ggactgcatg gtgactctgg ctgagaaagc tgggatgacc gaagaagaac ttctggtcca 780
agctcaggtc gctcgtattt gtcgagcctc cgactacgac cctaagtcca aggaggtcat 840
cctgtggaca ccatccatgt aatttactgg gccggacttc tggcccttta ctgcatgtac 900
aagtggttcg ggtcgaacaa ccgtcctaaa cactgagtct aaccgatagt catatcctat 960
caatccaaca gtcatccata ggtgaaacac taaactatca ctatagggac tttaggacct 1020
aagatatgac tataagatag actttagtct taacttaaag aggagattca agatggcgat 1080
taatgctatt gaaaacgttg ttaagcagtt acaggaagaa agacttgatg tcccgaacat 1140
ctcccagtct gccatccagt tcctgcacgt attgttcaac gcaagctacg ctgagaagat 1200
gggagctatc agtctcctca agcagcaggg ctacagcgat gcgttcattg ccgggtttat 1260
caagggtctc cagtattgtt ctgacactct cgactctgcg attgctatgc gtcgtgagct 1320
gaaagatacc gttcagttcg attaactgta ggagggacta tgtgtttcag tccaaagatt 1380
agcactccga agccttcggt ccaagcacct gaaccagcac ctctgagtga ggaagttgcg 1440
tcagttgaca tcggttccga atcggacgtg gacaccaacg agaccaaagg tatcaaagac 1500
ctgaaggtca agaaggagtc tgcacctaaa gataaatcgt cagtgagtcg tgctatgcga 1560
gcctctggcg taaacatggg gtaagacaat gctaccatat ctcaactcac gcgaaggtcg 1620
ccacatgtgc gcttgtcgcc tctgggaaga cgggcagtct aacttcaagt cattcgagga 1680
cttcaaggct catacttacc gtatggctga cgagtttgat ggtgaagagt acacaatcta 1740
cgatgtctca ggtcagccag tagcgtatct ctacatgctg gctaccgcat cctggcaccg 1800
acctactccc ggtcttgacc tttcaatcgt cgctattcgt cgtgactcgc agtcctcccg 1860
caaggttctt gagactgtca ggcacatcat agacgaagag tgtaagcgtt ggggtcttgg 1920
ctggtattct cgtgtcaagc atgtttctgg gtcggtagac atcgtaacaa ccaagtgcgt 1980
tagcacgaac aaggagatta accgtgggta aatcaatcag taaggctttc aagaaagtag 2040
taaaaggtgc gttagggaca gttggtctcg gtaaggacga ggcaccaaag gtagttgagg 2100
ctccgacccc agcagcagca cccgtggaag taccgaacga caaagtggaa gatgtggata 2160
ctgaagcaac cgcatctgac gagaagaaag tgaagcgttc cggtaagcgt agccttcagg 2220
tctctcgtac ctctggtggc ggtatttcta tttaaggagg tgacgaatgg ctgaacgtga 2280
agggttcgct gctgaaggcg cgaagtcagt ttatgataga ttgaagaacg gacgacagcc 2340
ttacgagacc cgcgcacaga actgcgctgc cgtgaccatc ccatcgctat ttcctaagga 2400
gtcagacaac tcgtctacgg aatacacaac tccgtggcaa gctgtaggtg ctcgctgttt 2460
gaacaacttg gctgcaaagc tgatgttggc gttattccct cagtcaccgt ggatgcgact 2520
gacagtctcc gaatatgagg ccaagacctt gagtcaggac tcagaggctg ctgctcgtgt 2580
tgacgaaggg ctggctatgg tcgagcgtgt gttgatggcc tacatggaga ccaacagttt 2640
ccgtgtccca ttgttcgaag ctctgaagca gcttatcgtc tccggtaact gtctgctcta 2700
tattccagag cctgaacagg gaacctacag tcctatgcga atgtaccgat tggtgtcata 2760
cgttgttcaa cgtgatgctt tcggtaacat cttgcagatt gtgactctcg acaaggtagc 2820
gtttagtgct ctaccggaag acgtgaagtc tcaactcaac gcagacgact atgagcctga 2880
caccgagcta gaagtgtata cgcacatcta ccgtcaggac gacgagtatc tgcgctacga 2940
ggaagttgaa ggcattgagg tagcagggac cgagggttct tacccactga ctgcatgtcc 3000
gtacatcccg gtacgaatgg ttcgactgga tggtgaagac tatggtcgtt cttactgcga 3060
ggagtatctg ggagacctga actcgctgga gacgattaca gaagctatca caaaaatggc 3120
taaggtagcc tccaaggtgg tgggcctcgt taacccgaac ggtatcacgc agcctcgtcg 3180
tctgaacaag gcggctacag gtgagttcgt ggctggtcgc gttgaggata tcaacttcct 3240
gcaactgacg aaaggtcagg actttacgat tgctaagtcg gtggctgacg ctatcgagca 3300
acgtttaggc tgggccttcc ttcttaatag tgctgttcag cgtaatgccg agcgagtcac 3360
tgctgaagag attcgttatg ttgctggcga actggaggcg accttaggtg gtgtgtactc 3420
agtacagtca caagagcttc agttacctat cgtccgtgta ctgatgaacc agcttcagtc 3480
tgctggaatg attcctgacc ttccgaaaga agcggtagag cctacggtct ccactggtct 3540
ggaagctctg ggccgtggtc aggacttgga gaagctgact caggcggtta acatgatgac 3600
cgggctacag cctctgcaac aggaccctga catcaacttg ccgaccctga agctgcgact 3660
gctgaatgcc ttaggcattg acaccgctgg tctgcttctg actcaggacg agaagatgca 3720
acgtattgct gaacaatccg ctcaaggagc tgtggtcaac ggtgcgtctg ctgctggcgc 3780
taacatgggt gctgctgtag gtcagggagc tggtgaggac atggctcaag cctaaactat 3840
cactatagga acaccgaaag taagagcgac taagccgacc atatggtagc cgttagtccc 3900
acactgcaag taggtgttta cctattaacg acttaaagga gaatgactca atgtctcaat 3960
cagtttatgc cgagttcggc gttagctcta atgcaatcac tggttccgtt gaggacctga 4020
acgaacacca gaagtctatg cttgaacagg acgtagctgt tcgtgatggc gacgacgcta 4080
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ctctggatga aaacgaagct gcattcgacg acatggtgtc ttctgctgta gaagctggca 4320
aggtcactgc tgatgaaatt accgctatca aggctgaata cgccaaggac ggtaagctgt 4380
ctgacgcatc ctacgctaag ttgcaggaag caggttacac caagcgtttc gtagattcgt 4440
ttgtacgtgg tcaggaagct ctggctgaac agtatgctgc tggtgttgtt cgctacgctg 4500
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ctgacatgat taaggctatg agtgacccgc gatacctgcg tgacgctaag tacacgatgg 4800
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caagagaaag actcaaggtt tccctattac ttcagtccat acggattggg catacagtaa 4920
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agaaaattgg tacagaccaa ggtaaaggta aatccagttc cgacgctctg gcgttgttcc 5040
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cctctggtgt gtatctggct ccgggtgagc gactgtcaga taagcgtaaa ggtatcaaac 5220
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cttccggtca gaaacacgca ttcccggcga ctgctactgg cgatgttaaa gttgctatgg 5820
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tgctcaaagg agaatacatg gtctacgcac taatgttctc aggactattt gttagtttct 6240
gggcgtatct cattctaacg ggaccttgta gtccttacga taaataggag actcaatgtc 6300
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cacaagacac ctcccggtaa taacgctgag actgacccac ctaaagtcga tgctcagtac 7680
ataggtgacg cgctgcgtac actactggtc gctgcttatc cggggtggac gttcaacctt 7740
gggtctggct accttgagat tgttgcccct agtgggacca gtattaactc agtggagacg 7800
acagacggtt acgccaacca gttaatcaca gcggtgattg acacagtgca gactatcagt 7860
aagctacctc tggcagcacc taatggctac atcattcgta tccaaggtga gaccaacagt 7920
agcgctgacg agtattacgt gatgtacgac tcttcgcgta agacttggcg tgagactgtg 7980
gagccgggcg tgactacagg tttcgacgcg actaccatgc ctcatgctct ggtccgtaag 8040
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gacaccaacc cgatgccttc cttcgtggac tcaaccatca atgatgtgtt cttctaccgt 8160
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gcgttcttcc ctaagagcgt ggcaaccctg agtgatgatg accctattga cgtagctgtg 8280
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tggtctgacg aggtgcaatt cgtgatgacc agctctggtg tcctgacttc caagtctatc 8400
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accactggtg ctaaggaccg tgtgtacatc tacaagttcc tgttcaaaga tggcgtacag 8700
ttgcaagcct catggtccca ctgggagttt gagactagtg acatgattat ggctactgcc 8760
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ctggagttca taaagcaggc tactgacatc gctggagagc cttaccgatt ccacatggat 8880
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ccgggaggta caatcatcta tctgggcact cctcagaacg agatgaccct gtatcgtgag 21360
ttggaaggtc gtggctacac cactactatc tggcctgctc gttatccacg cgacaggaag 21420
gactggcagt cttacggcga ccgtctggct cctatgcttc aggcagaact ggaagaggac 21480
cctgagtcct tctactggcg tccgaccgat gaggtacgat tcgatgatac ggacctgaag 21540
gaacgtgagc tgtcctatgg taaagctggc ttcgctctac agttcatgct taacccgaac 21600
ctgagtgatg ctgagaagta ccctctgaag ctccgtgacc ttatcgtagc cgacttggac 21660
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ttcagttcgt acacccagaa gattctggtc attgacccta gtggtcgtgg taaggatgaa 21840
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attaccactt gaattaatag gaattaacta tgagcactgc aatcatctgg actgcatctg 25080
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caatgag 39427
Claims (6)
1.一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，该噬菌体为大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）RDP-EC-20059，透过电镜观察，该大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）RDP-EC-20059头部呈多面体立体对称，包裹着核酸，直径约61nm，无尾，保藏编号为CGMCC No.22493。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20059在制备治疗大肠杆菌引起的疾病的药物中的用途。
3.一种用于防治大肠杆菌的杀菌组合物，其特征在于，包括有效量的如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）RDP-EC-20059。
4.一种如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体的应用，其特征在于，大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）RDP-EC-20059用作由大肠杆菌引起的细菌感染的治疗药物。
5.一种禽类养殖环境的清洁剂或消毒剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）RDP-EC-20059。
6.一种如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体的应用，其特征在于，大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）RDP-EC-20059用作生物杀菌剂。
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