CN113430176B - 一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体rdp-sa-21004及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体RDP‑SA‑21004，保藏编号为CGMCC No.22483，对全基因进行测序后发现，不具有毒力基因和溶原性基因；该噬菌体在4℃条件下保存10个月，其活性保持在10⁸pfu/mL以上，具有较强的稳定性；可高效感染宿主菌，其最佳感染复数为0.1；具有较广谱的杀灭沙门氏菌的能力，同时对大肠杆菌也有一定的裂解能力。该噬菌体既可以单独使用，也可以和其他沙门氏菌的噬菌体和益生菌复配使用，可以有效治疗和预防降低禽类沙门氏菌病。

Description

一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004及其在禽类动物致病性沙门氏菌感染中的应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella pullorum)属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，是沙门氏菌病的病原体。广泛存在于自然界中，迄今为止已经发现1000株左右。大多数脊椎动物体内均可分离到沙门氏菌，其主要寄生于人类和动物的肠道内。菌体大小为(0.6-0.9)×(1-3)μm，一般无芽孢，也无荚膜，多数有鞭毛，抗原结构和生化特性相对复杂。

沙门氏菌种类繁多，根据细菌表面的抗原所定义的抗原特性，已经描述了超过2500个肠道沙门氏菌血清型。由鸡白痢沙门氏菌造成的家禽感染是家禽养殖危害最大的细菌性疾病之一，能够引起家禽高发病率和死亡率。除此之外，肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等都是家禽易感的沙门氏菌。沙门氏菌极易在养殖场中进行水平传播和垂直传播，所以净化家禽特别是种禽养殖中的沙门氏菌病能极大地提高养殖效益。

沙门氏菌属中有人类致病菌、兽类致病菌以及人兽致病菌。感染沙门氏菌后，一般会出现胃肠炎症、发热、腹泻以及败血症等临床症状。当前，世界范围内的食物中毒问题中就有沙门氏菌引起的食物中毒。沙门氏菌可以不通过宿主以直接或间接的方式在动物之间、人与动物、人与人之间传播，而其主要的传播途径就是消化道。动物在感染了沙门氏菌后，繁殖力会受到影响，生长受阻，甚至会病状加重，死亡率升高。

由于抗生素的不合理使用，引起了细菌多重耐药性、药物残留、食品安全、环境菌群不平衡等问题，严重威胁人类及动物的健康。因此，寻找新型抗菌药物及治疗方案已成为当前的研究重点。

在畜牧养殖等方面，使用抗生素免疫造成免疫失败，兽药残留问题威胁着人类的身体健康。面对这样的挑战，噬菌体疗法已广泛应用于医学、畜牧兽医、食品卫生等各个领域中致病菌的防控。在农作物种植方面，研究者尝试将噬菌体用于马铃薯、柑橘，商业化的噬菌体制剂在农作物中大规模使用。在食品工业中，其表面细菌生物膜形成是食品工厂的主要问题之一，而形成生物膜的细菌对恶劣的环境条件、抗生素和消毒剂具有很高的抵抗力，噬菌体有着良好的治疗效果。

噬菌体具有特异性强、毒副作用小等特点，展现了良好的杀菌作用，同时具有良好的生物安全性，在防控细菌感染方面具有巨大的潜力。

特点优势：(1)特异性强。噬菌体具有独特的杀菌机制和高度的宿主专一性，是广谱抗生素无法比拟的优势，以致病菌为宿主筛选的噬菌体，不会对人及动物体内的其他正常菌群造成威胁。(2)相较于抗生素，噬菌体不易产生耐药性。噬菌体具有很强的降解生物被膜的能力，而生物被膜增强了细菌对抗生素的抗性，可使用噬菌体消除生物被膜来裂解多重耐药菌。(3)安全性高。噬菌体由核酸和蛋白质组成，降解为氨基酸和核酸，分布广且易分离筛选，与抗生素不同，噬菌体是人和动物正常的共生体，摄入噬菌体是一种自然过程。大多数研究表明噬菌体治疗细菌性感染有很强的安全性。(4)噬菌体个体微小且增殖能力强。一个噬菌体感染一个细菌后，可产生100个左右的子代噬菌体，渗透药物无法穿透的区域，通过一种“自动给药”的现象来确定剂量，避免在治疗部位重复使用噬菌体，单次给药就可达到理想效果。(5)噬菌体分布广泛。噬菌体存在自然界的各个角落，包括土壤、河流、污水，凡是有细菌的场所就有相应噬菌体的存在。在健康人体和动物体内(胃肠道、口腔等)的正常菌群中也广泛存在。(6)易筛选易获得。筛选纯化新噬菌体周期短，几周或几个月。通过人工培养细菌，扩增并过滤除菌，纯化制备高价噬菌体即可获得。综上，噬菌体作为抗菌剂具有特异性强、安全性强、不易产生耐药性等优势。

噬菌体治疗细菌性疾病具有很多优势。例如起效快、2-4h就能杀死病原菌，缓解症状，改善养殖动物的精神状态；对养殖动物安全，噬菌体特异性强，只能杀死相对应的病原菌，对动物肠道有益微生物不会有副作用，因此不会破坏肠道菌群，而抗生素在杀灭病原菌的同时，会导致微生态失衡，引起机会性感染甚至更严重的全身性感染；环境友好，噬菌体是宿主依赖性的，只有在宿主存在时才会发生作用，随着宿主的死亡而死亡，不会在体内残留；防止细菌耐药性，噬菌体作用机制与抗生素不同，治疗效果不受细菌耐药性的影响，基本没有副作用，长期以来，噬菌体在人体、动物、食品中的应用已经有了悠久历史，具有良好的治疗效果。

本发明在于相应国家全面禁抗的号令，解决细菌耐药性，抗生素滥用的问题，从禽粪便中分离纯化出一株裂性沙门氏菌噬菌体，为禽沙门氏菌的防治提供更多的可能性。

发明内容

本发明的目的在于提供一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004，旨在解决养殖场禽类因感染沙门氏菌，发病急而治疗不及时，且因致病菌耐药性而导致用药无效等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004，透过电镜观察，该噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约57.259nm，有一个长约112nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。经基因测序发现，不具有毒力基因和溶原基因，该噬菌体于2021年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22483。

进一步地，该噬菌体在4℃条件下保存10个月，其活性保持在10⁸pfu/mL以上，具有较强的稳定性。

进一步地，该噬菌体RDP-SA-21004可高效感染宿主菌，其最佳感染复数为0.1。

进一步地，该噬菌体具有较广谱的杀灭沙门氏菌的能力，同时对大肠杆菌也有一定的裂解能力。

本发明还提供了沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的药物中的用途。

本发明还提供了沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的饲料中的用途。

本发明的另一个目的是提供一种用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，包括有效量的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004。

本发明的另一个目的是提供一种用于抗沙门氏菌的抗生素，包括有效量的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004。

本发明的另一个目的是提供一种预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的添加剂，其有效成分包括沙门氏菌噬菌体RDP-SA-19009。

本发明的另一个目的是提供一种清洁剂或消毒剂，包括沙门氏菌噬菌体RDP-SA-19009。

本发明的有益效果体现在：

(1)本发明发现并分离了一株禽沙门氏菌，并以该沙门氏菌为宿主分离得到了噬菌体RDP-SA-21004，该噬菌体RDP-SA-21004对养殖环境中禽沙门氏菌具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽沙门氏菌的防治提供了良好的噬菌体来源；

(2)在本发明中，噬菌体RDP-SA-21004在pH为7.0时，噬菌体效价最高；在pH4-11的范围内效价均处于较高水平，可见噬菌体RDP-SA-21004能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性；本发明得到的噬菌体在30-65℃效价稳定性较强，可高效感染宿主菌BS-20079禽沙门氏菌，其最佳感染复数为0.1；

(3)本发明得到的噬菌体对宿主菌BS-20079的裂解效率均在99％以上，单独使用时，对沙门氏菌的裂解能力相对较强，裂解谱较宽；而且噬菌体RDP-SA-21004对其中两株大肠杆菌具有裂解能力，此特性显示这株噬菌体具有很重要的研究价值，如全基因组测序统计分析，以研究相关裂解基因，对噬菌体裂解能力相关的分子改造具有重要的意义；

(4)本发明沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004在4℃条件下保存可保持噬菌体处于较高活性长达10个月，表明这株噬菌体具有较强的稳定性，而高稳定性对于生产运输具有重要的意义；

(5)本发明沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、LB培养基、氯游离水等。

(6)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004(Salmonella pullorum phage RDP-SA-21004)，可以有效杀灭鸡肉表面的沙门氏菌并防治鸡肉在保存过程中沙门氏菌的污染，可作为食品防护的各种产品的有效成分。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由沙门氏菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。

(7)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004(Salmonella pullorum phage RDP-SA-21004)，可用于制备组合物，试剂，或试剂盒；可应用于沙门氏菌的快速检测，其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的沙门氏菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度；

(8)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004可以单独或混合使用，用作为生物杀菌剂，饲料添加剂，或因沙门氏菌引起的细菌感染的治疗药物、保健品及医疗器械；沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004可应用于治疗或预防由沙门氏菌引起的感染性疾病；可被沙门氏菌感染的寄主包括人类、家畜(猪、牛、羊等)、家禽(鸡、鸭、鹅等)，以及各种兽类、鱼类、鼠类等；

(9)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004可以应用于工业生产，可由宿主菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，具有极好的推广前景。本领域技术人员可以根据本发明的记载及本领域常识将本发明所述沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004或其组合物制备成应用于医疗，检测，消毒及食品防护等方面的各种产品加以工业应用。产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、直肠、胸膜内部等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。

附图说明

本发明上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：

图1为本发明噬菌体RDP-SA-21004的噬菌斑示意图；

图2为本发明噬菌体RDP-SA-21004的电镜图；

图3为本发明噬菌体RDP-SA-21004一步生长曲线示意图；

图4为本发明噬菌体RDP-SA-21004酸碱稳定性示意图；

图5为本发明噬菌体RDP-SA-21004热稳定性示意图；

图6为本发明噬菌体RDP-SA-21004对宿主的裂解曲线；

图7为本发明噬菌体RDP-SA-21004的遗传稳定性实验；

图8为本发明噬菌体RDP-SA-21004抑菌活性实验；

图9为本发明噬菌体RDP-SA-21004在4℃的保存稳定性实验；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明使用从山东潍坊一养殖场病禽肝脏中分离得到的沙门氏菌BS-20079，并通过实验确定了BS-20079的致病性和耐药性，以BS-20079为宿主，从环境中分离得到一株沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004，并通过全基因组序列确定了RDP-SA-21004的基因型。

实施例1致病性沙门氏菌BS-20079的分离及其鉴定

从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在沙门显色选择性培养基上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的淡紫色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3-5次，然后挑取单菌落接种于5mL LB液体中，于37℃、200rpm振荡培养4-6h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16S rRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性沙门氏菌，将其命名为BS-20079，于-80℃冰箱中保存。

实施例2噬菌体RDP-SA-21004的分离及纯化

(1)粪便处理：从养殖场采取粪便，称取3g病禽肝脏加入10mL SM缓冲液中研磨浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液用0.22μm滤器过滤，将滤出液4℃保存备用；

(2)噬菌体富集：取0.2mL菌悬液和1mL滤出液加入5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，将上清液用0.22μm滤器过滤，滤出液备用；

(3)噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取宿主沙门氏菌菌悬液0.1mL与0.7％的软琼脂混合均匀铺在LB平板上，待软琼脂凝固后将滤除液0.1mL点到平板上，静放至混合液吸收，放于37℃培养箱培养6-8h后，用接种环挑取透明噬菌斑置于2mL SM缓冲液中，4℃保存过夜，让噬菌体完全释放，即得噬菌体。

(3)噬菌体纯化：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和宿主沙门氏菌菌悬液0.2mL混合均匀，加入冷却至50℃左右的软琼脂混合均匀，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，挑取边缘光滑的单个透明斑于1mLSM缓冲液中，4℃过夜保存。取0.1mL过夜保存的浸出液和0.1mL菌悬液混合，加入冷却至50℃左右的软琼脂混合均匀，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化至噬菌斑为大小均一、边缘光滑的噬菌斑(参照图1所示)，即得纯化好的噬菌体。

将噬菌体菌悬液与60％的甘油+LB按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。

实施例3噬菌体的形态观察

取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图1所示。

由图1可知，噬菌体RDP-SA-21004有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约57.259nm，有一个长约112nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。

实施例4菌体基因组测序

通过对单株噬菌体的富集培养后，在4℃条件下8000g离心15分钟，加入10％PEG8000和0.5M NaCl静置过夜，再加入等量氯仿混匀，静置分层后5000g下离心10min，去处氯仿层和PEG层后，加入限制性核酸内切酶消化处理，并采用梯度密度氯化铯条件下悬浮噬菌体，后期采用TM缓冲液透析3次，每次30min，一部分送华大基因生物测序公司进行全基因组测序。测序方法如下：

采用Illumina TruSeq^TMNano DNA Sample Prep Kit方法构建文库；具体步骤为：

1)以1μg DNA起始量建库；

2)Covaris M220超声打断DNA到300-500bp；

3)补平3’端加A、连接index接头(TruSeq^TMNano DNA Sample Prep Kit)；

4)文库富集，PCR扩增8个cycles；

5)2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；

6)TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；

7)cBot固相载体上进行桥式PCR扩增，生成clusters；

8)Illumina Hiseq测序平台，进行2×150bp测序。

该噬菌体基因组全长为39740bp，不具有毒力基因和溶原基因。

实施例5最佳感染复数(MOI)实验

按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。具体参见表1。

表1最佳感染复数测定

由表1数据可知，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-SA-21004的最佳感染复数为0.1。

实施例6噬菌体生长曲线的测定

取对数生长期的沙门氏菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌和噬菌体RDP-SA-21004，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000rpm/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB液体培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的LB培养基中，迅速置于37℃200r/min的摇床中振荡培养并计时。前30min每隔5min取样计数，30-60min每隔20min计数，60-300min每隔30min计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。其中，平均裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌BS-20079浓度。

结果如图3所示：噬菌体感染宿主菌BS-20079后的40min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约50min，感染后50-150min内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为100min。通过计算，噬菌体裂解量约为228PFU/感染细胞，表明噬菌体具有极强的裂解和复制能力。

实施例7噬菌体pH稳定性实验

用盐酸溶液和NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1×10¹⁰pfu/mL，将稀释液在37℃，水浴1h，用生理盐水10倍梯度稀释后铺双平板，37℃倒置培养4-6h后计数。

结果如图4所示：噬菌体RDP-SA-21004在pH4.0-11.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在pH为7.0时，噬菌体效价最高，达到10^9.5pfu/mL；且在弱酸弱碱的条件下仍能保持较高的效价水平，仅在强酸强碱条件下，噬菌体的滴度会下降明显。由此表明，噬菌体RDP-SA-21004能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。

实施例8噬菌体热稳定性试验

将噬菌体原液分装到EP管中，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的条件下孵育30min和60min，然后用SM缓冲液10倍比例稀释后，铺双平板测定其效价。结果如图5所示。

由图5可知，噬菌体RDP-SA-21004具有较好的温度耐受性，温度达到60℃以下噬菌体效价均保持在较高水平，在10⁷-10⁹pfu/mL左右；65℃以后，随着温度的升高和时间的延长，噬菌体的活性发生明显的降低。噬菌体RDP-SA-21004在较高温度下也具有一定的稳定性，对生产和储存具有重要的意义。

实施例9噬菌体RDP-SA-21004对宿主的裂解试验

将培养6h的宿主菌BS-20079悬液以1:100的比例接种到100mL LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养2h(OD约0.15，约5.0×10⁸cfu/mL)将菌悬液分装在6个无菌锥形瓶中，以最佳感染复数向其中3个加入噬菌体悬液0.2mL(约2.5×10⁹pfu/mL，经0.22μm膜过滤)，同时以不加噬菌体的作为对照，取其平均值。在细菌液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。结果如图6所示。

由图6可知，没有加入噬菌体的宿主菌BS-20079，在增殖过程中，OD600在60min内逐渐增加，90min-210min内呈指数形式增加，240min以后趋于稳定。

沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004加入到宿主菌BS-20079菌悬液中，宿主沙门氏菌的OD600变化如下：在前90min，噬菌体处于对宿主的吸附、侵染阶段，OD600有所增加，随着宿主菌BS-20079指数级增加，噬菌体的增长也呈现指数式，随着噬菌体裂解宿主，噬菌体裂解率达到顶峰，未被裂解的宿主菌BS-20079继续繁殖，但由于培养体系中营养物质的限制，使宿主菌BS-20079的OD趋于平稳，整体OD600低于没有噬菌体的对照组。

实施例9噬菌体的稳定性遗传实验

将噬菌体RDP-SA-21004连续传代40次，每代培养基中加入等量的RDP-SA-21004和BS-20079，每代培养时间6h，然后铺双平板，将RDP-SA-21004连续传40代后，测定其效价。结果如图7所示。

由图7可知，噬菌体RDP-SA-21004在传代过程中，效价整体处于稳定，说明噬菌体RDP-SA-21004的遗传稳定性较好，是生产过程的优异选择。

实施例10沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004的裂解谱分析

采用点板法，测定本发明噬菌体RDP-SA-21004对实验室保存的部分菌株：大肠杆菌(100株)、沙门氏菌(50株)、变形杆菌(20株)、铜绿假单胞菌(20株)的裂解能力。

取100μL过夜培养的待测菌菌液加入到0.7％的LB半固体培养基中混匀，倒入平皿中，静置吹干。取10μL噬菌体RDP-SA-21004悬液滴加到平皿上，37℃培养4-6h，观察有无噬菌斑出现。结果如表2所示。

表2沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004的裂解谱分析的统计结果

由表2可知，噬菌体RDP-SA-21004对沙门氏菌的裂解能力相对较强，裂解谱较宽；而且噬菌体RDP-SA-21004对其中两株大肠杆菌具有裂解能力，此特性显示这株噬菌体具有很重要的研究价值，如全基因组测序统计分析，以研究相关裂解基因组学，对后续噬菌体裂解能力相关的分子改造具有重要的指导意义。

实施例11噬菌体RDP-SA-21004的抑菌活性

活化宿主菌BS-20079，37℃振荡培养4-6h。取100μL宿主菌BS-20079菌液和100μL噬菌体RDP-SA-21004原液加入到96孔板中，37℃培养条件下，利用浊度法测定吸光度OD600nm值的变化。其中试验组为：100μL沙门氏菌菌悬液和100μL生理盐水；空白组为：100μL噬菌体原液和100μL生理盐水。结果如图8所示。

由图8可知，试验组在初始6h内的浊度值保持不变且较低，而空白组的细菌浊度呈现急剧上升趋势，说明噬菌体RDP-SA-21004对宿主菌BS-20079在初始的6h内有较好的抑制作用。6h之后，虽然试验组的浊度值慢慢升高，但与空白组相比较，仍远远低于空白组的细菌OD值。

噬菌体治疗过程中，在一个给定的细菌数目的环境中，细菌不会被噬菌体完全裂解，噬菌体的效价也无法一直升高。主要是因为细菌菌落的多样性即细菌菌落中分为噬菌体敏感与非敏感菌株，噬菌体耗尽了对噬菌体敏感的菌株后会为了生存，而转化为原噬菌体形式活下去，不再裂解细菌，因此在培养6h后试验组的浊度值呈现上升趋势。

实施例12不同时长、不同效价噬菌体RDP-SA-21004处理沙门氏菌BS-20079

取2个50mL锥形瓶，各加入50mL LB液体培养基，再加入500μL沙门氏菌保存液，37℃摇床振荡培养4-6h。一瓶菌液放入4℃暂时保存，另一瓶中加入500μL噬菌体滤液，37℃摇床振荡培养8h，12000r·min^-1离心15min，经0.22μM滤膜过滤得到噬菌体滤液。从50mL菌液中取出5mL作为处理前对照，将噬菌体滤液依次进行10倍梯度稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释样品各0.5mL分别与5.0mL沙门氏菌液混匀后，分别在1h、2h、3h后，取样，测定样品中沙门氏菌数量。

具体操作如下：定时取样后，对样品进行10倍梯度稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8各稀释度样品0.1mL分别与5mL加热溶解冷却至55℃的LB半固体培养基混匀后倒入平板，倒置于37℃恒温箱中培养12-24h。每个稀释度平行做3个平板，取平均值。

平板菌落计数规则如下：

(1)同一稀释度的平均菌落数。出现较大相连菌苔，不予采用。菌苔不超过平板二分之一，剩余菌落散布均匀，计算剩余菌落数乘以2即为整个平板菌落数，计算该稀释度的平均菌落数，按照以下公式：

总菌数(cfu·mL^-1)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×10

(2)首先计算平均菌落数在30-300之间的稀释度，若仅有一个符合此范围，按照上公式计算。

(3)当满足30-300的稀释度有两个时，则计算菌落数的比值。当比值小于2时，选择平均值；比值大于2时，选择较小数值。

(4)当各稀释度平均菌落都在300以上时，选择稀释度最高者计算。

(5)当各稀释度平均菌落都在30以下时，选择稀释度最低者计算。

(6)当各稀释度平均菌落都不满足30-300时，选择最接近此范围者计算。

噬菌体的浓度及处理细菌的时间与菌群变化有密切的关系，利用不同效价的噬菌体RDP-SA-21004处理沙门氏菌1h、2h、3h后，分别检测宿主菌BS-20079数量。结果如表3所示。

表3不同时长不同效价噬菌体处理沙门氏菌结果

由表3可知，噬菌体效价相同，处理时间越长，沙门氏菌清除率越高；处理时间相同时，噬菌体效价越高，沙门氏菌清除率越高。当噬菌体效价为7.12×10¹⁰pfu·ml^-1、处理时间为3h时，沙门氏菌数降低率最大为99.31％。可见，沙门氏菌数量随着噬菌体效价增加和处理时间的增加而减少，降低至98-99％时保持平衡状态，噬菌体的降解效率处于较高状态。

实施例13噬菌体RDP-SA-21004在4℃保存效价衰减规律

将噬菌体RDP-SA-21004悬液(SM溶液)与宿主菌BS-20079混合后，37℃振荡培养6-8h，取部分培养液离过滤后用双层琼脂平板法测定噬菌体RDP-SA-21004的效价。将剩余培养液进行4℃保存，并每隔10天测定一次效价。

采用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价，具体方法如下：

取不同时间点的4℃保存的噬菌体悬液进行10倍梯度稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9的稀释样品各0.1mL分别与1.0mL宿主菌BS-20079菌液混匀后，再与约5mL加热溶解并冷却至60℃的LB半固体培养基混匀倒入LB平板中，每个稀释度平行做3个平板，待凝固后，倒置于37℃恒温培养箱中培养4-6h。

对相同稀释度3个平板上的噬菌斑进行计数，取其平均值。以平板上噬菌斑数在30-300个的稀释度为标准。噬菌体RDP-SA-21004以SM溶液悬液形式进行4℃保存，并以10天为间隔检测一次效价。结果如图9所示。

从图9可以看出，120天内，噬菌体RDP-SA-21004效价仍维持在10个数量级，在300天之内，效价维持在8个数量级，仍然符合杀菌作用的最低噬菌体的数量级要求。该噬菌体在4℃条件下保存10个月，其活性保持在10⁸pfu/mL以上，具有较强的稳定性，方便生产和储存。

实施例14噬菌体动物实验

选择高致病性沙门氏菌BS-20079，通过注射的方法，建立动物模型，初始100只鸡，造模成功后，剩余90只鸡，随机分成9组(实验开始时，肉鸡为10日龄)。选择4℃储存不同时间的相同剂量的噬菌体作为实验对象；设定阴性对照——不进行噬菌体治疗，给药7天，过程中观察实验组和对照组的疾病表现，对不同实验组的肉鸡进行解剖，观察治疗效果。如表4所示。

表4噬菌体动物实验

由表4可知，阴性对照组卵黄吸收不良，残留卵黄囊大，呈现绿色，有些雏鸡患有脐炎，脾脏比正常肿大2～3倍，表面有点状出血；肾脏肿大，有点状出血；胸肌有出血点；心包内有黄色浆液性渗出物，血凝不良；十二指肠壁增厚。噬菌体组症状明显减轻，内脏基本无症状，即使储存时间增加，噬菌体的体内治疗效果在四个月之内仍然处于较高水平。

综上可知，本发明所得噬菌体可以用于沙门氏菌引起的疾病的辅助治疗，并且在较长储存时间内仍然有较好的治疗效果。

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

序列表

<110> 瑞科盟（青岛）生物工程有限公司

<120> 一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39740

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

acgtcagcgt ttccttcgtc aagctgtagg actgctggtt cgccaatagc tgctaacata 60

tcgttgatgg cgtctaagtc atcgttagca ttcagtggaa tgtattgagc cataagtctc 120

ctctcacttt aagcaaaaaa cccctcaagc acccgaaggc acccaagggg tttcaattag 180

ttgttggact cagccagttt agcggccctg ttcgcagcac gagtacgcgc agctttctgt 240

tgaggagtta gagtctcctc ttcaggttcg gccgctactg tagcgacgtt aggttggcta 300

aaggtgctta cgccgctggg ctgaaaacca gtgcgccagc cgcttcagga cgcagaccac 360

cgtgacccat agcgtattta ccaacaatca ggtcaccctg agcatcgacg tcacggtcac 420

gttccagcgc caagtcacgc agcttcacag tacccacagc agaacggtga gagaacagac 480

ccacaacgtt gtccatagca actttaacgt cgccagtagc agttgccggg aatgcgtgtt 540

tctgaccgga agcgatagag atgccatcag caccacgagt ctcaccagcg ccaccctgta 600

ccagatgcgg aacttcaaca acaacgaagc ccatcacgtt acggatgtta ccagtctctg 660

ggtcaatcag cgcagcatag ttagcagcgt tcggcatcag agccgcgagg attgcagagt 720

agttgtccgg cgtggtgtag aagtaacggt cgccagcagg aacgtagttg gaggtcagct 780

tcgcacgagc aatggtcagt tgaccaatga ttgcttcacc cagtttagca ggggtatcga 840

ggtcagcttt cttaccaact tccagtacgg acgcagtacc cagaccagcg atgttctcgt 900

tggatgcagc cgggaggtta cacaggatag ccatttcagc cagaaccgca ccatcagcag 960

cgatagccag agcttcaccc aactggttgg agtattcgcc tgccacgtca tagtggttca 1020

tcgcatcttc aatgtcgaaa atcatcacat cggcagtcag cagaccgtca atggtaatca 1080

ctttctcggt atgtttgata cctttacgct tatcggacag tcgctcaccc ggagccagat 1140

acacaccaga ggtgcgaccc atgaccggga actgagcaga cttaccgttc tgaattgttc 1200

ggacaatatg cttgtcagca gttacagagc ggcgagtgaa tgcggtcagg acttcaccag 1260

caaagacctt caggaacaac gctagagcgt cggaactgga tttgccttta ccttggtctg 1320

taccaatttt ctgacccgga acgtttgcca tatgataatt ctcctattca attgaaagat 1380

aaagtttatt acttactgta tgcccaatcc gtatggactg aagtaatggg gaaacctttg 1440

agtctttctc ttggtctccc tatagtgata gtttagtcct acaggcttga ggcagctacc 1500

ttagcgcgaa cttccatcgt gtacttagcg tcacgcaggt atcgcgggtc actcatagcc 1560

ttaatcatgt cagccttgga gctgaatgct tcggtctgag gagccttagg tgcgaccaca 1620

ggtttagcct gagtggttat ggtacgctgg ggtttaacac ccacagcttt acaaagagtc 1680

ttgccagcca gattcagcag agccttggta gtcgcaatgt ccttacgaac gatagcagct 1740

tccagtgcct cacgagttga cgggtcgttg gactcaaggt gtgacaggat gcgattaaac 1800

tgttccgcac caccagcata gcgaaccaca ccagcagcat actgttcagc cagagcttcc 1860

tgcccacgta caaacgaatc tacgaaacgc ttggtgtaac ctgcttcctg caacttagcg 1920

taggatgcgt cagacagctt acagtccttg gcgtattcag ccttgatagc ggtaatttca 1980

tcagcagtga ccttgcctgc ttctacagca gaagacacca tgtcatcgaa tgcagcttcg 2040

ttttcatcca gagcggtgac actttcggtc agctctttcg gtgcatcacc cagttcgatg 2100

aactcaggct gctcaccatc tgtctcagac tcttcgtcat ctgactcgtg gtcttcttca 2160

ccttcagtct cttcgacgtt ctcgtcttct tcggtcgcct cctcgttttc ggcttccagt 2220

tgattgaagg taatagcatc atcgccatca cgaacagcta cgtcctgttc aagcatagac 2280

ttctggtgtt cgttcaggtc ctcaacggaa ccagtgattg cattagagct aacgccgaac 2340

tcggcataaa ctgattgaga cattgagtca ttctccttta agtcgttaat aggtaaacac 2400

ctacttgcag tgtgggacta acggctacca tatggtcggc ttagtcgctc ttactttcgg 2460

tgttcctata gtgatagttt aggcttgagc catgtcctcg ccagctccct gacctacagc 2520

agcacccatg ttagcaccag cagcagacgc accgttgacc acagctcctt gagcggattg 2580

ttcagcaata cgttgcatct tctcgtcctg agtaagcaga agaccagcag tgtcaatgcc 2640

taaggcattc agcagtcgca gcttaagggt cggcaagttg atgtcagggt cctgagagag 2700

ctgctgaaga ccagtcatca tgttaaccgc ctgagttagc ttctccaagt cctgaccacg 2760

acctaacgct tccagaccag tggagacagt aggctctacc gcttctttcg gaaggtcagg 2820

aatcattcca gcagactgaa gttggttcat cagcacacgg acgataggta actgaagctc 2880

ttgtgactgc actgagtaca cgccacctaa ggtcgcctcc agttcgccag caacataacg 2940

aatctcttca gcagtgactc gctcggcatt acgctgaaca gcgctattaa gaaggaaggc 3000

ccagcctaaa cgttgctcga tagcgtcagc caccgacttg gcaatcgtaa agtcctgacc 3060

tttcgtcagt tgcaggaagt tgatgtcctc gacgcgacca gccacgaact cacctgtagc 3120

cgccttgttc agacgacgag gttgcgtgat accgttcggg ttaacgaggc ccaccacctt 3180

ggaggctacc ttagccattt tggtgatagc ttctgtaatc gtctccagcg agttcaggtc 3240

tcccagatac tcctcgcaat aagaacgacc atagtcttca ccgtccagtc gaaccattcg 3300

taccgggatg tatggacatg cagtcagtgg gtaggaacca tcggtccctg ctacctcaat 3360

gccttccact tcctcgtagc gcagatactc gtcgtcctga cggtagatgt gcgtatacac 3420

ttccagctcg gtgtcaggct catagtcgtc tgcgttgagt tgggacttaa cgtcttccgg 3480

tagagcacta aacgctacct tgtcgagagt cacaatctgc aagatgttac cgaaagcatc 3540

acgttgaaca acgtaggaca ctaagcggta cattcgcata ggactgtaag taccctgttc 3600

aggctctgga atgtagagca gacagttacc tgagacgata agctgcttca gggcctcgaa 3660

caatgggaca cggaaactgt tagtctccat gtaggccatc aacacacgct cgaccatagc 3720

cagcccttcg tcaacacggg cagccgcctc tgagtcctga ctcaaggtct tggcctcata 3780

ttctgagact gttagtcgca tccacggtga ctgaggaaat aatgccaaca tcagctttgc 3840

agccaagttg ttcaaacagc gagcacccac agcttgccac ggcgtcacgt attccgtaga 3900

tgagttgtcg gactccttag gaaatagcga tgggatggtc acggcagcgc agttctgtgc 3960

gcgggtctcg taaggctgtc gtccgttctt caatctatca taaactgact tcgcgccttc 4020

agcagcaaat ccttcacgtt cagccatcta cgtgcctcca tgttttacct tggcgaacac 4080

gcaaaactgt agacttgcta acgcctagct cacgagccag tgttgtacaa cctacggttg 4140

acttgcggat ttctcgaaca aggtcttctg ttaaaaccga taacccttgg tcttcacctc 4200

tagccatttt ggttttattg atgcgaccac gctttgaggc gtcctgcatg ttatcacgct 4260

gagttcctaa ctctaagtgg tttacgttga aacacgctgg attatcacac ttatgacgga 4320

cgagcattcc gtctggtatt ggcccatgcg catcggcgta agcgagtcgg tgcatataca 4380

ctaacttacc gtctatacgc ttctgcccat atcctgctga ggatttggcc cacttccact 4440

cgatgcaccc ggtcaaatag agatgccccc accagaggta cgagagacct gaaggctacg 4500

cttaccggaa cgcttaactt tcttctcgtc agatgcagtc acttcggtat ccacatcttc 4560

aattttgtcg ttcggtactt ccactggtgc tgccggtgct gcaggcgctg gggtctgagc 4620

ctcaacaacc ttaggtgcat cgttagctcc aagaccaact gtccctaacg caccttttac 4680

tactttcttg aaagccttac tgattgattt acccacgatt aatctccttg ttcgtgctaa 4740

cgcacttggt tgttacgatg tctaccgacc cagaaacatg cttgacacga gaataccagc 4800

caagacccca acgcttgcac tcttcgtcta tgatgtgtct gacagtctca agaaccttgc 4860

gggaggactg cgagtcacga cgaatagcga cgattgaaag gtcaagaccg ggagtcggtc 4920

ggtgccaaga tgcggtagcc agcatgtaga gatacgctac tggttgacct gagacatcgt 4980

agattgtgta ctcttcaccg tcgaactcgt cagccatacg gtaagtatga gccttgaagt 5040

cctcgaatga cttgaagtta gactgcccgt cttcccagag gcgacaagcg cacatgtggc 5100

gaccttcgtg tgagttgaga tatggtagca ttgtcttacc ccatgttgac gccagaggct 5160

cgcatagcgc ggctaactga cgatttatct ttaggtgcag actccttctt gaccttcagg 5220

tctttgatac ctttggtctc gttggtgtcc acatcagatt cagccccgat gtcaactgac 5280

gcaacttcct cactcagagg cgctggttca ggtgctcgtt caagtgcttg gaccgaaggc 5340

ttcggagtgc taatctttgg actgaaacac atagtccctc ctacagttaa tcgaactgaa 5400

cggtatcttt cagctcacga cgcgtagcaa ccgcagagtc gagagtgtca gagcaatact 5460

ggagaccctt gatgaacccg gcaatgaacg catcgctgta gccctgctgc ttgaggagac 5520

tgatagcgcc catcttctca gcgtagcttg cgttgaacaa tacgtgcagg aactggatgg 5580

cagactggga gatgttaggg acatcgagtc tttcttcctg taactgctta acaacgtttt 5640

caatagcatt aatagccatc ttgaatctcc tctttaagtt aagactaaag tctatcttat 5700

agtcatatct taggtcctaa agtccctata gtgatagttt agtgtttcac ctatggatga 5760

ctgttgggtt gataggatat gactatcggt tagactcagt gtttaggacg gttgttcgac 5820

ccgaaccact tgtacatgca gtaaagggcc agaagtccgg cccagtaaat tacatggatg 5880

gtgtccacag gatgacctcc ttggacttag ggtcatagtc agaggctcga caaatacgag 5940

cgacctgagc ttggaccaga agttcctcct cggtcatccc agctttagca gccagagtca 6000

ccatgcagtc ccacaacgtc atgtcttcac gcttcggata cttcttccat tcggtcttaa 6060

tctggccttt gttcttgcca gtcttaagct cacggctctc ctgcacgaag tagtacggct 6120

cgtcaaggaa cgcacgagtg gtgtcctcac ccattcccgg aatgccaccg tagccatctg 6180

tagtatcacc cttgatggtc tgctccatgt gccagtagtc tgcctcggca gtcgtatgac 6240

tcagaatttc accagtggtt aaccagaaga actcacagtt cgggatggtc ttgaagtcct 6300

tatcacagga caccagcacc gcatgatcac atccgacaat ctgaggtcgg gtccctatga 6360

tacccataca gtcatcaccc tcaagcgtag gacgcaggaa gctgttgaac cgtgggtcag 6420

ccatcacttc ggctacgaac ttcttgtaac ctacaggctt gcgagaacct ttacggttgg 6480

ccttataggt aggcaggacg tccttacgcc agttgtaatc gtcagtgaag cacatcacaa 6540

tcttagcgtc tttccacgcc ttgcgcttct taacgatttc agagatggtg ttctcaagga 6600

tacgacgagc cttggcatgg tcgcagataa gggtataaat atcatcaccc caatctgtct 6660

cgtcctcagc agcagccata gatgaaaaca ctaagtagtc accatctaac acaagagcta 6720

ttttcttttc gctcacaggc agcctccgtg ttggttcagg aactttgtgc cagaagcggt 6780

aatctcccac gcaccgttgt tgcgcccatc catagacagg cagcttagat gtccacgact 6840

cgcagcctca gccacaagtg cagcgttgtt gcgcacatag tttgactgga aggtcttcgg 6900

gcaggactta agggccgcta ggacccgtaa gtattcactc attgcttgaa ccccactcgt 6960

atacgtttag taatatccat caatgacact ctttccacgt tggtccaatc ttaccttcgg 7020

tatcaaggac acatttaaag ttatagaact cacccacctt acgcatagca agctgagcaa 7080

tcttgacgac ttcttcggca atctcctgag tacgacatgc aatctgcaat tcgtcgtgca 7140

cccatgccat gtacgcgaag tctccttccc agccgtgtac atacccggcc tcttcaagca 7200

tacgttcagt ctcaacaatc cagtgtttac agaccactgc accatcacct tgtagtaagg 7260

cgttaagtgc tgagtgcggt gaccggatgt gaatgcggcg accgtccaga cctttcaacc 7320

atcgacgttt ccacttcacg atgttctcac catctaccca cttagagtct gagattaacg 7380

tattactcac agcttccctg aggtccttga tggctggtgt accctcaatg aatttcttca 7440

tgagagctga accttccttc ttaccaccgc cgactatcag tccaatctta gctgcccctg 7500

caccatacag gaacgcatag atgaacgtct tagagttgtt acggaaagcc tcatggtcgt 7560

ggttagactt atcgcgtggg acgttaggtg ctaacccagc gtttactgcg ttggcccagt 7620

ggatgtcacc ttcgaccaca gtctgcgcat aggcaccacc atcaaacgga gcagctcggt 7680

tccccagaca gcgaagctca agaccagaag catctacacc cacttgaatc caagggtctg 7740

gcttaccgtc cttcttgttc cacgctgcac cgaaagcacc acggcaggtc tcaccatatg 7800

gagcaccgtt agccgggact tgagccatgt ttggtgaact atgggtcgca cgtccggtta 7860

ctgccccgca tgggttgatt gaaccgtgca tacgtccgtc tggacctaca agtttcaacc 7920

atgcgttctt accttcagcc gcctgaccga tgcgcttctg gactaccaga tactcacgga 7980

ccagctctac gcaagcctga gcctctgcgt ctggtaactt aacgtgttct aacgtctcgt 8040

catcgactac aggtttccct gtgtcagtga agtccacagg ctcccagcca cgctccatca 8100

gaactttcgc taagtggtct ccgcttccag gattaaactc aacgtaagtg attggcgtga 8160

atggtgctcc ttccatcgtg tctcgtgagt cgaactcgca aggcttcaga cctaagcgtt 8220

gagctttgtt cttcggcttc ttgaatactg acccgacctt aggatacacg actctcggat 8280

acttcggaag gtcctttcct gtccgtggat gcttgaagaa ctccttgcct ccttttggtg 8340

cgtaccagct accgaaagtc gaacgcagct tgtccagaag ctctgcacgt ttgacggtga 8400

gttcacgata taagccttcg accatctcgg tgttcatcgg atagccatta cgttcaatct 8460

tcgcacaggt ccacgcagca tcatgttcca gacgcaacgc ataaatctgg tcgaaagcga 8520

actgttcaga ctggaagtaa tacttgtcag tcaggaactt cttgaacaac gccagtgtga 8580

ccacaacgtc ttgaacgtta tagtcaagca tctcctgaga cgggaacaac cattcgtccc 8640

cagccttata ttcgatacct tcagccttgc acttggcaac gtaatcgtgt ttgtactcac 8700

ctttcatctc accgagacga taaccccaag cctcaagaga ctgacgaccc atcatattag 8760

gcggcagacg accagctttc accgcgctca tgtctgagaa cttaatgttt ggatacatca 8820

agcgaccaag taccaaggta tcaataattc gacccttatt cacatttagg ttcttaccaa 8880

agtatttctt cttcagtatt ttcaaggctg gtatatcata gttcacacca ttgtgcagaa 8940

ccagcatacc gtcagtggat gccataatag attctatgcg gtctatgtac tctttgaatc 9000

cacctgtcag cccagtcata ggggcaacac catatttctc agtagcctga gttccagcgt 9060

taatgataac accacaatgg aactgtgaca cagtgtctag tagaccgtca gtctctatat 9120

ctgtgccata gaatgagttg agattaaaca ttatatttct ccaagtacgt tatagcagcc 9180

ctaagcacgg ctaccttgtc accgaactta ccaagtgcgc tattacatgt accacatagc 9240

aatcccctaa caatacctga gtcatggcaa tggtcaacgt gggctacatt attcttactc 9300

tcaatagacc catgcttgaa gataatgtct gagcatatag cgcatctgcc cttttgacta 9360

tcgaacatag tgtcatattc ctcaagtgtg agaccatagg ctttcttaag ccaagactta 9420

cgggcagata ggcgatgcgc ctcaccggcc tctgtacctt tgtttcgatg atatcgcgac 9480

ctattatcct cacgaacaca agatatgcac cacccatttg tcttcctgaa ctcagtggac 9540

tcctttgtag agccacatct actgcaagtc ctcatattgc ttctccttta gttataagtc 9600

taatcataaa ggccactcgc tgtgaatgac cttgagtcta gacctagaag tctgtacgca 9660

agaagtggta cataaacttc cggttagctt tcttccatgc cttagagtcg aacctttggt 9720

ctcccagaat gttagacagg caggttgctt catcgctcca ccatttgtac atgaaccgat 9780

ggtagcgagc tttaagtttt cttagcaatg tactcctcct tagaagtcgg tatcttccca 9840

cgagccgcta tcctcttctc cgctgctgcc agtgaagcta attggttcaa gccacccggt 9900

cgtcttgttg tattcgaggt atcctgccac tccagtgtca cccgtaaaac gacacttgag 9960

cagacgaagt tgaacaatat taggagtatc accttgctgg tttcgctcaa gggcaataat 10020

agtatcagac agttgacgga gagcaccaga accacgtagg tcagtgattg aaacaggtcg 10080

tccttcttca tgcgatttac ctttctccgg gttcttcagg tggcatatga ccacgacaac 10140

cacacccttc gtcttcgcaa acttcttgag acgagtcatg atgcggtcaa tggtcttacg 10200

ttcatctgag ttatcttcca tgccagacac aacgattgag atgtggtcca gcagtatgac 10260

gtcacagtcg agaccgtcca ccatgtatgc taacttagcg aacaaggtgt cttcctctga 10320

ctctgcgaat gaatcgtaca ggtggaactt atcgtctccg aacagcttgt cataccattc 10380

gtcaaaccgt ccatcctcta atatggcttg cttcagttcc ttgctctgtc gtagacggac 10440

gttattgtcc agacccataa ggtcctgaac tgtttcctct acagcctctt caagcatagc 10500

catacccaca cgcttacctc ctctgcccca ctctaagagg agctgacgga cgaaggtaga 10560

cttacccatg cctgaccctg aagtcaccat gataagctca ccagctcgcg cacctaatgt 10620

catcgcgttg agtgttgtgc atgacgagaa catgagacct tcagtctctg ccttaagcat 10680

tgcctcccgt gtgcggtcct tcagacttgc cgctgatacc acaccagccg gtacgaaagg 10740

tttagcgttc cagatagcat cggtgatggc cttgaagtcc ttcgcctgaa gtgcagcgtt 10800

ggcgtctttg tacccgttga tgaacgcaac cttaacccga cctgctggta agactggtgc 10860

tgcatcctca atggcctgac gacccggttc atccatgtcg aacatcaaga ttatctcttc 10920

gaactggtcg agatactcaa ggttcgcagc catagctttc ttcgcagact tggagcctaa 10980

cggaagcgag accacaggat acttaccgtc ctgcacctga gccacagaca gagcgtctat 11040

ctcaccctcg gtgatgacta tcttcttacc accgttccag agctgagagc caaacagcat 11100

gtcagacttg acgctaccga tagccgtgaa gttcttctca gcgtctcgga ctttctgccc 11160

taccttggtc ccggacctgt cgtaataatc cgccacctga accatcttgc cacccatgtt 11220

acccacccag tagctgtact tcttgcatat ctccatgctt agactacggg ctggtagtgg 11280

gacatatcgt ccagcgttct caccgaacgt taacagattg ctcacttgct ttctacctcc 11340

tgagggtgtg tatccctcgg tcaactccat gtctcctttc ttccatgcga ctgaagggtc 11400

acatgcaaaa caaaattgat ggccgtctga gtaaacacca ttggcatccg aggacccaca 11460

gtctggacac tgggtgtgat acagaaatac actctcgtcg ccttggtcat cgtatgacat 11520

tggtcactcc ttaatcacaa atgcgaacaa agggacagga ctaattgtcc cacccctaag 11580

gtgatagttt aggctttgaa gaactgagcc agctggtcag ctttggtgtc agcttgacga 11640

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ggaatttatt aaccgtggtc ggaagtgacc agttcgttgg tagtcaacca gcgttgcaag 11880

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ctcaagatat tcatttaaaa cccatgcccc ccacattccg tcaggctgag tgttataacc 12600

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agttcttttg cctccttata cttgaggccc accatcatag cctcagcata cttcctctca 16800

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ttaaccagcc acttgaacgg gacgttaagc tgttttgaca tcttggtagg gatgaccgtg 17520

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ctgaagacaa gatgtcttcg atattcagtt tacctttctt cggaagctca ggcaacttgt 17700

cgcgctggct ctcgtgaagc tggtattcaa actgctcgta gaagtcaagc agcacatcgt 17760

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taatgcctga ctcctgcttg tgcttgtcca gctctttctt cgtgcctttg ttgaccgtag 18000

gctgaaggtt gaatgaccct aagaacatca ggttcagacg agtggtatcc ttcttgcggt 18060

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tcgctggcat cactatgtcc tcgtaaactt ggtctgcgaa gccatactct ttcgacccgt 18360

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cgatgcggtc agacactatg cggtatatgt cttggacctt accggatggt gtcaggttta 18600

ctgcatgtcc accgatgtgg tcacgaagca tcgcgctgaa gtgctgaatc ccagagcagg 18660

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gcttaggtgg aacgacgcaa ggttgataga ctggcgcaat acccgcaagg ctgaatccac 19500

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cattgccagc accataacgc ttaagctcga ccagttgtgt agactgtatg acaatctcaa 19620

gcatcttgat gccaacgtgt accgcctcgg tcggactcca agttccccac gcatcttcca 19680

gttgaccttg ctccagcatg gaggcctcaa ccgcttgcat gtaggctttc ttataggata 19740

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gcctcagacg gttgctcgaa atggtctatt atctcgttga ccacacgcca cgacacgttt 21300

aagactcgct gctcgtaggt ctcaccatcc cggcagtagt caccgccgat gtcattcagt 21360

gagcggtact tatccatagc gaccatgtat gccctgctaa agcgcttgac cagatggatg 21420

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tcatccttct taaagcctac cttgattgca tatcccggca ggtcctcatg ctcaaaggct 21540

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tcgcagatga tagcgtggag ctgagacatc aggttattca tgattacttt atcgtgttcg 21720

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taatgttata ctataacact atacagatag agactcagag acaacccata gtccctacct 22920

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atacgagagt ctcgacccac ccgacccact gacttccagc agtaacgcca gcagcaagta 23400

gaacagcagc aagaaacctg tatgtagctc tattggtcgc cagagctttg agaacagctt 23460

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gggattatga ttaatatcac cctccttcca tcggtgcaag ccttaggtaa gaactcggag 23580

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ccttagccat agcctcaacg aagaactgca caccgatagc cagcgcatca agtcggtcat 24000

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ctgggtccaa gtccgctacg ataaggtcac gcagcttcag tgggtacttc tcagcatcac 24660

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ccagctcacg atacagggtc atctcgttct gaggagtacc cagatagatg attgtaccac 24960

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gctgaggcat gaggtcgatg attcgcttga tgaagatgga gttagcatcg gctcgttcct 25260

ttgaggccga cacaatcatg aacttaaagt ctgggttgtt ccatagtttc cagaccacga 25320

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gctcattatt cctgtcttgc ggcgttgact gcattaaggg cctcctcttt tgtatcaaaa 25560

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accaagtcct tcatgtcctt cgtggtttta cctgtaccag ccatgatagc aatatcgcca 30480

ttaactcgac ggttgtaggc cgggacaatc ttgtccatgt cccactcacg caggttgttg 30540

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ttcagtaggt catagacttt cagctctccc gtagtcagtt cagccttcag gtttccgcta 31080

ccatcttcga tagccataga cacacgctgg tagatgtcct gacggaatgc gccagagtct 31140

cgccagaatg ctgtctggaa gtacgggtct tttagtgcct cagtaaccgc atcgtcgatg 31200

tcgttgtaga accgatggtc cacagcacga agtctctcga acacgtctga cgcagttgtc 31260

ccgattttac ctgaggcccc agactgcata ccagtcggtg agcgcactaa gtcagcagct 31320

actccacgaa tctcagggtt ctcagaccga agcagcttca ggccaatctc ggtaagtcca 31380

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tccagacgtg tagctgggcc agcaaactca ttagtgttgc gacctaaggc tctgcctaac 31680

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ctgtcagtat agctcttcct gctccactgc ctcttgcctg tcggcctctg gaaaccttat 33000

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tatcacattt atgcctaaca acatagccat ctggtattgg ccccttattt agggagtagg 33120

agagacgatg tgccatatac ttaaccctag ccaccattat ccttccgtat ccttctccgt 33180

ctaagtggcc tgtgaatagg atacagccag actcttcagc tactgacagt tctgccagtc 33240

tctcactggc tgtcccgttc ttcattatgt tactccttac caattaatat gtttgcgata 33300

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gagccgttct gctcgactac agagagctga gagttcacta cccaaggatt agtcttgatg 33600

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gactgcttgc tgaaatactt attgaaggac ccgtagatag cgatgtttcg gtccgtgatg 35040

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cgaccagtct ttactctaag tgcttccata gcgtaagggt cgtcctgata cagcaatgtg 35280

ccgttctgga tagcctcacg tctctgctga ggtgtcaact tacggataat ctcgttggac 35340

cgctcgtctg ctctggcctt cgcatcgtca gctctggcct tctcatcgtc cttgaactgc 35400

ttgtacaatc ctgtcccaga ctcaacgaag ttagtaaacg cacgagccag accggagtcg 35460

ccagttggag cctgaacgct ggatgcttga tagttgacgg cgatagtttt acccggcgct 35520

ctgccacgac ccatagtccg attagccaga gctgattcaa tattactagc cattagtcct 35580

cctcttagat atgacctgta ggtgtacctt tagcatcact cagaaccacc agatagtgac 35640

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ttggtcttga tgattttacc ttgaccacgg atagcagact tggtgttctc aatgttggcg 35760

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tccttgactg tatctccttt gacctgacgt tcaatcctgt ccatagagtt accttccaga 35880

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tctgttagtt cagccatctg ctgctccttc aggtctcgct cctgcatctt caggtttgcg 36000

tcagagtagt tcatctgctt aatcatttcc tgagcctgtc ggttctgagc gtcaattgct 36060

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cttcaagaat ttaatgtgag acttattgcc tgaccacacg tagttccaga tggtcccgta 36300

ttggtctaac attaagtccc tgtactcaga gatacgcttt atgaactctc gcttctcttt 36360

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accataggca aacacttcac ctacactgtt cgttaaaacc acagatgacg gagataaatg 36480

ctcaagcagt ctttcagaga gacccacggt tgacccgtag tttgctttgc attcattaac 36540

atcatctgcc gaaagatgcc agagaaagta gtggacatct ggttcagtag ctttacgaat 36600

atacataaag tctcctatta aagtattata accttaaggg cctatagtcc ctatagtgat 36660

agttaaggta aatctatagg cccttcaata agttagacgg aacgagcttt cttagcgtat 36720

gacgcctccc agccacaccc aacgattgac actggggtag gatagtcgga ctctaaggtt 36780

agactcgtgg ttaatgcgtt accattcata gcaaagcgat actgtccatc cccaatgttg 36840

gtagtcccga tggtttgctg accaagggtg tacccattaa aggtgttcac gaactcccgc 36900

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aggaaccgtg aaaacttgta ggacatcaga taagaccgtc cgatgaacac tgtgcgtcct 37080

gaccaatcgc catttagtat agtcacagta gaggtactgt tcaagtcccc aaggtccaca 37140

taagcaccct gactgtcaat cagatagtac cgaccgggag acggagcgtt tccaccataa 37200

gcagaaccaa tgtcaaccgt agtcttatag gtgtcagcgt cgtatgagcc aattggtatt 37260

accatagaca ccttggagtc aatgtgtagt ctatatggct ctgacgggaa gtcagttgcc 37320

tccttgatga acttaaggtg ctcaaggtcc actccgcctt ggtgctgacg aacgatgaac 37380

atggtagagc caatagaagc agacgccaga atcttatcat ctttagggaa ctcccagtgt 37440

gaccaagagg cttgaagctg tacgccgtcc ttaaacaaga acttgtagat gtagattcgg 37500

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tcagacacat ctgctacagc gaagtatcgc ttaatgctgg tgaatgaccc acgaggcgct 37680

gagaagaaga ctgagcgtcc tacagcgaac ggtctggcat tgtcacctag ggcaaactct 37740

gagcctacat caagctggat agacttcgag gtaaggaccc cagagcttgt catcacgaac 37800

tgaacctcat ccgaccaaag tagtagctgc tcgctaaacg gaacggcata cttaaggatt 37860

gagattcgag ggtgacttac agctacgtca atagggtcat cgtcactcag tgtcgccaca 37920

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aagaacccta gcctgttcct gtagaagaat acatcgttaa tcgtagcatc cacgaagcta 38040

ggcatagggt ttgtgtcatc attaccagca ccacgcttag accagtccag agtcttgaac 38100

tcaaaggagc catcagattg tcgtaccaga gcgtgtggca ttgtggtgtt atcgaaccca 38160

gtgacaactc ccggctccac tgtctccttc cacgtcttag tgttggagtc atacatcacg 38220

tagtattcat cggcgctact gtttgtctcg ccttgaatct taatgatata cccattagga 38280

gcggcaagag gtagtttaga gattgtctgc acagtgtcta ggactgggct tattagctgg 38340

ttagcgtagc catcctccgt ctccactgag ttaatgtcag tccctgaggg ggcagtgatt 38400

aacaggaagc cagacccaag gtcgaacgtg aaggcagggt aagaagcaac aagaaggtct 38460

ctaagcgccg caccgatagc ctgagcatca accttaggag ggtcattcgc ggcatcatta 38520

cctgctggca acttatgcga aaccttaacg cctccattga ttcctacctt aagggtgcga 38580

ccatactgtc caccacgcag gttaattaaa gctcgtgctt tgcgattata accagagtgt 38640

gccttctcgc ttccaccttt gacgacaacc ttacggttaa cgacgaacgt atagtctgcc 38700

acggtaacga cacggatgtc atctcgtggg ttggaggact taacgtaatc taccgcaccg 38760

gacactgagt attgattacc actcaagtca actacctgaa tgttggaccc attgaacacg 38820

atgtaatact gctcatgctc gtcacggtta atcagatgga acttagggtt actcccaacg 38880

tcgatgttaa gacgtctctt gaagactgta ggtgggcgct tctggaggcc atcactctcg 38940

gatgaccagc agttaacctg tgcctcgcct tggtctgaga acctcagtat atcaggctgc 39000

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cgcgaaggta tgacggcagg aatcgaatcc tattgtcttg gacatcaggt gtcaggacag 39660

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ggatacgttg agcgttagag 39740

Claims (5)

1.一株烈性沙门氏菌噬菌体（Salmonella pullorum phage）RDP-SA-21004，其特征在于，透过电镜观察，该噬菌体头部为多面体立体对称,包裹着核酸，直径57.259nm，有一个长112nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科，不具有毒力基因和溶原基因，保藏编号CGMCC No.22483。

2.如权利要求1所述的烈性沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004在制备预防和/或治疗沙门氏菌引起的疾病的药物中的用途。

3.一种用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，其特征在于，包括有效量的如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004。

4.如权利要求3所述的用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，其特征在于，还包括用于抗沙门氏菌的抗生素。

5.一种清洁剂或消毒剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21004。

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