CN115161288B - 一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于奇异变形杆菌噬菌体技术领域，尤其涉及一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒及其应用。本发明主要公开了一种奇异变形杆菌噬菌体为PMP2(Proteus mirabilis phage PMP2)，保藏编号为CCTCC M 2021671。本发明中的奇异变形杆菌噬菌体是从自然界中分离的烈性噬菌体，经毒理实验证明其安全、无任何副作用。实验发现该噬菌体对酸碱性耐受范围较广，尤其对酸性条件耐受性较高，因此该噬菌体可通过口服经过胃酸，进而到达肠道，对肠道中的奇异变形杆菌起到强烈裂解作用；同时该噬菌体对高温具有良好的耐受性，可以适应工业生产中多种制剂的制备条件。该噬菌体为开发防治奇异变形杆菌污染的生物杀菌剂提供了较好的思路。
Description
技术领域
本发明属于噬菌体技术领域，具体涉及一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
变形杆菌是广泛分布于自然界的革兰阴性腐生性细菌，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。变形杆菌属包括奇异变形杆菌(Proteous mirabilis)、普通变形杆菌(Proteous vulgaris)、潘氏变形杆菌(Proteous penneri)和产黏变形杆菌(Proteousmyxofaciens)。国内流行病学资料显示，食源性微生物病原菌中，主要以沙门氏菌、副溶血性弧菌和变形杆菌为代表。近年来，变形杆菌在细菌性食物中毒中占有较大比重，尤其是奇异变形杆菌引起的食物中毒占变形杆菌食物中毒的70％。
奇异变形杆菌与感染相关的毒力因子主要表现在菌毛与荚膜多糖带来的附力与侵袭力上，另外该菌产生的各种蛋白水解酶、各种细胞毒性溶血素使感染变得更加复杂。奇异变形杆菌属肠道正常菌群，为条件性致病菌。在动物正常情况下，该菌无致病作用，动物不会发病；当肠道功能受到扰乱，或机体抵抗力下降时方可致病。故奇异变形杆病多在应激情况下发生。奇异变形杆菌广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中，多体现为继发感染，如慢性中耳炎、创伤感染等，也可引起膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等。
奇异变形杆菌主要污染动物性食品，特别是肉类，因此应加大对动物性食品中奇异变形杆菌的监测力度，保障消费者的食用安全。
随着家禽养殖业的不断发展,集约化程度不断提高，养殖环境污染加剧。在养殖过程中残饵、粪便、使用的抗生素等是养殖环境污染的主要来源，其中抗生素的滥用造成奇异变形杆菌的耐药性不断增强，耐药谱不断扩大，造成家禽体内残留的抗生素不断增加，进而威胁食品安全及人类健康。与传统的抗生素疗法相比，新兴的噬菌体疗法利用噬菌体自身的生物学特性——在敏感宿主菌胞内增殖，最后裂解宿主菌释放出子代噬菌体，从而达到破坏宿主菌的作用。在杀菌效果上，烈性噬菌体有广泛应用，尤其是利用其治疗泛耐药的“超级细菌”引起的感染，取得了良好的效果。具有绿色、环保、无二次污染等优点。
现有国内发表文献《奇异变形杆菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性分析》(孙盟盟,宋天一,胡士华,等.奇异变形杆菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性分析[J].中国生物制品学杂志,2012,25(03):336-339)，公开了4株奇异变形杆菌噬菌体，其编号分别为PrM-01、PrM-02、PrM-03和PrM-04。将其中标号为PrM-04奇异变形杆菌噬菌体进行进一步测定，发现其基因组大小约26000bp，具有多个酶切位点。
上述中的现有技术方案存在以下缺陷：上述奇异变形杆菌噬菌体对条件环境的耐受性未知，无法判断其应用于实际生产中的效果。为使奇异变形杆菌噬菌体可直接通过口服经过胃酸应用于家禽体内，抑或是将奇异变形杆菌噬菌体在高温环境下制备为饲料添加剂，因此亟需提供一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明的上述发明目的一是通过以下技术方案得以实现的：一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体，其特征在于：所述奇异变形杆菌噬菌体为(Proteus mirabilisphage)PMP2，保藏编号为CCTCC NO:M 2021671；述奇异变形杆菌噬菌体(Proteusmirabilis phage)PMP2，对酸性具有良好的耐受性，置于pH＝1.0～5.0下噬菌体效价变化较小。奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
通过采用上述技术方案，提供了一种新型的耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，该噬菌体同时对酸性及高温环境具有极强的耐受能力，可以高效杀灭奇异变形杆菌。该噬菌体具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
本申请在一较佳示例中可以进一步配置为：所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteusmirabilis phage)PMP2，对温度具有很好的耐受性，于75℃条件下具有良好的耐高温特性。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteusmirabilis phage)PMP2，连续传29代后，其效价为1012PFU/mL。
本发明的目的之二是提供一种含有耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的组合物，本发明的上述发明目的之二是通过以下技术方案得以实现的：组合物至少包含所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2以及其它噬菌体中的至少一种。
奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2具有极强的耐酸及耐高温能力，也可以与其它物质混合，满足一些特异性的用途要求。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述其它噬菌体为奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1，保藏编号为CCTCC NO:M2020902；鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1，保藏编号为：CCTCC NO:M2018765；大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1，保藏编号为CCTCC NO:M 2020438；或金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)J1P1，保藏编号为CCTCC NO:M 2016284中的一种。
通过上述技术方案，将奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2和其他噬菌体联合使用，以获得对目标细菌更好的杀灭效果。作为示例性的说明，奇异变形杆菌噬菌体PMP2与其他噬菌体之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述组合物包括化学性消毒剂。
本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：，所述化学性消毒剂为终浓度为0.0002％的二氧化氯。
将奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2和其他抗菌剂混合使用，以获得抗菌广谱性的同时还可对奇异变形杆菌特异性杀灭。此处能与本方案中的噬菌体联合使用的抗菌剂包括但不限于抗生素和化学抗菌剂。作为示例性的说明，奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2与其他抗菌剂之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
本发明的目的之三是提供所述耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的应用，所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2用作于生物杀菌剂、消毒剂。
本发明的目的之四是提供一种上述的奇异变形杆菌噬菌体及其组合物的应用，所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2用于为由奇异变形杆菌、且不限于由奇异变形杆菌引起的细菌感染提供潜在的治疗药物或保健品
本发明的上述发明目的之四是通过以下技术方案得以实现的：奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及其组合物用作于生物杀菌剂。
通过采用上述技术方案，可以用作为日常的杀菌剂，可以特异性地杀灭环境中的奇异变形杆菌，改善环境中的微生物分布；也可以用作在畜禽产品养殖、运输及保存的生物杀菌剂，用于防治在畜禽养殖、运输及保存过程中致病性的奇异变形杆菌污染；也可以与其它杀菌剂混合使用，喷洒于食品生产车间，防治食品加工过程中奇异变形杆菌及其他细菌的污染。
本发明的目的之五是提供一种上述的奇异变形杆菌噬菌体及其组合物的另一种应用，所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2作为饲料添加剂。
通过采用上述技术方案，奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及其组合物可用于添加于饲料中，可特异性、持续性防治饲料中奇异变形杆菌、且不限于奇异变形杆菌的生存和繁殖，防治饲料存储及动物养殖中奇异变形杆菌、且不限于由奇异变形杆菌引起的细菌污染。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1本发明的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，在较长的测量时间后，例如12h后，仍具有极强的耐酸能力，可以特异性地部分或完全灭活奇异变形杆菌，同时其MOI为0.001，仅需少量初始噬菌体即可完成大量增殖，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供了优质噬菌体株来源；本领域技术人员可以根据本发明的记载及本领域常识将本发明所述奇异变形杆菌噬菌体PMP2或其组合物制备成应用于医疗，检测，消毒及食品防护等方面的各种产品加以工业应用。
2本发明奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2是从自然界中分离的烈性噬菌体，经毒理实验证明其安全、无任何副作用；供试噬菌体不含毒力基因或不良基因；本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。
3本发明奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2具有良好的耐高温特性，65℃水浴2h仍具有50％以上存活率，75℃下水浴48h仍具3.7x102 PFU/mL效价；
4本发明的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，可以单独或混合使用，在浓度为103～104PFU/mL的奇异变形杆菌培养基中105～106PFU/mL的噬菌体对该浓度的奇异变形杆菌的灭菌率达到99％以上，对奇异变形杆菌具有广谱的杀菌能力。
5奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、LB培养基、氯游离水等。
6本发明的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，可以有效杀灭肉类表面的奇异变形杆菌并防治肉类在保存过程中奇异变形杆菌的污染，可作为食品防护的各种产品的有效成分。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由奇异变形杆菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。
7本发明的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，可用于制备组合物，试剂，或试剂盒，可应用于奇异变形杆菌的快速检测，其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的奇异变形杆菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度。
8本发明的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2可以单独或混合使用，可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成生物杀菌剂，饲料添加剂及治疗药物，应用于治疗或预防由奇异变形杆菌引起的感染性疾病。
9本发明的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2可以应用于工业生产，可由宿主菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化。其产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、直肠、胸膜内部等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。
奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，保藏编号为CCTCCNO:M2021671，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏时间为2021年06月04日。
鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1，保藏编号为CCTCCNO:M 2018765，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏时间为2018年11月09日。
大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1，保藏编号为CCTCC NO:M2020438，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏时间为2020年08月20日。
金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)J1P1，保藏编号为CCTCCNO:M 2016284，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏时间为2016年05月26日。
奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1，保藏编号为CCTCCNO:M2020902，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏时间为2020年12月14日。
以下实例中，
LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂7g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
SM缓冲液配方为：氯化钠5.8g，硫酸镁2g，1mol/L Tris-HCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水1000mL。
奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2、鸡白痢沙门氏菌噬菌体SG4P1(Salmonella pullorumphage SG4P1)、大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1和金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)J1P1的组合物1～组合物8均依实施例8所述方法制备。
奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2和终浓度为0.0002％的二氧化氯的组合物9依实施例8所述方法制备。
实施例1：噬菌体的筛选和纯化
(一)样品采集及处理
本申请中的样品采集自山东德州鸡场的养殖场污水与附近农田土壤。
采集的样品经过5000r/min离心10min，过0.22μm滤膜。
(二)样品中针对目标奇异变形杆菌的噬菌体富集
将上述滤液以1:1的比例与2倍LB液体培养基混合，接种目标奇异变形杆菌菌株100μL，过夜富集。
(三)噬菌体筛选及纯化
将上述富集液离心取上清过0.22μm膜后，取1mL与5mL含有目标奇异变形杆菌的LB半固体培养基混匀，倾倒于盛有LB固体培养基的培养皿上，待半固体培养基凝固后，37℃过夜培养，第二天观察是否有噬斑，记录实验结果。
挑取上述单噬菌斑于1mL SM缓冲液中，150rpm震荡15min，梯度稀释，将稀释液与5mL含有目标奇异变形杆菌的LB半固体培养基混匀，倾倒于盛有LB固体培养基的培养皿上，待半固体培养基凝固后，37℃过夜培养。重复该步骤3～5次，得到噬菌体单克隆样品，命名为奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2。奇异变形杆菌噬菌体(Proteusmirabilis phage)PMP2形态有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径为45～55nm，尾长105～115nm，尾部直径为6～10nm。奇异变形杆菌噬菌体PMP2头部直径为50nm，尾长108nm，尾部直径8nm。该噬菌体具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。将奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2的序列在NCBI网站上比对并结合透射电镜观察结果可得该噬菌体属于Autographiviridae科噬菌体。
奇异变形杆菌噬菌体PMP2，连续传29代后，其效价为1012PFU/mL。
(四)噬菌体颗粒制备
应用宿主菌将奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2扩增，待培养基澄清后，8000g离心10min，去除杂质，加入固体聚乙二醇(PEG8000)至终浓度为10％(w/v)，搅拌溶解，4℃过夜，4℃8000g离心20min，将沉淀重悬于SM缓冲液中。将得到的噬菌体悬液4℃保存待用。
实施例2：噬菌体效价的测定
用SM液做稀释液，将奇异变形杆菌噬菌体PMP2(由实施例1制得)的原液10倍梯度逐级稀释至l08倍。分别取l05、l06、l07及l08稀释度的噬菌体培养液l000μL与其宿主菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入5mL冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6～8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数。
实施例3：噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定
挑取奇异变形杆菌单个菌落，接种到盛有3mL LB培养液的试管中，37℃150rpm振荡培养8h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到l0mL LB培养液，37℃150rpm振荡培养至对数前期。按照感染复数比例加入奇异变形杆菌噬菌体PMP1的纯培养液(由实施例1制得)和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入LB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中150rpm摇培8h。培养完毕后5000g离心l0min并收集上清液，测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。
表1不同感染复数下奇异变形杆菌噬菌体PMP2的效价
结果如表1所示，奇异变形杆菌噬菌体PMP2效价达到最高(3.9x1011PFU/mL)时，其MOI为1:1000。其初始投入量少，繁殖速度快，可应用于工业生产中。
实施例4毒理实验
实验小鼠20只，雌雄各半，适应性饲养三天后，随机分为两组(噬菌体组、对照组)，每组10只(雌雄各5只)，给予噬菌体组计量为1010PFU/kg的奇异变形杆菌噬菌体(Proteusmirabilis phage)PMP2(实施例3制得)，对照组给予等量生理盐水，连续给药15d，将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。
实验结果显示，此剂量的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2对小鼠日常行为没有影响。解剖检查内脏未见异常。本申请的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2具有生物安全性，可应用于饲料添加剂。当然，奇异变形杆菌噬菌体PMP2也可以应用成保健品去运用或药剂去应用，在本毒理验中也证明是安全的。
实施例5奇异变形杆菌噬菌体PMP2的毒力基因或不良基因缺失检测试验
本实施例选取103种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因如表2所示，通过测定奇异变形杆菌噬菌体PMP2的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有下列毒力基因。结果显示，奇异变形杆菌噬菌体PMP2不含有下列毒力基因或不良基因，所以无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白，因此奇异变形杆菌噬菌体PMP2不会影响人或动物体的健康。
表2病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
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实施例6奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2的热稳定性试验
1.噬菌体计数方法：同实施例2所述方法。
2.各取l00μL噬菌体纯培养液(实施例3制得)装于无菌EP管中，分别于55℃、65℃、75℃水浴中作用2h、24h、48h。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。
表3奇异变形杆菌噬菌体PMP2于不同温度下的效价
结果如表3所示，实验组中奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2在55℃下较易存活。奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2具有良好的耐高温特性，与对照相比，65℃水浴2h仍具有50％以上的存活率，75℃下水浴48h仍具3.7x102PFU/mL效价。
实施例7：奇异变形杆菌噬菌体PMP2耐酸性能测试
1.噬菌体计数方法：同实施例2所述方法。
2.将效价为2.6x1010 PFU/mL的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2样品(实施例3制得)分别调节至pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0，处理1h、4h、8h、24h、96h后，分别测定效价。测试结果见表4。
表4奇异变形杆菌噬菌体PMP2在不同pH条件下的稳定性
结果显示：奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2在pH＝1.0条件下处理96h后仍具有103PFU/mL效价，在pH2.0～8.0条件下处理96h均可以稳定维持较高的效价。奇异变形杆菌噬菌体PMP2对酸性环境耐受性极强，证明其可以耐受动物胃肠道的低pH环境，在治疗动物胃肠道奇异变形杆菌感染方面有极强的潜力。
实施例8奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2组合物的制备
奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1原液的制备：将奇异变形杆菌噬菌体PMP1宿主菌接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，37℃下150rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1，37℃下150rpm震荡培养12h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到奇异变形杆菌噬菌体PMP1原液。
鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1原液的制备：将鸡白痢沙门氏菌噬菌体SG4P1宿主菌接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，37℃下150rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL鸡白痢沙门氏菌噬菌体SG4P1(Salmonellapullorum phage SG4P1)，37℃下150rpm震荡培养12h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到鸡白痢沙门氏菌噬菌体SG4P1原液。
大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1原液的制备：将大肠杆菌噬菌体EC35P1宿主菌接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，37℃下150rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1，37℃下150rpm震荡培养12h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到大肠杆菌噬菌体EC35P1原液。
金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)J1P1原液的制备：将金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1宿主菌接种至含有500mL LB培养基的锥形瓶中，37℃下150rpm震荡培养至OD值为0.2时，向其中加入1000PFU/mL金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcusaureus phage)J1P1，37℃下150rpm震荡培养12h。将发酵液8000rpm离心15min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到金黄色葡萄球菌噬菌体J1P1原液。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2(实施例3制得)和奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1的原液，将2株噬菌体等体积均匀混合制成奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2和奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1的1:1的组合物(组合物1)。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2(实施例3制得)和鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1的原液，将2株噬菌体等体积均匀混合制成奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2和鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1的1:1的组合物(组合物2)。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2(实施例3制得)、大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1的原液，将2株噬菌体等体积均匀混合制成奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2和大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1的1:1的组合物(组合物3)。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2(实施例3制得)、金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)J1P1的原液，将2株噬菌体等体积均匀混合制成奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2和金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)J1P1的1:1的组合物(组合物4)。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2、奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1和鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1的原液，将3株噬菌体等体积1:1:1均匀混合制成组合物(组合物5)。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2、奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1、鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1和大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1的原液，将4株噬菌体等体积1:1:1:1均匀混合制成组合物(组合物6)。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2、鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1、大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1和金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureusphage)J1P1的原液，将4株噬菌体等体积1:1:1:1均匀混合制成组合物(组合物7)。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2、奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1、鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1、大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1和金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)J1P1的原液，将5株噬菌体等体积1:1:1:1:1均匀混合制成组合物(组合物8)。
分别取效价为1x109 PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2和终浓度0.0002％的二氧化氯，将2者等体积1:1均匀混合制成组合物(组合物9)。
实施例9奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及其组合物在液体中的杀菌效果
1.奇异变形杆菌计数方法
采用BS奇异变形杆菌选择性培养基，应用稀释涂布的方法计数，37℃培养24h，黑色有金属光泽的菌落为阳性菌落。
2.奇异变形杆菌噬菌体PMP2在液体中杀菌效果实验
培养奇异变形杆菌至对数生长期，分装进不同试管中，用等体积的液体LB培养基稀释菌液至奇异变形杆菌的终浓度为2x103cfu/mL，接种进不同浓度的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，使样品中奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilisphage)PMP2的浓度分别是2x102PFU/mL、2x103PFU/mL、2x104PFU/mL、2x105PFU/mL，2x106PFU/mL。同时设置对照组和空白组(CK)，对照组给予终浓度2x103cfu/mL的奇异变形杆菌；空白组给予等量生理盐水。4h后检测奇异变形杆菌的残留量。结果参见表5。
表5不同浓度奇异变形杆菌噬菌体PMP2在液体中的杀菌效果
表5的测试结果显示：奇异变形杆菌噬菌体PMP2浓度为104～106PFU/mL时，噬菌体PMP2对液体LB培养基中奇异变形杆菌的杀菌效果最好，杀灭率在93％以上。表明奇异变形杆菌噬菌体PMP2具有应用为生物杀菌剂的潜力。
3高浓度奇异变形杆菌噬菌体PMP2的组合物在液体中杀菌效果实验
培养奇异变形杆菌至对数生长期，分装进不同试管中，用液体LB培养基稀释菌液至使奇异变形杆菌的终浓度为6x103cfu/mL，接种带有终浓度为2x106PFU/mL浓度的奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2的组合物1～组合物9(配制方法参照实施例8)。设置对照组和空白组(CK)，对照组给予终浓度6x103 cfu/mL的奇异变形杆菌；空白组给予等量生理盐水。4h后检测奇异变形杆菌的残留量。结果参见表6。
表6高浓度奇异变形杆菌噬菌体PMP2的组合物在液体中杀菌效果
表6测试结果显示：奇异变形杆菌噬菌体PMP2浓度为高浓度2x106PFU/mL时，其组合物不仅杀菌效果好，而且对其它组合成分无拮抗作用。奇异变形杆菌噬菌体PMP2的组合物具有应用为生物杀菌剂的潜力。
实施例10奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及其组合物对鸡肉样品保存过程中奇异变形杆菌污染的防治
1.噬菌体计数方法：同实施例2所述的方法。
2.奇异变形杆菌计数方法：同实施例9所描述的方法。
3.组合物1～组合物9的配制方法：同实施例8所描述的方法。
4.将高压蒸汽灭菌的鸡胸肉切成1cm见方的小方块60块，分为12组(单噬菌体PMP2组、组合物1、组合物2、组合物3、组合物4、组合物5、组合物6、组合物7、组合物8、组合物9、对照组和空白组)，每组5块，置于无菌平皿中。实验组每块接种1x105CFU奇异变形杆菌和剂量为1x108PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种1x105CFU奇异变形杆菌和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于37℃培养箱中培养。每2h取一块鸡肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体中的奇异变形杆菌含量，结果参见表7。
表7奇异变形杆菌噬菌体PMP2及其组合物对鸡肉样品保存过程中奇异变形杆菌污染的防治结果
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表7结果显示：8h后对照组的鸡肉表面生长了大量的奇异变形杆菌；而各实验组由于奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及其组合物的添加，鸡肉表面的奇异变形杆菌始终控制在极低的水平。奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及其组合物可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭鸡肉表面的奇异变形杆菌并防治鸡肉在保存过程中奇异变形杆菌的污染。当然，奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2也可以应用成保健品去运用或药剂去应用，实施例4也证明是安全的。
实施例11奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及其组合物对鸡肉样品保存过程中大肠杆菌污染的防治
1.噬菌体计数方法：同实施例2所述的方法。
2.大肠杆菌菌计数方法：采用伊红美蓝选择性培养基，应用稀释涂布的方法计数，37℃培养24h，平板上呈深紫色金属光泽的菌落为大肠杆菌菌落。
3.组合物1～组合物9的配制方法：同实施例8所描述的方法。
4.将高压蒸汽灭菌的鸡胸肉切成1cm见方的小方块60块，分为12组(单噬菌体PMP2组、组合物1、组合物2、组合物3、组合物4、组合物5、组合物6、组合物7、组合物8、组合物9、对照组和空白组)，每组5块，置于无菌平皿中。实验组每块接种1x105CFU大肠杆菌和剂量为1x108PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种1x105CFU大肠杆菌和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于37℃培养箱中培养。每2h取一块鸡肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体中的大肠杆菌含量，结果参见表8。
表8奇异变形杆菌噬菌体PMP2及其组合物对鸡肉样品保存过程中大肠杆菌污染的防治结果
结果显示：8h后对照组的鸡肉表面生长了大量的大肠杆菌；组合物3、组合物6、组合物7及组合物8对大肠杆菌抑制效果较好，使得鸡肉表面的大肠杆菌始终控制在极低的水平；其他处理组对大肠杆菌的抑制效果较弱。奇异变形杆菌噬菌体PMP2及其组合物可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭鸡肉表面的大肠杆菌并防治鸡肉在保存过程中大肠杆菌的污染。
实施例12奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2及其组合物的试剂盒的制备及使用
试剂盒中含有5～10mL的效价为1×107PFU/mL的奇异变形杆菌噬菌体(Proteusmirabilis phage)PMP2或奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2的组合物，1L LB半固体培养基，1L LB固体培养基。
试剂盒的使用方法为：取效价为1×107PFU/mL奇异变形杆菌噬菌体(Proteusmirabilis phage)PMP2噬菌体液体或奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2的组合物的液体，采用双层平板点滴法来测定供试噬菌体的裂解谱。挑取待检测单菌落，将其接种于目标液体培养基中，于目标温度下结合待检测菌株生长特性进行振荡培养，制得待检测菌株菌液。取300μL待检测菌株菌悬液分别与5mL LB半固体培养基混合铺于LB固体平板上，取10μL奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2液体或奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2的组合物点滴于平板上。待自然风干后根据待检测菌株生长特性于目标温度下进行培养，观察结果即可。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 菲吉乐科（南京）生物科技有限公司
<120> 一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒及其应用
<130> HF21A1425
<141> 2021-11-24
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 39311
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatgactgc tggtttcgac cggacgtcct ctgacgtcat cccacctcag gatggggact 60
gggcgacccg tgcgtctatg aactaccctt accgctttgc gtcgtacctc gctgagcagt 120
ccggctgcac atcaacggtt gttatgcgag caatctccgg gcacacagct aagcaggcgt 180
atgagcaggc tgaatggcag acaaacccga actgtgacat cgtgttcatc atgtacgcga 240
ttaacgactc cggtggcgtt gctggtgcga ctcttgatat ttacatggag tacatggaga 300
agctgattcg tcgctacatc gactggggct gtgctgttgt tgtccaacgt ccttcaggcg 360
gcggtcaggg ggcggggaac ccaaggtggc tgcactgggc caagcgttta cagatggttg 420
cccgtgtgta cggctgtcca atctttgacg cgcatgaggt aatgttctat cgtcattacg 480
ctgccgtgca gtctgatggg acccactaca actctatggg ctacgcgatt cacggagaga 540
aactggcttc catgctcatg gctggcggac ttctggatac ctaccgtccg gtggttaatg 600
agattaccgt atggaccggg atgatgtcag accgagttgg ctggtgtgat gctatgggga 660
acattggagc cttccgttct gacggagcgt tcacccgtac taagataact ggtcgtcttc 720
cggggagcac acgagtggtc acgaccttca gtttctatct ggatgctgag gccgcgcaca 780
tctacggtaa gttcgtaggg aagatgaacg tcatcatgac caatagtagc tggtggaaca 840
acaacgctca gccgtactac cagtacgctg atgaccagcc tcactccttc ggtatgtcac 900
ttgagcgaac ccctaagtct cctaatgact tttcaggcgc ttctggttcc cgtaagttca 960
tcggtcgagt cattggacgt ggttggcata ctctgacttt cttcaaggct ctggatggga 1020
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ctactgagca gatgtggggt caggacgagg agcgacgcta taaggttgta catacccgca 1140
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tccatatgcg agtgcctcaa agcgttctgg gaactggtcc gggagcatta tgccttccga 1260
cgccatactt ctacaacact atccctgcca ctctccgaat cacggacgag aatggaacgt 1320
acattgagtt cctcgtgtac aagaacggtt cgtctggtct gacttggact ggtaaggttc 1380
tgaagtcaac gcttgcggaa gcctcctacc cgacccttac ggctcagctc tcaactgcta 1440
agcagtctgt ggtcagggct gctggtcagg acggtacgaa tatgcctctg gagaatatct 1500
acgccttcaa cggcggactt cagccccaga acagctcagc gtctgacatt tcgtggaaag 1560
gaggtatcta cttccagttc acccttacgt ggccgggtac tgcaccaact ggttactgga 1620
acatcgagct tgaaggttct gactggttcg gaaactccga gtcttccttc ggtgctttct 1680
aaccgataac tttgggtcaa ggacgacccg tttaacaatg gaggtattat gattgagttc 1740
gacttcaaga atgaggtcct caaagcctcg cctatcgtcg ggaccgctgc ggctgatggt 1800
gccagtcggt tcttctttgg gttaacactc aacgaatggt tctacgtcgc tgctatcgcg 1860
tataccgtgg ttcagattgg cgtactgatt tacaagacga ttaagagcgg aggtaagaca 1920
tgacgcagat ggacttagag aagttcctgt taatgctgga caccgaacgt gctcgactca 1980
tgttgcaaga cctgcgggat gactctaagc gttcgccaca gctttacaac gccatcgaga 2040
agctgctggc tcgtcacaac tttgtactga gcaaggtgtc ggtggacgag aagcaactgg 2100
ctgacatgga ggcgctgaac cgagagtacg acaaggtgct atcagcgacc gaggataatg 2160
acaccgggta tggtgttcag taagtgttag actcaaggtc attaccacta tatgtagtgg 2220
cctttatgat taacacacac tacgagcggt gacgctacgt ggattctgag aaatgaggag 2280
ggcaactatg ctcgaacttt tacgtaaagc aatcccgtgg ctggttgcag gactcctgtt 2340
ctgctctggc tattgggtag ctgataataa gtgggaggcg aaggtaaaca atgagtacat 2400
cacgaaactt gaggcacgag agaatcaacg ggctgctgtc caaggtgaaa tcgacaaagt 2460
gtcagcagag tggcaagaca agatgtccgc gctggaaggc tctactgata ggattattgc 2520
tgaccttaac cgcgataaca agcggctgcg catccgagtc aaacccacca gtggaacagt 2580
ccagactgac ggtcgatgcg tcattgatgg ttacgccgaa cttgacgaac gagatgctaa 2640
gcgtcttatc gccatcggac tgaaaggcga cgaatggatt aaggccctcc agaagaccgt 2700
gagagccatg cagcaagaga aggaggtgaa accttgagtc aagacctagc ggcgcgtcag 2760
gcgcttatga ctgcccgtat gaaggcagac ttcgtgttct tcctgttcgt cctgtggaaa 2820
gctctgtccc ttccggtccc gactcgctgt cagattgaca tggcgaagaa gctatcggct 2880
ggggacaaca ggcgcttcat cttgcaggcg ttccgtggta tcgggaagtc cttcattacg 2940
tgcgccttcg tggtctggaa gctatggaac aacccggact tgaagttcat gattgtgtcg 3000
gcctcaaagg aacgagccga tgcgaactca atcttcatca agcgtatcat cgacctcatg 3060
cctcagctcc aagagttgaa gcctaagcag gggcagcgag acgcagtaat cagctttgac 3120
gtaggacctg ccaagcctga ccactctcct tcggttaagt ccgttggtat cactggtcag 3180
ttaactggta gccgtgctga catcctgatt gccgatgacg tagaggtccc cggtaactcc 3240
gctactcagg cagcacggga ccgactgtca gagctggtga aagagttcga cgcaatcctg 3300
aagccgggtg gtacggttat ctatctgggt actcctcaga ccgagatgac cttgtatcga 3360
cagcttgaag gtcgtggtta ctcaactacc atctggcctg cccgctaccc acgtgatgag 3420
aaggactgga agtcttacgg cgaccgtctg gccacgatgc ttcaggccga tcttgagtcc 3480
gaccctgagg gctactactg gctccctacc gatgaggttc gattcgacga tgaggacttg 3540
agggaacgtg agctgtctta cggtaaggct ggcttcgctc tacagttcat gctcaacccg 3600
aacctagggg acgccgagaa gtaccctctg aagctgcgtg accttatcgt agcggacttg 3660
gaccctgagt caagccctat ggtctaccag tggcttccga accttcagaa caagcgtgag 3720
gacgttccta acgttggact catgggtgac tcctaccaca cgtatcagac tgtaggttct 3780
gccttcagtt cgtacaccca gaagattctg gtaattgacc ctagtggtcg tggtaaggat 3840
gagaccgggt atgcggtact gtatcagctc aacggctaca tcttcgtgat ggaagctggt 3900
ggtatgcgcg gtggctatga ggactctacg ctggagtctc tggcgaagat tggtcgcaag 3960
tggaagatta acgagtacgt cattgagggt aacttcggtg atggtatgta tctcgaactc 4020
ttcaagcctg tggcggctcg tattcacccg gcggcagtaa ctgaggtcaa gagtaagggt 4080
caaaaggaac tccgcatctg cgacgttctg gagcctataa tggggtccca cagactcatc 4140
gtgaactcct cgaccattgt gtctgactac cagactgccg ctgacaagga tggcgtccgt 4200
aaccctatct actccctgtt ctaccagatg acccgtatca gccgtgaacg tggagccttg 4260
gcacacgatg accgacttga tgctctggct atcggtgtac agttcttcgt agagtctatg 4320
gctaaggatg ccgttaaggg gcagcgtgaa gtaaccgagg agtggctgga ggaacagatg 4380
gaagacccac ggaaaggctt taagtccatc gagacggact actgggacaa tggggtccgg 4440
gtccagttca atacagatga tgacttgggc ttagggtcct acgtacagtt ccactagcag 4500
tttgcataaa gtaccgcttt agttgcatga atacgcacta tgtaagtcgg tacataacgc 4560
tcgtaactct atgtattcct taggaaaatc ttataccctc actataggaa agacccccgg 4620
ttacttatag taaagactca atgaataatc atatgcacac tttatgcaag accttaggag 4680
gcagactcct gagttcttac ctaaggctag caccgatgga gagggtgatt gtaatcatca 4740
caccctcata acttaagtag accctaagcg acaggaggta tgtagcatgg gtaagaccaa 4800
agctgttctc aaagctctgg cgaccaatcg agctacgtac aggtttcttg ctgctgttct 4860
acttgctgct ggcgttactg ctggaagtca gtgggtcggg tgggtcgaga ctctcgtatg 4920
tactctggtg tctgagtgtc attaacgcca tcatggtaac aatcaacgaa cgtaagacct 4980
aaggtcagtt catagctgac gctactctac tgaccttagc tactgtagtc aaggacttta 5040
ggtaacacct atagaagcct ctcacttcca gtccacctac ttactggtcc actggtcgtc 5100
aagcctctgg gtctctgacc ttcggtcctt gacctacagt agctgctcct acggtctctc 5160
gatgagtttt ggaccaaaag ttcgagagtc catctcacag ttcaagaacc tcaagtctcc 5220
ccataggccc tctttcagtc tcgaccaaag gccctacccc tagaccttcg gtctaaacct 5280
caagtctttg acccgaagtc gacccgaagt ctggaccgat agggcctata tcttgtggtt 5340
gggacgatgg gtcgggacta tatgttgtgt ccttgagtct ctatctgtat cagcctcaag 5400
tcatcaccta cagtcatcac ctacagtcat cacctacagt caaccagcct acagtcaatc 5460
cctaagtgat ggactaccta cagtctaaca acctacagtc aatagacacc atgtcgacct 5520
acagtttatc agagtcctaa ggtctagact cacaggttat cacatccggt ctctttagca 5580
gtcagtgacc attgctgact agggttattg ttgttggtgt ctgccaactg gactcttatt 5640
atccatagtc cagacctaaa gtcaatcatc tgtagtcgat aatggtcttc cttatatagt 5700
cattggacta ctgtataaat taacatgata aatagttgtt gacagtaggt ctaacttttg 5760
gtttaatagc ttccgtcaac acgacacggc aacaaccgga tagtgaagac gccgggtcgg 5820
tccggttaag tagtcagcct gtaagacata cgaacaacag gcaaccgaca gctaggcgac 5880
tagcgacaga aagtagttga caagatgtac cgacttaaag tagtatgtac cacatcgaaa 5940
cgacagtgaa gcctaacact gaaacaggct agcgaggcga cgacagccaa gcgaatgctc 6000
tttaacaatc tggataactc ttaatgtgcg ccgatagtaa gcgattaact caagagactt 6060
gttggctact gcgggtcagg ctcaagatga gcgcctcagg tctctttctg ataatcactc 6120
acacttaaag gatacacatc atgatttaca ctaacgaacc agccaacgtc ttctatgtgc 6180
tcgtgtctgc cgctcgtgct aacctgtctg atatggctaa catggcccgt cagttagacc 6240
ttaaggcact gctgcaagca gaacctgaat attacggtgt gctcgaatgc actgggctta 6300
ctgggtgcta ccgcgaggaa gggcaagagg tcgccactga ggagagaacc taccgtgtgc 6360
gctgtgagtc caaggctcaa gctatcaacg ttgcacgact ggcctgcaat gactttgagc 6420
aagactgcgt gatggtctac aagtctcaga ctcacacggc tggactgatg ttctgcaaag 6480
gcttggacgg ctacaagacc acacgtctga acgggtcatt ccagcaagtc gatgcaccaa 6540
agggcgaatg cttcacgaaa gacgctgaag ggcgcttctg ggaggtggtg taagatggtt 6600
aactcatacc ctaatcacat caagccatgg ataacggttg atattgagac cgtgggcgac 6660
tccaagtttg tgaccatacg gtcaagcata cacgttaaca aggagttcaa acttccgcat 6720
agctatagcc tgagctgggg agactgggag attctgcgtg atggcgcttt cctcaagtac 6780
gccgggaggt tctactgatg tacacgataa gctacagcag tgagcaagcc ttctatgacg 6840
gtctagtcga gctaatgaag cgcggggctt gttacacggc taatcaccat gcgctgacca 6900
taacactgac aggcgggtac tgagtgccag actacaggtc atccatgcgg gtggcctgac 6960
tgattgtcac ttaaccacaa gaaggaaaca cgtaatgaac gcacacgata aagtaatcat 7020
gaacaacctg atgtctcagc ttcacgctat catctgcgag gagtgctaca agattgaaga 7080
ctcaagagct ggtatagcag gtcagccacg ctggggagcc tttgagatac tggcgaggga 7140
acatggttac aggctgttag gactgggaca cttcgccgct gcctttgagc atgaggacct 7200
gccgggatat gcaatcaagg tgggcttcaa gaaggatgac tcaggcgctg catatgcggc 7260
cttctgccga gagaatgagg gtctggctgg actaccagtc atccatctgg tcaagcgctt 7320
cagcagggcg tacatggtgg ctatggacaa gtaccgctca ctaaatgaca tcggcgggga 7380
ctactgccgg gacggtgaga cctatgagca acgagtcttg aacgtgtcgt ggcgtgtagt 7440
gaacgcaata atagaccaat gcgagcaacc atctgaggcc ctgagctggt ggctggacca 7500
agacgcgcga gctgagtttg cacacgtcga ggctcagtat attaaagacc ttgcgcagac 7560
cgcacgtaag attcacacgt tcttctacgg tctggcatcg ttcgacacgc accgagctaa 7620
cgtgatggtc gataacaacg ggcgcttgat agtcacagac ccagtgtctt ggactcaggc 7680
agaccatcaa gatgagctgc aaggcaggct gaacgcaata gctgagtgat agacgagagg 7740
ccactacatc tagtggtctc aaaggttatt tctcacaaca tataggcagg tgaactatgg 7800
gctggatact tctggtcatc ggctacgggt taatactcgc agtcatcacg aaagacatcg 7860
tcaaggcacg taaagtctac cgcttccagt atgtatcact gggccgctgg actgtaagac 7920
aaccaaacgg acgctttatg cgcaacctcg caaacgtctg ggacatagca accttaggga 7980
gtaaactata atgagcaagt caaatggtct ggcatacgca atggcggtag caatggataa 8040
cgcaatcatg acccggcagt cccggtctgg acgcgaacaa gctgaacgtg atatggttct 8100
gactaaacgc atgttggctg agggtcacaa ggtagacacc atgatttacg tctacgggtc 8160
caccaacatg aagtccgagg acggcaagct gctgctggca ggtcgacggg ctgacatcca 8220
acgggcaagc ctgacacaca cgaccaaagg tgacttcagt catctccacg ctaacccact 8280
gatatgcaag tagtattgat taaaccctca ctataggact caaggtctaa gactccagtt 8340
taaagaccaa agagacttta agtgaaagac taacaaacaa ggactttaag tatgagcgtc 8400
attcagcttg agaagcacga cttctcggac atctcaaacg ctatcgagcc attcaacatt 8460
ctggctgacc actacggtca ggacctcgca gtaaaacagc ttcagctaga gcatgaggca 8520
tacactgaag gcgagcgtcg tttcattaag aaccttgagc gtcaggctga gcgcggggag 8580
ctggctgata atcaggtcgc aagaccattg atgcaaactc tggtcccaaa gctggcgcaa 8640
gccgtcaagg aatggcatga gacccaaggg tcaacccgtg ggaaacctca ggtcgccttc 8700
ctgaagctga gcactgagaa caagcctcgt gagcttctgg tcaagcctga gtcggtggca 8760
gtcatcgtcc tgaagattgc acttagcaag ctggtcaagc ctgaaggcgt accgattacg 8820
ccgatggcct ccgctatagg ccgcacactg gaagatgaaa tccgcttcgg tcgcatccgt 8880
gaccaagagc aggagcactt caagaagacc atagccgaga acctgaagaa acgcgctggc 8940
gtggcctaca agaaagccta catgcaagcg gtcgaggcct ccatgctgga ccagaagcaa 9000
ctggctgatg cgtgggggac ttggagtcct gacgaggcgg tccacgtagg tatcaagatg 9060
cttgagctgc tgattcaatc cacacaactg gtagagctga agcgacacaa cgccgggaac 9120
gtagcgtcag acgtagaaat ggtccacctg tcagacttct gggccaagaa gatggctcag 9180
cgtggttaca gccttgcggg catcgctccg gtctaccaac cttgtgtcgt gcctccacgc 9240
ccttggaact cggtggtcgg tggcgggtac tgggctaaag gtcgcagacc tctcccgctg 9300
atgcgcttag ggtcgaaggc cgctatcgct cgctacgagg aagtttacat gcctgaagtc 9360
tacgaggcag tgaacatcat tcagcagact ccttggaagg tgaacaagaa ggtactggac 9420
gtggtgaaca tggtcgagaa gctgaacaat acgcctatcg cagacatccc tcagatggac 9480
ccgatgaagc cggaagacta caacggggag actgaagagg agctgaaggc gtggaagaaa 9540
gctgctgctg gcatctaccg ccgcgagaag gcccgacagt cccgccgttt gtctctgagc 9600
ttcatcgtag gacaggcgaa caagttctct cagttcaagg ccatttggtt cccgtacaac 9660
atggactggc gaggtcgcgt ctacgctgtc ccgatgttca acccacaagg caacgatatg 9720
cagaagggtc tgctgactct ggcagtcggt aagccaattg gtgcggacgg cttcaagtgg 9780
ctgaaggtcc acggtgcaaa ctgtgcgggt gtcgataaag tcaccttcga ggagcgcatc 9840
aagtgggtag aagacaacca cgacaacatc ctcgcggctg ctaagagtcc gatggatagt 9900
atcgactggt ggggcaagct ggactctccg ttctgcttcc tcgcgttctg cttcgagtat 9960
gctggggtca tgcaccacgg gctgagctac tcctgctctc tacctatcgc gttcgatggg 10020
tcctgctccg ggattcagca cttcagcgcg atgcttcgtg accacgttgg tggacatgcg 10080
gtcaacctga cgccaagcgg gaaggttcaa gacatctacc gcattgtgtc cgaccgtgtg 10140
gaagaacagc ttaaggaact gctggtcaac ggtagcgaca acgaggtgaa gactttcgag 10200
gacaagaaga caggcgagat tactgaacgt atggtccttg gaactcgtga gctggcccgt 10260
cagtggttga cctacggtat gtcacgctcg gtcactaaac gctcggtaat gactctggca 10320
tacgggtcga aagagtacgg gttcgcggac caagtgtttg aggacaccgt gatgccagcg 10380
attgacaatg gcaagggtgc gatgttcaca gacccaagcc aagcgtcccg cttcatggct 10440
aagatgattt gggatgcagt aagcgtgacc gtggttgctg cggtagacgc gatgaagtgg 10500
ctgcaaggtg cggctaaact gctggcttct gaggtcaagg acaagaagac caaagaggtc 10560
ctgaagcctt gcctcccggt acactgggtc acgcctgatg ggttcccggt ctggcaggag 10620
taccgcaaga aggacaccac acgtctggac ctgatgttcc tcggtacttt ccgtctgcaa 10680
cctaccgtca acaaaggcgg gagcaaggag ctggacaagc acaagcagga gtccggtatc 10740
agccctaact ttgtacactc acaggacggc agtcacctga ggaagactgt ggtccacact 10800
caccgcaagt atggcgtgat gtccttcgca gtgattcacg atagcttcgg gaccatcccg 10860
gctgacgctg agttcctgtt caaaggtgtc cgtgagacga tggtcgagac ctaccgcgac 10920
aacgatgtgc tgcaagactt ctacgagcag ttcgcggacc agcttcatga gagtcagcgc 10980
gacaagttgc ctgagcttcc gaagcgcggt aaactgaaca tcgaagacat tctgttatct 11040
gactttgcat tcgcctaagg aggcacctag tatgaaattc gcacacaagc aaactggcgt 11100
taagggtggc actcaaatcg tgaccgttac cgaacacaat ggcaagggtc ttgtgaagac 11160
cacggtcatc ccaaccgaga tgtcaaaaca gcttaatgtc ccattcaaat ggctggtgaa 11220
gcaggttgag aagtaacacg aacaggccct gactgaggca gcagcgaaat gacagactta 11280
cagtggctgg gagtgtggct cctagcttta gcagtttaca ctttaatcca acgcagaaga 11340
ggttaaccat atgttcggta agtcaaaact taaagcacaa atcaaagagt tgagcgtgaa 11400
ggcagcatac ttggagcgag ccgtagcggt ccgggacaag gacaacgagc ggctgaagga 11460
taaacttgct gagtcagagc gcaagcgcct aacaccacct gagcctgtca ctgtgaagcg 11520
tatggttggc ctgaagttcc gagcgctgtt caatggtctc taccagccga ctgagttcaa 11580
gaccgggcag gggccatgtg gcaagacagt gacacacttc accacgagtc ggaccgagcg 11640
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gagcgacatc gacggtcgca ttcagtacga ctacgagcaa gttaaggtct acggcgaaga 11760
ggcagaacgc gagcgagcac tgaggaagtt cgtagtccgg ccgcgctatg cttaaaccct 11820
cactatagga ttagactcaa ggtcatgact caaagtcgtg gccttcatga ttaaccctaa 11880
ctcaaactac tggagattta accatgtatc agaacaccgt caacttcgag cgcatccgtg 11940
aacgtcagca gactgaaggc tacatgccta aaggccgcaa gctgaacaag cctaaacgtg 12000
gcggtggcgt gaagggtgct ttccgtaacg ctgagggtaa agactctctg gtcaaccaag 12060
agaagtattt cgtaggagca taaccaaatg ggccgacttt atagtggcaa cctcaacgct 12120
ttcagagcag cgtgtaacag actttatcag ttagacttct gcgtgataca gcaggactgg 12180
tacgagacgc atcttcggaa agagtgcatg agacttcaag tcgaggaccg ggccggtaac 12240
atcttcgcgc ttgagacctt cgcacactgc gacgaagacg tgctgtataa cactgcaacc 12300
gactacctca acggtctcgc tgaccaacta gacacatgga gcaaagcata atgacaacta 12360
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cagcagccgg gtcgctggaa gctgaagtga agtatgacgg tgtgcgcctg aacctcccgg 12480
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gctggatgga cacttgcggt gatgacatcg gggcgaccaa agcgagcgac tggcgctggt 12600
tcctgaagca agctggctac gaaggaactg gcctgatgat tgacggcgag gtcatggtca 12660
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actacgagca ttcgatggac gctcttgaaa gtgagtggac caaggacatg aagggacgcc 12780
cgttccgttt aatcccggag atggtgactg tagttgtcta cggggtaatc gaccttaacg 12840
tcatcaacga cccgaaagcc gaaggtccta tccatagcgt cacacgactg aaggccgaag 12900
ctatcgtccc tctcctccag aaatacttcc cggaaatcga ctgggttctg tctgagtcac 12960
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acgagggtct ggtagtcaag gacccgctgg gcaaatacaa gcgtggcaag aagtcaggca 13080
tgtggaagat gaagcctgaa gacaccatcg acgggaccgt atgtggcctc gtgtggggga 13140
ctccgggaaa ggccaacgaa ggcaaggtca tcggctttga ggtactcttg gaggatggca 13200
tggtggtcaa cgcctgcggt ctgaccgagg agcagaagga tgagttcacc gctaaggtta 13260
aacgggctat cagtttccgt gaggactttg aggacttcgg gtcggaacct gaggacacca 13320
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tgcgtcaccc tagcttcaag tgctggcgcg ggacggaaga taacccgacc attaagagct 13440
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tcctctttaa accctcacta taggacaacc ctaaccgacc aaggagaaac cttatgtcta 13560
agaacttaat gttcaaccgt tttagtcaga ccttccacct gtctcacaat ccgttcgctt 13620
gcatcaagcg caacgagaag gtgggattct tcgggaaggc cgttaagctg gcacccacag 13680
tctacgctct gattgttccg agcaaagtag aagaggctcg ccagaagcag gagaccagcg 13740
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acgtcttaca gaagattcac gacgatgcgt atgcgaaagc actcgcagac cacgagaaga 14640
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aagacatcgg ctcaggtggc tacaaagcgt ctactgacgg tgacttcggg tctgacgact 15060
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cgtggctgca tggacaccaa aacgggggca ctctgtgggt gcctaccgct ctggacttga 15180
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gaagtgtacg tgaagattag caactcgcac gtcttcaacc ataagcgcct ccagatgcac 15720
acgactgtga gtgaacgctt caagtctcac ctgaatctcg ttatcgtcga gctggtggtg 15780
tacaatggta agtaaggttc agttcaaacc acgtacagtc actgacgcaa tcttcgtcca 15840
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gtcaggacgt ccagtcgatg tcgtagggtc acacgttaag gattggaact cccggtccgt 16020
aggcgtctgc cttgtaggtg gaattgacgc taagggcaag tttgaagcta acttcacgcc 16080
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gctgaacaac tgaagggatt cttcagctaa cttaaacact cactaaaggg atgaccactt 16500
tcggttgtcc cttcgttcgc attattgatt aaggagtgac caatgtcata tgaagaccaa 16560
gagcaggacg atagcgtctt cctctaccac accgagtgtc cagactgcgg gtcttcggat 16620
gccaatggtg tttactcaga cggacacatg tactgctttg cgtgtgaccc gtcagtcgct 16680
tggaagaaag gcgacatgga attgacagaa ggttacacgc cttcaggagg taagaagcaa 16740
gtgagcaacc tgttaacgtg gggtgagaac tcaggacgtt atgtccctct cccggctcgt 16800
ggactatcgg ctgacatctg caagaagtac agctactggg taggcatgat gcagggcaag 16860
atggtacaga ttgcggacta ctacgacagg tcagggacca aggtaggaca gaaggtccgg 16920
gacgcagaca agaacttcac agctatcggt agcgtcaaga atgacctact gtttggctct 16980
caactctggt ctggtggcaa gaagattgtc attaccgaag gtgagattga ctgcctgtca 17040
gtcgctcagg tacaggaagg caagtacccg gtggtctctc ttccgttagg cgcgaagtct 17100
gcgaagaaga cactggcagc gaaccttgag tacctcgacc agttcgaaga gattatcctg 17160
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gctggtaaag tcaaggtcgc attcatcaac gggtacaagg acgccaacgc tgcgcttcag 17280
gccaaggact tcagggcgat tcaggatgca atatggaacg ctaaaccttt cgtcccggct 17340
ggggtggtga gcgccaagtc tctgaaggac aggacccgcg aggcaatgct gaaggctgag 17400
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gctggtgagc ttatcatggt gacttcaggg tcaggcatgg gtaagtccac gttcgtccgc 17520
cagctcctct tagagtgggg cagacagggt aagcgtgttg gtatggcgat gctggaggaa 17580
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tccaaagaac tgaaagaagc aatcctgaag gatggacgat tcgacgaatg gtatgacaaa 17700
ctgttcaatg acgataagtt ccacctgtac gattcattcg ctgagtccga ggaagacacc 17760
ttgttcgcca agctgggcta tatggtggac ggtctggact gcgatgttat actgctggac 17820
cacatctcaa tcgtggtgtc tggcatggaa gataactcag atgagcgtaa gaccatcgac 17880
cgcatcatga cccgtctcaa gaagtttgcg aagacgaaag gcgtggttgt cgtggtcatc 17940
tgccacctga agaacccgga gaaaggtaag tctcatgaag aaggtcgccc tgtcagtatc 18000
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ccgaacatgg ctcaggttcc ggctaacggt gctccttggg gggaaatctg ccgaagtgct 20280
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gccaagacgt tcatctatgc gttcctgtat ggtgcagggg ccgcgaagat tggactgata 20580
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gacaaccata agtccgaggc caaagaggac atcgttaagc acctgccttc aggtaaaatc 21720
ttccgcgtgt ctctgggtcg aactggggac tactggcagg gctacgagac tgagttctat 21780
gatgctgaag aggttgaacc ttatgaagcg gtcgtggttc tataccgtcc tgtgaaactt 21840
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gatagctctg gttctggatg gtgactatct ggtattctct tctatggctg ctgccgagga 21960
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tcctcagcct aaagctgctg acactcaggt agctgctgct ccggtagaag tgcctcagga 24000
ccaagtgact gacgttgaga ccgatgtgac cgagaccgat aagaagaagg tcaaggcgac 24060
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tgttcgacat ccaagggtcc tcgactgaga acttcatcac ggtgtcgact gaaggtgctc 30300
cgaacaagct gttcatctac aagttcctct tcaaggatgg cgtacagctt caagcctcgt 30360
ggtcacactg ggagctggag cagggcgagc agattatggc ctcagcctgt atcgggtccg 30420
ctatgtacat cgtgcgtaag catggctatg gcgtggactt ggagaagctg gagttcatca 30480
aggagactgt ggacatcgct ggcgaaccgt accgtctaca ccttgatggc aaaacaacta 30540
tggtcatccc gactaacgca ttcaacccta acacatacac atcatccttc gacgttggtg 30600
cggcttacgg tggagttttc ccaccagcag ggaagtacgt catggtcgac tcaagtgggc 30660
gcttcgtgca actgccggac accgtatggt ccaacactcg gtgggtgact gtgaagggag 30720
attggtcagg caagacagtg ttcctcggtc gcgtctacaa gttcacctac gccttctctc 30780
ggttcctcat caagtatgaa gaccagaatg ggacggtaac ggaagactcc ggtcgactac 30840
agcttcgccg cgcttgggtg aactatcagc gtactggcgc tctggtgatg cgtgtcgtaa 30900
accaacagcg tgagtttctg aacaccctga acggctacaa gctgggacta caggacatcg 30960
gtcaggtcaa cattggtgat ggtcagttcc ggttcccaat gaacggtgac gctctgcaca 31020
ctcggttaat ccttgagtca gactatccga ctccattgtc catcgttggt tgcggctggg 31080
aggcttcata cgcccgtaaa gccaaagcta tctaactcat tgaatggcct atagaaacta 31140
ttacaccctc actataggga ctataggccc tttaagttat aggagacttt atgtatattc 31200
gtaaggctac tgaacctgat gtccactact tattgtggca tctctcacaa gatgacgtta 31260
aagagtgccg agcaaacttc gggtcgacta aaggtctgac tgatagaatg cttagccacc 31320
tcactccgtc atctgtggtt ttgacgaatg gtgtaggcga agtgtttgcc tatggcggga 31380
accaaggtga taacgtgtgg ttcctgactt caagtcttgt cgaaaggtta agaccgaaag 31440
acaagcggga gtttattcag cgtatctctg agtacaggga cttaatgtta gaccaatacg 31500
ggaccatctg gaactacgtg tggtcaggca ataagtctca cattagattc ttgcggttgc 31560
ttggcgctaa gtttcaccct gaggtgacta taagtccagt gacaggtgag cgttttcaat 31620
tattcacaat ctctaaggag gacgtatgtg cgaacccgta agtatcggca tgggtatcat 31680
ggctgtagcc ggggccacta tgtccgcatc ccaacaggca aaggctgagg gtgctgctat 31740
tgacgctcag aaccgacagg ctcaggagat gattaagcag atgaactact ctgacgccaa 31800
cctgaggatg caggagcgag accttaagga acagcaggtc gctgaactga ccgagacgac 31860
tctgaacggt attcgtaatc agggcatggt ccgtgcagca gtggctgagt ctggtctgga 31920
aggtaactcc atgaaccgaa ttgagcgctc agtggaaggc gacaccgtga aggaacgtgc 31980
tggcatcacc gaaagctaca accgcgacta tgcggctatc ttcgggaacc gtattgccaa 32040
cattgagaac accaagtctg ccatcaaggg tcaggctaaa atcatcaaga ccagccctct 32100
ggctcacgca cttaacgtca catctgctgg tatgcagggc tacatggctg gcgagtctct 32160
cgctgggtcc aagccgtcag gcggtgcagc tccaattagt gccgctaaag gcacacctac 32220
aggtcatagc taacaggggg accaatggct agtaatatcg aatcagcttt agctaaccgg 32280
actatgggcc gtggccgcgc tccgggcaaa gctatcagtg tagactatca agcggctaac 32340
gttcaggggc agactgggga ctccggtctt gcccgtgcgt tcaccaactt cgtggagtcc 32400
ggcactggcc tgtacaagca gtttcaagag aaggccaaga accttgggga tgagcggtct 32460
aacgagatta tccgtaagct gactccccag caacggcgtg aggccatcca gaatgggacc 32520
cttctgtatc aggacgaccc gtatgcgatg gaagcactga aagtcaagac tggtcgcaac 32580
gctgcctatg cggtggacga tgagattaac gtcaagattc agaacggtga gttccgcacc 32640
cgtcaggaca tggaggagta ccgacaccag cgacttcagg atgccgctaa gtcctatgct 32700
gatgaggctg ggattaaccc gaacgatgag catttccagc gtggctttaa cgcagacatc 32760
acggaccgca acgtagccat ctatgggtcg ttcaataagt atttctctaa gcagtccgag 32820
aataccgcta tgctgaacac ccgtgtcgag ctgaactcgt tcctgaacga tggggacctg 32880
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gccgccattc cgtctgacca aagggctacc gaagtcatct ctcagacggt gcgtgatgca 33000
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gttgaggctc aaggcaccga gtacaagctg gtagctaagt atcaggaaga cttgtcgctg 33180
ggcgttcagt ctgccctgct tcaggatgac ccgaccattg gtctggccca aatccagaaa 33240
ctcaaggctc aaaacaacca gctccagccg ggtgaggaaa tgacaccaca gcgtcagatg 33300
ctcattaatg ccgaagccag cctcttagag tccgtgaagc gcaagtccgc tgagcaggct 33360
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cagcgacgac tggctggtga caacgtgtcc accaactatg aggacctccc ggtctccgag 33480
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aaagcgtggc aggagctgaa gaacgactcg aagaacaagg acctctcgcg gctcccgacg 33960
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gatgcagcta cccagaacac tcagaagtgg ctgaacgaga acaccgtaac gttccagtct 34080
gaaggctctg acggtaagtc catcggcatg gtgtccaagc accagcttat ggtaggggat 34140
aaccctgagt cttggcaggt tggtcgagac attatcgaca cagcccgcaa gcagctcatc 34200
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ttcctgcaag acgccactgg gaccattcgt attcgctacg ataaggaact ggttggtaaa 34320
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ctggtcagac cgaggactcg ctcgatgtca ttggcgatgt gttcaaccct acccgctgga 35280
acaaccacaa gtggaccaga gaggagctag accagattcg taacgctggg gtcctgcctc 35340
agtattatgg ggtcatcact ggaggctccc ctcagaatct gactgagctg attaacttgg 35400
cgctggagaa ccagaagtta gacgctgaga aggctaaggc cgggactggc gctcaactgg 35460
ctgctggcgt gattggcgct ggtgttgacc cactcaccta cgttcctatt gccggacagg 35520
taggtaaagg cgggaagctg gtcaacaaga tgttcaccgt ggctgctcag tctggtgcgt 35580
tggctggcgc ttctgagatt gctcgtacct ctgttgctgg cggtgacgct catgtagctg 35640
aggcaattat gggtggcgct ctcttcggtg gtggaatgac tgctatcggg gacgctctgg 35700
gcaaggttct tggcaagtcg accaatgagt tcgctggacc agctacacgc cttgaagccc 35760
gtgagaccgc tcgtaacgtt gatggtcagg acctgtctcg tctccctatt caggaaggag 35820
aggagacctt cagtcaccaa ggcgttaagt tcgctgacgt gcctaatgag ccgggaagtg 35880
ttcgacttga ggatggttca atcctgattg gtgagaaccc gctgaaccct aagacacgtc 35940
aagtcttcga cgaggtgatt gaacccgaac gtgcggctgc tggtgtcaac cttggtggcc 36000
tcaccgagat tggcctgaag ctcctgagat ctgagaaccc tgagattcgt ggacttgccg 36060
ctgacttggt gcgctcacct acaggtatgc aatccggtgc gagcgggaag attgggacca 36120
cagcgtcaga cgtattcgag cgacttcgtg cagtggacca tcggttctac aacgacatcg 36180
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acggagcttt ccgtcaggac atctaccagc gtgtagctct ggctatcgag gacggaagtg 36300
ggaacctgaa gtctgagctg actccgggag aactgaaggt ctacgacctg ctgaagaacc 36360
agttcgacgc caagcgtgag atgatggaga accctgcgat gttcggtcgg gtggacgcta 36420
agtctatctt ccccggcagc cgcttcaagg ggacatacgt tcctcacgtt tacagcaacc 36480
agatgaagga gctgtacatc aaggagcttg gaagccctga ggcgctgcaa gaagcaatca 36540
agaagtcgtg gctcacgagc tatgcgtcaa gacctgaggt caaagcgcgg gtggacgagg 36600
ccctgatgga agctgaccct aatctgactc cagaaggact tgcggctgcg gtcgataagt 36660
acgccaacga taaggcttac ggtatctctc acaccgacct cttcgagcgc tcgtctgtca 36720
tggaagagaa catcaacggt ctggtgggtc tggagaacaa caacttcctt gaggctcgca 36780
acctgttcga tagcgatatg tctatcatcc tgccaaacgg tcagccgttc agtgtgaaca 36840
gtctccgcga gtgggacatg gataagattg tcccggcgta caaccgtcga gtcaatggcg 36900
acattgctat catggctggg accgggaaga ccacgaagga gatgaaggac gcagtagaga 36960
ccctgatgaa ccgtgcgggt gatgacggta aactgaaggg tgaagtctca acactgcgtg 37020
acaccctgaa gattctgact ggtcgtgctc gacgtgatgg tgcagacgat gccgccttct 37080
ctactgtgat gcgtaccatg accgacctgg ccttcttcgc caagaacgcc tatatgggcg 37140
tacagaactt gacggagatt ggcggtatgc tggcacgtgg taacgtccgt gcgatgctgc 37200
atggcattcc tatcttccgt gacctcgcct tccgtagtaa gaagatggga gcctcggaga 37260
ttaaggaact tcacaacgtt gtcttcggta aggagcttga cgactcaatc cgtccgtcca 37320
aacaggatgt catcgaccgc ctgcgagcgt acagtgacct gagtaagcct gtcgccaccg 37380
ctttaggttc tgccaagtat tacactgggg aacttgcggt ccgctctccg tttacgaagg 37440
tcctgaacgg cacgacgaac tacctgctgg atgctggacg tcagggcttc ttgtctgaca 37500
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tgtactacat ggctcaggcg cacatcaagg cttacgctat gcaggacggt cgtgaccggg 37980
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ggctaagctg gcgtgggtag actatcaggt ccataaccgt gggtccatca agtcctgctt 39300
cttgggagac t 39311
Claims (9)
1.一种耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体，其特征在于：所述奇异变形杆菌噬菌体为奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，保藏编号为CCTCC NO:M2021671；所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2，对酸性具有良好的耐受性，置于pH＝1.0～5.0下噬菌体效价变化较小。
2.一种根据权利要求1所述的耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的组合物，其特征在于：组合物至少包含所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2以及其它噬菌体中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的组合物，其特征在于：所述其它噬菌体为奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP1，保藏编号为CCTCC NO:M 2020902；鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum phage)SG4P1，保藏编号为：CCTCC NO:M2018765；大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)EC35P1，保藏编号为CCTCC NO:M2020438；或金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)J1P1，保藏编号为CCTCC NO:M 2016284中的一种。
4.根据权利要求2所述的耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的组合物，其特征在于：所述组合物还包括化学性消毒剂。
5.根据权利要求4所述的耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的组合物，其特征在于：所述化学性消毒剂为终浓度为0.0002％的二氧化氯。
6.一种含有权利要求1所述耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的试剂盒。
7.一种权利要求1所述耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的应用，其特征在于：所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2用作于生物杀菌剂、消毒剂。
8.一种权利要求1所述耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体在制备药物中的应用，其特征在于：所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2在制备由奇异变形杆菌、且不限于由奇异变形杆菌引起的细菌感染的药物中的应用。
9.一种权利要求1所述的耐酸和耐高温的奇异变形杆菌噬菌体的应用，其特征在于：所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)PMP2作为饲料添加剂。
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| 貉源奇异变形杆菌的分离鉴定及噬菌体的分离;周祥莹;刘慧;孙虎芝;陈引弟;任慧英;;黑龙江畜牧兽医(20);206-209 * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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