KR101267616B1 - 신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비브리오 하베이(V.harveyi) 특이적 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지(bacteriophage), 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 비브리오 하베이 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 이용하여 비브리오증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel isolated bacteriophage and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 비브리오 하베이(V.harveyi) 특이적 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지(bacteriophage), 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 비브리오 하베이 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 이용하여 비브리오증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

양식새우(penaeid shrimp)에서 비브리오증을 일으키는 세균으로 알려진 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)는 그람 음성, 간균의 발광성 세균으로 해양 환경의 도처에서 생존한다. 비브리오 하베이는 해양생물의 정상세균총 이나, 몇몇 종이 해양 어류, 패류, 새우의 중요한 병원체로 보고되었다(Karunasagar I et al. Aquaculture 128:203-209, 1994, Zhang XH and Austin B, J. Fish Dis. 23:93-103, 2000). 1990년부터 비브리오 하베이 감염은 라바(larva) 기의 새우 Penaeus monodon 과 Penaeus japonicas 의 폐사를 100% 일으키므로, 새우양식장의 심각한 경제적 손실을 낳고 있다(Liu PC et al., Lett. Appl. Microbiol. 22:413-416). 이와 같은, 새우류에서 비브리오 하베이에 대한 감염을 새우류 비브리오증, 새우류 세균성 패혈증, 발광성 비브리오증 또는 붉은다리(red-leg disease) 병이라고 명명한다. 비브리오증의 임상증상은 무기력, 조직 괴사, 성장지연, 라바(larva) 의 변태지연과 기형, 발광성(어둠 속에서 새우가 빛나는), 근 혼탁, 색소침착 등이 있다(Robertson, PAW et al., J. Microbiol. Methods 34:31-39, 1998).

비브리오 하베이의 병원성 메커니즘은 아직 명확히 밝혀지지 않았으며, 숙주 및 균의 종에 따라 병원성 메커니즘이 달라진다. 비브리오 하베이의 병원성 요소로 세포외물질(extracellular products ECP)이 있으며 이는, 프로테아제(protease), 헤모리신(hemolysins), 리파제(lipases), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccaride)와 박테리오신 유사물질(bacteriocin-like substances)을 포함한다(Teo JWP et al., Gene 312: 181-188, 2003).

많은 양식새우 부화장에서 비브리오 하베이의 감염을 막기 위한 예방대책으로 항생제를 사용하고 있다. 그러나 항생제 내성균과 항생제 잔류는 국제적인 문제이며 병원균에 대한 대체적인 치료방법이 시급한 상황이다.

한편, 박테리오파지는 특정 세균에만 감염하여 세균의 성장을 통제하는 세균특이적 바이러스로 세균 숙주 없이는 자가 증식이 불가능하다. 박테리오파지는 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA가 유전물질로써 핵산을 구성하고 있으며, 꼬리의 형태학적인 구조에 따라서 마이오비리데(Myoviridae), 시포비리데(Siphoviridae), 그리고 포도비리데(Podoviridae)로 분류된다(Arch Virol(2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter et al., Bacteriophages biology and application; CRC press).

최근, 동물의 성장촉진을 위해 사료에 첨가하는 항생제(antimicrobial growth promoter, AGP)의 오남용에 의한 내성균 증가로 인해, AGP의 사용을 금지하는 정책들이 입안되어 한국은 2011년 7월부터 AGP 사용이 전면금지 되었다.

이러한 흐름을 바탕으로 박테리오파지의 연구가 다시 관심을 모으고 있다. 유럽에서는 Clostridium sporogenes 와 Clostridium tyrobutiricum phage가 사료 내 오염된 클로스트리디움균의 통제하는 사료보존제로 등록되었다. 이는 박테리오파지가 항생제 치료가 어려운 세균의 통제나 축산물 등에 오염된 인수공통 전염균 등을 통제할 수 있는 능력이 있음을 보여준다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 과거 항생제와 같이 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결하기 위해, 양식어류와 새우류에서 비브리오증을 일으키는 비브리오 하베이에 감염하는 박테리오파지를 자연계에서 신규 분리하고, 이들의 형태적, 생화학적 및 유전적 특성과 함께 비브리오 하베이균만을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 비브리오 하베이균에 대하여 특이적 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 비브리오 하베이 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 어패류 또는 새우 양식용 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 또는 조성물을 이용하여 비브리오증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)에 특이적 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지를 제공한다.

본 발명자들은 바닷물로 부터 시료를 채취하여 시료에서 숙주세포인 비브리오 하베이 균주(Vibrio harveyi BB120, VH-BB120)를 선택적으로 용균시키는 박테리오파지를 분리하고, 상기 박테리오파지를 전자현미경을 통해 형태학적으로 관찰한 결과, 상기 박테리오파지는 비브리오균들 중 비브리오 하베이를 선택적으로 감염시키는 종 특이성을 갖고(표 1); 다양한 야생분리주 비브리오 하베이에 감염될 수 있으며(표 3); 비브리오 하베이에 특이적 사멸능을 갖고; 형태학상 정이십면체의 머리(isometric capsid)와 수축성이 없는 꼬리(long non-contractile tail)로 구성된 형태형(morphotype) B1, 시포비리데(Siphoviridae)에 속하고(도 1); 전체 게놈 크기가 약 75kbp이며(도 2); 상기 박테리오파지의 단백질 패턴을 분석한 결과, 50kDa, 44 kDa, 및 36 kDa 크기의 단백질을 주요 구조단백질로 갖는 것을 특징으로 한다(도 3).

아울러, 이들의 유전적 특성을 분석한 결과, 서열번호 1 내지 5의 핵산 분자를 전체게놈의 일부로서 포함하는 것을 확인하였고, 상기 서열번호 1 내지 5을 바탕으로 타종간 유사성을 비교한 결과, 핵산 분자 단편에 따라 20 내지 45%의 유사성을 보이나 모든 단편이 100% 일치하는 박테리오파지가 없는 신규한 박테리오파지임을 확인하였다(표 2). 상기 유전적 특성을 좀 더 구체적으로 분석한 결과, 상기 박테리오파지에 특이적인 프라이머 세트(primer set), 구체적으로, 서열번호 6과 7번, 서열번호 8과 9번, 서열번호 10과 11번, 서열번호 12와 13번 및 서열번호 14와 15번 프라이머 세트로 PCR을 진행하였을 때, 각각 600bp, 400bp, 900bp, 500bp 및 1000bp의 PCR 산출물이 얻어지는 것을 확인하였다(도 4a 내지 4d).

한편, 상기 박테리오파지를 비브리오 하베이에 감염시켰을 때, 용균반(phage plaque로 soft agar에서 하나의 박테리오파지에 의해 숙주세포가 용균되어 형성되는 clear zone)이 형성될 뿐만 아니라, 상기 용균반의 크기와 탁도 등이 동일하므로, 상기 박테리오파지가 비브리오 하베이를 용균시켜서 비브리오 하베이의 성장을 억제시킴을 확인하였다. 상기 박테리오파지를 다양한 pH 범위 및 온도에서 안정성을 조사한 결과, pH 4 내지 11의 pH 범위에서 안정하게 생존하는 내산성을 가지며(도 5), 43℃ 내지 60℃ 범위의 온도, 즉, 높은 온도에서도 안정하게 생존할 수 있는 내열성을 가짐을 확인하였다(도 6).

따라서, 이러한 비브리오 하베이에 대한 특이성, 내산성 및 내열성은 본 발명의 박테리오파지를 양식어패류 및 새우류의 비브리오 하베이 감염성 질병의 예방 및 치료용 조성물, 박테리오파지를 유효 성분으로 포함하는 다양한 제품 등에 적용함에 있어, 다양한 온도 및 pH 범위의 적용이 가능하게 한다.

이에, 본 발명자들은 바닷물로부터 시료를 채취하여, 비브리오 하베이에 대한 특이적 사멸능을 갖고 상기와 같은 특징을 갖는 상기 박테리오파지를 "Bacteriophage ΦCJ17"로 명명하고, 2012년 1월 2일 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11247P호로 기탁하였다.

또 하나의 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 비브리오 하베이에 의하여 유발된 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 박테리오파지는 비브리오 하베이를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 항균 활성을 가지므로, 이의 감염에 의해 유발되는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 바람직하게, 비브리오 하베이에 의하여 유발되는 감염성 질병은 비브리오증(Vibriosis)을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "비브리오증(Vibriosis)"이란, 비브리오 하베이균의 감염에 의하여 일어나며, 해수 양식어류, 패류 및 새우류 등 다양한 해양동물에 감염되는 질병을 의미하는데, 특히 새우류에서 무기력, 조직괴사, 성장지연, 라바의 변태지연, 기형, 발광, 근혼탁, 색소침착 등을 일으켜 대량폐사를 야기시킨다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

본 발명의 상기 조성물은 5 x 10² 내지 5 x 10¹²pfu/ml의 ΦCJ17을 포함하며, 바람직하게는 1 x 10⁶ 내지 1 x 10¹⁰pfu/ml의 ΦCJ17을 포함한다.

한편, 본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수 있으며, 질환부위 또는 개체에 도포 또는 침지하는 방법도 이용할 수 있다. 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 도 있다. 본 발명의 상기 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감음성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를들어 정제, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 사육수조의 물에 혼합하여 양식 가능하도록 하는 혼합제제형태가 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 혼합제제로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

본 발명에서 용어 "항생제"는 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 것이다. 상기 동물은 어패류, 새우 등을 포함하고, 천연 또는 양식된 것을 모두 포함한다.

본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 비브리오 하베이에 대한 특이성이 매우 높으므로, 비브리오 하베이에 의하여 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 특이적으로 사용될 수 있고, 약물 내성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효 성분으로 포함하는 어패류 또는 새우 양식용 사료첨가제를 제공한다.

축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이고 어패류 또는 가축에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있어서 문제이다. 항생제가 육류 또는 어패류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 또한, 사료에 섞여 먹이는 항생제의 종류가 많고 이는 다제 내성균 발생 확률이 높아지는 문제점이 있기 때문에 좀더 자연 친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결할 새로운 사료첨가용 항생물질로서 본 발명의 상기 박테리오파지를 이용할 수 있다.

본 발명의 어패류 또는 새우 양식용 사료첨가제는 박테리오파지를 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료제조시 직접 첨가시켜 사용할 수 있으며, 부화장이나 양식장 수조에서 직접 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 사료내 및 수조내 박테리오파지는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지를 포함하는 사료첨가제는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 어패류 또는 새우 양식용 사료는 본 발명의 박테리오파지 이외의 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(J AnimalSci 43: 910-926, 1976), 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(J Anim Sci 56:735-739, 1983) 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서의 ΦCJ17을 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질유, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단밸질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단밸질, 동물성플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서의 ΦCJ17을 포함하는 사료첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등을 추가로 포함할 수도 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한 부화장 및 양식장 수조에 혼합하여 공급함으로써 지속적으로 양식장 내 비브리오 하베이의 숫자를 감소시킬 수 있으며, 비브리오 하베이 청정 양식을 모색할 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효 성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제를 제공한다.

상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제는 비브리오 하베이 제거를 위한 살포에도 활용되어 양식장내 어패류 또는 새우의 활동 영역, 부화장, 양식 어패류 또는 새우의 폐사 지역, 양식 어패류 또는 새우의 조리 장소 및 조리 설비에 사용될 수 있으며 장소는 이에 국한되지 않는다. 또한, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 세척제는 부화장 또는 양식장의 수조에 감염 가능한 비브리오 하베이를 제거하는데 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지 또는 상기 조성물을 이용하여 비브리오 하베이에 의한 감염성 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 치료방법은 비브리오 하베이에 의한 감염성 질환이 발병된 개체에 상기 박테리오파지 또는 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 상기 박테리오파지 또는 조성물은 약학적 제제의 형태로 어패류 또는 새우에게 투여되거나, 어패류 또는 새우의 사료 또는 부화장 및 양식장 수조에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 사료첨가제의 형태로 사료에 혼합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 박테리오파지 또는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 치료방법에 투여되는 본 발명의 상기 박테리오파지 또는 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 개체의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 신규 박테리오파지는 모든 비브리오 하베이에 대하여 특이적 사멸능을 나타내므로, 비브리오 하베이 감염성 질병인 비브리오증의 예방 또는 치료에 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 사료 첨가용 조성물, 소독제 및 세척제 등으로 광범위하게 이용될 수 있다.

도 1은 ΦCJ17의 전자 현미경 사진이다.
도 2는 분리된 박테리오파지 ΦCJ17의 PFGE 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 3은 분리된 박테리오파지 ΦCJ17의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 4a는 서열번호 6 내지 9의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 박테리오파지 ΦCJ17의 PCR 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 4b는 서열번호 10 및 11의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 박테리오파지 ΦCJ17의 PCR 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 4c는 서열번호 12 및 13의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 박테리오파지 ΦCJ17의 PCR 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 4d는 서열번호 14 및 15의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 박테리오파지 ΦCJ17의 PCR 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5는 박테리오파지 ΦCJ17의 내산성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 박테리오파지 ΦCJ17의 내열성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 비브리오 하베이 사멸효과를 나타내는 박테리오파지의 분리

실시예 1-1: 비브리오 하베이 사멸효과를 나타내는 박테리오파지 스크리닝 및 단일 박테리오파지 순수분리

인천 중구 을왕동 바다에서 수득한 바닷물 50㎖를 4,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 0.45㎛ 필터로 여과하여 시료액을 준비하고, 이를 이용하여 소프트 아가 오버레이(soft agar overlay) 방법을 수행하였다.

구체적으로, 비브리오 하베이 균주(Vibrio harveyi BB120, VH-BB120, ATCC® BAA-1116TM) 진탕 배양액(OD₆₀₀=2) 150㎕와 10X LB 배지(tryptone 10g/ℓ, yeast extract 5g/ℓ 및 NaCl 10g/ℓ) 2㎖의 혼합물에 상기 시료액 18㎖을 가하여 혼합하고, 30℃에서 18시간 동안 배양한 다음, 배양액을 4,000rpm에서 10분간 원심분리하여 배양상등액을 수득하고, 상기 배양상등액을 0.45㎛ 필터로서 여과하였다. 이어, LB 평판배지의 위에 2% NaCl을 혼합한 0.6%(w/v) 한천 4㎖과 VH-BB120 진탕 배양액(OD₆₀₀=2) 150㎕의 혼합액을 부어 고형화시킨 다음, 그 위에 상기 여과된 배양상등액 10㎕를 적가하고, 30℃에서 18시간 동안 배양하여 용균반이 형성된 시료액을 선발하였다.

상기 선발된 시료액으로부터 유래된 배양상등액을 순차적으로 희석하여 일련의 농도수준으로 소프트 아가 오버레이 분석법에 적용하여 하나의 박테리오파지에 의하여 형성된 단일 용균반을 수득하고, 상기 수득한 단일 용균반으로부터 박테리오파지를 순수분리하였다. 구체적으로, 상기 용균반을 400㎕ SM 용액(NaCl 5.8g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 2g/ℓ, 1M Tris-HCl(pH7.5) 50㎖/ℓ)에 침지하고, 4시간 동안 실온에 정치하여 박테리오파지를 순수분리하였다.

상기 순수분리된 박테리오파지를 대량확보하기 위하여, 상기 용균반을 침지하고 정치시킨 용액의 상등액 100㎕, 2%(w/v) NaCl, 0.6%(w/v) 한천 12㎖ 및 VH-BB120 진탕 배양액 500㎕을 혼합하여, 150mm 지름의 LB 평판배지에서 소프트 아가 오버레이를 수행하여, 완전히 용균되도록 하였다. 이어, 상기 평판배지에 15㎖ SM 용액을 가하고, 실온에서 4시간 동안 저속으로 진탕시켜서 용균반에 포함된 박테리오파지를 용출시켰다. 상기 용출된 박테리오파지를 포함하는 SM 용액을 회수하고, 이를 0.45㎛ 필터로 여과하여 냉장 보관하였다.

실시예 1-2: 박테리오파지의 대량배양 및 정제

상기 실시예 1-1에서 선발된 박테리오파지를 VH-BB120을 이용하여 대량으로 배양하고, 이로부터 박테리오파지를 정제하였다

구체적으로, VH-BB120를 진탕 배양하여 1.0 X 10¹⁰cfu(colony forming unit)가 되도록 분주하여 4,000rpm 에서 10분간 원심분리한 후, 이를 4㎖ SM 용액에 재부유시켰다. 여기에 박테리오파지를 1.0 X 10⁶pfu(plaque forming unit)로 접종하고, MOI(multiplicity of infection)=0.001로 적정한 다음, 30℃에서 20분간 정치시켰다. 이어, 150㎖ LB 배지에 접종하고, 30℃에서 5시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 최종 부피의 1%(v/v)가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20 분간 교반하였으며, 제한효소인 DNase I과 RNase A를 각각 최종농도 1㎍/㎖이 되도록 첨가하고 30℃에서 30분동안 정치시켰다. 그런 다음, 최종 농도가 각각 1M과 10%(w/v)가 되도록 NaCl과 PEG(polyethylene glycol)를 가하고, 4℃에서 3 시간 추가 정치시켰으며, 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리하고, 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물을 5㎖ SM용액에 현탁시키고, 20 분간 실온에서 정치시킨 다음, 4㎖ 클로로포름을 가하여 교반하고, 4℃에서 4,000rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 0.45㎛ 필터로 여과한 다음, 글리세롤 밀도 구배법(밀도:40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심분리(35,000rpm, 1시간, 4℃)를 수행하여 박테리오파지를 정제하였다. 상기 정제한 박테리오파지를 500㎕ SM 용액에 현탁시킨다음, 타이터(titer)를 측정하였다.

상기 정제된 박테리오파지를 "Bacteriophage ΦCJ17"로 명명하고, 2012년 1월 2일 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11247P호로 기탁하였다.

실시예 2: Φ CJ17 의 비브리오 균주 감염성 비교

상기 실시예 1-2에서 정제한 ΦCJ17이 VH-BB120 이외의 다른 종의 비브리오균에 대하여도 용균 활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위해 교차감염을 수행하였다.

구체적으로, 5종류의 비브리오 파라하에몰리티쿠스(V.parahaemolyticus), 5종류의 비브리오 캠프벨리(V.campbelli) 및 2종류의 비브리오 하베이(V.harveyi)를 각각 배양하여 배양액을 수득하고, 상기 각각의 배양액과 상기 정제한 ΦCJ17을 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 수행하여 용균반의 형성여부를 확인하였다(표 1).

ΦCJ17의 병원성 비브리오균 감염여부

균주 명칭	용균반형성 여부
V.harveyi BB120 V.harveyi V.parahaemolyticus(MEBiC06047) V.campbellii(GMD258) V.parahaemolyticus(MEBiC06069) V.campbellii(WDC577) V.parahaemolyticus(MEBiC06080) V.campbellii(MEBiC05073) V.parahaemolyticus(MEBiC06081) V.campbellii(MEBiC05077) V.parahaemolyticus(MEBiC06254) V.campbellii(MEBiC05078)	O O X X X X X X X X X X

* 'MEBiC' source: 한국 해양 연구원, 해양 국한 생물지원 BANK

상기 표 1에서 보듯이, 실시예 1-2에서 정제한 ΦCJ17은 V.harveyi 이외의 비브리오균에 대하여는 용균활성을 나타내지 않음을 확인하여, 비브리오 하베이에 특이적인 사멸능을 갖는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: Φ CJ17 의 형태관찰

상기 실시예 1-2에서 정제한 ΦCJ17을 0.01%(w/v) 젤라틴 용액에 희석하고, 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 carbon-coated mica plate(ca.2.5 X 2.5 mm)에 적가하여 10 분간 적응시킨 다음, 멸균증류수로 세척하였다. 카본 필름(Carbon film)을 copper grid에 끼워 4% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)에서 30-60 초간 염색하고, 건조한 다음, 투과전자현미경(JEM-1011 transmission electron microscope, 80kV, 배율 X 120,000 ~ X 200,000)으로 검경하였다(도 1). 도 1은 ΦCJ17의 전자 현미경 사진이다. 도 1에서 보듯이, ΦCJ17은 형태학상 정이십면체의 머리(isometric capsid)와 수축성이 없는 꼬리(long non-contractile tail)로 구성된 형태형(morphotype) B1, 시포비리데(Siphoviridae)에 속함을 알 수 있었다.

실시예 4: Φ CJ17 의 전체 게놈 DNA 크기 분석

상기 실시예 1-2에서 정제한 ΦCJ17로부터 게놈 DNA를 추출하였다.

구체적으로, 정제된 ΦCJ17 배양액에 각각의 최종농도가 20mM, 50㎍/㎖ 및 0.5%(w/v)가 되도록 EDTA, proteinase K 및 SDS를 가하고, 55℃에서 1시간 동안 정치하였으며, 동일 부피의 페놀(pH8.0)을 가하여 교반한 다음, 실온에서 12,000rpm으로 10 분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 동일 부피의 PC(phenol:chloroform=1:1)와 혼합하고, 실온에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 동일 부피의 클로로포름과 혼합하고, 실온에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액에 3M 초산나트륨(sodium acetate)을 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가하여 혼합하고, 2배 부피의 차가운 95% 에탄올(ethanol)을 가하여 혼합한 다음, -20℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 이어, 0℃에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리하여 침전된 게놈 DNA를 수득하고, 이에 50㎕ TE 완충액(Tris-EDTA, pH 8.0)을 가하여 용해시키고, 그의 농도를 측정하였다. 그런 다음, 1㎍의 게놈 DNA를 1% PFGE(pulse-field gel electrophoresis) 아가로즈 젤에 로딩하고, BIORAD PFGE system 7번 프로그램(size range 25-100 kb ; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape ; forward voltage 180 V ; reverse voltage 120 V)을 이용하여 상온에서 20시간 동안 전개하였다(도 2). 도 2는 ΦCJ17의 게놈 DNA의 전기영동사진으로서, 약 75kbp의 크기를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5: Φ CJ17 의 단백질 패턴 분석

10¹⁰pfu/ml 타이터의 정제된 ΦCJ17 용액 15㎕와 5X SDS 시료 용액 5㎕을 혼합하고, 5분간 끓인다음, 15% SDS-PAGE를 수행하였다(도 3). 도 3은 ΦCJ17을 대상으로 수행한 SDS-PAGE 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 3에서 보듯이, 50kDa, 44kDa 및 36kDa 크기의 주요 단백질을 확인할 수 있었다.

실시예 6: Φ CJ17 의 유전적 특성 분석

상기 실시예 1-2에서 정제한 ΦCJ17의 유전자적 특성을 알아보기 위해서, ΦCJ17의 게놈 DNA 5㎍을 제한효소인 EcoR V, Sca I 및 Nru I으로 동시처리하고, Pvu II, Hinc II 와 Stu I 제한효소로 동시에 처리하였다. 벡터로는 pCL1920(Promega 사)를 Sma I 제한효소로 절단하고, CIP(calf intestinal alkaline phosphatase)로 처리한 것을 사용하였다. 절편화된 게놈 DNA와 벡터의 양이 3:1이 되도록 반응조건을 맞추어 혼합하고, 16℃에서 5시간 동안 연결반응을 수행하여, 각각의 게놈 DNA 절편을 포함하는 발현벡터를 수득하였다. 상기 수득한 발현벡터를 대장균의 한 종인 DH5α 세포에 도입시켜 각각의 형질전환체를 제조하였다. 상기 제조된 각각의 형질전환체를 엠피실린(ampicillin)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)이 포함된 LB 평판배지에 접종하고 배양한 다음, 통상의 청백 콜로니 선별법을 통해 2개 콜로니를 선발하였다. 상기 선발된 각각의 콜로니를 엠피실린이 포함된 배양배지에서 16시간 동안 진탕 배양하고, 이로부터 각각의 균체를 수득하였다. 상기 수득한 각 균체를 플라스미드 정제키트(Solgent 사)에 적용하여, 각 균체로부터 플라스미드를 추출하였다.

상기 플라스미드들을 M13 forward와 M13 reverse 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 클로닝 여부를 확인하고, 삽입된 게놈 DNA의 크기가 1kb 이상인 것을 선별하여, M13 forward 와 M13 reverse 프라이머 세트를 이용하여 염기서열의 유사성을 분석하였다(표 2).

ΦCJ17의 염기서열과 다른 박테리오파지의 해독염기 서열 상동성 비교

서열번호	organic	protein	quary	identity	e-value
1	Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris DP4	hypothetical protein	286-450	26/58(45%)	3.00E-10
2	Bacillus phage SPO1	gp21.9	8-385	26/128(20%)	0.21
	Lactobacillus phage Lb338-1	gp027	168-440	31/98(32%)	0.4
3	Pseudomonas phage 73	hypothetical protein ORF034	11-403	42/136(31%)	1.00E-08
4	Pseudomonas phage M6	hypothetical protein ORF038	2-439	39/146(27%)	9.00E-07
	Cellvibrio gilvus ATCC 13127	flagellin domain protein	401-595	27/73(37%)	7.5
6	Pseudomonas aeruginosa NCGM2.S1	hypothetical bacteriophage protein	85-660	69/192(36%)	5.00E-25

상기 표 2에서 보듯이, 핵산 분자 단편에 따라 20 내지 45%의 유사성을 보이나 모든 단편이 100% 일치하는 박테리오파지는 존재하지 않음을 확인하였으므로, 상기 ΦCJ17은 신규한 박테리오파지임을 알 수 있었다.

실시예 7: Φ CJ17 특이적 프라이머 염기서열 제작

ΦCJ17을 동정하기 위하여 ΦCJ17 특이적인 프라이머를 제작하였다.

구체적으로, 서열번호 1을 바탕으로 서열번호 6과 7, 서열번호 2를 바탕으로 서열번호 8와 9의 프라이머세트를 제작하였다. 또한 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5를 바탕으로 각각 서열번호 10과 11, 서열번호 12와 13 및 서열번호 14와 15의 프라이머 세트를 제작하여 PCR을 진행하였다. 0.1㎍의 박테리오파지 전체 게놈 DAN와 0.5 pmol이 되도록 프라이머를 pre-mix(Bioneer 사)에 첨가하고 최종부피가 20㎕가 되도록 맞추었다. 이를 denaturation; 94℃ 30초, annealing; 60℃ 30초, polymeration; 72℃ 1분의 조건으로 30cycles PCR을 진행하였다(도 4a 내지 4d). 도 4a는 서열번호 6 내지 9의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 박테리오파지 ΦCJ17의 PCR 결과를 나타내는 전기영동사진이고, 도 4b는 서열번호 10 및 11의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 박테리오파지 ΦCJ17의 PCR 결과를 나타내는 전기영동사진이며, 도 4c는 서열번호 12 및 13의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 박테리오파지 ΦCJ17의 PCR 결과를 나타내는 전기영동사진이고, 도 4d는 서열번호 14 및 15의 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 박테리오파지 ΦCJ17의 PCR 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 4a 내지 4d에서 보듯이, 서열번호 6과 7, 서열번호 8과 9, 서열번호 10과 11 및 서열번호 12와 13의 프라이머 세트를 이용했을 경우 각각 약 600bp, 400bp, 900bp, 500bp 및 1000bp 정도의 PCR 산물을 수득할 수 있음을 확인하였다.

실시예 8: 박테리오파지의 pH 에 따른 안정성 조사

ΦCJ17이 어류 위장 내 낮은 pH에서 안정성을 보유할 수 있는지 확인하기 위하여 다양한 pH 범위(pH 2.0 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, 9.5, 10.0, 11.0)에서 안정성 조사 실험을 수행하였다. 다양한 pH 용액(소디움아세테이트 용액(Sodium acetate buffer(pH 4.0, pH 5.5)), 소디움시트레이트 용액(Sodium citrate buffer(pH 2.0, pH 2.5 pH 3.0, pH 3.5)), 소디움포스페이트 용액(Sodium phosphate buffer(pH 6.5, pH 7.5)), 트리스 용액(Tris-HCl(pH 8.5, pH 9.5, pH 10.0, pH 11.0))을 각각 0.2M로 제작하였다. 180㎕의 pH 용액과 20㎕의 2.0 X 10¹¹PFU/㎖ 타이터의 박테리오파지 용액을 혼합하고, 2시간 동안 상온에서 정치하였다. 이들을 단계 희석하고, 소프트 아가 오버레이 방법을 이용하여 각 단계의 희석액을 10㎕씩 적가한 다음, 30℃에서 18시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다(도 5). 도 5는 박테리오파지 ΦCJ17의 내산성 실험 결과를 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 원래의 ΦCJ17의 타이터와 비교하여 pH 변화에 따른 타이터 변화를 통하여 상대적 안정성을 확인하였는데, pH 4.0부터 pH 11.0까지 박테리오파지 ΦCJ17의 활성을 잃지 않고 안정적임을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 박테리오파지의 온도에 따른 안정성 조사

박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 발생하는 열에 대한 안정성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 3.0 X 10¹¹PFU/㎖ 타이터의 ΦCJ17의 용액 100㎕를 37℃, 45℃, 53℃, 60℃ 및 70℃의 온도 조건 하에서 각각 0 분, 30분, 60분 및 120분 동안 정치시켰다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액 10㎕씩 적가한 다음, 30℃에서 18시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다(도 6). 도 6은 박테리오파지 ΦCJ17의 내열성 실험 결과를 나타낸다. 도 6에서 보듯이, 원래 타이터와 온도 및 노출 시간 변화에 따른 상대적 안정성을 확인하였는데, 60℃에서 2시간까지 노출이 되어도 활성을 유지하였으나, 70℃에서는 10분 노출부터 시간의 경과에 따라 활성이 감소함을 알 수 있었다.

실시예 10: 박테리오파지의 야생분리주 비브리오 하베이에 대한 감염범위 조사

ΦCJ17이 실험에 사용된 VH-BB120 이외의 한국 해양연구원 해양 국한 생물지원 뱅크에서 분리한 야생 분리주 비브리오 하베이 1주, ATCC에서 구매한 비브리오 하베이 1주 및 실험실에서 자체적으로 분리한 비브리오 하베이 1주를 포함하는 총 3주의 V.harveyi 에 대하여 용균 활성이 있는지 여부를 확인하였다. 각 균주의 진탕 배양액(OD₆₀₀=2) 150㎕을 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 진행하여 10⁸pfu/ml 타이터의 ΦCJ17의 용액 10㎕씩 적가한 다음, 30℃에서 18시간 동안 배양하여 용균반 형성 유무를 관찰하였다(표 3).

야생분리주 비브리오 하베이(V.harveyi) 에 대한 용균 형성 여부 조사

균주명	ΦCJ13 용균반형성 유무
V.harveyi(MEBiC05675) V.harveyi(LAB) V.harveyi(BB170)	O O O

* 'MEBiC' source: 한국 해양 연구원, 해양 국한 생물지원 BANK

* 'LAB' source: 수산시장 물 샘플에서 분리한 실험실 자체 분리균주

* 'BB170' source: ATCC® BAA-1117TM

상기 표 3에서 보듯이, 상기 ΦCJ17은 VH-BB120 뿐만 아니라, 모든 종류의 V.harveyi에 대한 감염능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 ΦCJ17은 어류 양식장과 같은 현장에 적용할 경우, V.harveyi에 대한 우수한 방제효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11247P 20120102

서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

1. 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)에 특이적 사멸능을 갖는 기탁번호 KCCM11247P인 박테리오파지.
   
2. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 비브리오 하베이 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 비브리오 하베이 감염성 질병은 비브리오증인 것인 조성물.
   
4. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제.
   
5. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 어패류 또는 새우 양식용 사료첨가제.
   
6. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제.
   
7. 제1항의 박테리오파지 또는, 제2항 또는 제3항의 조성물을 양식용 어패류 또는 새우에 투여하는 단계를 포함하는, 비브리오증의 예방 또는 치료방법.
   
   

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