KR101381796B1 - 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 상기 항균 조성물을 이용하여 인간을 제외한 동물의 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel bacteriophage and antibacterial composition comprising the same}
본 발명은 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 나타내는 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 신규 박테리오파지 또는 상기 항균 조성물을 이용하여 동물의 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
대장균 (Escherichia coli, 이하, 'E. coli'라 한다)은 장내 세균과 (Enterobacteriaceae), 에스케리키아속 (Escherichia)에 속하는 그람 음성의 단간균으로, 포유동물을 비롯한 다양한 동물의 장관 내에 존재하는 정상 세균총 중의 하나이다. 대장균은 대부분 비병원성으로 기회 감염을 유발할 수 있으나, 일부 고병원성 균주는 사람을 비롯한 동물 내에서 다양한 장 질환 및 패혈증 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.
대장균의 종류에는 장독소성 대장균 (Enterotoxigenic E. coli, ETEC), 장병원성 대장균 (Enteropathogenic E. coli, EPEC), 장출혈성 대장균 (Enterohemorrhagic E. coli, EHEC), 장응집성 대장균 (Enteroaggregative E. coli, EAEC), 장침입성 대장균 (Enteroinvacive E. coli, EIEC), 괴사소성 대장균 (Necrotoxigenic E. coli, NTEC) 등이 있으며, 이들 중 특히 장독소성 대장균은 양돈에서 대장균 감염성 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다.
현재, 양돈 산업의 대규모 집단 사육 추세에 따라 돼지의 대장균증은 양돈장에서 가장 흔하고 또 문제시되는 질병으로 대두되고 있다 (비특허문헌 1). 최근 우리 나라에서도 돼지의 대장균증 발생이 증가하여 설사로 인한 어린 돼지의 성장 지연 및 폐사로 사육 농가에 경제적으로 커다란 손실을 초래하고 있는 실정이다 (비특허문헌 2).
이러한 돼지 대장균증을 예방 및 치료하기 위하여 종래에는 돼지에 여러 항생제들을 사용하여 왔으나, 항생제를 오남용하는 경우 돼지에 내성을 유발하거나 항생제들이 돼지 체내에 잔류할 가능성이 있어 현재는 전세계적으로 항생제 투여에 많은 제한을 두고 있다 (비특허문헌 3).
한편, 박테리오파지 (bacteriophage)는 특정 세균에 감염하여 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스를 의미한다. 박테리오파지는 항생제에 비하여 숙주 특이성이 강할 뿐만 아니라, 최근 들어 항생제 사용에 대한 내성균 출현의 문제가 심각해짐에 따라 그 활용에 대한 관심이 높아지고 있다 (비특허문헌 4 및 5).
이에 세계 여러 나라에서 박테리오파지에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 박테리오파지에 대한 특허 출원은 물론, 이를 활용한 조성물에 대하여 미국식품의약국 (Food and Drug Administration, FDA)의 승인 등을 취득하려는 움직임이 증가되고 있는 추세이다.
박테리오파지에 관한 선행 기술로 특허문헌 1에서는 E. coli 0157:H 균을 통제하기 위한 7 종의 박테리오파지에 대하여 개시하고 있으며, 특허문헌 2에서는 황색 포도상 구균에 특이적인 사멸능을 갖는 박테리오파지에 대하여 개시하고 있다. 특허문헌 3에서는 세균 세포막의 펩티도글리칸 구조물을 특이적으로 파괴시키는 박테리오파지 유래 용균 단백질 및 이에 의한 세균 파쇄물에 대하여 개시하고 있다.
그러나, 상기와 같은 선행 기술들의 존재에도 불구하고 양돈을 비롯한 축산업에 있어서 중요한 문제가 되고 있는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 박테리오파지 관련 선행 기술은 여전히 부족한 실정이며, 따라서 이러한 박테리오파지 및 그 관련 기술의 개발이 요구되고 있다.
미국등록특허 제6,485,902호 대한민국등록특허공보 B1 제10-0910961호 대한민국공개특허공보 A 제10-2009-0021475호
박영일. 양돈학, 선진문화사, 353-359, 1998 홍의철. 단국대학교 석사학위논문, 조기 이유 자돈에 있어 난황 항체의 첨가 효과, 2001 Mason HS 외. Trends in Biotech, 13:388-392, 1995 Cislo, M 외. Arch Immunol. Ther. Exp. 2:175-183, 1987 김성훈 외. 박테리오파지, 새로운 대체 항생제, BioWave Vol.7 No.15, 2005, BRIC
본 발명자들은 항생제 사용에 의한 내성균의 출현 및 항생제의 육류 내 잔류 문제 등을 해결하고 병원성 대장균을 효율적으로 예방 및 치료하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 장독소성 대장균에 대하여 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 자연계에서 분리해 내기에 이르렀다.
또한, 상기 신규 박테리오파지의 형태적, 생화학적, 유전적 특성을 동정하고 상기 박테리오파지가 내산성 및 내열성 등이 뛰어남을 확인하여 이를 활용한 항생제, 소독제, 사료 첨가제, 기타 조성물을 개발하였고, 나아가 대장균 감염성 질병의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 이를 이용한 질병의 예방 또는 치료 방법을 개발하였다.
본 발명은 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 소독제 및/또는 세척제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여, 인간을 제외한 동물의 장독소성 대장균 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는, 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
삭제
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 소독제 또는 세척제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)은 장독소성 대장균을 특이적으로 사멸시키는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명의 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)은 내산성 및 내열성이 우수하여 다양한 온도 및 pH 범위에서 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 물질로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 소독제 및 세척제 등으로 활용될 수 있는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 갖는다.
도 1은 신규 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)(이하, 'ΦCJ20')의 전자 현미경 사진이다.
도 2는 신규 박테리오파지 ΦCJ20의 PFGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 신규 박테리오파지 ΦCJ20의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 신규 박테리오파지 ΦCJ20의 내산성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 신규 박테리오파지 ΦCJ20의 내열성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
구체적으로 본 발명의 일 양태는,
장독소성 대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 제공한다.
장독소성 대장균은 그람 음성의 간균으로 락토오스 (Lactose), 프럭토오스 (Fructose)를 분해하여 산과 가스를 생성하는 호기성 또는 통성 혐기성균이다. 장독소성 대장균은 보통의 배지에서도 잘 자라며 약 7℃ 내지 48℃의 온도에서 발육 가능하고 발육 최적 온도는 약 35℃ 내지 37℃이다. 또한 장독소성 대장균은 pH 4.5 내지 pH 9의 범위에서 발육 가능하다.
장독소성 대장균은 콜레라균 (Vibrio cholerae)과 유사한 독소를 생산하기 때문에 장독소성 대장균에 감염되면 콜레라에 감염된 경우와 유사한 병증을 나타내게 된다. 상기 생산되는 독소는 크게 이열성 독소 (heat-labile enterotoxin, LT) 및 내열성 독소 (heat-stable enterotoxin, ST) 두 가지로 구별된다. 상기 이열성 독소는 약 60℃에서 약 10분 동안 가열하는 경우 활성을 잃는 독소이고 상기 내열성 독소는 약 100℃에서 약 30분 동안 가열하여도 활성을 잃지 않는 내성을 나타내는 독소를 말한다.
장독소성 대장균은 소장 상부에서 증식하며, 장독소성 대장균의 농도가 장액의 단위 부피 (1 ml)당 약 107 cfu (colony formation unit) 내지 108 cfu에 도달한 경우에 대장균증을 비롯한 대장균 감염성 질병을 유발하게 된다.
박테리오파지 (bacteriophage)는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA (Deoxyribonucleic acid) 또는 RNA (Ribonucleic acid)를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.
본 발명의 박테리오파지 ΦCJ20은 장독소성 병원성 대장균을 선택적으로 감염시키는 종 특이성을 갖는 박테리오파지로서, 정이십면체의 머리 (isometric capsid)를 가지며 꼬리(tail)가 관찰되지 않는 구조 (도 1)를 갖는, 형태학상 포도비리데 (Podoviridae)에 속하는 박테리오파지이다. 박테리오파지 ΦCJ20의 염기서열과 다른 박테리오파지의 해독 염기 서열의 상동성을 비교한 결과는 [표 2]와 같다. 박테리오파지 ΦCJ20의 내산성에 있어서는 pH 5.0부터 pH 11.0까지 활성을 잃지 않고 안정적이며(도 4), 내열성에 있어서는 53℃에서 2 시간 동안 노출되었을 때까지는 활성을 유지하였으나, 60℃에서는 노출 시간의 경과에 따라 활성이 감소되었다(도 5). 박테리오파지 ΦCJ20의 DNA 염기서열은 서열목록상 서열번호 1과 같다.
상기 박테리오파지 ΦCJ20은 본 발명자들이 신규 분리한 박테리오파지로서, 2013년 1월 30 일자로 한국 미생물 보존 센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11362P로 기탁되었다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 박테리오파지 ΦCJ20은 장독소성 대장균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 항균 활성을 나타내기 때문에 장독소성 대장균에 의한 감염으로 유발되는 질병들을 예방하거나 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 상기 장독소성 대장균 감염성 질병의 예로 바람직하게는 대장균증 (Colibacillosis), 보다 바람직하게는 돼지 대장균증 (Colibacillosis in pigs)을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "대장균증"이란, 동물에 병원성 대장균이 감염되어 발생하는 질병을 의미하며 그 증상으로 패혈증, 설사 (신생기 설사 및 이유 후 설사), 독혈증 (부종병 및 뇌척수혈관증) 등이 나타난다. 이 중에서 패혈증은 생후 2일 내지 3일 이내의 신생기에 주로 발생하는 급성의 전신 감염증으로 폐사율이 상당히 높다. 설사는 1주 내지 2주령 이내의 포유기 및 이유 직후에 다발하는 장관 감염증으로 폐사 또는 발육 장애의 원인이 된다. 독혈증은 이유 후 8주 내지 12주령의 자돈에서 주로 발병하며 부종 및 신경 증상을 나타내다 급사를 일으키는 경우가 빈번히 발생한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 및/또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에 제공하여 해당 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 및/또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에 제공하여 기(旣)감염된 해당 질병의 증세를 호전시키거나 개선시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 5×102 내지 5×1012 pfu/㎖로 함유할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 1×106 내지 1×1010 pfu/㎖로 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물을 정제 또는 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스 (Saccharose), 솔비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 전분, 아밀로펙틴 (Amylopectin), 셀룰로오스 (Cellulose) 또는 젤라틴 (Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 (dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘 (magnesium stearate), 스테아르산 칼슘 (calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨 (sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 (polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 동물의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 보통으로 숙련된 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.
본 발명에 사용되는 용어 "항생제"란, 약제 형태로 인간을 포함한 동물에 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 효능을 갖는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 개념에 해당한다.
본 발명의 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 항생제는 종래 항생제에 비하여 장독소성 대장균에 대한 특이성이 매우 높아 익균은 죽이지 않고 특정 병원균만을 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성을 유도하지 않아 종래의 항생제에 비하여 제품 수명이 연장된 신규 항생제로 제공될 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 이를 포함하는 조성물을 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료 또는 음용수에 혼합시키는 방식으로 사용되거나, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 이를 포함하는 조성물을 사료 또는 음용수 제조 시 직접 첨가하는 방식으로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제로 사용되는 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 포함하는 조성물은 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 건조된 분말 형태로 제조하기 위한 건조 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는, 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조, 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 가지 이상의 방법을 함께 이용하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 상기 첨가될 수 있는 미생물의 비제한적인 예로는, 단백질 분해 효소, 지질 분해 효소 및/또는 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등과 같은 고초균; 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능을 갖는 락토바실러스 균주 (Lactobacillus sp.); 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 갖는 아스퍼질러스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 등과 같은 사상균; 및 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 등과 같은 효모로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 필요에 따라 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 사용 가능한 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료 또는 음용수의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등; 사료 또는 음용수의 효용 증대를 위하여 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백질태질소화합물 (非蛋白質態窒素化合物), 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제 또는 올리고당 등이 있으며, 그 외에 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 함께 첨가될 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 사료 100 중량부에 대하여, 바람직하게는 0.05 내지 10 중량부로 함유될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 2 중량부로 함유될 수 있다. 본 발명의 상기 음용수 첨가제는 음용수 100 중량부에 대하여, 바람직하게는 O.0001 내지 0.01 중량부로 함유될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.001 내지 0.005 중량부로 함유될 수 있다. 상기 범위 내에서 장독소성 대장균에 대한 박테리오파지 ΦCJ20의 활성이 충분히 발휘되는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 첨가하거나, 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 직접 첨가하여 제조된 사료 또는 음용수를 제공한다
본 발명에서 사용되는 사료는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 음용수는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 음용수를 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제를 제공한다. 상기 소독제 또는 세척제의 제형은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 알려진 제형으로 제조되어 사용할 수 있다.
상기 소독제는 장독소성 대장균을 제거하기 위하여 살포될 수 있으며 동물의 활동 영역, 도축장, 폐사 지역, 조리 장소 또는 조리 설비 등에 살포될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
상기 세척제는 장독소성 대장균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 동물의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로 사용될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 장독소성 대장균에 의해 감염되었거나 감염될 위험이 있는 인간을 제외한 대상체에 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 이를 포함하는 조성물의 적합한 1일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며 이는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명한 사항이다. 상기 인간을 제외한 대상체는 바람직하게는 장독소성 대장균에 감염되었거나 감염될 위험이 있는 돼지이다.
특정 동물에 대한 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 이를 포함하는 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.
본 발명의 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에 분무식 비강 투여되거나, 동물의 사료 또는 음용수에 직접 첨가되어 이를 섭식시키는 방식으로 투여될 수 있으며, 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제의 형태로 사료 또는 음용수에 혼합되어 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 조직에 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 이를 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 즉, 상기 박테리오파지 ΦCJ20 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ20을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] - 장독소성 대장균에 감염하는 박테리오파지의 분리
< 실시예 1-1>
박테리오파지 스크리닝 및 단일 박테리오파지 분리
충청도 홍성군 광천 지역의 삼화원종 농장 지역의 양돈 분변 및 환경 샘플로부터 수득한 시료 50 ㎖를 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 그 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 시료액을 준비하고, 이를 이용하여 소프트 아가 오버레이 (soft agar overlay) 방법을 수행하였다. 상기 소프트 아가 오버레이 방법이란 탑-아가 (top-agar, 0.7% 한천을 이용하여 고체 배지 위에 붙이는 것)에서 성장하는 숙주세포를 이용하여 박테리오파지가 용균하는 것을 관찰하는 방법을 말한다.
구체적으로, 서울대학교 수의학과 수의전염병학실에서 분리한 장독소성 대장균 (SNU105) 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕와 10×LB 배지 (트립토판 (tryptone) 10 g/ℓ; 효모 추출물 5 g/ℓ; NaCl 10 g/ℓ) 2 ㎖에 상기 시료 여과액 18 ㎖를 혼합하고 이를 30℃에서 18시간 동안 배양한 다음, 상기 배양액을 4,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 그 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 그 다음, LB 평판 배지 위에 0.7%(w/v) 한천 3 ㎖와 장독소성 대장균 (SNU105) 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕의 혼합액을 부어 굳힌 후, 그 위에 상기 시료액 10 ㎕를 적가하고 30℃에서 18시간 동안 배양하여 용균반이 형성됨을 확인하였다.
하나의 용균반에는 한 종류의 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있기 때문에, 상기 형성된 용균반으로부터 단일 박테리오파지를 분리하고자 하였다. 구체적으로, 상기 용균반을 400 ㎕의 SM 용액 (NaCl 5.8 g/ℓ; MgSO47H2O 2 g/ℓ; 1M Tris-Cl (pH 7.5) 50 ㎖)에 가하고 실온에서 4시간 동안 방치하여 박테리오파지 용액을 수득하였다. 이어서, 상기 박테리오파지 용액 100 ㎕를 0.7%(w/v) 한천 5 ㎖ 및 장독소성 대장균 (SNU105) 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕와 혼합하고 150 mm 지름의 LB 평판 배지를 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 수행하였으며, 완전히 용균될 때까지 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 LB 평판 배지에 5 ㎖의 SM 용액을 가하고 실온에서 4시간 동안 방치하여 박테리오파지 용액을 수득하였다.
상기 용액을 회수하고, 1%(v/v) 클로로포름을 가한 다음, 10분간 혼합하고 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였으며 상기 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 최종 시료를 수득하였다.
< 실시예 1-2>
박테리오파지의 대량 배양 및 정제
상기 실시예 1-1에서 수득한 박테리오파지를 장독소성 대장균 (SNU105)을 이용하여 대량으로 배양하고 이로부터 박테리오파지를 정제하였다.
구체적으로, 장독소성 대장균 (SNU105)을 진탕 배양하여 1.5×1010 cfu가 되도록 분주하여 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 이를 4 ㎖ SM 용액에 재부유시켰다. 여기에 상기 박테리오파지를 1.5×106 pfu로 접종하고 MOI (multiplicity of infection) = 0.0001로 적정한 다음, 상온에서 20분간 정치시켰다. 이어서, 이를 150 ㎖ LB 배지에 접종하고 30℃에서 5시간 동안 배양하였다.
배양이 종료된 후, 최종 부피의 1%(v/v)가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20 분간 교반하였으며 제한 효소인 DNase I과 RNase A를 각각 최종 농도 1 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고 30℃에서 30분 동안 정치시켰다. 그 다음, 최종 농도가 각각 1M과 10%(w/v)가 되도록 NaCl과 폴리에틸렌 글리콜을 가하고 4℃에서 3 시간 동안 추가 정치시켰으며 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 침전물을 수득하였다.
상기 수득한 침전물을 5 ㎖ SM 용액에 현탁시키고 20 분간 실온에서 정치시킨 다음, 1 ㎖ 클로로포름을 가하여 교반하고 4℃에서 4,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과한 다음, 글리세롤 밀도 구배법 (밀도: 40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심 분리 (35,000 rpm, 1시간, 4℃)를 수행하여 박테리오파지를 정제하였다.
본 발명자는 양돈분으로부터 시료를 채취하여, 장독소성 대장균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 상기 박테리오파지를 "Bacteriophage ΦCJ20"로 명명하고, 2013년 1월 30일 한국미생물 보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11362P호로 기탁하였다.
< 실시예 2>
Φ CJ20 의 대장균 감염성 비교
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ20이 장독소성 대장균 (SNU105) 이외에 다른 대장균에 대하여도 용균 활성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위해 교차 감염을 수행하였다.
구체적으로, 2 종의 장독소성 대장균 (SNUJG280 및 SNU105)과 11 종의 비병원성 대장균 (MC4100, BL21(DE3), Rosetta(DE3), 2616, 281, 1917, DH5a, GM2929, Tuner(DE3), W3110, K12G)을 각각 배양하여 배양액을 수득하고, 상기 각각의 배양액과 상기 정제한 박테리오파지 ΦCJ20을 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 수행하여 용균반의 형성 여부를 확인하였다.
상기 결과는 하기의 표 1에 나타낸다.
혈청형(serotype) 종 ΦCJ20 용균반 형성 유무





비병원성 대장균		 MC4100 ○
BL21(DE3) ○
Rosetta(DE3) ○
2616 ×
281 ×
1917 ○
DH5a ○
GM2929 ○
Turner ○
W3110 ○
K12G ○
장독소성 대장균 SNUJG280 ○
SNU105 ○
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ20은 비병원성 대장균에 있어서 9 종 (MC4100, BL21(DE3), Rosetta(DE3), 1917, DH5a, GM2929, Tuner(DE3), W3110, 및 K12G)에 대하여 용균 활성을 나타내었으며 나머지 2종 (2616 및 281)에 대하여는 용균 활성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3>
ΦCJ20의 형태 관찰
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ20을 0.01% 젤라틴 용액에 희석하고 2.5% 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 탄소 코팅된 운모판 (carbon-coated mica plate (ca. 2.5 mm×2.5 mm))에 적가하여 10분간 적응시킨 다음, 멸균 증류수로 세척하였다. 탄소 피막 (carbon film)을 구리 그리드 (copper grid)에 끼워 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)에서 30초 내지 60 초간 염색하고 건조한 다음, 투과 전자 현미경 (JEM-1011, 80 kV, 배율 ×120,000 내지 ×200,000)으로 검경하였다 (도 1).
도 1은 박테리오파지 ΦCJ20의 전자 현미경 사진을 나타낸 것으로, 형태학상 정이십면체의 머리를 가지며 꼬리가 없는 형태형를 나타내는 것으로 보아 포도비리데에 속함을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
Φ CJ20 의 전체 게놈 DNA 의 크기 분석
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ20으로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
구체적으로, 정제된 박테리오파지 ΦCJ20 배양액에 20 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), 50 ㎍/㎖ 단백질 분해 효소 (proteinase) K 및 0.5%(w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)를 가하고 50℃에서 1시간 동안 정치하였으며 동일 부피의 페놀 (pH 8.0)을 가하여 교반한 다음, 실온에서 12,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다.
상기 상등액을 동일 부피의 PC (페놀:클로로포름 = 1:1)와 혼합하고 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 동일 부피의 클로로포름과 혼합하고 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 그 상등액을 수득하였다. 상기 상등액에 3M 초산 나트륨 (sodium acetate)을 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가하여 혼합하고, 2배 부피의 차가운 95% 에탄올을 가하여 혼합한 다음, -20℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 이어서, 0℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심 분리한 후 상등액을 제거하여 침전물을 수득한 다음, 이에 50 ㎕ TE 완충액 (Tris-EDTA, pH 8.0)을 가하여 용해하였다. 상기에서 추출된 DNA를 10배 희석하여 OD260에서 흡광도를 측정하여 농도를 측정하였다.
그 다음, 1 ㎍의 DNA를 1% PFGE (pulse-field gel electrophoresis) 아가로스겔에 로딩하고, 바이오래드 (BIORAD) PFGE 시스템 7번 프로그램 (크기 범위 25 kb 내지 100 kb; 스위치 타임 램프 (switch time ramp) 0.4초 내지 2.0초, 선형 (linear shape); 순방향 전압 (forward voltage) 180 V; 역방향 전압 (reverse voltage) 120 V)을 이용하여 상온에서 20 시간 동안 전개하였다 (도 2).
도 2는 박테리오파지 ΦCJ20의 게놈 DNA의 전기 영동 사진으로서, 박테리오파지 ΦCJ20의 게놈 DNA는 약 40 kb의 크기를 나타냄을 확인할 수 있었다. 도 2에서 M은 크기 측정의 기준이 되는 DNA이다.
< 실시예 5>
Φ CJ20 의 단백질 패턴 분석
1010 pfu/㎖ 타이터 (titer)의 정제된 박테리오파지 ΦCJ20 용액 15 ㎕와 5X SDS 시료 용액 3 ㎕를 혼합하고 5분간 끓인 다음, 12% SDS-PAGE를 수행하였다 (도 3).
도 3은 박테리오파지 ΦCJ20을 대상으로 수행한 SDS-PAGE 결과를 나타내는 전기 영동 사진으로서, 약 46.5 kDa, 43 kDa, 39.5 kDa 및 17.1 kDa 크기의 주요 단백질을 확인할 수 있었다.
< 실시예 6>
Φ CJ20 의 유전적 특성 분석
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ20의 유전자적 특성을 알아보기 위하여, 박테리오파지 ΦCJ20의 DNA를 유전자 분석기기 FLX 티타늄 시퀀서 (titanium sequencer)(Roche)를 사용하여 분석하였다. (주)마크로젠 (Macrogen Inc.)에서 GS와 드 노보 어셈블리 소프트웨어 (de novo assembler software)(Roche)를 사용하여 유전자를 조합하였다. 전사 해석틀 (open reading frame)은 GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02 및 FGENESB 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. BLASTP와 인터프로스캔 (InterProScan) 프로그램을 사용하여 전사 해석틀의 이름을 명명 (annotation)하였다.
상기 박테리오파지의 염기 서열은 기존에 보고된 박테리오파지의 염기 서열과 다양한 유사성을 보였으나, 모든 단편이 100% 일치하는 박테리오파지는 없는 것으로 확인되었다. 이에 상기 박테리오파지는 신규 분리된 박테리오파지임을 확인할 수 있었다.
하기 표 2는 ΦCJ20 염기 서열과 다른 박테리오파지의 해독 염기 서열의 상동성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
Figure 112013017828082-pat00001
Figure 112013017828082-pat00002
Figure 112013017828082-pat00003

상기 제조된 박테리오파지 ΦCJ20의 DNA를 유전자 분석기기를 사용하여 분석한 염기 서열 일부 결과는 서열번호 1과 같다.
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< 실시예 7>
pH 에 따른 ΦCJ20의 안정성 조사
박테리오파지 ΦCJ20이 위장 내 낮은 pH에서 안정성을 보유할 수 있는 지를 확인하기 위하여 다양한 pH 범위 (pH 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 7.5, 8.3, 9.2 및 11.0)에서 안정성 조사 실험을 실시하였다.
실험을 위하여 다양한 pH 용액 (아세트산 나트륨 완충 용액 (pH 4.0, pH 5.5, 및 pH 6.4)), 시트르산 나트륨 완충 용액 (pH 3.0 및 pH 3.5), 인산 나트륨 완충 용액 (pH 6.9 및 pH 7.4), Tris-HCl 용액 (pH 8.2, pH 9.0, pH 9.8 및 pH 11.0)을 각각 0.2 M로 제작하였다.
상기 각 pH 용액 180 ㎕와 2.1×1010 PFU/㎖ 타이터의 박테리오파지 용액 20 ㎕를 섞어 각 pH 용액의 농도가 1M이 되게 한 후, 2 시간 동안 상온에서 정치하였다. 대조군은 동일한 방법으로 2.1×1010 PFU/㎖ 박테리오파지 용액 20 ㎕를 SM 용액 180 ㎕에 섞어 준 후, 2 시간 동안 상온에서 정치하였다. 그 다음, 이들을 단계 희석하고 소프트 아가 오버레이 방법을 이용하여 각 단계의 희석액을 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다 (도 4).
도 4는 박테리오파지 ΦCJ20의 내산성 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 박테리오파지 ΦCJ20은 pH 5.0부터 pH 11.0까지 활성을 잃지 않고 안정적임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 8>
온도에 따른 ΦCJ20의 안정성 조사
박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 발생하는 열에 대한 안정성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 2.0×1010 PFU/㎖ 농도의 박테리오파지 ΦCJ20의 용액 100 ㎕를 37℃, 42℃, 53℃ 및 60℃의 온도 조건 하에서 각각 0분, 30분, 60분 및 120분 동안 정치시켰다. 그 다음, 상기 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다 (도 5).
도 5는 박테리오파지 ΦCJ20의 내열성 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 ΦCJ20은 53℃에서 2 시간 동안 노출되었을 때까지는 활성을 유지하였으나, 60℃에서는 노출 시간의 경과에 따라 활성이 감소됨을 알 수 있었다.
< 실시예 9>
야생 분리주 장독소성 대장균에 대한 Φ CJ20 의 감염 범위 조사
박테리오파지 ΦCJ20이 실험에 사용된 장독소성 대장균 (SNU105) 이외에 서울대학교 수의과대학 및 캐나다의 겔프 대학에서 분리한 야생 분리주 장독소성 대장균 15주에 대하여 용균 활성이 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 각 균주의 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕를 섞어 소프트 아가 오버레이 방법을 진행하여 109 pfu/㎖ 타이터의 박테리오파지 ΦCJ20의 용액 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균반 형성 유무를 관찰하였다.
상기 결과는 표 3에 나타낸다.
혈청형 종 ΦCJ20 용균반 형성 유무






장독소성 대장균
(ETEC)		 SNU345 ×
SNU105 ○
SNU0122 ×
SNU0149 ○
SNUJG280 ○
SNUF4 ○
SNU162 ○
SNU160 ○
SNU107 ○
CANRO8 ○
SNU2618 ×
SNU2617 ×
SNU193 ×
SNU274 ○
SNU3220 ○
상기 표 3에서 나타난 바와 같이, 박테리오파지 ΦCJ20은 일반 양돈 농가에서 돼지 설사의 원인균으로 상당 부분을 차지하고 있는 ETEC O-혈청형 O149 (SNU107, SNUF4, SNUJG280, SNU3220, CANR08, SNU0149)에 대해 감염능을 보이고 있고, 뿐만 아니라 F-혈청형 K88 (SNU105, SNU107, SNU160, SNU162, SNUF4, SNU3220, CANR08, SNUJG280)에 대한 감염능을 보이고 있어서 현장 적용 시 우수한 효율성을 기대할 수 있다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11362P 20130130
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Claims (10)

  1. 장독소성 대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli)에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P).
  2. 제1항에 따른 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 감염성 질병은 대장균증인, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 따른 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 항생제.
  6. 제1항에 따른 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제.
  7. 제1항에 따른 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P)을 유효 성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제.
  8. 제1항에 따른 상기 박테리오파지 ΦCJ20 (KCCM11362P) 또는 제2항에 따른 상기 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 감염성 질병은 대장균증인, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법.
  10. 삭제
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101592177B1 (ko) 2014-05-07 2016-02-05 주식회사 인트론바이오테크놀로지 대장균에 대한 광범위 항균 활성을 갖는 박테리오파지를 활용한 대장균 감염을 방지 및 처치하는 방법

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101381793B1 (ko) * 2013-02-27 2014-04-07 씨제이제일제당 (주) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR101381795B1 (ko) * 2013-02-27 2014-04-07 씨제이제일제당 (주) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
US11058131B2 (en) 2015-04-16 2021-07-13 Kennesaw State University Research And Service Foundation, Inc. Escherichia coli O157:H7 bacteriophage Φ241
KR101993125B1 (ko) * 2016-12-22 2019-06-26 주식회사 옵티팜 신규한 esbl 생성 대장균 특이 박테리오파지 eco4 및 이를 포함하는 항균 조성물
CN109207435A (zh) * 2017-07-04 2019-01-15 中国科学院大学 一株新型大肠杆菌h21噬菌体st31的分离鉴定
CN111057681B (zh) * 2019-12-02 2023-02-28 衡阳师范学院 一株噬菌体及其应用
US11701398B2 (en) * 2020-06-04 2023-07-18 Intron Biotechnology, Inc. Compositions and methods for inhibiting the proliferation of pathogenic Escherichia coli
DE102020128879A1 (de) * 2020-11-03 2022-05-05 Oxana Karpf Verfahren zur Reduktion der Population mindestens einer intestinalen und/oder gastrointestinalen Bakterienart umfassend Bakteriophagen sowie Bakteriophagen und deren Verwendung
CN114410591B (zh) * 2021-12-02 2023-08-15 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 一种耐酸耐高温的金黄色葡萄球菌噬菌体及其组合物、试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020090356A1 (en) 2000-06-06 2002-07-11 Waddell Thomas E. Use of bacteriophages for control of escherichia coli 0 157
US8021657B2 (en) 2001-12-13 2011-09-20 Nestec S.A. Isolated phages and their use in food or pet food products
KR101101376B1 (ko) 2009-10-16 2012-01-02 경희대학교 산학협력단 대장균 또는 시겔라속 균에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060171966A1 (en) * 2002-08-30 2006-08-03 Centre For Health And Population Research Variants of vibrio cholerae 01 biotype e1 tor with attributes of classical biotype
KR100974185B1 (ko) 2007-08-27 2010-08-05 주식회사 인트론바이오테크놀로지 박테리오파지 유래 용균단백질 작용에 의해 제조된세균파쇄물 및 이를 포함하는 동물질병 예방용 백신 조성물
KR100910961B1 (ko) 2007-09-13 2009-08-05 주식회사 인트론바이오테크놀로지 황색포도상구균의 균막 처치에 효과적인 박테리오파지 또는그것 유래의 용균단백질
CN101724607B (zh) * 2009-12-18 2012-05-09 江苏省农业科学院 一种产肠毒素性大肠杆菌的噬菌体ek99-c及其应用
KR101260645B1 (ko) * 2011-11-14 2013-05-03 씨제이제일제당 (주) 대장균 특이적 사멸능을 나타내는 신규 분리된 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020090356A1 (en) 2000-06-06 2002-07-11 Waddell Thomas E. Use of bacteriophages for control of escherichia coli 0 157
US8021657B2 (en) 2001-12-13 2011-09-20 Nestec S.A. Isolated phages and their use in food or pet food products
KR101101376B1 (ko) 2009-10-16 2012-01-02 경희대학교 산학협력단 대장균 또는 시겔라속 균에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Seung Bin CHA 등. J. Vet. Med. Sci. 74(8): pp. 1037-1039, 2012 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101592177B1 (ko) 2014-05-07 2016-02-05 주식회사 인트론바이오테크놀로지 대장균에 대한 광범위 항균 활성을 갖는 박테리오파지를 활용한 대장균 감염을 방지 및 처치하는 방법

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