CN110846283B - 宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于大肠杆菌技术领域，具体涉及一种宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。噬菌体为大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1），保藏编号为CCTCC M 2018936。本发明的噬菌体对正常微生物菌群无毒害作用且其DNA无法编码毒力基因，为开发新型抗菌制剂提供了优良菌种资源，具有良好的应用开发前景。

Description

宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用

技术领域

本发明属于大肠杆菌的研发技术领域，具体涉及宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。

背景技术

大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，是为人和动物肠道中的常居菌。大多数大肠杆菌菌株无害。然而，有些大肠杆菌可引起食源性疾病。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为二百多个型，其中一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症。该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。

噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性。由于其具备强大的杀菌能力，噬菌体可作为一种抗细菌感染制剂使用，自20世纪初以来一直受到国内外许多学者关注。

孙利厂等人(《中国动物传染病学报》2018,12，10)从养殖场采集的污水样品中分离到宽噬菌谱肠出血性大肠杆菌烈性噬菌体，并进行了噬菌斑、噬菌谱、形态学(透射电镜)、遗传物质、酸碱及热稳定性、一步生长曲线等生物学特性及控制养殖环境中的肠出血性大肠杆菌的污染研究。

中国专利CN106754751A公开了一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用，对EHEC具有高效杀菌能力。

中国专利CN106591241A公开了一种新型肠出血性大肠杆菌O157，以用于防治污水排放或回用引发的肠出血性大肠杆菌O157的污染。

中国专利CN110129283A公开了一种短尾强裂解性大肠杆菌噬菌体，命名为PD38，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年9月26日，保藏编号为CGMCCNo.16391。该噬菌体对大肠杆菌具有较好的裂解作用，对食品、养殖环境中的大肠杆菌具有良好的消杀作用，同时可以防治鸡大肠杆菌引起的疾病。

中国专利CN109251899A公开了一种耐药大肠杆菌噬菌体及其应用。分类命名为EscherichiaphagevB_EcoP-EG1，保藏号为：CCTCCM2018562，保藏日期为2018年8月21日。

中国专利CN106754751A一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用，该噬菌体菌株保藏号为CCTCCNO：M2016539，于2016年9月29日保藏于中国武汉大学中国典型培养物保藏中心，分类命名为肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_ECM_MIE，Entero-hemorrhagicEscherichiacoliO157:H7phagevB_ECM_MIE；对EHEC具有高效杀菌能力。

韩国专利KR102003786B1公开了一种新的大肠杆菌特异性噬菌体EcoH7及其制备方法。更噬菌体EcoH7对产大肠杆菌具有非常高的特异性，可以解决抗生素对抗生素的耐药性，食品中的残留问题，以及广泛的宿主范围，因此可广泛用于抗生素，组合物，饲料，消毒剂或清洗剂领域。

美国专利US10265353B2公开了一种从自然界中分离的能够特异性杀死肠出血性大肠杆菌菌株的肌病毒科噬菌体ESC-CHP-1，保藏号:KCTC12660bp，使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物可以预防和治疗肠出血性大肠杆菌的感染。

美国专利US7635584B2公开了一种对大肠杆菌O157:H7菌株具有强裂解活性的分离的噬菌体，以及使用该噬菌体和/或衍生自该噬菌体的后代或衍生物来控制大肠杆菌O157:H7在各种环境中的生长的方法。

目前，关于大肠杆菌噬菌体的研究主要集中于肠出血性噬菌体方面，针对更多病原的大肠杆菌噬菌体及其应用方面的研究鲜见报道。综上，急需开发新的裂解谱宽、安全性高的新型噬菌体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用，具有裂解谱宽，安全性好的特点。

采用的一种宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体CL1(EscherichiacoliphageCL1)，保藏编号为CCTCC NO：M2018936。

进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL1(EscherichiacoliphageCL1)为烈性噬菌体，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径约为100nm,尾部长约150nm,属于肌尾科噬菌体；且在pH3～pH11、在4℃～37℃条件下具有耐碱性，MOI＝0.1条件下培养6h，其效价为1.4×10¹⁰pfu/mL。

进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL1(EscherichiacoliphageCL1)具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL1(EscherichiacoliphageCL1)的主要结构蛋白相对分子量为43kDa。

进一步的，所述组合物进一步含有大肠杆菌噬菌体CL6（Escherichia coliphageCL6）或大肠杆菌噬菌体CL7（Escherichia coli phage CL7）中的一种；所述大肠杆菌噬菌体CL6的保藏编号为CCTCC NO：M2018932，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，所述大肠杆菌噬菌体CL7的保藏编号为CCTCC NO：M2018933，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

进一步的，所述组合物同时含有大肠杆菌噬菌体CL1、大肠杆菌噬菌体CL6和大肠杆菌噬菌体CL7。

进一步的，所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体的组合物包括大肠杆菌噬菌体制备由大肠杆菌引发的仔猪黄痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎等疾病的药物中的应用。

一种含有上述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。

上述的大肠杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体组合物或含有大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在制备由大肠杆菌引发的仔猪黄痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎等疾病的药物中的应用。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明大肠杆菌噬菌体CL1、CL6以及CL7均为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；具有较广的宿主范围；其DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可进行大规模发酵培养；其培养液可于室温下稳定存活，于4℃下可保存12个月。本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的3株大肠杆菌噬菌体能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。本发明中CL1，CL6及CL7对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达80.00％，76.00％和74.00％。其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7，CL1+CL6+CL7的裂解率分别为90.00％，86.00％，88.00％和94.00％。

(2)本发明大肠杆菌噬菌体CL1、CL6以及CL7或其组合物的产品形式包括但不限于以载体携带、浓缩喷洒或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、生活水体等范围；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于含水性载体；浓缩喷洒形式包括但不限于虾苗喷洒等；药剂浸泡形式包括但不限于漂洗剂等。

(3)本发明大肠杆菌噬菌体CL1、CL6以及CL7或其组合物被制备常作为有效成分应用于环境消毒的各种产品，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、养殖业设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。上述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于消毒剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、海水等。

附图说明

图1是电镜鉴定的大肠杆菌噬菌体CL1形态结构示意图；

图2是电镜鉴定的大肠杆菌噬菌体CL6形态结构示意图；

图3是电镜鉴定的大肠杆菌噬菌体CL7形态结构示意图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。

大肠杆菌噬菌体CL1(EscherichiacoliphageCL1)，保藏编号为CCTCCNO：M2018936，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；

大肠杆菌噬菌体CL6(EscherichiacoliphageCL6)，保藏编号为CCTCCNO：M2018932，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；

大肠杆菌噬菌体CL7(EscherichiacoliphageCL7)，保藏编号为CCTCCNO：M2018933，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日。

以下实例中，

TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；

TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；

TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000mL；

SM液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/LTrisHCl50mL，明胶0.25g，蒸馏水1000mL。

实施例1：噬菌体的分离制备及纯化培养

本发明中大肠杆菌噬菌体CL1的来源样品采集于江苏省南京市江宁区众彩农贸市场污水，CL6的来源样品采集于江苏省南京市江宁区江南奶牛场牛粪，CL7的来源样品采集于江苏省南京市江宁大学城地下污水，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。

噬菌体的分离：取10mL过滤后上清液，加入10mL2倍TSB培养基中，同时加入1mL噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养6h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5mL噬菌体宿主菌对数期菌液，加入5mL，40℃半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10μl，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养6h，形成噬菌体点滴斑。

噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mLSM缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀释，取10²，10⁴和10⁶稀释液分别加入对数期宿主菌0.5mL，混合均匀静置15min后，加入5mL，40℃半固体TSB培养基，立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养6h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mLSM缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1mL对数期宿主菌菌液的50mLTSB培养基中，37℃条件下180rpm摇培6h。取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化噬菌体溶液，分别得到大肠杆菌噬菌体CL1(EscherichiacoliphageCL1)，保藏编号为CCTCC NO：M2018936；大肠杆菌噬菌体CL6(EscherichiacoliphageCL6)，保藏编号CCTCC NO：M2018932；大肠杆菌噬菌体CL7(EscherichiacoliphageCL7)，保藏编号CCTCC NO：M2018933。

实施例2：噬菌体的电镜观察

分别取实施例1制得的各噬菌体培养物上清作电镜观察：取20μL样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸(PTA)于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察：结果如图1所示，大肠杆菌噬菌体CL1形态发现，有一呈多面体对称的头部和较长的尾部，长径L约为60nm，横径W约为15nm；尾长约60nm，宽约2nm，有可收缩的肌鞘(参见图1)；大肠杆菌噬菌体CL6形态发现，其形态为蝌蚪状，具有多面体对称的头部结构和较长的尾部，头部长径L约为50nm，横径W约为52；尾部长约50nm，宽约3nm,有可收缩的肌鞘，尾部的末端具有3条短棘(参见图2)；大肠杆菌噬菌体CL7形态发现，具有呈正多面体的头部结构和较长的尾部，头部长径L约为60nm,横径W为50nm；尾部长约50nm，宽约3nm,有可收缩的肌鞘，尾部的末端具有3条短棘(参见图3)。

实施例3：噬菌体基因组的提取与测序

分别取实施例1制得的各噬菌体100mL，加入终浓度1μg/mL的DNaseI，RNaseA，37℃条件孵育60min后加入5.84gNacl(终浓度1mol/L)，溶解后置于冰浴中1h。4℃条件下，11000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中。加入固体PEG8000(终浓度10％，即100mL加入10g)，完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。再次加入DNaseI、RNaseA至终浓度1μg/mL，37℃反应30～60min。加入EDTA至终浓度20mmol/L(即1mLSM液加入40μL0.5mol/LEDTA)，同时每1mLSM液中加入10μL10％SDS。从加入蛋白酶步骤开始，使用DP315-RTIANampVirusRNAKit病毒RNA提取试剂盒(Tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用EppendorfBioPhotometerPlus测定其浓度和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：

大肠杆菌噬菌体CL1(EscherichiacoliphageCL1)具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

实施例4：噬菌体的毒力基因或不良基因缺失检测试验

本发明选取43种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表1)，通过测定大肠杆菌噬菌体CL1，CL6，及CL7的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本发明3株供试噬菌体均不含有下列毒力基因。

表1 病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因

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实施例5：噬菌体MOI及效价的测定

挑取大肠杆菌DC1单个菌落，接种到盛有3mLTSB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1∶100比例转接到10mLTSB培养液，37℃160rprn振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为10、1、0.01和0.0001的比例分别加入噬菌体3种噬菌体纯培养液和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中160rpm振荡培养6h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，按如下方法测定噬菌体效价：用SM液做稀释液，将噬菌体CL1,CL6及CL7原液(由实施例1制得)分别10倍梯度稀释至10⁷倍。分别取10⁵、10⁶及10⁷稀释度的噬菌体培养液100μL与其宿主菌大肠杆菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4mL冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。

结果表明，培养6h条件下，噬菌体CL1效价达到最高(1.4×10¹⁰pfu/mL)时，其MOI＝0.1；噬菌体CL6效价达到最高(2.6×10¹⁰pfu/mL)时，其MOI＝0.001；噬菌体CL7效价达到最高(2.0×10¹⁰pfu/mL)时，其MOI＝0.0001。

表2 3株噬菌体MOI值

实施例6制备噬菌体鸡尾酒组合物

将实施例5富集得到的噬菌体溶液分装至50ml离心管中，每管40ml；加入固体PEG8000(终浓度10％，即40ml加入4g)，完全溶解后，冰浴至少3h；将噬菌体4℃，12000rpm离心20min；弃去上清液，使用等体积的SM缓冲液充分溶解沉淀；将噬菌体SM洗脱液使用0.22μm滤膜，过滤除菌。检测效价后，根据表3中的要求分别将噬菌体进行稀释混合。最终获得的鸡尾酒混合液总效价均为3×10⁸pfu/mL，各噬菌体的单位体积有效工作效价相等。

表3 不同的噬菌体组合物及比例

实施例7：噬菌体及噬菌体鸡尾酒组合物pH和温度稳定性的测定

7-1：不同pH条件下噬菌体的稳定性

将1ml效价为1×10⁸pfu/mLCL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体和1ml效价为1×10⁸pfu/mL的噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”各7份分别置于4mlpH＝1,3,5,7,9,11和13的SM溶液中，制成效价为5×10⁷pfu/mL的噬菌体溶液，4℃培养24h后，再检测其效价。

结果如表4所示，在pH5～pH9之间，3株噬菌体CL1，CL6,及CL7及其噬菌体鸡尾酒“CL1+CL6”,“CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”的效价均无显著变化，表明其在中性，微酸和微碱条件下有较好的稳定性。

在pH＝3的酸性条件下和pH＝11的碱性条件下，3株噬菌体及其噬菌体鸡尾酒的效价有一定程度的下降，但是与pH＝7条件下相比，效价仍未下降超过3个数量级，表明其在酸性和碱性条件下仍有一定程度的耐受性。在pH＝1的极酸性条件下和pH＝13的极碱性条件下，3株噬菌体及其噬菌体鸡尾酒的效价1个小时内均下降为0。

表4 3株单一噬菌体及其鸡尾酒混合物在不同pH条件下的稳定性

7-2：不同温度条件下噬菌体的稳定性

将效价为1.0×10⁷pfu/mLCL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，以及总效价为3.0×10⁷pfu/mL的噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”分别置于4℃，25℃以及37℃条件下，检测其效价。

结果表明，在4℃条件下，CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”都具有较好的稳定性，存放3个月后，效价并无明显下降，且存放12个月后，效价下降依然未超过1个数量级；在25℃条件下；CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”在1周之内效价无明显下降，4周后，效价均大约仅仅下降1个数量级；在37℃条件下，CL1，CL6,及CL7等3种单一噬菌体，及其噬菌体鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”在24小时内效价没有明显下降，72小时后，效价均大约仅仅下降1个数量级。由此表明，由上述3种噬菌体组成的鸡尾酒混合物“CL1+CL6”,“CL1+CL7”,“CL6+CL7”和“CL1+CL6+CL7”在不同温度条件下都具有较好的稳定性，参见表5—7。

表5 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物在4℃条件下的稳定性

表6 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物在25℃条件下的稳定性

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表7 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物在37℃条件下的稳定性

实施例8噬菌体对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌的裂解能力

采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取从山东，四川，重庆，安徽，广东和河南等6省分离所得的45株猪源耐药性大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mLTSB的试管中，160rpm培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表8所示，CL1，CL6及CL7对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达62.22％，64.44％和66.67％。

其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7，CL1+CL6+CL7的裂解率分别为84.44％，84.44％，82.22％和91.11％。由此表明，采用上述3种噬菌体的鸡尾酒混合物对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。

表8 噬菌体对不同来源地的猪源耐药性大肠杆菌的裂解结果

注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”

实施例9噬菌体对不同来源地的牛源耐药性大肠杆菌的裂解能力

采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取从山东，河南，河北，吉林和广东等5省分离所得的40株牛源耐药性大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mLTSB的试管中，160rpm培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表9所示，CL1，CL6及CL7对不同来源地的牛源耐药性大肠杆菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达67.5％，70.00％和72.50％。

其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7，CL1+CL6+CL7的裂解率分别为82.50％，85.00％，77.50％和85.00％。由此表明，采用上述3种噬菌体的鸡尾酒混合物对不同来源地的牛源耐药性大肠杆菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。

表9 噬菌体对不同来源地的牛源耐药性大肠杆菌的裂解结果

注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”

实施例10：噬菌体对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌的裂解能力采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取从山东，河南，安徽，江苏，江西和广东等6省分离所得的50株禽源耐药性大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mLTSB的试管中，160rpm培养6h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表9所示，CL1，CL6及CL7对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌具有较宽的宿主范围，其裂解率分别可达80.00％，76.00％和74.00％。

其噬菌体鸡尾酒混合物CL1+CL6，CL1+CL7，CL6+CL7，CL1+CL6+CL7的裂解率分别为90.00％，86.00％，88.00％和94.00％。由此表明，采用上述3种噬菌体的鸡尾酒混合物对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌裂解谱范围要远远高于单株噬菌体。

表10 噬菌体对不同来源地的禽源耐药性大肠杆菌的裂解结果

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注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”

实施例11：噬菌体对非宿主性致病性细菌的裂解试验

挑取20株非宿主性病原细菌单菌落，包括无乳链球菌4株，停乳链球菌4株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌4株，鲍曼不动杆菌3株。分别接种于盛有3mLTSB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μL噬菌体培养液(由实施例6制得)滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。结果显示，3株噬菌体及其鸡尾酒混合物均无法识别20株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株(表11)。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。

表11 3株噬菌体及其鸡尾酒混合物对非宿主性致病性细菌的裂解试验

注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”

本发明宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体组合物或含有大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒可适用于制备大肠杆菌引发的仔猪黄痢，鸡白痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎等疾病的药物中。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到发明法的保护。

序列表

<110> 菲吉乐科（南京）生物科技有限公司

<120> 宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53126

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

cgactttaat tctgcaaggg tcacatgacc cttgagaata ggaagccaaa cgaaccagtc 60

agtttcttgc gtccctgact gttgcttgcg ttttatttcg tcaagggcgt ggctagaccc 120

gctagacctg acaggccatt ccctttgaaa aaatccgcga actgatatac caatccctcc 180

ttgagcacac cgaagatatg gctacgatgt gcgttgaagt gttggtcctt acagtcagac 240

agcttacgcg gtttgccatc aactacaaca acagtattgc ggaagattag ttcctcaata 300

gctgtcatct cgtcagaacc tgcgttctcc agaacagcgt ccaacaggac cagcattgct 360

ttcttaccgt ccactttgcc gtctttaccc acaatgtcag cgttaccaat gcctttgaac 420

agcttacctg cttttttcag gactgtccag gcttgcagcg cgtttgcgag tgtcatgttg 480

tacgttacgt cgtcgatgtc aaatgatttg ggctcagtca tttgtgcttt cctctattgt 540

tactggtcaa agccttcagt taactgcata ccaccttggt ggaacacaat agcgaaggta 600

gtcgggttat ggccgttacc gcgagtccac ggggaaccat cggtaaagta accttttttg 660

ccccatgcca aatcctggtt tagcaggtct ttggcttgca gcacaaacgg gacaaatcca 720

cgaatgttgt tacgctgcag gttgtactgg tcgttaagcc atttggcatc cggaccattt 780

tgcttaacct tgatagttag cttaatggct ttggacgggt tcataatctg aatgccattg 840

ccatctgcac ctgcaagata ggtggaagct gggtccaccc attgcacgtc aatgacatcg 900

gcaccgtctg cccagtcgga cagctgaaca ccattcaggc tcaacacgca ttcagaagaa 960

tcgatgatca ttgatctgct ccttagcgag tgaagttaat caggatgtcg ctggagtgga 1020

ttgcacccgc cagcttaatc gcgatttgca ttacaacggc ctgacgagct tcacgctcat 1080

ccagaggctg gtcatctacg tcagggatgt agatgtagaa acctgtttcg agtcggtcgc 1140

cataagacag tgtaccaaac tcatcaccgt accagatacc aggtgcaacc aagccgttgt 1200

cgacagcctg ctgacaagca acagctgcag caccggtaag gcgctcgtga cctttgttcg 1260

tctgcggcac cttcgtgggt gacgtagcga ttgagttgaa gacgtaagtc tggacagcat 1320

tacagaacca gtcgagacca tgtacttcat cccagaagcg cggcggcttg gacgtaccaa 1380

gaacagtacc ttctgcaagc atagcaaagg tgctgtagta tgtgtaccag ttaataccca 1440

gcgccttaca cttattagct tcagtgagcg ttaaagtgtt gttcggtgta ataccaggct 1500

cttgtttgaa cttcatggta atcgtagtgc ggttacctga gaagttaaca gacagagcac 1560

gcgccatagc agaaatgtct gcatagtgtt ggttgttctt atcgtactga agccacatat 1620

tgttgtagcc tttaccagcc agagttttaa tcgggttgga gtcgctgttt tcaatatgag 1680

ttgctttagt ggtagtgtag ctgcaacgtt ttttatcgta agcagcaaca gttgacgcca 1740

gcaaactgat gtcatcgtca gacagctcac cagtaggcgg aagcggacgc agaacatacc 1800

agtcaggata cacatcgttg aatgctctaa tagccgcatc cagagtagag gtgttgctcc 1860

atgaggcgat aactactgaa cgaggacgcg gagattgtgc aaagaaaatc ttcagcgcgc 1920

caagtacaac tgaaccagta ccccaataag actcggcctc agagtagctg ccgatttcaa 1980

catagtgtcc gttgtcgctg tcaggaaaag cagtgccagg gtcctgagtt aaaagagcca 2040

gcttaccgaa gtcacctttg ctgataccag ttggagtgtt gttcagttga acgtttacaa 2100

tctggtttac attcaacggc atttttgttt acctcttggg tggactttcc ggccattata 2160

ctcagtaagt ttaaccaagt aaatggccag tgcaaagtta attaattttt atgctgcatc 2220

gacggactga taagagctgt ccgacgctgt agcatttctc acagttactg tggcaccaat 2280

acgacatcca ccgttaccaa cgcccgtaat aacaccggta ttacttacag tagcgacagt 2340

atcgtctgta gttgtatact gaatgttata gcctgggtct gtcttagcgt attcaggtct 2400

aacagttaca accagctgct gcgtgttgcc aacagtaagt gcaggcagcg aatcagtagt 2460

aacagaaagc tcagacacgt aaggagatgt tgtaccagaa gcagcaacac cgttcatcac 2520

aacgttagca gtaatagttg ctgaaccttc agatttagca gtcatcaagc catttgcatc 2580

tatactaatg atagcgtcat ttgacgattc ataagtaacg gtaacgctct tagagtccga 2640

cggataaatc tcaacatcaa gctgtttggt gttacccaca agccattcgg catactgagg 2700

gtatacctgt accttctcag aaatttgtgc ccaagtagct gcactaatat cagcaccatt 2760

actagttgcg taaatccaga tgttacatcc gccgctagca acaccagtta caacgcctga 2820

tgaatcaaca gttgcaatag ctgggtcagc agactcataa cgaatattag tcagctcagc 2880

gtcagactgg ttaacagtgt aagtgaactg ctgagtacca cctactggaa taccaccaag 2940

accatctggt gtaataacag ccacctctgt gcaagtcgct acaaacgaag caacaagtcc 3000

accgtcgtct gttgtaactg taatagtcga agttccagga gattgaccgt atataactcc 3060

gttagtgtca acagtaacag cgtctgtgtt tgaactattg tagctaactt ttttgttagt 3120

tgcgttgtca ggtgttataa caattttagt ttgcacctga tggccggcac ttactttagt 3180

cggagagtca ggagcccatg caacatccgt aactgcgatt ctggggtctg taactttaac 3240

ctcgattcta tcagtaaagt tcccatcatt agtgataaca gtaacatcaa ttaaacctgc 3300

agcgttagcg gttaccaaac cagcttcagt cacagacgca acttctgata caggagcact 3360

ccatacaaca gacgggtcag tagcattttc aggagtcaca gtggcatgta gctgaagcgt 3420

gtcaccaacc tccatagaag ctgtatcgcc ttcatcaata cttacaccgg taacatttac 3480

agcaggtacc ctgactataa tgtcaagagt gtcagtctta tcaccgtcat tcgtcttaac 3540

agtaacagtg gcattaccag ctataatacc agtaacattt ccgtcagtat ccacagttgc 3600

tacagtaggc gcactgcttt cgtatgtcac tgttttgtca gtggcatctt ctggcgatat 3660

acgaatacta gtcccagctg tgcttccgat attaacgtta agaggtgact gagtaagaaa 3720

ctcaactcct gtaacgtgta caacaggcgg aataacagtt acagtacagc tatcgaatat 3780

agagctgtca acaccgtact gcacgtttac agttgtttcg ccatctccaa tggcagtgac 3840

aagcccgctg tcgttaacga tagcaacaga ctcatcgtct gaaatccagt agaaatcagg 3900

tttgtctgca ttagcaggta aataggtgta tgtcaggcgt tgagtcttgc cctcttcaag 3960

tgtcacactt gtgggagaca ctgtaacaga ttcaacaagg ataggtgccc gagcaatgtt 4020

aaactttgcc cgtactgtat aaccgccgtc aacagacgta ccagtcacgt atgcaacacc 4080

ttccgccagt ggcttcacaa atccgagctc atcaacagtg ataacgtccg ggtcgctaga 4140

tttccatgcc ataccacgct cagtagcgtt ggttggaatg taacgcacaa ctagctgaac 4200

agggtcatca cccgcgacga ttgagtactc gtagttggaa agcattatac cttccagcgg 4260

aacattgggg gtaaaacctt tacccccgtt gctcttactg aactggacgt cgacaacctc 4320

attaagtgga agcgacatca atcagctcct tactcagcag taacagttac tgacgcggtg 4380

tcagtgaagc tgccatcagc tgttttgaca gtgatggtga cgacaccagc tgctttaccg 4440

gtcaccagac cagttgcact aacggtagct ttagcctgat cgtttgattc gtaggtaaca 4500

gctttgttag tagcaccagc aggcagtaca gttgcagtca gctgtacagt ggaacctact 4560

acaacgcttg gcgacttagg tgctaacgta acaccagtga cggctacagg cggagcagtt 4620

accgtaattg ctacagtatc tgttttggaa gggtcaagct tggatttagc agtaatagtt 4680

gctgaaccaa ctttgatacc ctgaacacga cctgaaccat caacagtggc tttgtcaggc 4740

gcattgcttt cccacaacac ggtgacgtca tctgcgtctg ccggtgctac tgctgctgac 4800

agagttgtaa actcaccaac agcaatcgac ttagtcttag gcgtagcagt tacaccggta 4860

actggggttg gaatgaattt tccgttctcg tcaagcttgg ttggcttgga taacgggaac 4920

tgagtaaccg actcttgacg caggtctgcg tctttaacag gacggttggc tgtagtacga 4980

tttgccatct ggagaatcct cttattgggt gcgccagctt attataggct ggcgcctcgg 5040

ttaagtaaat agtggttacg ggcctaaatc ataaatatct gctttagccc ctttgttttt 5100

gtacagcagg tataagccca accctcgcaa tatttcgcca gagtaaaaac catagtacat 5160

ggcgttgctt tcaggtcctg taccagtttc aaggcgtaac gctggcgacc aaccaccatc 5220

cattacgtgc cccggaatac cagttatgtc atagtggtct tccagctcat tgacaagcat 5280

atccatcagc ttatcaagtc ctgataccgt tgacccacaa agggctgaca tagctgcacc 5340

agcaagccat agtccgcaca tgtgacctgt gaagtctgaa gggactggca gagcaacgcc 5400

ttcttgcggg aagttagaag gtgacacacc tcctgacctt tccatgaagt caagcaacca 5460

ttttgaccag ttatccacat aagcaataag cttactcgga actggcttac cacggtttac 5520

tagctcatac catccacgtg ctgcggagaa ataagcacga ggctggtaac ctgaccatgc 5580

actaccatta ccccagtgat acatggtaaa cgtatcaggt acaccatatt taaagttatc 5640

ccaacggttc cagataaaag cagatgcacc agggcctagc tgaccaaact tcttatagta 5700

ccattgctga gaatcgtaca aaaagttaac catgttgttc agcctgattg tacctgctgc 5760

agtatcgtca tgcgtaaaga caaacggata ctgatagcca gggtaaggta taccgtgcca 5820

accatcgaac tgcttagaat cagggttata aatgttggag aacggaataa cacctggtgt 5880

gtaagcaagg ttatcattct catagtccag cacagtacag tcgcctagct tagctgtgta 5940

cgggttatct gccgagaaag taagacgata cttaatcgtg taaccaattg gccagttata 6000

gcgaggcgga acatcattca cacagtacca gctaatactt gtcgacgtat caacaccgtc 6060

aggcagtaca aacgcgaact gcttaatctc gccgaattgt gggctagctg gtggtgtacc 6120

tgtgttttcc tggtatgacg ccagcctgaa ctcccaggtg cgaatctgct gagttaccca 6180

tcctggtgcg gcaggtaaat cacgtaccca actccagcct tgcgcgtcag ttactttgat 6240

gcacaacgga cctgtagaag tatacgtcag cgagtttaaa ggtgcctggg aagattccag 6300

tagccaaaag cctataatgg cacctgacga actatccggt attgtcatac gaacagtgtt 6360

gccacgtctg ttgtcaagta tgtcagtacg gtaagacact gcaatagagg cattgccata 6420

atcagtggat gaacgaatat cagctaagat atactcagaa ccatctggct tagtacctgc 6480

gacaaaatca cttaacggaa tgtcatagtt agcaggcgaa gcaccaagag caggtagctg 6540

tgcgacaaaa cgatagatgt tttgctcgac gtcaaccttt tcacggttca tgtacatttc 6600

caccttgacg ttgatgttct gaccagcgtc atctttgcca ccgacctctg tacgtatctt 6660

agctgttggc ttacacttaa accatacagc ctgctgctcc agagatgatt gagctttttg 6720

gttctggcgt agaactatat aaccattttc atcacgtgaa tatatagctt gtgccagttc 6780

aggataagac caatcataag agatgccatc agtaaacgga gatgacgcgt gagagtcttg 6840

acggaagaac tggtcttgtt tatcaatatc aatatactcc tccagcgtaa acagaacagc 6900

ttgccaagcg ttgtaatact ttttctcgtt agtaattcgc cacagcatat agcagcagtc 6960

acagaaccac aactcagcat ccgcagcatt accgcgctga agctcgccgt acaatggaac 7020

gtttaccggt ctgttgtgcc atacttcatt tcgcttaagc aaataaccac cgtgttcaac 7080

aggaagctta acggcatagt taagcagata cacaccgttg acagtgtggt cacggagttg 7140

aatctcacct ctgcgagagt caggcagtcc agtctcaaga atctcgcctc cccatagctc 7200

atcgtttttg ccaggcagaa caccaatctt gttattggtc catgcaacaa tatactcgat 7260

gagatgtaca ggaggttcag cagctgacca gtccacagtg tagcttggtt cacccagata 7320

cctcggccag tcaatccagg ctaactgatt ccacgggtca gctggcatgg tagtgatgcg 7380

ataattgttg taaatatcgt cccagtcaac tttattttta ataacacgga caccaccatt 7440

aatagcaggc caagccatgt gtcccctgtg ggcccaagta gcaacatcca ggtactcgcc 7500

ccagaaagga gaaccatgag ggatttgtgc tttgccgtta acaaatttaa ctggcacatt 7560

tttatagccg ccttgtgttg gtgaatcagg gttgattggg aagctggcta gcacaggctc 7620

tttgccatta caaagccagt tagcgatcca gcgacgagga gtatcaggga ttgggtcccc 7680

ctcgtaataa tacttgacgt aagcattgaa gtactcaatt gctttgtcga ggtaccgctg 7740

ttccttagta gcaaggtacg cgtgaatttc gccgagtatt agcagcgact ggctttcaga 7800

cggagcatca ccgttaggtt ggtactccat catagtgtgc gcaataaaat ggcggttgtt 7860

cgacactact ccttctgggt tgaagatata gtgctgacgc gtagcgtcgt cagttctgcc 7920

agtattgcgc tcaagaaagt ggtggtgacc ttcgataagg ctttcgacat tagctcgatg 7980

gtctgatccg tctttaagca acatcgtgtg cattatttaa tccatccacc gttaaagaaa 8040

cccatccaag ttgcgcctga atcaaaggta agcaacgtaa caacatctgt gtaacccaca 8100

aggaatgaca gaacgggctt tctgttgttt gcccatttta ttctggagtc ccaggaagac 8160

accttgttag aaccagtgcc ttgcttaata gcaatagtaa tctgacgcgc aacagtagac 8220

gggtcagata caccaccgat attaattacg gtgtttggct ggttaagagt aaggctgaca 8280

attgttttag atgcagcagg tatagttacg gtagctgcac ttgcaacgtt gccgtactca 8340

tagattgctg acgtcgaaga tactgtagcc tgttcagctg cggtttctgc agcttctttg 8400

gccgcaatag ccgcatcacg tgcagcacgt gcctgtatag cagcttcgtt agcgttttca 8460

aagtttggta tagcttcatt gattgcagcg ttaatgcctt cgagtgtgcg tatgacacca 8520

ccttccgggt tagggatgtt tgggtcgtct gacataccga agtcatgaat gagctggaca 8580

gcagttgtta gcttatccag ctgcgcttgc agttccgggt ctactccagt tgccattacg 8640

gttcctctac tgtaccagtc gctttgttac cgttgtcatc catacaagtg atgtcaacct 8700

tgtagatgta cggttgctca attttaactt tatgcacata gctaatgtca acagtcatca 8760

ttgacttctg cgcatagcct gcaccgatag caccgccgac attatcaatc ttcgatattt 8820

tggttattgc ataatgtcgt aaacggttaa actgcttagc tggtgagcta cccagcgcta 8880

tgtgtagctt acgcattagc tcagcagcat tcttaccgac agctgtaata cgtacagctg 8940

tcatcattgg cttgctgacg tactcaaagc cgtcagagcc ttgtctggtt ctaggaggtc 9000

cgaagtcata tgcgtcgcca ggacgcagat aaacatacgg tgtaccatca actgtaccag 9060

actcttcacc aataatacat gaaccgtcag gtaatgttaa aagcttctga acgagctccc 9120

tgaggtcctt tatggagaat tgctgtaacg tagtagtggc catgacgact ccatgggtcg 9180

atacggaata cacggtatgg ctggtcttcg tatataacga agtctccgag ctttagttct 9240

tgtccacagt atatcgcaat acgtgggaac tcatgctcgc catcgtcttt agtcaacagg 9300

ttaggctggt tagtagctgc accaggttga atgttacaca gatactttgc agctgtatat 9360

tcgtcttcga agtcgccgtt tggtaagcgc gaatcatttc ggagaagaac atctgttaat 9420

gctacaaagg ttttatcctt cattagcgaa gttatcttga gcattatagc ctccagtttc 9480

tgccaacttt gtaccctatg gaatcataca actgcataga ttctctaagt gtaccaggcc 9540

cgcgtttgcg ttcttctgtc agctcggtgt taggaggtgg cacgtcactg tccattctgt 9600

cgtgaacagc gtcaacaagc atacgaccta ttttgtcgtt aagctcatgc gcagtcatgc 9660

ttcctctgag aacagcaggt acattatcac ggaaagcttt gtttattgcc tgtcggcctt 9720

tacccctacc gccaacagca ctacgaagaa agcttcgttc tggcagacca ttgagaccgt 9780

actcatgtac cattgctagc tcggcgtttg ttatacggtc cctgggattt acacgtctgt 9840

tgtgctctgg atgaacacct actgatacgc cttgaccctc aaacgactta aaggcacggt 9900

aggtgaactc gaacttttgt ttatcgcgac gttcaaggcg tatacgaatc attatactct 9960

ccgtgctctc agtgctgcac ccacaaggtg cttgagcatg accttgacgt ctgacgtcca 10020

gaggtcagtt gcaccggtaa cgcctgactt ggagtcgaag tattcaatct ccaggttacc 10080

aactttctta cggcgcaaag cctggtcact acgcacacct tcttcgccat catagctcaa 10140

tacgctggcc atcatataaa gctgtgccag cttaacttct cgtggaatta cagactccgc 10200

gatgtcaaca ttgcatgcac cgaggccagt acgtggccaa gccatgctct gcgttttgct 10260

gaccttacga cctagccagt taaactggtt atcaagtcga atagctgctt tggcagcttg 10320

gtagtacggg tcagttcctg gttgaatgag aataccttcg ttagtgataa actcgtctac 10380

ttctgcggcg ctaacgtacg agttagcacc cggaacaatt gaaccgtctt ccacaacaag 10440

tgtgtatgcc atagaaagcc tccagcaagt ttagtccgat tatataccag aacttttaca 10500

ttgtaaagca gaattaggaa tgtagtcgcc acttacgaat gttttgagtc tatggcagtt 10560

ggcgcacaat gttctaaggt tacttggatc gtcattagag tgattaccgt ctacatggtc 10620

cacgtctaac tgacaagggt gtacaggaat aaaaccacac tcctcgcaat ggtctttttt 10680

gaataagcga taatctcgct tatgagttac tataccatat cttttgttat ggcacgtact 10740

acaatgtgct ctgtacttat cttttgcaca tttagattgt aggttagtac aaccttcggt 10800

aatacacaca ccacgaacat ctactggttc cggcttaagt cgtctacggc ccattacacg 10860

cccttttaaa gttaataaaa aggcgcacgt cgtcacgtgc gccttttgtt agtcccgttt 10920

gtgggttaga ttgcagactt agccagcaac ataacaccag cggtgtcttt gttggaagtc 10980

gcaactttag accaggacgc ctgagcagcc aggtcttcat cagtcggaga ctgaccagct 11040

ttgtgaccga cccagctgta gcctttcagc gacacgttga agtcgtattc accctgcatc 11100

tgacgcagga tgttttcacc accggtttgc tcggaggtaa ccatgtcgta caggccgccg 11160

acctgaacga ttgcagcaga cggggtcagg cccagagtac ggtacttagc agaagcaccg 11220

gaaccatcaa ccagagccgg gatgtcggaa acgacatagc gacgacccag gaagtctttg 11280

tacacgttca ggtcaccaat ctggaacagg tgttccgtgt tgttgatagc ctggtcgatg 11340

agggagtgga acgcagtaga gtgcatgatg tacgcacgaa tctgctgaga acggtcaccc 11400

atcttcgcgt tgactttgtt caggttctgc atggcgatgt ttgcagcagc accggagcct 11460

gaagttacgt ccagaacaac atcagcgttt gcgccgatag cagctaccag acatgcagca 11520

gtggtgttca ggtagtcctg gaacattgca gcagaagcct gtgcagcaac aacagctgct 11580

ggttcagtgt cacctgcacc gatgcgacgc atcatagtac cggtaatgtt cagaggacca 11640

acacggccgt cgattttaac agagcggtcc agaatctggc ccagagtctg cgcatcaact 11700

ttattggtgc ctgcgtaagc gttacggcgg gtagcgatgc cgtcaaccag ctgccacatt 11760

gcctgctcaa cgtaatcacc aattacgtac tggttaccca ggataagggt acctgcagaa 11820

gcttcgttga acttctgtac gtcctggtct accagttcgg tggcggtaga acgtacttgt 11880

tcgttaaaaa tatacagtga cataaattat ttgccccatt gtgtgttttg gattttagca 11940

cgagcacgtg ctatgcggtc gtccccgcct ccgaaagtgt gctgttcgcc accgccgttc 12000

ccaccaggat tagctccgcc gccgttggca ccgccaccgc cagccttggt tccacgcaca 12060

agaggtgcaa actgcttatc agcgcgcata tgctccacta gctcatctgg cgttgtagca 12120

gtcgggttac ccataacatc cacgacgata gtacgccact taccatcaat ttcctgagcg 12180

cgcagtcggg ccttgatgtg tggcataatt aatgccgggg tgtcagagag ttggttagcc 12240

aggttcaacg cgatgttatc aaccatctgc gcttccagct gtgcttgcag ctgtgcctga 12300

cgactggtat actgttcaag ttcagcctga tgcttctctt tgattgaacg ctcaagagat 12360

tcaacatcac gctcacgacg tgcgcgttct tcttcagcga ggcgagcacg ttcagcttct 12420

tttttcttct cttcgagaag ttttttggtg tgctgctcca tacgctgttt ttctttgcgc 12480

aggtcttcta attctttcag cgttttttcg tctggttcaa catccaaacg aaacgcaccg 12540

gacgcgtcgt ctttgatata caggccacgg aagccttcat caacttcgtt aaggtcagtt 12600

acaactgttt taagtgccat aattttacaa tcctatatga gaggggctca atccactcaa 12660

gtgggctccg aacaggtttg ggtcaaaccg cgcagccagc catccgaaat ccactgagcc 12720

ctgcagactc tcgtggccgg ctgttgcgcg gttgacatga aggattatat agccaggtaa 12780

aacgaaagta aatagtttta ttcagttttt tctggattat tttcctgccc atcgctgttc 12840

ttagctgctt gagcgttctt ttctgcttct tttgctacct cacgcgcatc gcgttcagcc 12900

agctcttcat caattagctt cttggcttct tcatcggtga gcttagcaat gccagcttgt 12960

ttaagattgc tacgcatttc actaaacgtg atagcaccgg caatccattc attaaccagc 13020

tgctgacgtt cttgataagt caactggcta tagatgaagt tgtagctgag gttaatcgta 13080

atttcttctt tagggtgtcc gtagaacagg ccacaccatt cgattgcctt acgataagca 13140

gcttcaacgt tctgcgcaac agttacgata agcgaagctt cagacgccgc ttcattctta 13200

atctcaactt cgcgtcgttc taccttacca ttctcacgaa tcagacgagc accgattgca 13260

atcatctgtg cttctttttg cttcatcgct tcaaacggct gggtgttagg gttggtctgg 13320

ataataccta cagcggcgtt agccggcagc ggaataccac caaacgaacc gagtcgcagt 13380

tcacccttca gaacatcttc aacccatgcc tcagtaagac cagacgccca tactgtgggt 13440

tgacctgtta cgaagcatga ctcttcgtag tcagcagagt tacggtagtg tgcaatatta 13500

agcacagcta agtcgtacat cggcggaggg tcaatctcag cgctgtttgt ttcagaacca 13560

ataaactgga acggaataaa cttcagcggt aagccattgg agtcgcgtaa gacaacattt 13620

tcctgcgtga catacaacgc accaccggag acgttctgcg cattcttgtc gcccttattg 13680

acccacaaag actggttgca attgccttct tcatccaggt aaaggtgacg ccacacgggt 13740

gtgtagtctt gctgaaagcc atcagtaacc cccggtatct gttcgcaaat gacaacctga 13800

gtgagcatca ctttaccgtt gcgatactct tctcgccagt ttataatctg ccatggcata 13860

tacagcgtta cagtcggctg tacatctccg tccatcagct ctttacgggt aaagccaatg 13920

gactcgccaa actcaccgat acgtgcttta gggaagtcag tcaacagacc cgctcgacca 13980

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tcgatattta ctttcagcac ttccatatcg tcaggcatca acatctcagg ctgctgctgg 14100

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cgcaggtacg aattgtaccg catcaggttt tcttctgtgc agttcgtagg gtcaggacga 14220

ggcagataaa aatcaccgcg tgctttaaca gcttcctgac cctcgatgca gtccttaatc 14280

attcggtact taccagcgtt cttagtcagc tcaggacgct ggtatccgac gttaggcgtg 14340

ctgcttgggg ttatcgacat tttaccgtcc catatttatt ttgagcttgg tagtataacg 14400

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gtcgacatct tccgtgttgt tcttgtcacg cggcagaacc ggcaacgtgt ttatggctgc 14520

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accacgcgga ataaagtact cattgccttc gtcgtctgta agcgaggcac catttgcaat 14940

agcccagata ccaacagaga acgggtgagt agaaccccag tcaagagaac gttcgatagt 15000

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cgcaccacca gcaacaatat cccagtcgcc ttccttcata gcagcaacaa gagccgggtc 15120

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accagggttt gacccacaaa agatgagtgg cagtggccgg aaaaagttct caggtacttt 15360

gagagcaccg agtcggacac ggttacgcaa gaagcggtac atcgtttctg tgaagtgagt 15420

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gtactggagg tgacagagtt tgatgttcgc accgttccag aatttaatcg tgttgctcga 15540

gtagttaatc ttgcacttgc cagctttgca cataccgtcc agcaaggcag gataacttgt 15600

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acgggttttt ttaggttttg ccatgggtat cgtcctcgtt aatccggata gtcgggatta 16140

taacgagtta cgcgaagtaa gtaaacagaa tataaaaatg gagtgtctag agagatgatg 16200

agaaagtcta cagtagaaag gcgaataagt agcttatata gatgaagaac tagcttagac 16260

gcctttagat ttatccggtt tttaggccat ttctaccaga aacgggaacc atttaccttc 16320

gaagtaaccg cgctcatcta caagaaaagg cattacctct tttccgtact taataacgtt 16380

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cgtaaatgaa gaactgctta ctcatcataa ccagctcatc aatgaggttg tcatactgat 17400

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gagatttaag gaactcaata agtgtacttt taccagcatt atcagggccc tcgattatga 17760

tgttcatttg tgtaaactcc tgtatcgttg tatcagaact tgtttgttat caacatattc 17820

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ggagctcttc gtgctctttt tcgctacaaa cgatagccaa ttgaggcgga tatggctcta 18900

attgaacaat tttcataatg ttacccacaa gtaggagacc gtgaggccgt ttgatgattc 18960

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cacctatttc aattgaaatg attactctgg taactattgt gattgataca attaccgggt 19260

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attttggatt gaataattac atgtgaaact atatcaattg catatgagaa ccactctcaa 19440

ttgcaagtga ttatcatttc taaaaacttg cataaactta caaataaaag gtgtacaatc 19500

aagagtgatt ggactattat atatttattg aatgtgatga ccaagtgacc agtcaactgg 19560

tctggagggt attagtatgg tttaatttgg gtaggtagta cttaaccagt caacaggtac 19620

atctggtaga tgtcaatggt accttttgct ctttaacaat ctggtaacat gtttcttgtt 19680

gatagtaaca ctagtaatag tttcaaccag tgactattgg taacagtagt cacaactgga 19740

aactagtaca agaggtgact attaagatgg acaactacac actttggtat gataccaatg 19800

aagggctttg gtgtgtcaat ataaacaatg gtccagttcc agactttgag tcaatggatg 19860

tggaagattg tgttgacttt atccaatccc aagttattaa atatcaggag aaataagatg 19920

aaagttttag aattgtccca agaagaactg gaattattgg ttgaccaatt ggacaccact 19980

ttatttatgg aaagtgacct gttggaatat gacagggaga gtggaaggga tgtcaaagac 20040

caggaagtta gggtcaagtt actccaatca attctggata agttgaagta atttccaaca 20100

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ctgttgagtc tgtaaaatct ggtctgacta ctgaaagtct tgggactatt gtagtgcaga 20280

tggatagtct tcagtacttt gccaataacc agatcattaa gatgattaag tcccttaatg 20340

atgaaagttc tgtaagtgtc aaggactcaa aagaagtgtt ggtcaaggca ttgtttgatg 20400

aactgaacca actggaagtg gaagaggtca aagttgtggc atcaagatct tccaatggcg 20460

gggcccggaa gtcatctggt ccatcaacca aggacacttg ttatctggtg tttaaggatt 20520

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gggaagcaat caaaaattgt gcgacccggg acgtgactga tccggaatac gacgagtcaa 21180

aatttgaggt caagtgatgc cactagtcaa atttactacg gtagaccttg ccaatggact 21240

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tgattgattc aacaatgagg atttgatgaa agtcctcatg attgagttaa cccacaagtg 21480

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gagcggcgcc aagcagaaat acaaagaact gcaagctgct gggattatca acccccgaaa 21780

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attcagggta gaacaactgg actgaatggt atgacgggtt ggacataagt tcagcaaacg 24420

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gcaggtacga gtgttaatgg tgatttggta aagtagcgag tcggtaactc tttattgaac 26040

aggccgactt ttgtaatacc gcgttgcttg caggcatatt cattgccttc ggcgagtagc 26100

ttaataccgt tgcgaatatg ccgcaacagt tttggcttta tcattgagtc tctcctcttg 26160

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gctgtacgac aagctggcga atctgaaccg ctggatggca caagcgaaag ctgaccagga 27120

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taacctgaca ccagaacaac tggctatcgt cgaccctgtt gtgaagacct cgcctggtat 27420

tccgactgta acattcaccc cggcggctac ggaagaagcc gagtaattag acggggctta 27480

gcacaagccc cttgactttt ggagacttac atggcatcag aacgttttcg tgataacggc 27540

aagaagtaca atcttgaaga ccgttataag catcatcttg gcattctcaa gtccgtcatg 27600

cgtactgcag gaatggacga gatggaacct ctttgtaata tccttcctcg cgtacgtcat 27660

atggtacagg ataatgtcgt gctgaataaa gctattgagc aggcacaggc tgagggtgtt 27720

gcatttattc gtgtaaccca caaaaaggat ggcaccagcc tggaagtggt taacagccgt 27780

aacgttacag tcaaggccgg tgatcaatcg tgaagatagc ccatctgatt cttgatgcca 27840

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attgtttgtg tgatgctatt tgcacttctg ccttaaaata aatgtgtacg tcaccactca 28500

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ttgcatgcgt ggatgagacc ggtaactggc tgacctacaa tgaagacgtc ttccgtctgt 28980

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caagctacaa ggctatcacc cttaccagct gtggtactat catccggagt cagacagcta 31020

cctgcttctg acaggtcgag ctgcagaaca gatgcagaac gacgacccga acgtgcagct 31080

cactaaaatc ggttcggacg agtcgaaaga gaagcaccaa gcctggatgg cgaagaaagc 31140

cgctcaagct gagaaaggaa ccagcgaata aaagtgttta cgccatgata aaaagtggcg 31200

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cagtcttttg acccaatccc gaaaggctgg tacaacttca tgattgaaga ggttgagctg 31380

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acttctaccg acttactgga aaaccgtatt gtagctggta aagttggtgt tcgtatcgac 31620

aagaccggtg aatacgatcc gcagaacgat attcgcgaat acaaggcgtc aactgaagca 31680

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cctattttcg tatacggaga ctaccatgca aaagaaaaag atggacaagt gggacaggcg 31920

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tagcgttctt gtggaccaga acaagcgtat tatttccact ggatataatg gtctgcctac 32040

gcagttagac tctataagaa tagtgcctaa tagccttaag aacgctctaa ctattcatag 32100

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agcttaagct gaatcaagct gtgtatattg caatcaacaa gaacaccgat gagatgtatt 32880

ttgaggtggt cgagattgac ttactggaaa gcgacataca actgagtaaa gcggaggctg 32940

ttgtatatgc ggaatctggt ttggatatgc cgaagatttc tgaatcgcct atttggtggg 33000

agtgcaaacc agggatgtgc gaataccatc acctgtgcca caaaggggca atgccagaca 33060

ggaactgcag aacctgccat tacagtaaac cgcttcaggg caaagtgtgg tactgcaaca 33120

agcaccagaa agaactcgaa acaatcgaag agcaattagc ggcttgcgat gagtatcgcc 33180

ctgctgatgt cttcccacag gatgagaagc ccgttaaact ttccttaaaa taaaagtata 33240

catcaccaca aggaagtggt ataatatatg aagttaatga ggagacgtta ccaatgtcac 33300

gtaatgctga agcaagagag gctcgtgaag ctgggctgac tagatttata tcttcttatc 33360

cttgccgtaa atgcggtgga acagaattta aagtagctga cgcttcttgc tggacgtgta 33420

ggaaagcaaa acaaaatgct gttaggtcaa caaaagaagg tagacagtac gccagggacg 33480

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ttaagactga acaaggtaga gcgttaaatc gtgaaagacg aacaagacga agagttattg 33600

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gtcctgttgg ctacgaagtg gaccacatta ttccgcttaa tggtaaattg gtgtcagggt 33720

tacattctct gtcaaatctg caatacttac cagcagacgt caacagaagt aaaggaaata 33780

aatatgagct ttgaggcacg ttggtaccaa actgaagctg tgaccgcttg gtggtcatac 33840

ttcaattctt atagtggtaa cccacttatt gtcatgccga caggttcagg taaatcacct 33900

gtacttggta tgctgatgaa ggatattctt accagctatc cgcgtcagcg tattcttata 33960

ctgactcacg tcaaggagct ggttgaacaa gacgccaaag cgattgttcg tcactggcca 34020

caagcaccag tatcaatcta ctcttcaggt gcaggacata aagacttttc aggtcgtatc 34080

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atattcattg acgaagccca tcttgttcct gagaagtctg aaacaacata ccgtaaggtt 34200

attgctcact tcaaagagct taatcctaag gtaaaggtaa caggactcac agcaactccg 34260

tatcgcctgg caggtggtca cttgctggac tgtggtatat ttaccgacat ctgctatgac 34320

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atggcagatg cctggtggcg taatgctgca ggaacagaac cgcctgaaac atgcgatgag 35340

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actccatcgg tgtgataagt gcaacgctct atactttccg cggtgagagc acacagcaag 36660

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gtatctcctt acgccaccct gccaaaagga ccagttaacg ctggtccttt tttattttta 36840

ccagaagcgt aaaaagtgct ttaccactag agagtgatgt ggtataataa gttatctttt 36900

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catcttcttt ccaggaagta tgcaacattg ctcaaactct tgaacatgaa tttgataagg 37080

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gtaaagaacg ttgggacact ttagaacagg ctcgtcatat tatctggtct acagaaatta 37260

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gcaggcgtta ccgcttttca tgagaagttt gacctcaagc ctgttagtca aggcggtaaa 37380

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aagaaggacg gcgacaaagc tggcttctta gatggtattg tagatttaat ttacattgcc 37500

gcaggtacgt tatacttgta tgaccagact gcatggttca ccaacgaatt tgagtatccg 37560

attctgttaa ctacgccatg cggatttatg gaccgcttcg atgctgacgg ccttattgta 37620

tatgttaagg atactgaaga cactcattgc gaccgtctgg cccagttaat tatccacctg 37680

attacctggt gtgcaaacaa caactggcca cttgacgcag catgggatgc ggtacaggct 37740

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tgtacggcgt gcaatggatt aagccattct ataagaatgg tgttcttact aatcagctta 38280

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ggaacccaca agagatggac gccatggccc ttccgccttg ttaccatggt tttcagctgt 38400

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cagacttacc agataagatt attccaaaga tgtccgtcga cattaagttc cagtcgacta 39660

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ccaagttaaa gtcggtgcta acatcacata tgacttgggc tggcttgcag cagaaggcgt 40200

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ctatatggag tgcaagctca ttccattaat gcttaagatg cgttttgcgg gtgtgcgtgt 40560

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tggcttcctt cacggtcaat tccatcaaat gcgcggtgat gacggcggaa ccgttagtgg 40920

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accactcctt cgtgcttgtt tcgtaccgga tgtcggacac cgatggggat cagcagacta 41040

cgcccaaatt gaatatcgat tcatggcgca ttttgcagtc ggcccgggcg ctgatgagtt 41100

acgagcaatt ttcgcggcta acccggaagc agattaccac aatgttatgg tcgatattat 41160

caaggaagcc tcaggtcacg ttatagagcg taaaccggcc aagaccatca actttggttt 41220

gctatatggc atgatgctta atgctcttgc ccgtaaatta gcaatgacgc ctgaagaagc 41280

ggaacctgtt ctgaaggcat accatcaggg tgcaccattt attggtgcta ccatgaagca 41340

ttatgaagat ttatgttata gccaggggta tgtagaaacc tttatgggcc ggaagacgtg 41400

gttcaacaaa tgggtcccaa aacgtggtgg attcggtaag atgcctttac catttgaaga 41460

agcacgtcag gagtatggtc caaacattaa actggcagac acccacaaag caatcaaccg 41520

agtgctgcaa gggtcgtcag cagaccagat gaagtctgca atgctgaaag ggtatgaaga 41580

cggttacttt gacgtgattg gcgtacctcg cctgactgta cacgatgagc ttaacttctc 41640

tctaccgact ggtaagcaag cagaagatgg attctatgat ttcgtacggg tcatggaaac 41700

tgtactaccg cttcgtgtac ctgttcttac tgatgctaag atagaaagta actgggcaga 41760

ggcacactaa ttaaaggtct ataatatgtc taagataggt ttagagtatg aagtagatga 41820

aacgcttaag ttaagggcga aggagatact agacgcctca ggctgcacgt caggcctgga 41880

ctggtttatg aagatattcc aggaagaacc agaagctgtt gccaaaaaga tttacaagag 41940

cgatatttta cgacaggata ttcctgtgct gtgcttccag atacgtggtg aggatgattg 42000

ctggacgcaa cagctatgcg acgaattaga aaccctgtat tgtgaagaag agggaaaata 42060

atgattgaga ctacgcgcac atcggacatt actgatatgg cttctgaagc tgagcaagtt 42120

gcccgggacg cagcgctgtc gaaccgtgta agatacacag gcgtaagccc actgacgtgc 42180

taccagtgtg gggaagacat tgaagagaaa cgacgtcagc tcttacccgg tacagtattg 42240

tgtgcatcct gcgcgcagta taacgagaag aaaggaaagc gataatgaaa gtagatttta 42300

aagaagttaa tgctcttgtt gataaactgg agtatcattt ctggcaggta ccgaatacaa 42360

ctgtaactgt atgtgtggca acactggatg gcttccagtt aggtgtaggt acttctggtt 42420

gtgttgaccc tgcagagttc aatgcagaca tcggcaaaca agtagctcag gacaatgcgc 42480

ttgcacaggc taaagaccaa atctggttac tgaagggcgc tgctttacgc gctgatatgt 42540

tcccaggctt cctgcaggct taatcaaata aaggggccat cactcggccc ctttgttact 42600

ccagttaatt atgctgtcca tcttgtctgc acaatcatca agagctgttc cacgttcaat 42660

agctaactga cctattgcct tccaggtgtt acctgttaat tcaggcttat ggcatttaac 42720

caggtacgca ccaggcggat aaaccttgac taccctgtca acataaacaa cttcaggctt 42780

atcagcgcat gagttcaaga acggcagaag gagcaacggt attagcgcac gaatcatatt 42840

ttgtcgcttc gtcatattta cccttcttat cacgcagttg ttgttcaagt tcagctatct 42900

tactggcgcg tttggctgag gcctcacgtt catcctttac agaattaatc agcgtttgat 42960

tagcagcaga caactcgcca ttagtcttgt taagctgttt gattataccg tcgcggtcgg 43020

taatatcgcc tttcagctca cgtacccaca aagacaggaa cacaatggcg atgccaagaa 43080

taactgcaat tattgcaccg gttttagaca taacgccttt tccttttgct tacgtattgt 43140

caagcccctg tacttaccac ccatatccca gtccgttatg cggttacaca tttcagtcca 43200

gttttgttta cgagcagcag tatatatttt ggtaggtgaa ccatccttgt tcttacggag 43260

tctagtgcaa ccatggttaa ataccataga ggtcatggcg ctgaactggt tcgtgttcat 43320

atctttaccg tggaaccagt cattaacaca tttttcggcc tcttgaatat tcttgaccca 43380

gcggtcagca atctcctggt ctgtcaggcc ttcgcgccgt acagcgggct catcgctgta 43440

gatgcggcta ccaatgccaa ctgttaaata accagtaggg catacatacg ggttgcgcat 43500

acaaccttct gcattaccga ttatttcaag accttcttta ttagtacgga catgcgtact 43560

cgtcatcgac aatacaagcc cgatgatagc cagcacgctg caacctcctt tagtcgctgc 43620

tgatttcaga ctcacgcaac acctcttctt tcgatgcgac ttcatcctct atcggcttct 43680

tacgattgta ataatccgac ataattttgg ttcgccgtgt ttggttatac gtaacaacaa 43740

tcagcatcac caaggaactg agtataccga taagagtacc ccaatcactt agtgataaag 43800

tacttactgt tattgttacc caagccacaa actggccaat aagggaagac ttgtcgttgt 43860

agtcaaacat cccatatctc cggtttattg tatacccaga gtggattata gcacgactca 43920

agcgtaaaag aaacactacc agcaactgca caagcttgct ggtagcaatt agttacggtc 43980

gtacaggcca gtcgatatgc ggcgcatctg acataacaag cagcaacaaa tcggcacgga 44040

atttatggag agcgataata cgttcctcat cttcttcagt gtcgagttgt ccttcaaccc 44100

aagcctgttc ttcctgcagg cgttcttctg caatcacctt ctgcagttca gagtgcttaa 44160

caaacttgcc attaacgtac gaccattcgt aatagcaatc cgcaaactta gcaacaggga 44220

cagactcaac aatatgcaaa tcgcaattaa caggaaacag tagcgtagga tcgttagcat 44280

acgcggcaac agcattgtac ttgtcaacaa caatgtaatg aaccagctct ttattcttag 44340

ccagctcttt ggccagcttg cgccagtcat taccattgtt atccttgatg aatacaacgc 44400

cttgcttaat cagcggaagt gtctccgccg tcctttgtgg gttgtattct gtaaagttga 44460

aaaatgacag ttgcatggtt tactccggca taggtggaac aaccatagcg gaaccaaggt 44520

taatgtcaag acgattgaca gcaatcctgt aatcacgcca tttagcaaat agctcttttt 44580

cttcatcggt agcattgcca ctatcaactg tgtcacgtaa aacactgacc ttggtcgaag 44640

cgatggacag agcttgttct ttacgctcac gggcaatctc cttcatcatt ggtgcgttaa 44700

gcgtaaactc tttaccgtcg aacagccatt cgccaacagt ctcgaagatg ttgaaaggcg 44760

ggtcatacgt taccaccata tcgcaaccca caggatggaa catagttggg tcggtatgtg 44820

cagcaattac aactccgttc ttatctacct gcaagaacgt tgcgccttcg tatttgacag 44880

cgaactcttt tgcgagattg taccagtcgc gaccttcctc atccttgagg aagattgcac 44940

cagcatttac aatgttctcg ttctcttctg ttacctcagg atggtacatg gtaaagttac 45000

ggaacacctt atgcttagtc ataataaacc tttacgatac gttgcttacg ttaatccaag 45060

tgccgttgat ataatactgt aacggcgctg accagtatgt accaccgcgc agctctttct 45120

tattaccgaa gcgccagcca gtcattacat gcccaggata gaacgttgac tcggatacac 45180

cagcagcaat acgagcgccg agtcgaatac cccgaacgtt accggctgaa gtatcgatag 45240

gctgcgggtt gttaggtgaa tatactctaa caccattctc acataaaata aagctatttg 45300

tggtagttac tcggctatta aggccatcca cctgcaaagc tactgtacgg cggtcggcaa 45360

taccaccagg gcgacatacc gccatgttaa tctgtgtagc accgccagcc acaaggatgt 45420

gttggatgtg cgacataggt acagatcccc agcgagcagc agtgacaaca ttactgttag 45480

ccgcgacaga aactgaagtc agcaactcct gaacagcagt accacctgcg atgttaccag 45540

aatactcgac agtacctacg ccggcggagt tagcagcacg tagcaagtcg gaagtagtac 45600

gtgcaatatg caaccagccg acagtaccta agttgccgcg gattgagtca gaaccatcca 45660

tagggatgaa gtcctgatta atacccagct cagaggcagt aggtttattg tcaggcccgt 45720

aagagtatga ccatccgccc caggtattat taaccttctc gcgcatggct attacgcgct 45780

tacctttagt gcgtccccac tgtgaagcgt ttttcgcatc ccagttgata tgcagaatct 45840

ccgtctcaac gccgttagta ggtccgcccg tacctgacgc tggaagctgg tagataccgt 45900

cgtttacaat gctgttagca ttagtaacta cctcagcgtt gccgcctaag ccaaatgcac 45960

cgacctggat cacgttacca gaggctttac caacctgtcg tgctgcagca gttgccgcag 46020

tcaggtcgag tacagggcgc cactgcgtag ggttagcaga cggtggcata ttaatgttct 46080

gcaccagaca acggtacagc atattgtcgg cgttaacttt aaccagtgca ccaaccgggt 46140

aggtctcagt ttctacccat gtatcaacac cctgctgaag gatgtagtgg atacctttgt 46200

cagtacggtt accgataaag ttaaaccact ccatcggagg aataccttcc gagtagccaa 46260

gggttgcacc ccagccacga gcaaggtcac cgaacggcag cagttcacca gtacccgcgg 46320

agctggcgaa gatgtcgtta tcgggtcttg tttgtacatc agccatatac attcacctgt 46380

gctggtaagt ttacagtagc gtaacggtac agactatccg tgacgtcaac gctcgtgtta 46440

agttcaatct tcacccctgt ggggcgcgga agtatatcgt agttctgaat cagcacttgc 46500

ttaagtggtg tcagagtact gtatatctcc agagtcattg tcatatcttc gttgtcagtt 46560

ataacgaagt tattcatccc gaagaattca atcaggaagt cgattaaata cggcatagta 46620

ccgtcttgca tgttcttcca gattttcatc ttgatgtaag tacgcaggtc aatgtcgtca 46680

agaattaccg ggtcccatac tgatgcgccg tagcgataga acgggccacc tttattacca 46740

gacgaaccac cgaagccaag cacgtctggt actttgttgg taaagccgaa gaacttacgg 46800

tctacgcctt tcttgagaac acgagatgcg ccgacgcggg ctgcaacatt atcaagacct 46860

ttaccaaaag ctttatcaat attaaggcta tcaacaactt gttgggcacc gtcccagata 46920

ccttgaattg catcatcgaa gcccttaata gttgcaacag cttttggctt atcagcgtac 46980

tgttgaataa gtagtttatg atattcagcc atcagcattc accactgcaa tagtgatacg 47040

gtctgcagcg aatattgcac gctcaagagc agtgatacgc agaatcgtat ctgtcgacgg 47100

attagctgat ttacccacaa agaaagtctt gatgtagaag ttagggctta cgccattcgc 47160

ttcttgaatc agctgaccca gttcgtaggt tgatacctct tcaccgatat tgtatacctt 47220

ggacagaata gcattcttaa taagttcctc ggaaacgtcg gtaaacagtt ccttacgggc 47280

tacaacaagt gaagcataag cctcaacata agtaggctga ctccatttca ttgtgcgctg 47340

tgtacctgac ttatccgtaa tctgataaga cacagtgcca atctgcttac agccattagt 47400

cttacgacgg aagatacagt cagcaatagc agcaggcgaa ccaccatcca caacaatctg 47460

catactgtga ggaggtaagc cagttaacgg gtcccgagta tcttcttcgt tctcgtaacc 47520

gttacacgcg ataacatcag tcatctgacg aatctcagca acaataccgt ctaagctgtt 47580

cgtgccaggt ttgccgtaag agttatacgc acggtctatt gcctcagagt cgagctcagt 47640

ggacgcaccg ccagacgaca cttgcatgtt ggtaacttta cgcacaccag aaacgatggt 47700

ctgtggttta agctcatcgt ttgcaagtac gacaaagcgg ccagtcttaa cagaactgaa 47760

gcttgtttcg actacaccgt tatcatccag cgcaacagtg gagttaagct ggtacacgtt 47820

attcgagctg tcagttacgt agtaaggggt acgtataata gtgttacggt caccttcaat 47880

cttaaccctg gtcaacagcg ttgacatctc acctttacgc tgaagcgcta cgtaggcaag 47940

gaactggtct acgtatacac cagatgcctg gttagggtca agcatagaaa acagaattgc 48000

aacttgctcg tcctggtctg caaacatctg cgccagaata ccaaccattt gtccgtcagc 48060

agacttagct gacaaatcaa tatccgcgcc atacacacga cggaagagcg tttcgaatct 48120

gctaatccag tcgtcgagct tgacgggaac atagcctgtg ctagttacag agcccatcag 48180

ttttctccgg ttaaattaat acttctgtta atagaggttg tgttgtggta aatatcatta 48240

acctcaaccg aataaacagc gtgacgtgag tcagggtcga agcttagggt aaagctctcg 48300

atagaactaa ctccatactc cgcaagtatt gctgtcttga ttgcagcctc caggtcagcc 48360

catcgaacag gcttctccat tagtccgaac caatcaatgc catagtccag gtcatgtacc 48420

cagtccatag tataacagcg gagtatctgc acgatgcgtt gttcaatgga ctcagacgta 48480

tcggcgtagt caagtcggcc acgcccaaaa ttccagtccc agtttgaatc gagtcgtctt 48540

gttcgcattg tgggttacct agttttgcgg gccattagta ataccgccac cgtcaccatt 48600

ttcttggtgt ctgtgtttgg acatcttaac gccgccaatg tcaacttctt taaacttggc 48660

cactgtgttt ggtgcattaa gtgttggtgt atcaagcaag tccactgctg tagcctttat 48720

cgataccttg ccagcattat taatattgat atagtgactg ccgtcaacct tacggatagt 48780

tacaccttcc atccagtttg ttatcttcag aggcttaggt ctgaagccca caagacagaa 48840

gcagtcagac aggtcattct ggcggaagtc acctggtata gcgttttcag ccagctcgta 48900

ccatacgtca atacatctgt cggcaacaag aagtaagcac gggtcgcctt tctttggttc 48960

aagcgttata acaaaatcac caccgcctag ctggaacaaa ggaacatcag ctgctggtgg 49020

tagcggtctc attgaaccat cttcgttttc ggcactaacc ataggttcaa caacaacagt 49080

ctgtaggttg ctgttaaacg atactatgcg gccaggtaaa cagtggcgct taccaatcat 49140

tgcagcaaac agtgcagcct caatggcctc gtcaagtgtt gctgtgttat agtcaatagc 49200

tgacatcagc tacctccgcc tactgtattg tcaacaccgg gttcagtaac atagtcgtac 49260

tcaatctttg acagtttgcg tggcttcttg agtcgacgaa ctttcttcgc aaactgtcca 49320

ccgagaaccg tcaagtcagc acgccacggt cctttcggtt tattgtcacc ccgaaatctt 49380

atagtgtcga ttttatactg tccgttgtac tgtgtaaaca tagaatttac ttgtacaaga 49440

ccaccgatgg ccagagaagg attcaggttg caagtaacct caagaccttt gtctgtgccg 49500

cgaggagcac caatcatgcc agacgattct gacagcacaa caacgtcgta gtcagtaaca 49560

gagtcgttag gaatgatatt gagtttattg tcttgtatag accaggtagc cttgttggca 49620

gcagcaacct ggtcgagtat gctgtgcgtt tgtccgaaca gagtacgtgc tctcaggaaa 49680

gctggtttgt tgctgtcaag gcagacgtac ccttcttcaa cgtttggcat gctagccagg 49740

caaacgtcaa caacactgtc atacgtagaa ccagcagcca gcgtcgtatt aacaaagcca 49800

tcgttgtaag atttacgggc atcgccacat tcgagaacag tctgaatgtc aaggccgttt 49860

cgttggtcgt tagcacgagt aatatcgcct tcgaatatca aacgataaac tatgttgtca 49920

agaccgtaac ccacagagag acggacgtag tcccaggtac ctgacgccaa cttataacgg 49980

ttggattcag tcaagttaaa cactgtgatt gtcgctttat ttggatgctt cgtgttaccc 50040

ttttgaatgt caaaggtaac acgaagattt gagatgatta tgccttcatc tttaccgttg 50100

ctgacctcaa gctttaacgc gcggccaaac tgacgggtag gctgttttgt cgacgatgta 50160

gacactgcaa cgtcctccca tgtcatctgt agtcatagga ccgatgcggc tggaggattt 50220

gtcacttacc agcaacgcta tacgcgtgtc ccagttacca aaagcaatac gcccatattg 50280

taaagcataa ctggaacaaa gtacagcatt acttgatatg tcagtcactg tagcttgcca 50340

gagctgacct accgtgttat agtacaactc aatgttatac gtatatccag cgatagaaat 50400

tgatattgat tgcttacctt cggaggtagg ttccaagtca taaataccag aaccatcatt 50460

acctataatg tcaaggaaag cagttgtggt aaatatcatc agaatatacc ccgtaagtta 50520

aagccaaaca tgtcaccgag tgttacacca aaaccgcggt tatcgtttac acgtttctcg 50580

ctaatcggtg tagttgtgtt tatgtccttc ttactggtgg catcaccctg accttgtgca 50640

cgtccgcttt tcttagtgcc gttattagca gggcgccctg tcgacttagc ggctacagcg 50700

tttgtaacta caatcggtac ttcaatgact tcacggaacg taagggtaaa cgtagctgaa 50760

ccatctttct cctgcacaac acgaacagac ttcaaaagca tattcgtata cttgaagata 50820

ccagtatcaa cgtcacagta aataacgttt ttctgtaaat ccagcagtgt acggtatacc 50880

tgttcaatcc tcatgttgtc agaagactta agttgttcag ctatactaaa gtcaggaagc 50940

catggaacta aagagcgtga aatggtggcg tctaaaccgc cccagtctat gaatgagact 51000

agcttgttaa cagcaaagtc ccttgttcct tcgaggacag tagacactac ctgtggaagc 51060

tgaatatcat ccaagaaatc catagaccgt aagccggtta cgtcgttaac tgttgactct 51120

tgaatcgact cgtcgatata gccaactaca acaccagtta cagtaataac ttttggttgt 51180

actgcagcat ggtccgaagc cttagccccg gactcaagtt cattgtcagc gatgtcaagg 51240

tcagactgat gctcttcatt cgtgacagca tccatcttaa tacctccgca gttgcggaag 51300

cgtaaggtgg ttgtaccgtc gcccatgagt ctgtcacggg cgtcctggta caagttattg 51360

gcagcatcag taattccagc aaagatgtca ctcattgtgt taccgccgtt ttgttgttag 51420

cccttacagt agcgttctct ttctgcgcct gtttgacctg gtcgttgact tcacgaccta 51480

cttcttgtgg gttctgcaca ccggtaatag tagcatcaac tttaacgcta ttatcctggt 51540

ggataacagt tgcgttctgc tgctgctggc tttgcttagc agtatttatg gctgactgca 51600

tagcctgacc gccagctgtc atctcccctg tgatagggtt gaagttacgc atagaccagt 51660

taagtgctct gctccagaag cttccgccct gctcagtggt aggcgacaca gcattaacag 51720

tagcctcagc acctgtcaca agtttgttgc cagcaaagcc aagcgtagaa tcgagcttac 51780

caaacaacgc catcaggaac ttaccgccag gcagctgata aagcgcttca gacaaccaca 51840

gctttatttg ctctatgcct tgcttaactt cgcctaggaa accttgccac cagttaccga 51900

gtttattcca taagcgaccg tcaaatattg acagaataaa gtctgcaata actacgatat 51960

actgcttgac aattccccat gcggctacaa catcttttga ccacttaaca actgtctcac 52020

gtcctgccag cgcatcatca aggtcagcga gtacagcaat aactgtgccg atagccagta 52080

caatccacgt gagcggattc ataagtattt tggcagctaa acccacaaag gcgttgccga 52140

ccttagttag cacgggaata agtgccagca gtgcgtatga ggttattgca accattaacg 52200

ggaagttatc cccgataacg tagataagtc gttttacgtt ttcaattgta ttgaatacaa 52260

cttcgtcgaa ctttctaaat gccgcagtaa gtgtggtatc gttaagcact gctgtgagtg 52320

acttaaccat acttatcgcg cctttagtta cctcatccca tactctggtc tgggtaatct 52380

tagaacgagc agcataccaa attgtgctca ggttagttaa ctgcgctttg agtgtctgtg 52440

acacttcgtg ggcaattggt tttaaacgtt cggcttcttg tttgagcgcg ctagtcagta 52500

tgtcggcagt gatttgcttc tgccgcatca tatcctgaag ctcgccgagc ttcttaccag 52560

tgtagcggga caatgcgccc cagatgtcaa caccggcgtt aatgaactgg ttcttttcct 52620

ggccctgcaa tgaacccatc gcagtcgcct ggccatacgc aacaatggta cgtgccaaat 52680

caccgcctgt tgcagcagtg attgttttga gcatttgtag cgaaccgttt aacgggtcaa 52740

cgccatacgc tttaagttta gtaaagccgt ctagtgcctc ctggaatggt gtacccattt 52800

gcagagacat atccatcagc gttttccacg tcgattcgac gtcgtagccg aagcctttaa 52860

tcttggcggc gagtacgtca gcctctaacg caggcgcaaa catcctaccg agcgccccag 52920

cggcgcgctc agcaagattg atcacatcgc cgagggtaat cacaaaacgg cgggacagct 52980

ggtcgaagag gtcaaagcca gaactgtcgg ctttactctc aagcgttacc agaaagctat 53040

cgattatggt cgccatggat ttcctctaac tcggcatagt ccagaatagc aatatgcagg 53100

tcgcacaaat cacacaagct gtaaga 53126

Claims (8)

1.一种大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1），保藏编号为CCTCC NO：M2018936，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

2.根据权利要求1所述大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1）在pH3～pH11、在4℃～37℃条件下具有耐碱性，MOI=0.1条件下培养6h，其效价为1.4×10¹⁰ pfu/mL。

3.根据权利要求1所述大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1）的基因组序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1 所述大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1）的结构蛋白相对分子量为43kDa。

5.一种含有权利要求1～4任一项所述大肠杆菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物进一步含有大肠杆菌噬菌体CL6（Escherichia coli phage CL6）或大肠杆菌噬菌体CL7（Escherichia coli phage CL7）中的一种；所述大肠杆菌噬菌体CL6的保藏编号为CCTCC NO：M2018932，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，所述大肠杆菌噬菌体CL7的保藏编号为CCTCC NO：M2018933，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

6.根据权利要求5所述大肠杆菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物同时含有大肠杆菌噬菌体CL1（Escherichia coli phage CL1），大肠杆菌噬菌体CL6（Escherichiacoli phage CL6）和大肠杆菌噬菌体CL7（Escherichia coli phage CL7）。

7.一种含有权利要求1～6任一项所述大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。

8.一种权利要求1～6任一项所述大肠杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体组合物或权利要求7所述的试剂在制备治疗大肠杆菌引发的仔猪黄痢、犊牛腹泻、奶牛乳房炎疾病的药物中的应用。

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