CN113755450B - 一株大肠杆菌噬菌体gn4-1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株大肠杆菌噬菌体GN4‑1，所述大肠杆菌(Escherichiacoli phage)GN4‑1保藏号为CCTCC M 2021880；所述大肠杆菌噬菌体GN4‑1在制备预防和治疗大肠杆菌感染的疾病的药物中的应用。本发明大肠杆菌噬菌体GN4‑1能裂解20株不同来源大肠杆菌的宽谱大肠杆菌噬菌体，能同时杀灭多种细菌、且稳定性高、安全性好，易制成制剂等，对感染大肠杆菌的动物和被大肠杆菌污染的环境均有很好的治疗、杀灭作用。

Description

一株大肠杆菌噬菌体GN4-1及其应用
技术领域
本发明涉及大肠杆菌噬菌体的技术领域，特别涉及一株大肠杆菌噬菌体GN4-1及其应用。
背景技术
大肠埃希氏杆菌是中等大小杆菌，呈短杆状，其大小为1～3um×0.5～0.7um，有鞭毛，无芽胞，有的菌株可形成荚膜，革兰氏染色阴性，需氧或兼性厌氧，生化反应活泼、易于在普通培养上增殖，适应性强，是人和动物肠道中的常见细菌，可分为致病性和非致病性两大类。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为二百多个型，其中一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物具有致病性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症。大肠杆菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，60℃短时间内加热后仍有部分细菌存活。大肠杆菌在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中则存活更久。大肠杆菌病一年四季均可发生，每年在多雨、闷热、潮湿季节多发。
噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌体是病毒的一种，其特别之处是专以细菌为宿主，跟别的病毒一样，噬菌体只是一团由蛋白质外壳包裹的遗传物质，大部分噬菌体还长有"尾巴"，用来将遗传物质注入宿主体内。中国专利CN112680423A公开了一种能同时裂解四种细菌的宽谱强裂解性大肠杆菌噬菌体，命名为EC35P1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年8月20日，保藏编号为CCTCCM2020438。该噬菌体除对大肠杆菌具有较好的裂解作用外，还可裂解志贺氏菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌，且可实现大规模工业生产。韩国专利KR102003786B1公开了一种新的大肠杆菌特异性噬菌体EcoH7及其制备方法。该噬菌体EcoH7对大肠杆菌具有非常高的特异性，可以解决大肠杆菌对抗生素的耐药性与食品中的大肠杆菌的残留问题，且具有广泛的宿主范围，可广泛用于抗生素、组合物、饲料、消毒剂或清洗剂领域。中国专利CN108103031A公开了一种水产养殖用宽谱噬菌体大肠杆菌噬菌体NTHP01以基因工程大肠杆菌DH5α为宿主菌发酵制备，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年8月28日，保藏编号为CGMCC No.9623。该噬菌体除了气单胞菌具有较好的裂解作用外，还可裂解其他细菌(迟缓爱德华氏菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、格瓦斯细菌、弗氏柠檬酸杆菌、肠杆菌等常见细菌)也具有裂解作用(并未公开其具有宽谱性)。
关于大肠杆菌噬菌体的研究主要集中于肠出血性噬菌体裂解性方面，针对大肠杆菌噬菌体还能裂解其它属的细菌和应用方面的研究报道并不多。故寻找一株能同时杀灭多种细菌、且稳定性高、安全性好、效价高的新型大肠杆菌噬菌体分离物是非常有必要的。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一株能裂解20株不同来源大肠杆菌的宽谱大肠杆菌噬菌体，旨为大肠杆菌的感染提供新的治疗方案，以及为大肠杆菌造成的环境和饲料等污染提供新型的消毒手段。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一株大肠杆菌噬菌体GN4-1，所述大肠杆菌(Escherichia coli phage)GN4-1保藏号为CCTCC M 2021880，保藏日期：2021年7月14日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心。
如上所述大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)GN4-1在制备预防和治疗大肠杆菌感染的疾病的药物中的应用。
一种噬菌体组合物，包括如上所述的大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)GN4-1。
一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括如上所述的大肠杆菌噬菌体(Escherichiacoli phage)GN4-1或如上所述的噬菌体组合物。
其中，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体，其剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
一种水体消毒剂，有效成分包括如上所述的大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GN4-1或所述的噬菌体组合物；其中还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分。
其中，所述消毒剂可通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具和饲料进行大肠杆菌的消毒。
一种用于水产品消毒的生物抑菌剂，包括如上所述的大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)GN4-1或所述的噬菌体组合物；生物抑菌剂的使用方法为：对水产品产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中大肠杆菌的增殖。
所述大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)GN4-1对分离于牛场粪便的宿主大肠杆菌D4-1具有较好的消杀效果，对另外分离于仔猪(13株)、犬猫(3株)、禽(1株)及人(2株)的大肠杆菌也有很强的消杀效果，抗菌谱较广，可应用于制备防治大肠杆菌的药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1能裂解20株不同来源大肠杆菌的宽谱大肠杆菌噬菌体，能同时杀灭多种细菌、且稳定性高、安全性好，易制成制剂等，对感染大肠杆菌的动物和被大肠杆菌污染的环境均有很好的治疗、杀灭作用。
保藏信息说明
大肠杆菌噬菌体GN4-1于2021年7月14日，保藏于湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021880。
附图说明
图1是本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1噬菌斑图片。
图2是本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1透射电镜图片。
图3是本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1最佳感染复数图。
图4是本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1宿主谱热图。
图5是本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1一步生长曲线图。
图6是温度对本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1活性影响示意图。
图7是pH对本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1活性影响示意图。
图8是本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1培养基中杀菌示意图。
图9是本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1控制4株不同大肠杆菌体内感染示意图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
实验所用宿主菌为多重耐药临床株，为大肠杆菌临床株(表1中的GX ED4-1)，分离于广西崇左某牛场奶牛粪便中分离得到，与本发明大肠杆菌噬菌体GN4-1正在办理保藏中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2021880。
LB(Luria broth)液体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
0.6％LB半固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉6g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
1.2％LB固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉12g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌后，冷却至50℃，倾倒平板，冷却凝固后，倒置备用。
伊红美蓝固体培养基(1L)：伊红美蓝琼脂粉5.445g,加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
SM缓冲液(1L)：称取6.055g Tris-HCI(pH为7.5)定容至100ml，加入5.800g NaCl，2.000g MgSO4后，加入ddH2O定容至1L。
1mol/L无菌CaCl2溶液(1L)：用天平称量Ca Cl2固体111g，倒入烧杯加水溶解，将溶液倒入1L容量瓶并用蒸馏水润洗烧杯3次，润洗液一并倒入容量瓶，再定容，高压灭菌备用。
DNase I、RNase A、PEG8000、磷钨酸(PTA，2％w/v)为市售所得。
实施例1
大肠杆菌噬菌体GN4-1的分离
样品采自广西崇左某牛场化粪池中污水，样品于4℃、12000rpm离心10min，上清再重复离心3次，最终上清分别用0.45μm和0.22μm滤膜过滤；取5mL滤液，加入保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌0.1mL，加入2×LB液体培养基5mL，放置于37℃培养14～16h，次日，4℃、12000rpm离心上述培养14～16h后所得培养物10min，上清液用0.22μm滤膜过滤除菌，得到含有噬菌体的原液也即噬菌体悬液。
取保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌划线接种于伊红美蓝固体培养基上，培养过夜后，挑取单克隆接种于5mL LB(Luria broth)液体培养基中，37℃振荡培养8h后作为宿主菌培养物备用。
将1.2％LB固体培养基分为2个区域，吸取上述备用的宿主菌培养物0.1mL和3mL0.6％LB半固体混合均匀后平铺于1.2％LB固体培养基上，待其晾干后取上述噬菌体悬液10μL滴于其中一个区域待自然晾干后，置于37℃培养箱培养后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成，若有空斑形成，证明有噬菌体存在。
重新另取一份上述噬菌体悬液0.1ml连续10倍稀释，分别取出10-2、10-4、10-6稀释液0.1ml加入0.1ml保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌，静置15min，加入45℃左右的0.6％半固体LB培养基3.5ml，均匀铺在预先制备好的1.2％LB固体培养基上，37℃培养8h后观察噬菌斑生长情况；挑取单个透亮无晕环、大小均一、边缘整齐的噬菌斑放入装有0.1mL宿主菌培养物和LB液体培养基的EP管中，37℃过夜共培养；第二天取共培养物离心过滤，将滤液用SM缓冲液10倍稀释，与0.1ml宿主菌做双层，如此重复10次左右，即可获得噬菌斑大小均一的噬菌体，4℃保存，备用。
用双层平板法检测上述备用的噬菌体，结果如图1所示，该噬菌体在琼脂培养基中可以形成针尖状透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，为典型的裂解性噬菌体。
实施例2
大肠杆菌噬菌体GN4-1的扩增纯化
取实施例1备用的噬菌体0.1ml和实施例1备用的宿主菌培养物0.1ml于试管中作用15min，加入10ml LB液体培养基，37℃培养6h，4℃、12000rpm离心20min，取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液即为噬菌体裂解液。
PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入DNase I、RNase A至终浓度均为1μg/ml，37℃温育30min，加入终浓度为1M的NaCl冰浴1h(即加入氯化钠使混合溶中氯化钠的最终浓度为1M)，4℃、12000rpm离心10min，取上清加入终浓度为10％的PEG8000，4℃过夜，然后4℃、12000rpm离心10min，弃上清，倒置5min，尽可能的除去多余的水，然后向剩余的固体物质加入SM缓冲液重悬，加入等体积的氯仿温和震荡30s，4℃、5000rpm离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获纯化的噬菌体悬液。
双层平板法检测噬菌体效价：上述纯化的噬菌体悬液进行10倍梯度稀释，取各梯度的噬菌体稀释液0.1ml与宿主菌液0.1ml充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养左右6-10h，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数，选择出现30-300左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价，噬菌体的效价(PFU/ml)＝稀释倍数×噬菌斑个数×10，噬菌体效价为6×109PFU/ml。
实施例3
大肠杆菌噬菌体GN4-1的透射电镜观察
实施例2纯化后的噬菌体悬液做电镜观察，将实施例2纯化后的噬菌体悬液滴在铜片上，自然沉淀5～10min，用滤纸吸去多余的液体，滴一滴2％的磷钨酸(PTA，2％w/v)染色，室温干燥后使用透射电子显微镜观察；观察结果如图2(100kV)所示，该噬菌体有呈正二十面体的头部，头部直径约为150nm，尾部100nm，根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》，该噬菌体属于肌尾病毒家族(Myoviridae)，命名为GN4-1。
实施例4
大肠杆菌噬菌体GN4-1最佳感染复数的测定(感染复数为感染初期噬菌体的数与宿主菌数比值)
取实施例1中备用的宿主菌培养物，调整浓度到1×109CFU/mL，按照感染复数分别为1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例分别加入实施例1备用的噬菌体和实施例1中备用的宿主菌培养物，加入LB液体培养基使培养体系的总体积相同，在37℃静止培养5h，于10000rpm离心10min，收集上清稀释到适当浓度，用双层法测定效价，结果如图3所示，大肠杆菌噬菌体GN4-1的最佳感染复数为1。
实施例5
大肠杆菌噬菌体GN4-1宿主谱分析
将实施例1备用的噬菌体效价调整为109PFU/ml备用，用分离于不同动物的30株细菌对噬菌体的宿主谱进行分析(大肠杆菌噬菌体GN4-1的宿主谱信息如表1所示)，具体操作如下：分别取30株细菌过夜培养物0.1ml，加入45℃左右的0.6％LB半固体培养基3ml，均匀铺在预先制备好的固体1.2％LB固体培养基上，然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域取10μL效价调整为109PFU/ml上述备用的噬菌体滴加在表面，另一个区域滴加即生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12h，观察结果，如有噬菌斑产生则记为“+”，否则为“-”；结果如图4所示：大肠杆菌噬菌体GN4-1能裂解宿主菌外还能裂解另外19株分离于不同动物的细菌。
表1.大肠杆菌噬菌体GN4-1的宿主谱信息
Figure BDA0003245496970000081
Figure BDA0003245496970000091
注：主要针对OK1、OK2、H6、O157血清(斜体+粗体为宿主菌)。
实施例6
大肠杆菌噬菌体GN4-1一步生长曲线的测定
将实施例1中备用的宿主菌培养物与过量的实施例1备用的噬菌体混合(MOI>10，确保所有细菌与噬菌体吸附)，37℃温浴15min后12000rpm离心1min，弃上清(未吸附的噬菌体)，LB液体培养基洗涤沉淀(相互吸附的细菌及噬菌体颗粒)1次，用10ml预热的LB液体培养基重悬沉淀，迅速置于37℃摇床中振荡培养，从0min开始，每隔10min取120μl培养物，4℃、10000rpm离心2min去除细菌，取上清稀释至适当浓度(适当浓度即在平板上形成30-300个噬菌斑的浓度)，双层法测定噬菌体效价，测130min，共取样14次，以取样时间为横坐标，噬菌体的效价的对数为纵坐标，绘制一步生长曲线得出噬菌体的潜伏期、暴发期、爆发量。一步生长曲线结果如图5所示，其感染宿主菌潜伏期极短(＜10min)，暴发期为30min。
实施例7
大肠杆菌噬菌体GN4-1的温度、酸碱度耐受实验
取10个无菌EP管，各加入0.5ml实施例1备用的噬菌体，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下作用30min、60min，作用时间结束后立即置于水浴中冷却，然后测定噬菌体的效价；检测结果如图6所示：该噬菌体能耐受50℃高温，60min内效价基本稳定，大于60℃时噬菌体效价随时间推移明显下降，60℃环境中30min内效价基本稳定，之后开始下降至失活，70℃、80℃环境中噬菌体迅速失活。
取11份0.1ml实施例1备用的噬菌体分别放入pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的SM缓冲液(0.9ml)中，37℃作用1-2h，然后用双层法测定反应后噬菌体的效价；检测结果如图7所示：大肠杆菌噬菌体GN4-1在pH值为4～10的环境中效价变化较小，活性基本不变；当环境pH>10或pH<4时，噬菌体的效价随酸、碱性的增强急剧下降；pH>12或pH<2时，噬菌体效价为0，全部失活，因此可知该噬菌体的最适pH为4～10。
实施例8
大肠杆菌噬菌体GN4-1在培养基中的杀菌效果
取不同动物源宿主菌培养物D4-1(猪)、P10(猪)、C4-2(猫)、P11(禽)和H116(人)，分别稀释到1×109CFU/ml，取无菌试管30根，对照组加入3ml LB液体培养基，实验组按照MOI＝1(最佳感染复数)分别加入1.5ml上述宿主菌培养物和1.5ml不同浓度的实施例1备用的噬菌体，置于37℃摇床(180rpm)连续震荡，每组做3个重复；6h后用分光光度计测宿主菌与噬菌体的共培养液的OD600，噬菌体杀菌实验结果如图8所示，positive control即培养液中仅有宿主菌没有噬菌体，在6h内OD600明显上升，并维持在一个较高水平；在不同细菌培养液中加入噬菌体GN4-1，6h后OD600都有明显降低且维持在极低水平(OD600＜0.25)，细菌几乎被全部杀死，说明噬菌体浓度不占优势时也能很好的抑制细菌的增长；综上所述，大肠杆菌噬菌体GN4-1在防控和治疗不同来源大肠杆菌感染方面都具有较好的应用前景。
实施例9
大肠杆菌噬菌体GN4-1控制4株不同大肠杆菌感染实验
实验选在广西大学动物房进行，实验对象是购自北京实验动物中心的SPF级BALB/c小鼠，取80只6周龄SPF级BALB/c小鼠，随机分成5组，每组4只，给予充足的食物和饮水饲养1周；1周后，各实验组小鼠分别腹腔注射不同剂量的菌液实施例1备用的宿主菌培养物和另外三株大肠杆菌(109、108、107、106cfu/只)，对照组腹腔注射等量的无菌PBS，观察实验小鼠的死亡情况，引起一组小鼠全部死亡的最小剂量即为最小致死量(MLD)；结果显示如表2所示，D4-1最小致死量(MLD)为108cfu/只；C4-2最小致死量(MLD)为109cfu/只；P11最小致死量(MLD)为109cfu/只；H116最小致死量(MLD)为108cfu/只。剖检高浓度致死小鼠检查，发现小鼠有严重腹水，并且小鼠肝脏和肺脏有明显坏死灶，盲肠出血，肠粘膜明显变薄。
表2.大肠杆菌D4-1(猪)、C4-2(猫)、P11(禽)和H116(人)在的最小致死量确定
Figure BDA0003245496970000111
60只BALB/c小鼠(公母各半)被随机分为三组，每组25只，分组如表3所示：以下所有小鼠大肠杆菌的攻毒剂量均为0.1mL(MLD浓度)，噬菌体攻毒剂量均为0.1mL(109PFU/mL)除阴性对照组仅0h腹腔注射0.1mL，噬菌体GN4-1治疗组在攻菌第4h开始进行噬菌体治疗，给予足够的饮水饮食连续观察并记录7天。
表3.大肠杆菌噬菌体GN4-1控制4株不同大肠杆菌感染实验分组
Figure BDA0003245496970000112
Figure BDA0003245496970000121
结果如图9显示，小鼠肝脏中，GN4-1对四种大肠杆菌均具有明显有效地控制作用，尤其是对D4-1控制作用最好，对H116控制最弱，对C4-2和P11的控制介于二者之间。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (8)

1.一株大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）GN4-1，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）GN4-1保藏号为CCTCC NO.M2021880。
2.根据权利要求1所述大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）GN4-1在制备预防和治疗大肠杆菌感染的疾病的药物中的应用。
3.一种噬菌体组合物，其特征在于：所述噬菌体组合物包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）GN4-1。
4.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂有效成分包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）GN4-1或如权利要求3所述的噬菌体组合物。
5.根据权利要求4所述噬菌体药物制剂，其特征在于：还包含药学上可接受的载体，剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂。
6.一种水体消毒剂，其特征在于：所述水体消毒剂有效成分包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）GN4-1或权利要求3所述的噬菌体组合物；其中还包含其他用于环境中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分。
7.根据权利要求6所述水体消毒剂通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具和饲料进行大肠杆菌的消毒。
8.一种用于水产品消毒的生物抑菌剂，其特征在于：包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage）GN4-1或如权利要求3所述的噬菌体组合物；生物抑菌剂的使用方法为：对水产品产品表面进行浸泡或者喷雾消毒，来抑制产品加工或保鲜过程中大肠杆菌的增殖。
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