KR101260645B1

KR101260645B1 - 대장균 특이적 사멸능을 나타내는 신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR101260645B1
Application number: KR1020110118446A
Authority: KR
Inventors: 김재원; 조영욱; 신은미; 김영사; 양시용
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2011-11-14
Publication date: 2013-05-03
Also published as: WO2013073843A1; BR112013004206B1; US20140356330A1; TWI465570B; EP2780447A4; EP2780447B1; TW201326395A; BR112013004206A2; CN103946375A; CN103946375B; EP2780447A1; US9358258B2

Abstract

본 발명은 대장균 특이적 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지(bacteriophage), 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 장독소 대장균 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 이용하여 대장균증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 박테리오파지는 병원성 대장균에 특이적 사멸능을 가지는 반면, 내산성 및 내열성이 우수하므로, 병원성 대장균 감염성 질병인 돼지 대장균증의 예방 또는 치료에 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 사료 첨가용 조성물, 소독제 및 세척제 등으로 광범위하게 이용될 수 있다.

Description

대장균 특이적 사멸능을 나타내는 신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel isolated bacteriophage having E. coli specific antibacterial activity and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 대장균 특이적 사멸능을 나타내는 신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 대장균 특이적 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지(bacteriophage), 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 장독소 대장균 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 이용하여 대장균증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

대장균은 장내세균과(Enterobacteriaceae), 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 그람 음성의 단간균으로 포유동물을 비롯한 다양한 동물의 장관 내에 존재하는 정상 세균총 중의 하나이다. 대부분 비병원성으로 기회감염을 유발할 수 있으나, 일부 고병원성 균주는 사람을 비롯한 포유 동물에서 다양한 장 질환과 패혈증 등을 유발하는 것으로 밝혀져 있다. 이들 중 위장관계 질환을 일으키는 균주들을 병원성에 따라 크게 여섯 종류로 분류할 수 있다. 이들은 장독소성 대장균(Enterotoxigenic E.coli, ETEC), 장병원성 대장균(Enteropathogenic E.coli, EPEC), 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC), 장응집성 대장균(Enteroaggregative E.coli, EAEC), 장침입성 대장균(Enteroinvacive E.coli, EIEC), 괴사소성 대장균(Necrotoxigenic E.coli, NTEC)이다. 이들 중 장독소성 대장균(Enterotoxigenic E.coli, ETEC)은 양돈에서 대장균 감염성 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 세균이나 바이러스의 감염에 의하여 유발되는 질병은 그 원인체를 밝히면 진단이 가능하지만, 대장균의 경우는 건강한 동물의 장내에 상재하기 때문에 대장균 감염에 의하여 유발되는 질병을 조기에 진단하기가 어렵다는 문제점이 있었다(특허등록 제963157호).

상기 ETEC는 그람 음성의 간균이며 주모성 편모가 있어서 운동성은 있으나, 편모가 없고 비운동성인 것도 있다. 락토즈(Lactose), 프락토즈(Fructose)를 분해하여 산과 가스를 생성하는 호기성 또는 통성 혐기성균이다. 보통 배지에서도 잘 자라고 발육 가능한 온도는 7~48℃, 최적 온도는 35~37℃, 발육 가능한 pH 범위는 pH 4.5~9.0 이다. 콜레라와 유사한 독소를 생산하는데, 이 독소는 60℃에서 10분간 가열했을 때 활성을 잃는 이열성독소(heat-labile enterotoxin, LT)와 100℃에서 30분간 가열해도 내성을 나타내는 내열성독소(heat-stable enterotoxin)로 나눌 수 있다. 이 균에 감염되면 콜레라의 경우와 유사한 특징을 보이는데, 균은 소장 상부에서 증식해 ml 당 10⁷~10⁸ cfu(colony formation unit)의 균농도에 도달한 경우에 대장균 감염성 질병을 유발시킨다.

현재, 양돈산업의 대규모 집단사육 추세에 따라 돼지의 대장균증은 양돈장에서 가장 흔하고 또 문제시되는 질병으로 대두되고 있다(박영일, 선진문화사, 353-359, 1998). 최근 우리나라에서도 돼지의 대장균증 발생이 증가하여 설사로 인한 어린 돼지의 성장지연 및 폐사로 사육농가에 경제적으로 커다란 손실을 초래하고 있는 실정이다(홍의철, 단국대학교 석사학위논문, 조기 이유 자돈에 있어 난황 항체의 첨가 효과, 2001). 특히 병원성 대장균 감염에 의한 설사를 주 증상으로 하는 소화기 질병인 돼지 대장균증은 우리나라의 거의 모든 사육농가에서 발생되는 질병이다. 돼지 대장균증은 어린 돼지에서 많이 발생하며, 그 감염시기에 따라 신생자돈 설사, 포유자돈 설사 및 이유자돈 설사로 나뉜다. 대장균의 감염에 의한 대장균증은 병원성 대장균이 주로 오염된 사료나 물 등을 통한 경구감염에 의해 전파되며, 신생자돈에 있어서는 분변을 통한 감염이나 어미의 유두를 통한 감염이 주 경로이다 (황철호, 10-2006-0102624, 돼지 장독소성 대장균증에 대한 경구 백신용 형질전환식물체 개발, 2006년10월22일). 돼지 대장균증을 예방 및 치료하기 위하여 많은 항생제를 사용하고 있으나, 항생제 오남용시 돼지에게 내성 및 체내에 잔류될 가능성이 있기 때문에 현재 세계적으로 항생제 투여에 많은 제한을 두고 있다(Mason HS et al., Trends in Biotech. 13:388-392, 1995).

한편, 박테리오파지는 특정 세균에만 감염하여 세균의 성장을 통제하는 세균특이적 바이러스로 세균 숙주 없이는 자가 증식이 불가능하다. 박테리오파지는 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA가 유전물질로써 핵산을 구성하고 있으며, 형태학적인 구조에 따라서 수축성 꼬리 형태의 마이오비리데(Myoviridae), 길고 수축성이 없는 꼬리의 시포비리데(Siphoviridae), 그리고 짧은 꼬리의 포도비리데(Podoviridae)로 분류된다.(Arch Virol (2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter et al ., Bacteriophages biology and application; CRC press).

박테리오파지의 발견 이후 이를 감염질병 치료제로 이용하기 위한 연구가 진행되었지만 광범위한 숙주범위(broad target spectrum)를 갖는 항생제의 특성에 비해 숙주특이성(specific target spectrum)을 갖는 박테리오파지가 경쟁에서 밀려나 관심을 받지 못했다. 하지만 항생제의 오남용으로 항생제 내성균의 문제가 심각해 지고, 식품내의 항생제 잔류에 의한 인체에 미칠 영향에 대한 우려가 더해지고 있다(Cislo, M et al . Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183; 김성훈 외. 박테리오파지, 새로운 대체항생제. BRIC). 특히 동물의 성장촉진을 위해 사료에 첨가하는 항생제(antimicrobial growth promoter, AGP)가 항생제 내성유발의 주요원인임이 밝혀짐에 따라 AGP의 사용을 금지하는 정책들이 입안되어 유럽연합은 2006년부터 모든 AGP의 사용이 금지되었고 한국은 2011년 7월에 전면금지 되었다.

이러한 흐름을 바탕으로 박테리오파지의 연구가 다시 관심을 모으고 있다. 박테리오파지를 이용하여 E. coli O157:H 균을 통제하기 위한 박테리오파지 7개가 2002년도에 미국 특허등록(미국 등록특허 제6,485,902호) 되었으며, Nymox 사에서는 다양한 종의 미생물을 통제하는 박테리오파지 2종에 대하여 2005년도에 미국 특허등록(미국 등록특허 제6,942,858호)을 받았다. 박테리오파지에 관한 연구가 활발히 진행됨에 따라 산업계에서 또한 박테리오파지를 이용한 다양한 상품을 개발하고 있다. 유럽의 EBI food safety 사는 박테리오파지를 이용하여 리스테리아균에 의한 식중독을 방지하는 식품첨가제 제품인 Listerix-P100을 개발하여 최초로 미국 FDA의 승인을 받았고 동일한 개념의 리스테리아균 통제 식품첨가형 박테리오파지 제품 LMP-102를 개발하여 GRAS(Generally regarded as safe)의 인증을 받았다. 또한 2007년에는 OmniLytics 사에서 도축과정 중에 E. coli O157이 소고기 제품으로 오염되는 것을 막기 위한 세척액으로 박테리오파지를 이용한 제품이 개발되어 USDA's Food Safety and Inspection Service(FSIS)로부터 승인되었다. Clostridium sporogenes phage NCIMB 30008과 Clostridium tyrobutiricum phage NCIMB 30008는 각각 2003년과 2005년에 유럽에서 사료보존제로써 등록되어 사료 내 오염된 클로스트리디움균의 통제를 목적하는 제품으로 개발되었다. 이러한 연구에서 박테리오파지는 항생제 치료가 어려운 세균의 통제나 축산물 등에 오염된 인수공통 전염균 등을 식품단계에서 통제할 수 있는 연구가 지속적으로 이루어지고 있음을 보여준다.

이에, 본 발명자들은 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점 및 식품 내의 항생제의 잔류 문제 및 과거 항생제와 같이 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결하기 위해, 가축의 주요질병을 일으키는 대장균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 신규 박테리오파지를 자연계에서 분리하였다. 그리고, 이들의 형태적, 생화학적 및 유전적 특성을 확인한 결과, 상기 박테리오파지가 병원성 대장균을 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라, 내산성 및 내열성이 뛰어남을 확인하였다. 또한 상기 박테리오파지는 병원성 대장균에 의해 유발되는 가축의 감염성 질병의 예방 또는 치료 목적으로 이용할 수 있는 조성물 및, 병원성 대장균의 증식을 효과적으로 예방할 수 있고 통제할 수 있는 다양한 제품 즉, 동물 사료 첨가제, 동물 음용수, 축사 소독제 및 육가공 세척제에도 적용이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 병원성 대장균에 대하여 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 대장균 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 또는 조성물을 이용하여 대장균증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 장독소성 대장균(Enterotoxigenic E.coli, ETEC)에 특이적 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지를 제공한다.

본 발명자들은 충청도 홍성군 광천지역의 삼화원종 양계분으로부터 시료를 채취하여 시료에서 숙주세포인 ETEC를 선택적으로 감염시켜서 용균시키는 박테리오파지를 분리하고, 상기 박테리오파지를 전자현미경을 통해 형태학적으로 관찰한 결과, 상기 박테리오파지는 장독소성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli)에 특이적 사멸능을 갖고; 형태학상 정이십면체의 머리(isometric capsid)를 갖고 있고, 꼬리(tail)가 관찰되지 않는 구조를 갖는 형태형 포도비리데(Podoviridae)에 속하며(도 1); 전체 게놈 크기가 약 35kbp이고; 상기 박테리오파지의 단백질 패턴을 분석한 결과, 주요 구조단백질로서 약 43kDa, 38kDa, 34kDa, 및 33kDa의 단백질을 포함함을 알 수 있었다(도 3). 또한, 본 발명의 박테리오파지는 대장균 중에서 ETEC를 선택적으로 감염시키는 종 특이성을 갖는다(표 1).

아울러, 이들의 유전적 특성을 분석한 결과, 서열번호 1 내지 6의 핵산 분자를 전체게놈의 일부로서 포함하는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 1 내지 6을 바탕으로 타종간 유사성을 비교한 결과, 핵산 분자 단편에 따라 86%-100% 의 다양한 유사성을 보이나 모든 단편이 100% 일치하는 박테리오파지가 없는 것으로, 신규 분리된 박테리오파지임을 확인하였다(표 2). 상기 유전적 특성을 좀 더 구체적으로 분석한 결과, 상기 박테리오파지에 특이적인 프라이머 세트(primer set), 구체적으로, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14, 서열번호 15와 16 및 서열번호 17과 18의 프라이머 세트로 PCR을 진행하였을 때, 특정 크기의 PCR 산출물이 얻어지는 것을 확인하였다.

한편, 상기 박테리오파지를 ETEC에 감염시켰을 때, 용균반(phage plaque으로 soft agar에서 하나의 박테리오파지에 의해 숙주세포가 용균되어 형성되는 clear zone)이 형성될 뿐만 아니라, 상기 용균반의 크기와 탁도가 동일하므로, 상기 박테리오파지가 ETEC를 용균시켜서 ETEC의 성장을 억제시킴을 확인하였고, 상기 박테리오파지를 다양한 pH 범위 및 온도에서 안정성을 조사한 결과, pH 3 내지 10 및 40℃ 내지 60℃ 범위의 넓은 범위에서 안정하게 생존할 수 있는 특성을 나타냄을 확인하였고, 특히 높은 온도에 내해 내열성을 가지는 것을 확인하였다(도 5). 이러한 ETEC 특이적 용균활성, 내산성 및 내열성은 본 발명의 박테리오파지를 양돈의 ETEC 유래 질병의 예방 및 치료용 조성물, 및 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 다양한 제품에 적용함에 있어, 다양한 온도 및 pH 범위의 적용이 가능하게 한다.

이에, 본 발명자는 양계분으로부터 시료를 채취하여, ETEC에 대한 특이적 사멸능을 갖고 상기와 같은 특징을 갖는 상기 박테리오파지를 "Bacteriophage ΦCJ13"으로 명명하고, 2011년 11월 7일 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11217P호로 기탁하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 장독소성 대장균(Enterotoxigenic E. coli, ETEC)에 의하여 유발된 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 박테리오파지는 ETEC를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 항균 활성을 가지므로, 이의 감염에 의해 유발되는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 바람직하게, ETEC에 의하여 유발되는 돼지 대장균증(colibacillosis in pigs)을 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "대장균증(Colibacillosis)"이란, 가축에 병원성 대장균이 감염되어 발생하는 질병을 의미하는데, 증상으로는 패혈증, 설사(신생기 설사 및 이유후 설사), 독혈증(부종병 및 뇌척수혈관증) 등이 나타난다. 이 중에서 패혈증은 생후 2～3일 이내에 신생기에 많이 발생하는 급성의 전신감염증이며 폐사율이 높다. 설사는 1～2주령 이내의 포유기 및 이유직후에 다발하는 장관감염증이며, 폐사 또는 발육장애의 원인이 된다. 독혈증은 이유후의 8～12주령의 자돈에 발생하고 온몸이 붓고, 신경증상을 나타내며 갑자기 죽는 경우가 많다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

본 발명의 상기 조성물은 5 x 10² 내지 5 x 10¹² pfu/㎖ 의 ΦCJ13을 포함하며, 바람직하게는 1 x 10⁶ 내지 1 x 10¹⁰ pfu/㎖의 ΦCJ13을 포함한다.

한편, 본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수 있으며, 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법도 이용할 수 있다. 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 도 있다. 본 발명의 상기 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감음성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

본 발명의 용어 "항생제"는 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 것이다.

상기 동물은 인간을 포함한 포유동물이다.

본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 병원성 대장균을 효과적으로 사멸시킬 수 있고, 약물 내성 내지 저항성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효 성분으로 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.

축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이고 가축에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있어서 문제이다. 항생제가 육류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 또한, 사료에 섞여 먹이는 항생제의 종류가 많고 이는 다제 내성균 발생 확률이 높아지는 문제점이 있기 때문에 좀더 자연 친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결할 새로운 사료첨가제용 항생물질로서 본 발명의 상기 박테리오파지를 이용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 박테리오파지를 포함하는 조성물의 형태로 제조되어, 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가하는 방식으로 사용될 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파지는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가용 조성물은 본 발명의 박테리오파지 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(J AnimalSci 43: 910-926, 1976) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(J Anim Sci 56:735-739, 1983)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서의 ΦCJ13을 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질유, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단밸질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단밸질, 동물성플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에서의 ΦCJ13을 포함하는 사료 첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다. 또한 음용수에 혼합하여 공급함으로써 지속적으로 장내 ETEC의 숫자를 감소시킬 수 있으며, 병원성 대장균 청정 가축 생산을 모색할 수 있다.

상기 목적을 달성하기위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효 성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제를 제공한다.

상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제는 ETEC 제거를 위한 살포에도 활용되어 가축의 활동 영역, 가축 도축장, 가축 폐사 지역, 가축 조리 장소 및 조리 설비에 사용될 수 있으며 장소는 이에 국한된 것은 아니다. 또한 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 세척제는 살아있는 가축의 피부 표면 및 신체 각 부위에 묻어있거나 혹은 감염 가능한 ETEC을 제거하는데 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지 또는 상기 조성물을 이용하여 병원성 대장균, 바람직하게는 ETEC에 의한 감염성 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 본 발명의 치료방법은 병원성 대장균, 바람직하게는 ETEC에 의한 감염성 질환이 발병된 개체에 상기 박테리오파지 또는 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 상기 박테리오파지 또는 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 사료 첨가용 조성물의 형태로 제조되어 가축의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 박테리오파지 또는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 치료방법에 투여되는 본 발명의 상기 박테리오파지 또는 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 신규 박테리오파지는 병원성 대장균에 특이적 사멸능을 가지는 반면, 내산성 및 내열성이 우수하므로, 병원성 대장균 감염성 질병인 돼지 대장균증의 예방 또는 치료에 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 사료 첨가용 조성물, 소독제 및 세척제 등으로 광범위하게 이용될 수 있다.

도 1은 ΦCJ13 의 전자 현미경 사진이다.
도 2은 분리된 박테리오파지 ΦCJ13의 PFGE 결과이다.
도 3는 분리된 박테리오파지 ΦCJ13의 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 박테리오파지 ΦCJ13의 내산성 실험 결과이다.
도 5는 박테리오파지 ΦCJ13의 내열성 실험 결과이다.
도 6은 ETEC 균을 강제 급여 후ΦCJ13을 첨가한 사료를 급여한 이유자돈과 일반 사료를 급여한 이유자돈의 설사 지수를 비교한 결과이다.
도 7은 분변에서의 ETEC 균주의 양을 Real time PCR을 이용하여 정량 분석한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 장독소성 대장균에 감염하는 박테리오파지의 분리

실시예 1-1: 박테리오파지 스크리닝 및 단일 박테리오파지 분리

충청도 홍성군 광천지역의 삼화원종 농장지역의 양계 분변 및 환경 샘플로부터 수득한시료 50㎖를 4,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 시료액을 준비하고, 이를 이용하여 소프트 아가 오버레이(soft agar overlay) 방법을 수행하였다.

구체적으로, 장독소성 대장균(Enterotoxigenic E. coli, ETEC, SNU0105) 진탕 배양액(OD₆₀₀=2) 150㎕ 와 10 X LB배지(tryptone 10g/ℓ; yeast extract 5g/ℓ; NaCl 10g/ℓ) 2㎖에 시료 여과액 18㎖를 혼합하고, 30℃에서 18시간 동안 배양한 다음, 배양액을 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 0.45㎛ 필터로 여과하였다. LB 평판배지의 위에 0.7%(w/v) 한천 3㎖과 ETEC(SNU105) 진탕 배양액 (OD₆₀₀=2) 150㎕의 혼합액을 부어 굳힌 후, 그 위에 시료액 10㎕를 적가하여 30℃에서 18시간 동안 배양하여, 용균반이 형성됨을 확인하였다.

하나의 용균반에는 한 종류의 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있기 때문에, 상기 형성된 용균반으로부터 단일 박테리오파지를 분리하고자 하였다. 구체적으로, 상기 용균반을 400㎕의 SM용액(NaCl 5.8g/ℓ; MgSO₄7H₂O 2g/ℓ; 1M Tris-Cl(pH7.5) 50㎖)에 가하고, 실온에서 4시간 동안 방치하여, 박테리오파지 용액을 수득하였다. 이어, 상기 박테리오파지 용액 100㎕를 0.7%(w/v) 한천 12㎖ 및 ETEC(SNU105) 진탕 배양액 (OD₆₀₀=2) 500㎕와 혼합하고, 150mm 지름의 LB 평판배지를 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 수행하였으며, 완전히 용균될 때까지 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 LB 평판배지에 15㎖의 SM용액을 가하고, 실온에서 4시간 동안 방치하여, 박테리오파지 용액을 수득하였다.

상기 용액을 회수하고, 1%(v/v) 클로로포름을 가한 다음, 10분간 혼합하고, 4,000rpm으로 10분간 원심분리하여, 상등액을 수득하였으며, 상기 상등액을 0.45㎛ 필터로 여과하여 최종 시료를 수득하였다.

실시예 1-2: 박테리오파지의 대량배양 및 정제

상기 실시예 1-1에서 수득한 박테리오파지를 ETEC(SNU105)를 이용하여 대량으로 배양하고, 이로부터 박테리오파지를 정제하였다.

구체적으로, ETEC(SNU105)를 진탕 배양하여 1.5 X 10¹⁰ cfu가 되도록 분주하여 4,000rpm 에서 10분간 원심분리한 후, 이를 4㎖ SM 용액에 재부유시켰다. 여기에 박테리오파지를 1.5 X 10⁶ pfu로 접종하고, MOI(multiplicity of infection)=0.0001로 적정한 다음, 상온에서 20 분간 정치시켰다. 이어, 150㎖ LB 배지에 접종하고, 30℃에서 5시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 최종 부피의 1%(v/v)가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20 분간 교반하였으며, 제한효소인 DNase I과 RNase A를 각각 최종농도 1㎍/㎖이 되도록 첨가하고 30℃에서 30분동안 정치시켰다. 그런 다음, 최종 농도가 각각 1M과 10%(w/v)가 되도록 NaCl과 PEG(polyethylene glycol)를 가하고, 4℃에서 3 시간 추가 정치시켰으며, 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리하고, 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 5㎖ SM용액에 현탁시키고, 20 분간 실온에서 정치시킨 다음, 4㎖ 클로로포름을 가하여 교반하고, 4℃에서 4,000rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 0.45㎛ 필터로 여과한 다음, 글리세롤 밀도 구배법(밀도:40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심분리(35,000rpm, 1시간, 4℃)를 수행하여 박테리오파지를 정제하였다.

본 발명자는 양계분으로부터 시료를 채취하여, ETEC에 대한 특이적 사멸능을 갖고 상기와 같은 특징을 갖는 상기 박테리오파지를 "Bacteriophage ΦCJ13"으로 명명하고, 2011년 11월 7일 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11217P호로 기탁하였다.

실시예 2: Φ CJ13 의 대장균 감염성 비교

상기 실시예 1에서 정제한 ΦCJ13이 ETEC(SNU105) 외에 다른 대장균에 대하여도 용균 활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위해 교차감염을 수행하였다.

구체적으로, 2종류의 ETEC(ETEC(SNU105) 및 ETEC(CANRO8))와 8종의 비병원성 대장균(DH5a, MC4100, Rosetta(DE3), GM2929, K12G, W3110, BL21(DE3), Tuner(DE3))을 각각 배양하여 배양액을 수득하고, 상기 각각의 배양액과 상기 정제한 ΦCJ13을 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 수행하여 용균반의 형성여부를 확인하였다(표 1).

ΦCJ13의 비병원성 대장균 감염여부

균주 명칭	용균반형성 여부
ETEC(SNU105) ETEC(CANRO8) E. coli DH5a E. coli MC4100 E. coli Rosetta(DE3) E. coli GM2929 E. coli K12G E. coli W3110 E. coli BL21(DE3) E. coli Tuner(DE3)	O O X X X X X X/O X X

* 'SNU'source: 서울대학교 수의과대학

* 'CAN'source: University of Guelph in Canada

상기 표 1에서 보듯이, 실시예 1에서 정제한 ΦCJ13은 비병원성 대장균에 대하여는 용균활성을 나타내지 않음을 확인하였다.

실시예 3: Φ CJ13 의 형태관찰

상기 실시예 1에서 정제한 ΦCJ13을 0.01% 젤라틴 용액에 희석하고, 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 carbon-coated mica plate(ca.2.5 X 2.5 mm)에 적가하여 10 분간 적응시킨 다음, 멸균증류수로 세척하였다. 카본 필름(Carbon film)을 copper grid에 끼워 4% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)에서 30-60 초간 염색하고, 건조한 다음, 투과전자현미경(JEM-1011 transmission electron microscope, 80kV, 배율 X 120,000 ~ X 200,000)으로 검경하였다(도 1). 도 1은 ΦCJ13의 전자 현미경 사진이다. 형태학상 정이십면체의 머리(isometric capsid)와 꼬리(tail)가 없는 형태형(morphotype)인 포도비리데(Podoviridae)에 속함을 알 수 있었다.

실시예 4: Φ CJ13 의 전체 게놈 DNA 크기 분석

상기 실시예 1에서 정제한 ΦCJ13로부터 게놈 DNA를 추출하였다.

구체적으로, 정제된 ΦCJ13 배양액에 20mM EDTA, 50㎍/㎖ proteinase K 및 0.5%(w/v) SDS를 가하고, 50℃에서 1시간 동안 정치하였으며, 동일 부피의 페놀(pH8.0)을 가하여 교반한 다음, 실온에서 12,000rpm으로 10 분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 동일 부피의 PC(phenol:chloroform=1:1)와 혼합하고, 실온에서 12000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 동일 부피의 클로로포름과 혼합하고, 실온에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액에 3M 초산나트륨(sodium acetate)을 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가하여 혼합하고, 2배 부피의 차가운 95% 에탄올(ethanol)을 가하여 혼합한 다음, -20℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 이어, 0℃에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이에 50㎕ TE 완충액(Tris-EDTA, pH 8.0)을 가하여 용해시키고, 그의 농도를 측정하였다. 그런 다음, 1㎍의 DNA를 1% PFGE(pulse-field gel electrophoresis) 아가로즈 젤에 로딩하고, BIORAD PFGE system 7번 프로그램(size range 25-100 kb ; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape ; forward voltage 180 V ; reverse voltage 120 V)을 이용하여 상온에서 20시간 동안 전개하였다(도 2). 도 2는 ΦCJ13의 게놈 DNA의 전기영동사진으로서, 약 35kbp의 크기를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5: Φ CJ13 의 단백질 패턴 분석

10¹⁰ pfu/㎖ 타이터(titer)의 정제된 ΦCJ13 용액 15㎕와 5X SDS 시료 용액 3㎕를 혼합하고, 5분간 끓인다음, 15% SDS-PAGE를 수행하였다(도 3). 도 3은 ΦCJ13을 대상으로 수행한 SDS-PAGE 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 3에서 보듯이, 43kDa, 38kDa, 34kDa 및 33kDa 크기의 주요 단백질을 확인할 수 있었다.

실시예 6: Φ CJ13 의 유전적 특성 분석

상기 실시예 1에서 정제한 ΦCJ13의 유전자적 특성을 알아보기 위해서, ΦCJ13의 게놈 DNA 5㎍을 제한효소인 EcoR V, Sca I 및 Nru I으로 동시처리하고, Pvu II, Hinc II 와 Stu I 제한효소로 동시에 처리하였다. 벡터로는 pCL1920 (Promega 사)를 Sma I 제한효소로 자른 후 CIP(calf intestinal alkaline phosphatase) 처리한 것을 사용하였다. 절편된 게놈 DNA와 벡터의 양이 3:1이 되도록 반응조건을 맞추어 섞은 후 16℃에서 5 간 동안 라이게이션(ligation)을 진행하였다. 이를 대장균의 한 종인 DH5α 세포에 도입시켰다. 이렇게 형질전환 된 전환체를 엠피실린(ampicillin)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)이 포함된 LB plate에서 통상의 청백 콜로니 선별법을 통해 2개 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 엠피실린이 포함된 배양배지에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 여기서 플라스미드 정제키트 (Solgent 사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다.

상기 플라스미드들을 M13 forward와 M13 reverse 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 클로닝 여부를 확인하였으며 삽입조각 크기가 1 kb 이상 되는 것을 골라 M13 forward 와 M13 reverse 프라이머 세트를 이용하여 염기서열의 유사성을 분석하였다(표 2).

ΦCJ13의 염기서열과 다른 박테리오파지의 해독염기 서열 상동성 비교

서열번호	organic	protein	quary	identity	e-value
1	Enterobacteria phage EcoDS1	gp19	38-388	116/117(99%)	7.00E-53
1	Enterobacteria phage EcoDS1	gp19.5	727-52	38/38 (100%)	5.00E-05
2	Enterobacteria phage K1F	tail tube(gp 12)	966-37	306/310(99%)	4.00E-165
3	Enterobacteria phage K1F	tail tubular protein A(gp 11)	360-31	109/110(99%)	8.00E-44
3	Enterobacteria phage EcoDS1	major capsid protein (gp 10A)	807-932	50/50 (100%)	3.00E-49
4	Enterobacteria phage K1F	endo-N-acylneuraminidase	303-40	88/88 (100%)	5.00E-42
4	Enterobacteria phage EcoDS1	internal virion protein D(gp 16)	1169-371	128/129(99%)	3.00E-110
5	Enterobacteria phage P1	putative lipoprotein (Plp)	510-136	124/125 (99%)	3.00E-62
	Enterobacteria phage P1	gene upstream of plp (Upl)	702-514	63/63 (100%)	8.00E-28
	Enterobacteria phage P1	tellurite or colicin resistnce / inhibition of celldivision (TciA)	908-1140	50/55 (91%)	8.00E-21
6	Enterobacteria phage EcoDS1	internal virion protein D (gp16)	1066-284	225/264 (86%)	1.00E-118
6	Enterobacteria phage EcoDS1	gp17	216-37	60/60 (100%)	2.00E-25

실시예 7: Φ CJ13 특이적 프라이머 염기서열 제작

ΦCJ13을 동정하기 위하여 ΦCJ13 특이적인 프라이머를 제작하였다.

구체적으로, 서열번호 1을 바탕으로 서열번호 7과 8, 서열번호 2를 바탕으로 서열번호 9와 10의 프라이머세트를 제작하였다. 또한 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 바탕으로 각각 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14, 서열번호 15와 16 및 서열번호 17과 18의 프라이머 세트를 제작하여 PCR을 진행하였다. 0.1㎍의 박테리오파지 전체 게놈 DAN와 0.5 pmol이 되도록 프라이머를 pre-mix (Bioneer 사)에 첨가하고 최종부피가 20㎖이 되도록 맞추었다. 이를 denaturation; 94℃ 30 초, annealing; 60℃ 30 초, polymeration; 72℃ 1 분의 조건으로 30 cycles PCR을 진행하였다. 그 결과 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14, 서열번호 15와 16, 및 17과 18의 프라이머 세트를 이용했을 경우 각각 약 170bp, 180bp, 200bp, 205bp, 240bp 및 200bp 정도의 PCR 산물을 수득하였다.

실시예 8: 박테리오파지의 pH 에 따른 안정성 조사

ΦCJ13이 돼지 위장 내 낮은 pH에서 안정성을 보유할 수 있는지 확인하기 위하여 다양한 pH 범위(pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.2, 9.0, 9.8 및 11.0)에서 안정성 조사 실험을 하였다. 다양한 pH 용액(소디움아세테이트 용액(Sodium acetate buffer(pH 2.1, pH 4.0, pH 5.5, 및 pH 6.4)), 소디움시트레이트 용액(Sodium citrate buffer(pH 2.5, pH 3.0 및 pH 3.5)), 소디움포스페이트 용액(Sodium phosphate buffer(pH 6.9 및 pH 7.4)), 트리스 용액(Tris-HCl(pH 8.2, pH 9.0, pH 9.8 및 pH 11.0))을 각각 0.2M로 제작하였다. pH 용액 90㎕와 1.0 X 10¹¹PFU/㎖ 타이터의 박테리오파지용액 10㎕를 섞어 각 pH 용액의 농도가 1M이 되게 한 후, 2시간 동안 상온에서 정치하였다. 이들을 단계 희석하고, 소프트 아가 오버레이 방법을 이용하여 각 단계의 희석액을 10㎕씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다(도 4). 도 4는 박테리오파지 ΦCJ13의 내산성 실험 결과를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 대조군과 비교하여 pH 3.0 부터 pH 10.0까지 박테리오파지 ΦCJ13의 활성을 잃지 않고 안정적임을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 박테리오파지의 온도에 따른 안정성 조사

박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 발생하는 열에 대한 안정성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 1.0 X 10⁸ PFU/㎖ 농도의 ΦCJ13의 용액 100㎕를 40℃, 50℃, 60℃ 및 70℃의 온도 조건 하에서 각각 0 분, 30분, 60분 및 120분 동안 정치시켰다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액 10㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다(도 5). 도 5는 박테리오파지 ΦCJ13의 내열성 실험 결과를 나타낸다/ 도 5에서 보듯이, 50℃에서 2시간까지 노출이 되어도 활성을 유지하였으나, 60℃에서는 30분 노출부터 시간의 경과에 따라 활성이 감소함을 알 수 있었다.

실시예 10: 박테리오파지의 야생분리주 ETEC 에 대한 감염범위 조사

ΦCJ13이 실험에 사용된 ETEC(SNU105) 이외 서울대학교 수의과대학 및 캐나다의 Guelph 대학에서 분리한 야생 분리주 ETEC 10주에 대하여 용균 활성이 있는지 여부를 확인하였다. 각 균주의 진탕 배양액 (OD600=2) 150㎕를 섞어 소프트 아가 오버레이 방법을 진행하여 10⁸ pfu/㎖ 타이터의 ΦCJ13의 용액 10㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균반 형성 유무를 관찰하였다(표 3).

우리 나라 야생 분리주 ETEC에 대한 용균 형성 여부 조사

균주명	ΦCJ13 용균반형성 유무
ETEC SNU105 ETEC SNUF4 ETEC SNU162 ETEC SNU160 ETEC SNUJG280 ETEC SNU107 ETEC SNU2618 ETEC SNU193 ETEC CAN3220 ETEC SNUR08	O O O O O O O O O O

* 'SNU'source: 서울대학교 수의과대학

* 'CAN'source: University of Guelph in Canada

상기 표 3에서 보듯이, 일반 양돈농가에서 돼지설사에 원인균으로 많은 부분을 차지하고 있는 ETEC O-혈청형 O149 (SNU107, SNUF4, SNUJG280, CAN3220, SNUR08)에 대해 감염능을 보이고 있고, 뿐만 아니라 F-혈청형 K88 (SNU105, SNU107, SNU160, SNU162, SNU193, SNUF4, CAN3220, SNUR08, SNUJG280), K99 (SNU2618) 에 대한 감염능을 보이고 있어서 현장 적용시 우수한 효율성을 기대 할 수 있다.

실시예 11: 이유자돈 사료 내 ETEC 박테리오파지 이용성 평가

육안검사, 임상증상(설사여부, 침울 등), 분변 PCR을 통해 ETEC 항원 음성인 건강하다고 판단되는 50두의 생후 25일령 전후의 이유자돈(Landrace X Yorkshire)을 체중, 성별 등에 따라 분리 사육하며 14일간 실험을 진행하였다.

먼저, ETEC 균주를 TSB에 접종하여 37℃에서 18시간 배양하여 사용하였다. 상기 배양액을 PBS(PH 7.2)로 희석하여 10⁸ pfu/㎖로 조정하고, 경구 주입관(Sonde)을 사용하여 시험 시작 후 7일된 5주령의 실험돈에 경구접종하였다. 실험 개시일부터 박테리오파지 투여군은 사료 1kg당 박테리오파지(10⁶ PFU/g 또는 10⁸ PFU/g)를 1g 혼합하여 오전과 오후에 일정한 시간에 하루 2회 섭식시켰다. 또한, 박테리오파지 대조군은 위와 같은 시간대에 일반 사료만 섭식시켰다(도 6 및 도 7).

먼저, 도 6은 ETEC 균을 강제 급여 후ΦCJ13을 첨가한 사료를 급여한 이유자돈과 일반 사료를 급여한 이유자돈의 설사 지수를 비교한 결과로서, ETEC 균주를 강제급여 하지 않은 이유자돈군을 음성 대조군으로 정의했고, ETEC 균주(1.0x108 pfu/㎖)를 강제 급여하고 일반사료만을 섭취한 이유자돈군을 양성 대조군으로 정의 했다. 시험군은 ETEC 균주 급여 7일 전부터 박테리오파지가 첨가된 사료를 급여하기 시작 했다. 박테리오파지가 첨가된 사료를 급여한 이유자돈의 설사지수가 일반사료를 급여한 그룹보다 설사지수가 낮은 것을 볼 수 있었다. 도 6에서 보듯이, 설사지수는 Sherman 등(1983)의 방법에 의하여 FC(fecal consistency) 점수(정상적인 분, 0; 연변, 1; 묽은 설사, 2; 심한설사, 3)를 측정한 결과, ETEC 박테리오파지를 급여한 경우 양성시험군 (ETEC 급여 후 일반사료 급여군)은 높은 설사지수를 보였으며, 박테리오파지가 첨가된 사료를 급여한 시험군의 경우 3-4일 경까지 설사지수가 오르다가 다시 정상화됨을 확인하였다.

다음으로, 도 7은 분변에서의 ETEC 균주의 양을 Real time PCR을 이용하여 정량 분석한 결과로서, 박테리오파지를 첨가한 사료를 급여 받은 이유자돈의 분변에서 일반사료를 급여한 군의 분변에 비해 적은 양의 ETEC이 측정되었다. 도 7에서 보듯이, Real time PCR을 이용하여 분변 중 ETEC균주를 정량적으로 분석한 결과 박테리오파지를 급여한 시험군의 경우 분변중의 ETEC 함량이 양성 시험군에 비해 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 12: 이유자돈 장 내부의 융모길이의 분석

통상적으로 ETEC에 노출된 자돈 내장융모는 정상적인 자돈의 융모에 비해 융모길이가 짧아지고 수분 흡수에 이상이 생겨 설사가 유발되는 특징을 나타낸다고 알려져 있다(Gaastra W. et al ., Microbial Rev. 46,129-161, 1982). 이에 근거하여, ETEC에 노출된 자돈의 내장에서 ΦCJ13의 융모길이에 대한 효과를 확인하고자 하였다.

상기 실시예 11을 종료한 후, 안락사시킨 실험자돈의 십이지장, 공장, 회장 및 결장의 일정한 부위의 조직을 각각 3cm씩 채취하고, 10% 중성포르말린에 넣어 48시간동안 고정시켰다. 이어, 일반적인 조직 처리 과정을 거친 후 조직을 파라핀에 포매하고, 3㎛ 두께로 박절한 후 조직 절편을 탈파라핀화하여 재함수 과정을 거친 다음 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 실시하였다. 그런 다음, 융모의 높이 및 음와의 길이를 측정하여 장의 형태학적 분석을 수행하였다. 이때, 융모의 높이와 음와의 길이는 각 샘플당 염색된 십이지장, 공장, 회장의 상, 하, 좌, 우 네 부위를 spot diagnostic insight(Olympus, USA)를 이용하여 촬영 후 융모(V)의 높이, 음와(C)의 깊이, 융모의 높이:음와의 깊이의 비(V/C ratio)를 측정한 후, 이를 통계학적으로 분석하였다(표 4).

장 내부 융모길이의 분석

장내위치	이유자돈 군집				P value
장내위치	음성군	양성군	phage (1E+6)	phage (1E+8)	P value
십이지장
융모 길이(㎛)	540.9	305.6	334.5	322.9	<.0001
음와 깊이(㎛)	287	345.3	343.5	316.2	0.0013
V/C ratio	0.483a	0.239b	0.501b	0.401b	-
공장
융모 길이(㎛)	75.9	52.5	54.7	128.5	0.0013
음와 깊이(㎛)	233.9	258	264	210.8	0.169
V/C ratio	1.798	0.885	1.013	1.747	0.0005
회장
융모 길이(㎛)	406	228	282.7	402	<.0001
음와 깊이(㎛)	256.0a	307.2a	244.4a	222.3a	-
V/C ratio	1.640a	0.804c	1.235b	1.868a	-

a, b, c: 평균값이 표준편차범위 이상으로 뚜렷하게 구분됨

상기 표 4에서 보듯이, 십이지장에서 융모의 길이는 ETEC 공격접종군들(양성군)이 비공격접종군인 음성군보다 짧았으며, 음와의 깊이는 증가되었고(P<0.05), 공장에서는 융모의 길이가 박테리오파지를 투여한 phage (1E+8)군이 128.5㎛로 ETEC만 공격접종한 양성군의 52.5㎛보다 길었으며(P<0.05) 음와의 깊이는 시험군 모두 유의차가 없었다. V/C ratio는 박테리오파지를 투여한 phage (1E+6)군과 (1E+8)군이 각각 1.013 및 1.747로 ETEC만 공격접종한 양성군의 0.885보다 유의적으로 높은 비율을 보였으며 또한 phage (1E+8)군이 (1E+6)군보다 높은 비율을 보였다(P<0.05). 회장에서 V/C ratio는 phage (1E+6)군이 1.235, phage (1E+8)군이 1.868로 phage (1E+6)군의 0.804보다 유의적으로 높은 비율로 보였다(P<0.05). 건강한 돼지의 융모길이가 긴 것을 감안 할 때 박테리오파지의 효과는 유의적으로 관찰 되었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11217P

20111107

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel isolated bacteriophage having E. coli specific antibacterial activity and antibacterial composition comprising the same <130> PA110787/KR <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 824 <212> DNA <213> bacteriophage <400> 1 gcacacgatg accgacttga tgcgcttgct ataggtgtac agttcttcgt tgagtctatg 60 gctaaggatg ccaacaaagg cgaacgtgaa gtcactgagg agtggctgga ggaacagatg 120 gagaacccac ggaaaggctt cgagtccatc cacactgagt tctgggacaa tggggtccgg 180 gtaactcacg atacggacga cgagctggga ctagggtcat acgttacgtt ccactagctg 240 aatgaataat tataggtgaa agctgcatga atacgcggtt agtaacctat agttactacc 300 agtctaacct actgttttac aaggagtttg gacttaacta tcactatagg gaagaccccc 360 ggttacttat agtattactg tagtgaatat acatatgcag actttatgca agaccttagg 420 aggcagactc cgagttctta cctaaggctt gcaccgatgg aaggagggtg atattaatca 480 taatccctcc aatacagata gtaaagacca tagatacagg aggtatgtag catatggcaa 540 agaccaaagc tgtacttaaa gctctggcga ccaatcgagc tacatacagg tttcttgctg 600 ctgttctact tgctgctggc gttactgctg 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600 gtggaccacc cagatgtgaa ctacgggaca gagccgcata accaatcatc gtcgggtcaa 660 gagcttgctt gaggtattca cggtctcgac catcctgcat agcgtaagcc ttgacgtgag 720 cttgagccat atagtagata ccagccagac ccatagacat cacggtagat agagcagcat 780 ccatcgctcg gttgttcttc gtggcgttat agaaagttcg catggttcgc ccattgatgg 840 acttgatgac gaagttctta aactgaaagg acagtcttag cgagagggcc ataagccttg 900 gcatccatgt tagacagctt atgaggtcgt agtaacgttt catcagcgat ggtgtcaccc 960 atacgccaca gtccatagc 979 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgaaagctgc atgaatacgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tgcctcctaa ggtcttgcat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggattgagat tcgagggtga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgccacgatt aacgatgtgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gcttcacagt acccacagca 20 <210> 12 <211> 20 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Claims

장독소성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli)에 특이적 사멸능을 갖는 기탁번호 KCCM11217P인 박테리오파지.
제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는, 장독소성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli) 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 장독소성 대장균 감염성 질병은 대장균증인 것인 조성물.
제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제.
제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물.
제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제.
제1항의 박테리오파지 또는, 제2항 또는 제3항의 조성물을 치료를 필요로 하는 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 대장균증의 치료방법.
제7항에 있어서,
상기 동물은 돼지인 것인 방법.