CN114292822B - 大肠杆菌噬菌体zjrp5及其应用和杀菌剂、药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病害防治领域，特别是涉及大肠杆菌噬菌体ZJRP5及其应用和杀菌剂、药物。本发明一株具有杀菌作用的大肠杆菌噬菌体ZJRP5，所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的保藏编号为CCTCCNO.M202183。本发明所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5拥有较宽的宿主范围，能够有效防治大肠杆菌感染。

Description

大肠杆菌噬菌体ZJRP5及其应用和杀菌剂、药物

技术领域

本发明涉及病害防治领域，特别是涉及大肠杆菌噬菌体ZJRP5及其应用和杀菌剂、药物。

背景技术

肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)是引起家兔腹泻的主要病原菌，该菌具有高度传染性，严重制约了兔产业的健康发展。临床上常用抗生素进行防治，然而细菌耐药性问题的日益加剧致使养殖业发展和公共卫生安全面临严峻挑战。

大肠杆菌主要是环境中粪便通过污染水、土壤和饲料等途径，最后被动物食用所感染。常采用的方式方法：环境卫生消毒、口服或注射抗生素、口服或注射疫苗，达到治疗和预防大肠杆菌感染的目的，但由于其血清型众多及细菌耐药性问题，导致抗生素、疫苗使用受限。因此使用噬菌体来治疗耐药菌成为一种替代方案。但是，目前没有能够同时针对多种大肠杆菌的噬菌体。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了大肠杆菌噬菌体ZJRP5及其应用和杀菌剂、药物。本发明所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5拥有较宽的宿主范围，能够有效防治大肠杆菌感染。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株具有杀菌作用的大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)ZJRP5，所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的保藏编号为CCTCC NO.M 2021783。

本发明提供了上述技术方案所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5在制备杀菌药物或制备防治或预防大肠杆菌引起的传染病药物中的应用。

优选的，所述传染病包括大肠杆菌病。

本发明提供了一种杀菌剂，所述杀菌剂的有效成分包括上述技术方案所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。

优选的，所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5的浓度为1×10⁴～2×10¹⁰PFU/mL。

本发明提供了一种杀菌药物，所述药物的有效成分包括上述技术方案所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。

本发明提供了一种消毒剂或清洁剂，有效成分包括上述技术方案所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。

本发明提供了一种饲料添加剂组合物，有效成分包括上述技术方案所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。

优选的，靶标病菌包括大肠杆菌。

有益效果：本发明一株具有杀菌作用的大肠杆菌噬菌体ZJRP5，所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的保藏编号为CCTCC NO.M202183。本发明所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5拥有较宽的宿主范围，能够防治大肠杆菌感染。试验结果表明，本发明所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5可裂解8株致病性大肠杆菌，能有效防治兔大肠杆菌感染。可见该噬菌体拥有较宽的宿主范围，为宽谱噬菌体，特别是在防治兔大肠杆菌感染临床检测中可实现杀菌的效果，在兔大肠杆菌感染防控领域有相关产品具有应用及产品研发前景。

生物保藏说明息

大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)ZJRP5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072，保藏日期为2021年6月25日，保藏编号为CCTCC No.M 2021783。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ZJRE1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072，保藏日期为2021年6月25日，保藏编号为CCTCCNo.M 2021778。

附图说明

图1为噬菌体Ⅰ形态图；

图2为ZJRP5的全基因组比对进化树，其中，ZJRP5为大肠杆菌噬菌体ZJRP5；

图3为噬菌体Ⅰ的一步生长曲线图；

图4为噬菌体ZJRP5不同时间测定OD₆₀₀值，其中，ZJRP5为大肠杆菌噬菌体ZJRP5，ZJRE1为大肠埃希氏菌ZJRE1；

图5为血清内毒素含量检测结果；

图6为感染动物的回肠组织切片图，其中，A为A组，B为B组，C为C组。

具体实施方式

本发明提供了一株具有杀菌作用的大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)ZJRP5，所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的保藏编号为CCTCC NO.M 2021783。在本发明中，所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5的形态为：由六角形的头部、可收缩的尾鞘和尾管组成，头部直径约为95nm，尾鞘尾管长度约为100nm。在本发明中，所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5的生物学特性为：噬菌体的最佳感染复数为0.01，噬菌体在为pH7下存活率超过90％，在pH为5条件下存活率为89％。热稳定性测定在37℃或42℃条件下存活率接近100％。噬菌体一步生长曲线结果显示，噬菌体的潜伏期为16～19min，一个细胞的噬菌体最高裂解量为166个子代噬菌。本发明所述噬菌体ZJRP5为双链DNA，其基因组长度为166580bp，GC含量40.25％的，其全序列进行BLAST比较结果该噬菌体与大肠杆菌噬菌体EC_D7有97％的同一性。同时T4-like噬菌体的衣壳蛋白，不仅充当噬菌体遗传信息的保护包裹作用，同时在噬菌体组装等方面起着重要作用，作为典型的保守基因，常常用于遗传学和生物多样性分析，噬菌体ZJRP5 headvertex protein基因(参考NCBI Reference Sequence:NC_041936.1)的序列如SEQ IDNo.1所示：atgactcatatttttactgaactgttgcgggaatctacttcctcagtagctaaccagacagcgcgaccgcaactattatcattaactcgcgcggtaaacaacctgattttctctgatctggtagcaatccagccaacggatcaaccagtatctgcattgtacggcctacgttatcttaatcgtgatggtcagatgactttccgaactgctacaacctacggtggcgcggctggtgatcgcacagagattgaagagttttcaaaagaaaaatcttatgacgaaggcgcactgttcaaatcagacgatgttgtatacgaagttgtgaccgctggtacagtcggtgaagatgccgaaactccagaagctgcaatctttaaaggcgtaatgacaaacaaaattcgtttctatagcgattgtgcatcggtagaatactttgaagataaaaacaccgaaatttcgtctacctctatgcagtttgataaatggcaggttaatgtaggttctcgtaaactgaaaacctcattcacgaccgaattgatgcaggatcttgaggcaagccaaatcaactctgaaaactctgtaattgatcttctggctactgttgcttccgaagagatcaacaaagatattattcagaagttgatcactgtatcatctcgctataaaattaaagggatcacccctgatggcgtactttctctcgttagcgttaaggatgcaccaacacaagcgcgtgaactttaccgctatgcttgcgaaatgagcaatcaaatgttgcggacttcctcctttgctggtacatacgttttggcgtcttctcgcgtggttggcctcctgcaatctaccggttggatggaagaaaccgacaatgctctaagtgaaggtcgtctgcgttgcggtctggaagtgtacgcagacacaacgacacctttcgattatatgctcgttggttgtaagcacatgatcggtgatatggagagtgtaggttctctgttctactccccatatacagaagccgacggcgctggcgcgtataagagcgtaattgaccctaatagcttccagcatcatgtagctattatgaatcgttattcactctctgtcaacccatacacatcaaaagttgatcaggaagaacaccaggtcatcaagggtgacgattggggtaaaatggctggacgctctgaaatgtcctacattttaggaatcgaactgccaccgcttgagattgacaacgcttaa，即该噬菌体特异性序列。本发明所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5可裂解8株致病性大肠杆菌，拥有较宽的宿主范围，能够防治大肠杆菌感染。

本发明所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5通过实验验证该噬菌体可裂解8株致病性大肠杆菌，能有效防治兔大肠杆菌感染。可见该噬菌体拥有较宽的宿主范围，为宽谱噬菌体，特别是在防治兔大肠杆菌感染临床检测中可实现杀菌的效果，在兔大肠杆菌感染防控领域有相关产品具有应用及产品研发前景。因此，本发明所述噬菌体能够用于制备杀菌药物或制备防治或预防大肠杆菌引起的传染病药物。

本发明提供了上述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5在制备杀菌药物或制备防治或预防大肠杆菌引起的传染病药物中的应用。在本发明中，所述传染病优选包括大肠杆菌病。本发明所述噬菌体具有较宽的宿主范围，能够对多种大肠杆菌起到杀菌的作用。

本发明提供了一种杀菌剂，所述杀菌剂的有效成分包括上述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。在本发明中，所述杀菌剂中有效活性成分优选为大肠杆菌噬菌体ZJRP5增殖液；所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5增殖液中的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的浓度优选为1×10⁴～2×10¹⁰PFU/mL，进一步优选为1×10⁵～1×10⁸PFU/mL，更优选为1×10⁶～1×10⁸PFU/mL。在本发明中，所述杀菌剂的靶标病菌包括大肠杆菌。本发明通过动物模型实验验证本发明所述杀菌剂能够有效防治兔大肠杆菌。

本发明提供了一种杀菌药物，所述药物的有效成分包括上述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。在本发明中，所述杀菌药物中有效活性成分优选为大肠杆菌噬菌体ZJRP5增殖液；所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5增殖液中的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的浓度优选为1×10⁴～1×10⁹PFU/mL，进一步优选为1×10⁵～1×10⁸PFU/mL，更优选为1×10⁶～1×10⁸PFU/mL。在本发明中，所述杀菌药物的靶标病菌优选包括大肠杆菌。

本发明提供了一种消毒剂或清洁剂，有效成分包上述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。在本发明中，所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5中的活性成分优选为大肠杆菌噬菌体ZJRP5增殖液；所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5增殖液中的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的浓度优选为1×10⁴～2×10¹⁰PFU/mL，进一步优选为1×10⁵～1×10⁸PFU/mL，更优选为1×10⁶～1×10⁸PFU/mL。在本发明中，所述消毒剂或清洁剂的靶标病菌优选包括大肠杆菌，本发明提供的消毒剂或清洁剂以大肠杆菌噬菌体ZJRP5为活性组分，对大肠杆菌有较好的杀灭效果。

本发明提供了一种饲料添加剂组合物，有效成分包括上述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。在本发明中，所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5中的活性成分优选为大肠杆菌噬菌体ZJRP5增殖液；所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5增殖液中的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的浓度优选为1×10⁴～2×10¹⁰PFU/mL，进一步优选为1×10⁵～1×10⁸PFU/mL，更优选为1×10⁶～1×10⁸PFU/mL。在本发明中，所述饲料添加剂组合物的靶标病菌优选包括大肠杆菌。本发明以大肠杆菌噬菌体ZJRP5为活性成分作为饲料添加剂，能够有效防治动物的大肠杆菌导致的传染病。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的大肠杆菌噬菌体ZJRP5及其应用和杀菌剂、药物进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1噬菌体分离纯化与形态观察

宿主菌：宿主菌为兔致病性大肠杆菌：大肠埃希氏菌ZJRE1(CCTCC No.M2021778)，分离自腹泻病兔，为肠致病性大肠杆菌，后续实施例采用的宿主菌均为兔致病性大肠杆菌ZJRE1(CCTCC No.M 2021778)。

试验样品前处理：将50个采集的兔粪便样本分别置于15mL离心管，加入0.9wt.％生理盐水10mL和采集的污水样本5mL，4℃冰箱过夜，6000r·min^-1离心10min，取上清，0.22μm过滤除菌，得到50个过滤粪便和污水样品，4℃冰箱保存备用。

噬菌体扩增及初筛：宿主菌TSA平板(购于OXOID公司)常规划线培养，挑取单个接种于2mL TSB培养基(购于OXOID公司)中，37℃恒温摇床培养12h，得到宿主菌培养物；取20μL宿主菌培养物接种于2mL TSB(购于OXOID公司)培养基中，37℃恒温摇床培养，每隔30min测量菌液OD值(美国Spectramax多功能酶标仪)，直至菌液浓度OD₆₀₀值为0.2(对数生长期)，向摇菌管中分别加入过滤粪便和污水样品1.5mL，37℃摇床内过夜，培养液置于2mL离心管中，4000r·min^-1离心10min，取上清，通过0.22μm滤器过滤，得样品滤液，4℃冰箱备用；取宿主菌100μL涂布于TSA平板上，在TSA平板背面画出大的正方形，再均等分成9个正方形格子并进行标号，将50个样品滤液根据平板标号进行点滴，每份样品10μL，37℃恒温培养箱过液培养。

双层平板法分离噬菌体及纯化：配置分离所需半固体培养基：取3g TSB和4g TSA，加入200mL去离子水，高压灭菌，55℃温箱保存备用；将平板出现空斑的样本按照标号找出对应噬菌体滤液等比例进行梯度稀释，稀释至10^-2、10^-3。取稀释至10^-2和10^-3的噬菌体稀释液各100μL与0.1ml处于对数生长期分离宿主菌液(即菌液浓度OD₆₀₀值为0.2)混合，37℃恒温培养箱孵育20min，得孵育液；将半固体培养基5mL分别加入孵育液中，轻轻混匀；混合均匀的半固体培养基倒入TSA平板中，37℃培养过夜，观察噬菌斑；

挑取透光度良好，个体较大的单噬菌斑于1mL SM溶液(购于百奥莱德生物公司)中获得噬菌体液，各取100μL噬菌体液和100μL宿主菌液(宿主菌液的制备方法同“噬菌体扩增及初筛”)混合20min，继续用双层平板法培养噬菌体，如此重复三次。直至形成的噬菌斑形状和大小基本一致，得纯化后的噬菌体Ⅰ。

纯化后的噬菌体Ⅰ增殖液制备：(1)取20μL上述制备得到的宿主菌培养物接种于2mL TSB(购于OXOID公司)培养基中，37℃恒温摇床培养，每隔30min测量菌液OD值(美国Spectramax多功能酶标仪)，直至菌液浓度OD₆₀₀值为0.2(即宿主菌的对数生长期)；(2)分别挑取纯化后的噬菌体Ⅰ的单个噬菌斑，接种于3mL处于宿主菌中，37℃160r/min振荡培养肉眼可见液体澄清，之后10000rpm离心10min，再用0.22μm的滤器过滤，即可得到纯化后的噬菌体Ⅰ增殖液。将增殖后的噬菌体用于后续研究，或加入50％的甘油或10％DMSO混合均匀后于-80℃保藏。

电镜观察形态结构：取纯化后的噬菌体Ⅰ增殖液20μL滴在铜网上，静置10min后，用滤纸在铜网侧面将剩余的液体吸取，再在铜网上滴2％磷钨酸10μL，同样吸取剩余液体，静置干燥后放于飞利浦CM100型透射电镜100kv条件下观察噬菌体Ⅰ形态。结果显示如图1所示：噬菌体Ⅰ为由六角形的头部、可收缩的尾鞘和尾管组成，头部直径约为95nm，尾鞘尾管长度约为100nm。

实施例2噬菌体ⅠpH稳定性测定

双层平板法测定噬菌体Ⅰ效价：制备得到的噬菌体Ⅰ增殖液(参照实施例1)分别用无菌生理盐水10倍梯度稀释，得稀释增殖液。做双层板，下层为10mL LB固体培养基，上层为100μL稀释增殖液、500μL宿主菌液的培养物(培养物为稀释增殖液和宿主菌液混合后37℃水浴5min所得)和5mL TSB半固体培养基(购于OXOID公司)，待凝固后，倒置37℃恒温培养箱中18h观察是否有噬菌斑。每个浓度重复3次，噬菌斑计数，计算噬菌体效价。计算公式如下：噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数目×稀释倍数×10。

不同pH条件下噬菌体Ⅰ的稳定性测定：将500μL噬菌体Ⅰ增殖液(TSB调整浓度至1×10⁹PFU/mL)用1mmol/L的NaOH和HC1调节TSB pH为3、5、7、9，分别于37℃温箱孵育1h后，每个pH处理重复3次，双层平板法测定噬菌体效价，检测结果见表1。

表1不同pH条件下噬菌体Ⅰ的效价和存活率

结果如表1所示，噬菌体Ⅰ在pH为5和7条件下存活率大于90％，噬菌体效价仍接近10⁹PFU/mL；pH为3和9条件下，噬菌体全部死亡。

实施例3噬菌体Ⅰ热稳定性测定

分别取500μL实施例2制备得到的噬菌体Ⅰ增殖液(TSB调整浓度至1×10⁹PFU/mL)于试管中，分别放置于37℃、42℃、50℃和60℃恒温水浴锅中，静置1h后取出，冰浴冷却10min。分别取100μL冷却所得噬菌体Ⅰ增殖液用双层平板法测定噬菌体效价，结果见表2。

表2不同微温度条件下噬菌体Ⅰ的效价

由表2记载的可知，随着温度升高，噬菌体Ⅰ存活率也随之降低。噬菌体Ⅰ在37℃和42℃条件下的效价均在10⁹PFU/mL左右，存活率接近100％；在50℃条件下噬菌体存活率为80％左右，但效价接近10⁹PFU/mL左右；且在55℃条件下，噬菌体Ⅰ的存活率为40％左右；在60℃条件下，噬菌体的效价下降至10⁷PFU/mL左右，存活率不足1％。

实施例4噬菌体Ⅰ一步生长曲线测定

按照实施例1方法，获得宿主菌培养物，取50μL宿主菌接种于5mL TSB培养基中，按实施例1培养菌液浓度至OD₆₀₀≈0.2(TSB调整浓度至1×10⁷CFU/mL)，取900μL菌液与100μL浓度为1×10⁷PFU/mL的噬菌体Ⅰ增殖液(制备方法参照实施例1，TSB调整浓度至1×10⁷PFU/mL)分别混合置于37℃恒温培养箱孵育10min。噬菌体充分吸附宿主菌后，加入10mL的TSB重悬。将该混合培养物用TSB稀释100倍后置于37℃、200rpm摇床中培养，每隔5min，用双层平板法测定噬菌体效价，结果如表3和图3所示。噬菌体的裂解量则以曲线中噬菌体计数与潜伏期噬菌体计数的比值表示(Zhang C.,Li W.,Liu W.,Zou L.,Yan C.,Lu K.,RenH.2013.T4-like phage Bp7,a potential antimicrobial agent for controllingdrug-resistant Escherichia coli in chickens.Appl.Environ.Microbiol.,79:5559-5565.https://doi.org/10.1128/)。

表3噬菌体Ⅰ一步生长曲线测定数据

min	重复1	重复2	重复3
				0	0	0	0
5	0	0	0
				10	1	2	2
15	1	3	2
				20	6	12	10
25	129	148	139
				30	161	168	169
35	157	146	150
				40	166	156	158

噬菌体一步生长曲线结果如表3和图3所示，噬菌体Ⅰ的潜伏期为16～19min，一个细胞中的噬菌体Ⅰ的最高裂解量为166个子代噬菌体。

实施例5噬菌体最佳感染复数(MOI)测定

感染复数MOI：感染情况下，噬菌体与宿主菌细胞的数量比值，即每个细胞感染噬菌体的数目。

具体步骤为：(1)制备噬菌体Ⅰ增殖液(方法同实施例1)；(2)将噬菌体Ⅰ增殖液滴度用TSB调整到约为1.0×10⁹PFU/mL，然后用TSB进行连续10倍比稀释，分别得到浓度为1.0×10⁹、1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴PFU/mL的噬菌体Ⅰ增殖稀释液。(3)按照实施例1方法，获得宿主菌培养物，取50μL宿主菌培养物接种于5mL TSB培养基中，37℃震荡培养12h，调整浓度至1×10⁸CFU/mL，得宿主菌液。(4)噬菌体Ⅰ增殖液稀释液分别与浓度约为1.0×10⁸CFU/mL的宿主菌混合后，37℃摇床震荡培养8h，将培养所得培养物6000r·min^-1离心5min，收集上清并稀释，采用双层平板法进行测定噬菌体Ⅰ效价的测定，结果如表4所示。

表4噬菌体Ⅰ效价的测定测定数值

由表4记载的可知，噬菌体Ⅰ浓度为1×10⁶PFU/mL、细菌浓度为1×10⁸CFU/mL时，即噬菌体Ⅰ与宿主菌感染比为0.01时，噬菌体Ⅰ效价最高为3.68×10¹¹PFU/mL，扩增比值最高为368000，在此浓度下噬菌体Ⅰ扩增效率最高。

由实施例2～5记载的可知，噬菌体的生物学特性：噬菌体的最佳感染复数为0.01，效价为10⁹PFU/mL。噬菌体在pH为5、7条件下感染效价基本保持不变、仍接近10⁹PFU/mL，pH为3和9条件下噬菌体全部死亡。热稳定性测定结果显示效价为10⁹PFU/mL噬菌体在37℃和42℃条件下的效价均在10⁹PFU/mL左右；随温度升高噬菌体效价也随之下降，但在50℃条件下仍接近10⁹PFU/mL左右,在60℃条件下噬菌体的效价急剧下降至10⁷PFU/mL左右，70℃噬菌体不能存活。噬菌体一步生长曲线结果显示，噬菌体的潜伏期为16～19min，一个细胞的噬菌体最高裂解量为166个子代噬菌。

实施例6噬菌体Ⅰ全基因组高通量测序

本实施例由苏州金唯智生物科技有限公司进行高通量测序。扩增得到的噬菌体Ⅰ的基因组特征如表5所示，该噬菌体的基因组长度为166580bp，GC含量40.25％，T4-like噬菌体的衣壳蛋白，不仅充当噬菌体遗传信息的保护包裹作用，同时在噬菌体组装等方面起着重要作用，作为典型的保守基因，常常用于遗传学和生物多样性分析，噬菌体ZJRP5 gp24head vertex protein基因的序列如SEQ ID No.1。同时对该噬菌体的全序列制作系统进化树，结果如图2所示，噬菌体Ⅰ为烈性噬菌体，属于尾噬菌体目，肌尾噬菌体科，为Tevenvirinae亚科，Krischvirus属，BLAST比较结果该噬菌体与大肠杆菌噬菌体EC_Makalu_002有97％的同一性(查询覆盖率＝94％；E值＝0.0)，为T4-like噬菌体，因此将噬菌体Ⅰ命名为大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)ZJRP5。

表5噬菌体Ⅰ基因组特征

核酸	基因组长度(bp)	GC含量(％)	BLAST比较相似
				dsDNA	166580	40.25	大肠杆菌噬菌体EC_D7

实施例7体外条件下噬菌体ZJRP5对宿主菌的作用效果

(1)按照实施例1方法，获得宿主菌培养物，取50μL宿主菌接种于5mL TSB培养基中，37℃震荡培养，所得培养液的浓度D₆₀₀≈0.2，得培养液；

(2)按实施例1进行噬菌体ZJRP5裂解液制备，调整浓度1×10⁵PFU/mL；

(3)取100μL培养液与100μL噬菌体ZJRP5增殖液混合，置于37℃恒温培养箱孵育10min。噬菌体ZJRP5充分吸附宿主菌后，6000r·min^-1离心5min，弃上清液，将所得白色沉淀用10mL TSB培养液重悬，37℃摇床震荡培养，分别在0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、22、24h后，取样测定OD₆₀₀值对比细菌浓度，每个处理重复3次，结果见表6和图4。

表6不同时间测定得到的OD₆₀₀值

时间(h)	重复1	重复2	重复3
				0	0.2617	0.2424	0.2491
0.5	0.3797	0.3835	0.3813
				1	0.4992	0.4889	0.503
2	0.1482	0.1367	0.1454
				3	0.1208	0.1165	0.1161
4	0.1146	0.1213	0.1187
				5	0.1073	0.1105	0.1086
6	0.2281	0.2237	0.2262
				7	0.1013	0.1035	0.1039
8	0.114	0.1256	0.1187
				9	0.2464	0.1859	0.2146
10	0.2964	0.286	0.2913
				20	0.6806	0.5993	0.6403
22	0.7853	0.6651	0.7223
				24	0.7517	0.7112	0.7317

由表6和图4记载的可知，噬菌体ZJRP5优化的过程中噬菌体感染宿主菌1h内菌液OD₆₀₀升高，此时噬菌体ZJRP5与宿主菌相互吸附；噬菌体感染宿主菌2～6h内，菌液OD₆₀₀下降，噬菌体ZJRP5开始裂解宿主菌，6h时出现不同浓度出现浮动，噬菌体ZJRP5感染宿主菌8h后，菌液OD₆₀₀值上升，说明噬菌体ZJRP5裂解宿主菌最佳作用时间是8h。

实施例8噬菌体宿主谱测定

本实施例采用的15株大肠杆菌均购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(http://cvcc.ivdc.org.cn/)，详见表7。

首先将待测大肠杆菌的菌液分别接种到TSB培养液(购于OXOID生物公司)中，37℃摇床震荡培养18h，调整浓度至1×10⁸CFU/mL，取100μL均匀涂布在TSA平板上，静置干燥后，在TSA平板背面画出大小均等9个正方形格子并进行标号；

将噬菌体ZJRP5裂解液(采用实施例1的方式获得)根据平板标号进行点滴，每格噬菌体ZJRP5裂解液的用量为10μL，待干燥后，37℃恒温培养箱培养18h，观察噬菌斑情况，对细菌裂解情况标注并统计。噬菌体宿主谱结果显示，采用点滴法对噬菌体宿主谱进行测定，结果见表7。

表7噬菌体宿主谱测定结果

大肠杆菌菌株E.coli	ZJRP5
		大肠杆菌CCTCC2021778	+
大肠杆菌CVCC2939	-
		大肠杆菌CVCC2917	-
大肠杆菌CVCC2889	+
		大肠杆菌CVCC2881	+
大肠杆菌CVCC1454	-
		大肠杆菌CVCC1510	+
大肠杆菌CVCC200	+
		大肠杆菌CVCC2592	+
大肠杆菌CVCC1501	-
		大肠杆菌CVCC1343	-
大肠杆菌CVCC1490	+
		大肠杆菌CVCC227	-
大肠杆菌CVCC249	+
		大肠杆菌CVCC232	-
大肠杆菌CVCC1495	-

注：“+”表示敏感，“-”表示不敏感。

由表7记载的可知，噬菌体ZJRP5可裂解8株致病性大肠杆菌分别是CCTCC2021778(兔源)、CVCC2889(人畜禽共患)、CVCC2881(人畜禽共患)、CVCC1510(猪源)、CVCC200(猪源)、CVCC2592(人畜禽共患)、CVCC1490(鸡源)、CVCC249(猪源)，该株噬菌拥有较宽的宿主范围，为宽谱噬菌体。

实施例9噬菌体抗兔大肠杆菌效果

试验方案：35日龄新西兰实验兔(新西兰肉兔)18只，随机分为3组，即A组、B组、C组，每组6只。

A组、B组、C组分别为空白对照组、攻毒对照组、灌胃噬菌体裂解液。

试验开始前1天，实验兔断食断水，试验开始前10min每只实验兔口服500μL NaCO₃溶液，以减少实验兔体内胃酸。A组口服灌胃50mL PBS溶液；B、C分别灌胃50mL浓度为4×10⁸CFU/mL宿主菌培养物(按照实施例1方法，获得宿主菌培养液，取1000μL宿主菌接种于100mL TSB培养基中，37℃震荡培养18h，用TSB调整浓度至4×10⁸CFU/mL，得宿主菌培养物)；C组口服30mL浓度为2×10¹⁰PFU/mL的噬菌体ZJRP5增殖液(按实施例2方法制备)，每隔8小时进行灌胃噬菌体ZJRP5增殖液，共3次。饲喂5天，持续观察记录兔精神状况和腹泻率。在试验5天内，A组实验兔食欲正常、运动自如，并无腹泻等临床症状；B组共3只实验兔发生腹泻，1只实验兔死亡；C组共1只实验兔发生腹泻，其余其余实验兔食欲正常、运动自如，并无腹泻等临床症状。

分别于感染前1天，感染后第3天、第5天对所有实验兔进行体重称量称量结果见表8和表9，同时每只实验兔采集100μL新鲜血液放置于含有1％肝素钠的抗凝试剂管中，其中含有1％肝素钠的抗凝试剂中肝素钠的用量为2μL，在全自动血液分析仪上测定血液白细胞含量和嗜中性粒细胞的含量，检测结果见表10和表11。

表8不同天数实验兔的重量(ɡ)

表9感染宿主菌后噬菌体ZJRP5治疗兔增重变化

试验天数		A组	B组	C组
					0～3d	增重变化	73±3a	-3.8±3b	54±5a
0～5d	增重变化	95±13a	14.2±6b	118±20c

注：肩标不同字母表示显著差异。

由表8和表9记载的可知，B组在0～3天体重下降且增重为负(P＜0.05)；C组相对于A组体重增长不显著，但在0～5天，C组相对于A组的增重有显著差异(P＜0.05)，由此可见，在感染宿主菌的情况下，本发明所述噬菌体ZJRP5能够提高实验兔的重量。

表10血液白细胞(WBC)的含量(10³/μL)

	0d	3d	5d
				A组	6.93±3.95	8.61±4.50a	11.95±5.12a
B组	4.48±2.24	13.83±1.91b	19.18±2.77c
				C组	4.6±2.29	10.26±3.13b	13.88±3.27a

注：肩标不同字母表示显著差异。

表11血液嗜中性粒细胞(W-LCC)的含量(10³/μL)

	0d	3d	5d
				A组	1.08±1.50	1.53±1.30a	2.4±1.74a
B组	0.53±0.20	6.07±6.06c	6.6±7.34c
				C组	0.80±0.69	2.22±0.91a	2.76±1.40a

注：肩标不同字母表示显著差异。

由表10和表11记载的可知，B组白细胞(WBC)数量和嗜中性粒细胞(W-LCC)的比例显著升高。B组的WBC数量在第3天相对于A组显著上升(P＜0.05)，与噬菌体C组差异不显著。在第5天，B组的WBC数量继续上升，相对于其他A组、C组都有显著差异。B组在第3、5天的W-LCC数量显著高于其他三组。

试验的第5天同时对剩余的血液离心分离血清并分装，使用兔内毒素酶联免疫分析试剂盒按照说明书上操作步骤进行测定，测定结果见表12和图5。

表12血清内毒素的含量(nq/mL)

A组	8.072392	39.38921	7.185544	11.80454	20.89474	6.150888
							B组	106.1615	66.51198	101.4501	54.15154	109.598	91.25134
C组	63.35258	41.27376	15.40736	63.35258	68.91386	57.99454

注：肩标不同字母表示显著差异。

血清内毒素含量检测结果由表13和图5记载的可知，B组血清中内毒素含量显著高于其他三组(P＜0.05)。而接受噬菌体防治的C组的实验兔与B组相比血清内毒素含量显著降低。可见，本发明所述噬菌体能够降低实验兔的内毒素含量，达到有效防治致病性大肠杆菌。

为观察宿主菌对小肠绒毛的粘附情况，在宿主菌感染后第5天处死。取回肠用生理盐水清洗，然后放入4％多聚甲醛组织固定液中再做组织石蜡切片，切片的组织样本用苏木精－伊红染色后在显微镜下观察和拍照。结果如图6所示实验A组实验兔肠黏膜层绒毛完整且饱满，排列整齐(图6中的A)。B组实验兔肠黏膜层绒毛排列紊乱，绒毛明显萎缩、断裂、脱落，绒毛内出血点明显，提示可能是由于ZJE1定殖在肠道绒毛而引发炎症(图6中的B)。噬菌体C组实验兔肠绒毛结构较为完整，接近正常形态(图6中的C)。可见，本发明所述噬菌体能够修复致病性大肠杆菌对小肠绒毛的破坏，达到有效防治致病性大肠杆菌。

由上述实施例记载的可知，本发明所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5拥有较宽的宿主范围，能够防治大肠杆菌感染。试验结果表明，本发明所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5可裂解8株致病性大肠杆菌，能有效防治兔大肠杆菌感染。可见该株噬菌拥有较宽的宿主范围，为宽谱噬菌体，特别是在防治兔大肠杆菌感染临床检测中可实现杀菌的效果，在兔大肠杆菌感染防控领域有相关产品具有应用及产品研发前景。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 大肠杆菌噬菌体ZJRP5及其应用和杀菌剂、药物

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactcata tttttactga actgttgcgg gaatctactt cctcagtagc taaccagaca 60

gcgcgaccgc aactattatc attaactcgc gcggtaaaca acctgatttt ctctgatctg 120

gtagcaatcc agccaacgga tcaaccagta tctgcattgt acggcctacg ttatcttaat 180

cgtgatggtc agatgacttt ccgaactgct acaacctacg gtggcgcggc tggtgatcgc 240

acagagattg aagagttttc aaaagaaaaa tcttatgacg aaggcgcact gttcaaatca 300

gacgatgttg tatacgaagt tgtgaccgct ggtacagtcg gtgaagatgc cgaaactcca 360

gaagctgcaa tctttaaagg cgtaatgaca aacaaaattc gtttctatag cgattgtgca 420

tcggtagaat actttgaaga taaaaacacc gaaatttcgt ctacctctat gcagtttgat 480

aaatggcagg ttaatgtagg ttctcgtaaa ctgaaaacct cattcacgac cgaattgatg 540

caggatcttg aggcaagcca aatcaactct gaaaactctg taattgatct tctggctact 600

gttgcttccg aagagatcaa caaagatatt attcagaagt tgatcactgt atcatctcgc 660

tataaaatta aagggatcac ccctgatggc gtactttctc tcgttagcgt taaggatgca 720

ccaacacaag cgcgtgaact ttaccgctat gcttgcgaaa tgagcaatca aatgttgcgg 780

acttcctcct ttgctggtac atacgttttg gcgtcttctc gcgtggttgg cctcctgcaa 840

tctaccggtt ggatggaaga aaccgacaat gctctaagtg aaggtcgtct gcgttgcggt 900

ctggaagtgt acgcagacac aacgacacct ttcgattata tgctcgttgg ttgtaagcac 960

atgatcggtg atatggagag tgtaggttct ctgttctact ccccatatac agaagccgac 1020

ggcgctggcg cgtataagag cgtaattgac cctaatagct tccagcatca tgtagctatt 1080

atgaatcgtt attcactctc tgtcaaccca tacacatcaa aagttgatca ggaagaacac 1140

caggtcatca agggtgacga ttggggtaaa atggctggac gctctgaaat gtcctacatt 1200

ttaggaatcg aactgccacc gcttgagatt gacaacgctt aa 1242

Claims (9)

1.一株具有杀菌作用的大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)ZJRP5，其特征在于，所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5的保藏编号为CCTCC NO.M2021783。

2.权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5在制备杀菌药物或制备防治或预防大肠杆菌引起的传染病药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述传染病包括大肠杆菌病。

4.一种杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂的有效成分包括权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。

5.根据权利要求4所述杀菌剂，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体ZJRP5的浓度为1×10⁴～2×10¹⁰PFU/mL。

6.一种杀菌药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。

7.一种消毒剂或清洁剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。

8.一种饲料添加剂组合物，其特征在于，有效成分包括权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体ZJRP5。

9.根据权利要求4所述的杀菌剂或根据权利要求6所述的杀菌药物或根据权利要求7所述的消毒剂、清洁剂或根据权利要求8所述的饲料添加剂组合物，其特征在于，靶标病菌包括大肠杆菌。

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