BR112015020706B1

BR112015020706B1 - Composição, aditivo alimentar ou aditivo para água potável, e desinfetante ou produto de limpeza

Info

Publication number: BR112015020706B1
Application number: BR112015020706-5A
Authority: BR
Inventors: Eun Mi Shin; Gi Duk Bae; Jae Won Kim
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2014-02-24
Publication date: 2023-04-25
Also published as: CN105324481A; ES2652336T3; WO2014133289A1; KR101381796B1; JP6059827B2; EP2961833B1; US9862935B2; PH12015501890B1; EP2961833A4; EP2961833A1; PH12015501890A1; CN105324481B; JP2016509838A; US20160083696A1; BR112015020706A2

Abstract

NOVO BACTERIÓFAGO E COMPOSIÇÃO ANTIBACTERIANA COMPREENDENDO O MESMO A presente invenção se refere a um novo bacteriófago (fi)CJ20 (KCCM11362P). A presente invenção se refere ainda a uma composição antibacteriana, compreendendo o bacteriófago (fi)CJ20 (KCCM11362P) como um ingrediente ativo. Além disso, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli (ETEC) em animais, exceto humanos, utilizando o bacteriófago (fi)CJ20 (KCCM11362P) ou a composição antibacteriana compreendendo o bacteriófago (fi)CJ20 (KCCM11362P) como um ingrediente ativo.

Description

Campo Técnico

A presente invenção se refere a um novo bacteriófago com uma atividade bactericida específica contra a bactéria Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC). e uma composição antibacteriana compreendendo o mesmo. A presente invenção se refere ainda a um método de prevenção e tratamento de doenças de animais utilizando o novo bacteriófago ou a composição antibacteriana.

Antecedentes da Invenção

A Escherichia coli (aqui referida como E. coli), é uma pequena bactéria gram- negativa em forma de bastonete, pertencente ao gênero da Escherichia e à família da Enterobacteriaceae, sendo uma das Horas normais existentes no intestino de diversos animais, inclusive de mamíferos. Sabe-se que a maioria das estirpes de E. coli são não- patogênicas e podem causar infecções oportunistas, mas algumas estirpes altamente patogênicas causam diversas doenças intestinais e septicemia em animais, incluindo humanos.

Um exemplo de E. coli pode compreender a E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enteroinvasiva (EIF.C), E. coli necrotoxigênica (NTEC), ou similares. Sabe- se que dentre estas, particularmente a F.TEC, pode gerar doenças infecciosas associadas a E. coli em suínos.

Atualmente, como um grande número de suínos pertence a uma raça coletiva na indústria de carne de porco, a colibacilose em suínos tem sido vista frequentemente como uma das doenças mais perturbadoras (Documento não patentário 1). Recentemente, a ocorrência de colibacilose em suínos tem aumentado na Coréia, o que tem causado um retardamento no crescimento e morte de suínos filhotes devido a sintomas como diarreia, causando assim prejuízos econômicos enormes aos fazendeiros (Documento não patentário 2).

A fim de prevenir e tratar a colibacilose em suínos, vários antibióticos tem sido administrados no estado da técnica, porém, quando são mal administrados, podem dar margem à resistência da droga e permanecer no corpo do animal. Portanto, atualmente, o uso de antibióticos nestes casos tem encontrado algumas restrições em todo o mundo (Documento não patentário 3).

Por sua vez, o bacteriófago é um tipo especializado de vírus que infecta e destrói somente bactérias, e pode se autorreplicar somente dentro de bactérias hospedeiras. O bacteriófago apresenta forte especificidade hospedeira em comparação com os antibióticos e, recentemente, o aparecimento de uma estirpe resistente a antibióticos tomou-se um grave problema, de tal modo que o interesse no uso prático do bacteriófago tem aumentado (Documentos não patentários 4 e 5).

Portanto, pesquisas relativas a bacteriófagos têm sido ativamente conduzidas em vários países de todo o mundo e, além de pedidos de patentes para bacteriófagos, houve um aumento gradual nos pedidos de aprovação encaminhados ao Food and Drug Administration (FDA) para composições contendo bacteriófagos.

Com relação aos bacteriófagos disponíveis no estado técnica, o Documento Patentário 1 revela 7 tipos de bacteriófagos para controlar a E.coli O157:H, e o Documento Patentário 2 revela um bacteriófago com uma atividade bactericida específica contra a Staphylococcus aureus. Além destes, o Documento Patentário 3 descreve uma proteína lítica derivada de um bacteriófago que destrói especificamente a estrutura do peptidoglicano da membrana celular bacteriana e bactérias lisadas pela proteína lítica.

Entrentanto, apesar da existência dos referidos documentos no estado da técnica, uma tecnologia associada com o bacteriófago para prevenir e/ou tratar doenças infecciosas causadas pela ETEC, que é um problema importante na indústria animal, incluindo a indústria de carne de suínos, é ainda insuficiente, de tal modo que um bacteriófago e uma tecnologia associada ao bacteriófago devem ser desenvolvidos.

Documentos disponíveis no estado da ténica Documentos Patentários

-Documento Patentário 1: Patente americana No. 6.485,902 -Documento Patentário 2: Patente coreana registrada No. 10-0910961 BI -Documento Patentário 3: Patente coreana publicada No. 10-2009-0021475 A

Documentos não Patentários

-Documento não Patentário 1: Young II Park, Swine Production Science, Sunj Publishing Group, 353-359, 1998. -Documento não Patentário 2: Eu Chui Hong, tese de mestrado, Dankook University, Addition Effect of Egg Yolk in Early Weaned Piglets, 2001.

-Documento não Patentário 3: Mason IIS et al., Trends in Biotech, 13:388-392, 1995. -Documento não Patentário 4: Cislo M, et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. 2:175-183, 1987.

-Documento não Patentário 5: Sung Hun Kim et al., Bacteriophage, Novel Alternative Antibiotics, BioWave Vol. 7 No. 15, 2005, BRIC.

Divulgação Problema Técnico

Os inventores da presente invenção realizaram estudos para solucionar problemas como a presença de bactérias resistentes a antibióticos, a presença de antibióticos remanescentes na carne e similares, além de prevenir e tratar eficientemente doenças infecciosas causadas por E.coli, e como resultado, os inventores da presente invenção isolaram o novo bacteriófago ΦCJ20 (KCCMI1362P) que possui uma atividade bactericida específica contra a ETEC presente na natureza.

Além disso, os inventores da presente invenção identificaram características morfológicas, bioquímicas e genéticas do novo bacteriófago e confirmaram que o bacteriófago tem uma excelente resistência a ácidos, resistência ao calor, e a condições similares, desenvolvendo assim um antibiótico, um desinfetante, um aditivo alimentar, e outras composições usando o novo bacteriófago. Além disso, os inventores da presente invenção desenvolveram uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por E.coli, e um método para prevenir ou tratar a doença utilizando a composição.

A presente invenção visa proporcionar um novo bacteriófago ΦCJ20 (KCCM11362P) com uma atividade bactericida específica contra a ETEC.

A presente invenção visa proporcionar ainda uma composição para a prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas por ETEC contendo o bacteriófago ΦCJ20 (KCCM 11362P) como um ingrediente ativo.

Ademais, a presente invenção visa proporcionar um antibiótico, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, um desinfetante ou um produto de limpeza contendo o bacteriófago ΦCJ20 (KCCMI I362P) como um ingrediente ativo.

Além disso, a presente invenção visa proporcionar um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas por ETEC em animais, exceto humanos, utilizando o bacteriófago ΦCJ20 (KCCMI1362P) ou uma composição contendo o bacteriófago ΦCJ20 (KCCM I 1362P) como um ingrediente ativo.

Solução Técnica

De acordo com uma configuração, a presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ20 (KCCMI I362P) com urna atividade bactericida específica contra a Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC).

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por ETEC, a dita composição contendo o bacteriófago ΦCJ20 (KCCM1 I362P) como um ingrediente ativo, conforme acima descrito.

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona um antibiótico, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, um desinfetante ou um produto de limpeza contendo o bacteriófago ΦCJ20 (KCCM11362P) como um ingrediente ativo, conforme acima descrito.

De acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de doença infecciosa causada por ETEC, compreendendo a administração do bacteriófago ΦCJ20 (KCCM11362P) ou da composição contendo o mesmo, conforme acima descrito, como um ingrediente ativo para animais, exceto humanos.

Efeitos Vantajosos

O bacteriófago ΦCJ20 (KCCM1I362P) de acordo com a presente invenção tem o efeito específico de matar a Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC).

Além disso, o bacteriófago ΦCJ20 (KCCM11362P) de acordo com a presente invenção apresenta excelente resistência a ácidos e ao calor, de tal modo que o bacteriófago ΦCJ20 (KCCMI1362P) pode ser usado para prevenir ou tratar doenças infecciosas por ETEC em vários níveis de temperatura ou de pH, podendo ser utilizado como um antibiótico, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, um desinfetante, um produto de limpeza ou similar.

Ademais, de acordo com a presente invenção, é possível prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas por ETEC através da administração do bacteriófago ΦCJ20 (KCCM11362P) ou da composição contendo o mesmo como um ingrediente ativo para animais, exceto humanos.

Descrição das Figuras

A FIG. 1 é uma fotografia, obtida de um microscópio de elétrons, do novo bacteriófago ΦCJ20 (KCCM1 I362P, doravante denominado “ΦCJ20”). A FIG. 2 mostra o resultado de uma eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do novo bacteriófago ΦCJ20. A FIG. 3 ilustra o resultado de uma eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) do bacteriófago ΦCJ20. A FIG. 4 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao ácido do novo bacteriófago ΦCJ20. A FIG. 5 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao calor do novo bacteriófago ΦCJ20.

Configuração Ideal

A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes. Considerações óbvias e facilmente interpretáveis pelos peritos na arte serão omitidas no presente relatório descritivo.

Especificamente, uma configuração da presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ20 (K.CCM 11362P), com uma atividade bactericida específica contra a Escherichia coli (ETEC).

A ETEC, que é uma bactéria gram-negativa em forma de bastonete, é uma bactéria aeróbica ou facultativamente anaeróbica decompositora de lactose ou frutose capaz de produzir ácido e gás. A ETEC cresce bem em um meio comum ou médio, podendo crescer entre 7 a 48°C, sendo que uma temperatura ótima de crescimento varia entre 35 e 37°C. Além disso, a ETEC pode crescer num nível de pH de 4,5 a 9,0.

Uma vez que a ETEC produz enterotoxinas similares à Vibrio cholerae, no caso de infecção por ETEC, serão exibidos sintomas da doença similares ao da cólera. As toxinas produzidas são divididas em dois tipos, uma enterotoxina termolábil (LT) e uma enterotoxina termoestável (ST). A enterotoxina termolábil é uma enterotoxina que perde sua atividade quando aquecida a 60°C durante 10 minutos, e a enterotoxina termoestável é uma enterotoxina que não perde sua atividade tão facilmente, sendo resistente ainda que aquecida a IOO°C durante 30 minutos.

Nos casos em que a concentração de ETEC atinge de lOcfu (unidade de formação de colônia) a 108cfu por unidade de volume (Iml) de fluido seroso enquanto a ETEC se prolifera numa porção superior do intestino, a ETEC pode causar doenças infecciosas por E.coli como a colibacilose.

Um bacteriófago é um vírus específico da bactéria que infecta bactérias específicas para suprimir e inibir o crescimento da bactéria, e representa um vírus compreendendo ácido desoxirribonucleico (DNA) em cadeia simples ou dupla, ou ácido ribonucleico (RNA) como um material genético.

O bacteriófago ΦCJ20 de acordo com a presente invenção, que é um bacteriófago com especificidade para infectar seletivamenle a ETEC, tem uma estrutura de cápside isométrica e uma cauda não contrátii e. morfologicamente, pertence à Podoviridae.

O bacteriófago ΦCJ20, que é um bacteriófago isolado recentemente pelos inventores da presente invenção, foi depositado no Centro Coreano de Cultura de Microorganismos (361-221, Hongjedong, Seodamun-gu, Seoul, República da Coréia) sob o número de depósito KCCM I 1362P em 30 de janeiro de 2013.

Em outro aspecto geral, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por ETEC contendo o bacteriófago ΦCJ20 como um ingrediente ativo.

Urna vez que o bacteriófago ΦCJ20 apresenta uma atividade antibacteriana capaz de matar especificamente ETEC. o bacteriófago ΦCJ20 pode ser utilizado para prevenir ou tratar doenças geradas pela infecção de ETEC. Como um exemplo de doença infecciosa causada por ETEC, podemos citar preferivelmente a colibacilose, mais especi ficam ente a colibacilose em suínos, mas não se limitando a ela,

O termo “colibacilose” tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a uma doença causada pela infecção de um animal com E.coli patogênico, e apresenta sintomas corno a sepsia, diarreia (diarreia neonatal e diarreia pós desmame), toxemia (edema e angiopatia cérebro-espinhal), ou similares. Dentre estas, a sepsia é uma infecção sistêmica aguda que ocorre frequentemente de 2 a 3 dias após o nascimento e possui um alto índice de mortalidade. A diarreia é o resultado mais comum das infecções pela via gastrointestinal, que ocorre durante o período de lactação dentro de 1-2 semanas após o nascimento e imediatamente após o período de desmame, causando morte ou retardamento do crescimento. A toxemia ocorre principalmente quando os leitões têm de 8 a 12 semanas após o período de desmame, e é frequentemente acompanhada por edema e sinais neurológicos, seguida de morte repentina.

O termo "prevenção" tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações relativas ao fornecimento do bacteriófago ΦCJ20 e/ou da composição contendo o mesmo como ingrediente ativo para animais, exceto humanos, a fim de suprimir a doença correspondente ou retardar a ocorrência da doença.

O termo "tratamento" tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações relativas ao fornecimento do bacteriófago ΦCJ20 e/ou da composição contendo o mesmo como ingrediente ativo para animais, exceto humanos, a fim de permitir a melhora ou alívio dos sintomas da doença causada pela infecção.

A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas pela bactéria ETEC de acordo com a presente invenção pode conter o bacteriófago ΦCJ20 2 12 6 10 com um teor preferível de 5x10 a 5x10 pfu / mβ, mais preferivelmente, 1x10 a 1x10 pfu / mé'.

A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas pela bactéria ETEC de acordo com a presente invenção pode conter ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável, e ser formulado em conjunto com o excipiente, para dessa forma ser fornecido como alimento, um fármaco, um aditivo alimentar, um aditivo para água potável, e similares. O termo "excipiente farmacêutico aceitável", tal como empregado no presente relatório descritivo, significa um veículo ou um diluente que não estimula o organismo vivo e não inibe a atividade biológica e as propriedades de uma composição administrada.

Não há limitações específicas para o tipo de excipiente utilizável de acordo com a presente invenção, e qualquer excipiente pode ser utilizado desde que seja geralmente utilizado na técnica e desde que seja farmaceuticamente aceitável. Como um exemplo não restritivo do excipiente, podemos citar solução salina, água estéril, soro fisiológico tamponado, solução de Ringer, uma solução injetável de albumina, uma solução de dextrose, uma solução de maltodextrina. glicerol, etanol, e outros similares. Tais excipientes podem ser utilizados isoladamente ou como uma mistura de pelo menos dois deles.

Além disso, se necessário, outros aditivos em geral, tais como um antioxidante, uma solução tampão, e/ou um agente bacteriostático, etc., podem ser ainda adicionados e utilizados, c uma composição pode ser formulada para injeção, tal como solução aquosa, suspensão, emulsão, ou similares, pílulas, cápsulas, grânulos, comprimidos, ou similares e, adicionalmente, por adição de um diluente. um dispersante. um surfactante. um aglutinante, um lubrificante e/ou similares, para então ser utilizados.

Não há limitações específicas para o método de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas por ETEC, mas qualquer método geralmente utilizado na arte pode ser utilizado. Como um exemplo não limitativo do método de administração, a composição pode ser administrada por via oral ou parentérica.

Como um exemplo não restritivo da formulação para a administração por via oral, podemos citar trociscos, pastilhas, comprimidos, suspensões aquosas, suspensões oleosas, pó preparado, grânulos preparados, emulsões, cápsulas duras, cápsulas moles, xaropes, elixires ou similares.

A fim de formular a composição de acordo com a presente invenção na forma de um comprimido, uma cápsula, ou similar, a formulação pode conter ainda um aglutinante tal como a lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose, gelatina: um excipiente tal como fosfato dicálcico, ou similar; um desintegrante tal como amido de milho, amido de batata doce, ou similar; um lubrificante tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearil fumarato de sódio, cera de polietilenoglicol, ou similares. No caso de formulação em cápsula, a formulação pode conter ainda um excipiente líquido tal como óleo gorduroso, além dos materiais acima mencionados.

Como um método de administração parentérica. é possível utilizar um método de administração intravenoso, um método de administração abdominal, um método de administração intramuscular, um método de administração por via subcutânea, um método de administração local, etc.. Além disso, também pode ser utilizado um método de aplicação ou pulverização da composição sobre o local da doença, mas a presente invenção não se limita a estes métodos.

Um exemplo de formulação para administração parentérica pode compreender formulações injetáveis para injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção intramuscular, ou similares; formulações para supositórios; formulações para pulverização, tais como formulações de aerossol que podem ser inaladas através do sistema respiratório, ou similares, mas a presente invenção não se limita a estas formulações. A fim de formular a composição para injeção, a composição de acordo com a presente invenção pode ser misturada com um estabilizador ou uma solução tampão em água para, dessa forma, preparar uma solução ou uma suspensão e, em seguida, a solução preparada ou a suspensão pode ser formulada em uma dose individual para uma ampola ou frasco. No caso da formulação da composição para pulverização, tal como a formulação de aerossol ou similares, um propulsor ou similar pode ser misturado juntamente com um aditivo para que a composição condensada em água ou em 5 pó seja dispersa.

Uma aplicação adequada, spray, ou dose de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas por ETEC pode ser diferentemente determinada dependendo de fatores tais como a idade, peso, sexo, grau dos sintomas da doença, um tipo de alimento, a taxa de excreção dos animais sujeitos à administração, ou 10 similares, bem como um método de formulação da composição, um método de administração, um tempo dc administração e/ou via de administração. Geralmente, um veterinário com conhecimentos na técnica pode facilmente determinar e prescrever uma dose eficaz para o tratamento pretendido.

Em outro aspecto geral, a presente invenção pode proporcionar um antibiótico 15 contendo o bacteriófago ΦCJ20 como um ingrediente ativo.

O termo "antibiótico", tal como empregado no presente relatório descritivo, significa um agente capaz de ser fornecido aos animais, incluindo seres humanos, em forma de droga, para assim matar as bactérias, c corresponde a um conceito compreendendo coletivamente um conservante, um desinfetante, e um agente antibacteriano.

O antibiótico contendo o bacteriófago ΦCJ20 como ingrediente ativo, de acordo com a presente invenção pode ter uma elevada especificidade para a ETEC se comparado com um antibiótico convencional e por isso não mata bactérias benéficas, mas apenas bactérias patogênicas específicas, não induzindo resistência às drogas, de modo que o antibiótico de acordo com a presente invenção pode ser fornecido como um novo antibiótico tendo um 25 tempo dc vida maior comparado aos antibióticos disponíveis no estado técnica.

Em outro aspecto geral, a presente invenção pode proporcionar um aditivo alimentar e um aditivo para água potável contendo o bacteriófago ΦCJ20 como um ingrediente ativo.

O aditivo alimentar e o aditivo para água potável de acordo com a presente invenção podem ser utilizados de uma maneira em que o bacteriófago ΦCJ20 ou a composição contendo o mesmo seja preparado individualmente como um aditivo alimentar ou para água e em seguida misturado a um alimento ou água potável, ou de uma forma em que o bacteriófago ΦCJ20 ou a composição contendo o mesmo seja diretamente adicionada no momento da preparação do alimento ou da água potável.

O bacteriófago ΦCJ20 ou a composição contendo o mesmo utilizada como aditivo alimentar ou para água potável de acordo com a presente invenção pode ser usado na forma líquida ou seca, preferivelmente em forma de pó seco.

Um método de secagem para a preparação do aditivo alimentar e do aditivo para água potável sob a forma de pó seco de acordo com a presente invenção não apresenta limitações e um método comumente utilizado pelos peritos na arte pode ser utilizado. Como exemplos não limitativos do método de secagem, podemos usar um método de secagem natural com ar. um método de secagem natural, um método de secagem por pulverização, um método de secagem por congelamento, ou métodos similares. Um destes métodos pode ser utilizado sozinho ou pelo menos dois destes métodos podem ser utilizados em conjunto.

Outro micróbio não patogênico pode ser adicionado ao aditivo alimentar ou aditivo para água potável. Como exemplo não restritivo do micróbio a ser adicionado, é possível escolher um micróbio selecionado dentre um grupo compreendendo Bacillus sp., capaz de produzir, protease, lipase e/ou enzima de conversão de açúcar, tal como Bacillus Subtilis ou similares; um Lactobacillus sp. com atividade fisiológica e atividade de degradação para um material orgânico em condições anaeróbicas, tal como o estômago de vaca; fungo de mofo com capacidade de aumentar o peso de um animal doméstico, a produção de leite, e a digestão de alimentos como Aspergillus oryzae, ou similares; e leveduras como Saccharomyces cerevisiae, ou similares. Um ou a combinação de pelo menos dois destes micróbios podem ser utilizados.

O aditivo alimentar ou aditivo para água potável contendo o bacteriófago ΦCJ20 como ingrediente ativo, de acordo com a presente invenção, pode ainda conter outros aditivos, conforme necessário. Como um exemplo não restritivo de aditivo, é possível utilizar um aglutinante, um emulsificante, um conservante, e similares, os quais são adicionados para evitar a deterioração do alimento ou da água; aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, composições nitrogenadas não proteicas, silicatos, soluções tampão, agentes corantes, agentes extratantes, oligossacarídeos, e similares, que são adicionados de modo a aumentar a utilidade do alimento ou da água potável. O aditivo pode incluir ainda um agente de mistura para alimentos, ou similar. Um ou a combinação de pelo menos dois destes aditivos podem ser utilizados.

O aditivo alimentar pode ser adicionado num teor de 0,05 a 10, preferivelmente de 0,1 a 2 partes por peso com base em 100 partes por peso do alimento. O aditivo para água potável pode ser adicionado num teor entre 0,0001 a 0,01, preferivelmente de 0,001 a 0.005 partes por peso com base em 100 partes por peso de água potável. A atividade do bacteriófago ΦCJ20 contra a ETEC pode ser suficientemente demonstrada nas faixas acima mencionadas.

Em outro aspecto geral, a presente invenção proporciona um alimento ou água potável preparados pela adição de um aditivo alimentar ou de água potável contendo o bacteriófago ΦCJ20 como ingrediente ativo, ou pela adição direta do bacteriófago ΦCJ20.

O alimento utilizado na presente invenção não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer outro alimento comumente usado pelos peritos na arte pode ser utilizado. Um exemplo não restritivo do alimento pode incluir alimentos vegetais corno grãos, raízes e frutas, subprodutos de processamento de alimentos, algas, fibras, subprodutos farmacêuticos, gorduras, amidos, cucurbitáceas ou subprodutos de cereais; e alimentos para animais, tais como proteínas, materiais inorgânicos, gorduras, minerais, proteínas de células individuais, plânctons animais ou alimentos. Um ou a combinação de pelo menos dois destes alimentos podem ser utilizados.

A água potável usada na presente invenção não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer água potável pode ser usada na presente invenção.

Em outro aspecto geral, a presente invenção pode fornecer um desinfetante ou um produto de limpeza contendo o bacteriófago ΦCJ20 como um ingrediente ativo. Uma formulação do desinfetante ou produto de limpeza não apresenta limitações, de tal sorte que o desinfetante ou o produto de limpeza podem ser preparados com qualquer formulação conhecida na arte.

O desinfetante pode ser pulverizado de modo a eliminar a ETEC em uma região onde vivem os animais, em um matadouro, em uma área de mortalidade, em uma cozinha ou em um equipamento de cozinha, ou similares, não estando a presente invenção limitada a estes exemplos.

Em outro aspecto geral, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas utilizando o bacteriófago ΦCJ20 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ20 como um ingrediente ativo.

Especificamente, o método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas de acordo com a presente invenção pode incluir a administração do bacteriófago ΦCJ20 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ20 como ingrediente ativo para animais infectados por ETEC ou que estejam expostas a risco de infecção por ETEC, exceto humanos, em uma dosagem farmacêutica eficaz. Será perfeitamente compreendido pelos peritos na arte que, quando a composição farmacêutica é administrada ao paciente, a dose total diária adequada pode ser determinada por um médico assistente ou veterinário de acordo com sua avaliação médica.

Uma dose específica farmaceuticamente eficaz do bacteriófago ΦCJ20 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ20 como ingrediente ativo para um determinado animal, pode ser determinada considerando-se o tempo de administração e a via de administração do bacteriófago ΦCJ20 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ20. uma taxa de secreção da composição, o período de duração do tratamento, ou fatores similares, somados ao tipo e ao grau de resposta desejada, a idade, peso, estado geral de saúde, sexo, ou dieta de determinado animal. Além disso, a dose farmaceuticamente eficaz pode ser alterada de acordo com diversos fatores, tais como os ingredientes das drogas ou de outras composições usadas simultaneamente ou separadamente, e outros fatores similares bem conhecidos no campo médico.

O bacteriófago ΦCJ20 de acordo com a presente invenção ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ20 como ingrediente ativo pode ser administrado como uma forma farmacêutica (spray nasal) para animais ou aplicado diretamente em um alimento ou na água potável dos animais. Além disso, o bacteriófago ΦCJ20 ou a composição contendo o mesmo podem ser misturados em um alimento ou na água potável em forma de aditivo alimentar ou aditivo para água potável, e então administrados.

A via de administração e o método de administração do bacteriófago ΦCJ20 de acordo com a presente invenção ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ20 como ingrediente ativo não são especificamente limitadas, mas qualquer via de administração e método de administração podem ser utilizados, desde que o bacteriófago ΦCJ20 ou a composição contendo o mesmo possam chegar ao tecido desejado. Isto é, o bacteriófago ΦCJ20 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ20 como o ingrediente ativo pode ser administrado através de várias vias oral ou parentérica. Como um exemplo não restritivo da via de administração, é possível utilizar a via oral, retal, local, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, subcutânea e administração nasal ou inalação.

A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes através de exemplos. No entanto, estes exemplos visam apenas ilustrar a presente invenção sem o propósito de limitar o escopo da presente invenção aos exemplos apresentados.

(Exemplo 1] Isolamento do bacteriófago infectando ETEC <Exemplos 1-1> Seleção do bacteriófago e isolamento de um único bacteriófago

Foi obtida uma amostra de 50mt? de fezes de porco e amostras colhidas no ambiente da Samwham Gps. Breeding Agri, na área de Gwangcheon, Ilong seong-gun, na província de Chungchong, República da Coréia, e as amostras foram centrifugadas a 4.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45gm para preparar uma solução de amostra, e depois um método de sobreposição de ágar macio foi realizado utilizando a solução de amostra preparada. O método de sobreposição de ágar macio é um método de observação de uma ação de lise do bacteriófago utilizando células hospedeiras crescendo em ágar de superfície (sobre um meio sólido com 0,7% de ágar).

Especificamente, 18mf de amostra filtrada foi misturada com 150fa? de uma solução agitada da cultura (OD60o ~ 2) de ETEC (SNU105) foi obtida do Colégio de Medicina Veterinária da Universidade Nacional de Seoul e 2m<? de meio 10x Luria Bertani (LB) (triptona 10 g/l; extrato de levedura 5 g/l e NaCI 10 g/l) e cultivada a 30°C por 18 horas. Em seguida, a solução da cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi filtrado com filtro de 0.45gm. Em seguida, depois que uma mistura de 3nfa? de ágar a 0,7% (w/v) e 150fa? da solução agitada da cultura (OD^oo = 2) de ETEC(SNU105) foram vertidas e endurecidas numa placa com meio LB, 10fa? da solução de amostra foi derramada sobre a placa, seguida por cultura a 30°C por 18 horas. Em seguida, confirmou-se que uma placa foi formada.

Considerando que um único tipo de bacteriófago estava presente numa única placa, tentou-se isolar um único bacteriófago da placa formada. Especificamente, a placa foi colocada em 400μ£ de uma solução SM [NaCl (5.8 g/l); MgSCUYEhO (2g/l); I M Tris-Cl (pH 7,5/50mt?)] e deixada à temperatura ambiente durante 4 horas, obtendo assim a solução do bacteriófago. Em seguida, lOOuβ da solução do bacteriófago foi misturada com 5 mt? de 0,7%(w/v) de ágar e 15μl da solução agitada da cultura (OD^oo = 2) de ETEC(SNU105), seguida pela realização do método de sobreposição em ágar macio usando um meio LB com um diâmetro de 150 mm.. A cultura foi realizada até que a ETEC fosse completamentc lisada. Após o término da cultura. 5nU? da solução SM foram adicionados ao meio LB e deixados à temperatura ambiente por um período de 4 horas, obtendo assim a solução do bacteriófago.

Após a solução ser recuperada, foi adicionado clorofórmio numa quantidade de l%(v/v) e misturada durante 10 minutos, seguida por centrifugação a 4.000 rpm por 10 minutos, obtendo assim o sobrenadante. O sobrenadante obtido foi filtrado com um filtro de 0,45gm, obtendo assim uma amostra final.

<Exemplos l-2> Cultura em grande escala e purificação do bacteriófago

O bacteriófago obtido no Exemplo 1-1 foi cultivado em grande escala utilizando ETEC(SNU105) e, em seguida, o bacteriófago foi purificado.

Especificamente, depois que a cultura de ETEC(SNU 105) foi agitada, uma alíquota de l,5xlθ'”cfu foi centrifugada a 4.000 rpm durante 10 minutos e depois ressuspensa em 4mé? de solução SM. O bacteriófago de 1.5x10” pfu foi inoculado [multiplicidade de infecção (MOI) - 0,0001], e deixado em temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, a solução foi inoculada em 150jné? da média EB e cultivado a 30°C durante 5 horas.

Após a conclusão da cultura, foi adicionado clorofórmio numa quantidade de l%(v/v) do volume final e o material mexido durante 20 minutos. Em seguida, foram adicionadas enzimas de restrição DNase I e RNase A para obter uma concentração final de \μβ/mβ, respectivamente, e a solução foi deixada a 30°C durante 30 minutos. A seguir, foram adicionados NaCl e glicol polietileno (PEG) para obter concentrações finais de 1 M e 10% (w/v), respectivamente, e em seguida a solução foi deixada a 4°C durante 3 horas, seguida de uma centrifugação a 4°C e 12.000 rpm por um período de 20 minutos, obtendo assim os precipitados.

O precipitado obtido foi ressuspenso em 5nuf? da solução SM e foi deixado em temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, foi adicionado luU? de clorofórmio e a solução mexida, seguida por uma centrifugação a 4°C e 4.000 rpm durante 20 minutos, obtendo assim o sobrenadante. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45gm, e foi realizada uma ultracentrifugação (35.000 rpm, I hora. 4°C) utilizando um método de gradiente de densidade de glicerol (densidade: 40%. 5% de glicerol), purificando assim o bacteriófago.

Os inventores da presente invenção denominaram o bacteriófago obtido através da amostra de fezes de porcos com atividade bactericida específica contra a ETEC de "Bacteriófago ΦCJ20", e depositaram o bacteriófago no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (361-221, Hongjedong, Seodamun-gu, Seoul. República da Coréia) como um número de depósito KCCMI 1362P em 30 de janeiro de 2013.

<Exemplo 2> Exame de infecção do (DCJ20 em E.coli

A fim de confirmar se o bacteriófago ΦCJ20 purificado no Exemplo I tem ou não atividade lítica nas espécies de E.coli outras que a ETEC(SNU 105), foram realizadas infecções cruzadas com outras espécies de E.coli.

Especificamente, dois tipos de estirpes de ETEC (SNUJG280 e SNU105) e 11 tipos 5 de estirpes não-patogênicas de E.coli [MC4I00, BL21(DE3), Rosetta (DE3), 2616, 281, 1917, DH5a, GM2929, Tuner (DE3), W3110 e K.12G] foram cultivadas, respectivamente, obtendo assim soluções de cultura. Em seguida, cada uma das soluções de cultura e do bacteriófago ΦCJ20 purificado foram usadas para realizar o método de sobreposição de ágar macio, para confirmar se uma placa foi ou não formada. Os resultados estão ilustrados na Tabela I a seguir. [Tabela 1]

Conforme demonstrado na Tabela 1, foi confirmado que o bacteriófago ΦCJ20 purificado no Exemplo 1 possui atividade lítica em 9 tipos de estirpes não-patogênicas de E.coli [MC4100, BL21(DE3), Rosetta (DE3), 1917, DH5a, GM2929, Tuner (DE3), W3I 10 e KI2G], mas não possui atividade lítica nos outros 2 tipos de estirpes não-patogênicas de E.coli (2616 e 281) dentre as estirpes não-patogênicas de E.coli.

<Exemplo 3> Observação morfológica do ΦCJ20

O bacteriófago ΦCJ20 purificado no Exemplo 1 foi diluído em solução de gelatina a 0,01% e em seguida, fixado em 2,5% de solução de glutaraldeído. O bacteriófago fixado foi derramado sobre uma placa de mica revestida com carbono (cerca de 2,5 mm x 2,5 mm) durante 10 minutos e lavado com água destilada estéril. Uma película de carbono foi disposta sobre uma grelha de cobre, tingida com 2% de acetato de uranilo durante 30 a 60 segundos, seca, e observada através de um microscópio de transmissão de elétrons (JEM-1011, 80 kV, a ampliação: XI20,000 para X200.000) (FIG.l).

FIG. 1 mostra uma fotografia do bacteriófago ΦCJ20 feita pelo microscópio de elétrons. Foi possível observar que, como o bacteriófago ΦCJ20 tem uma cápside isométrica, mas não tem cauda, o bacteriófago ΦCJ20 pertence morfologicamente à Podoviridae.

<Exemplo 4> A análise do tamanho do DNA genômico do ΦCJ20

O DNA genômico foi extraído a partir do bacteriófago ΦCJ20 purificado no Exemplo I. Especifícamente, 20mM do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). 50qg / mê' de proteinase K e 0,5% (w/v) de dodec il sul fato de sódio (SDS) foram adicionados a uma solução da cultura do bacteriófago ΦCJ20 purificado e foram deixados a 50 °C durante I hora. Um volume igual de fenol (pH 8.0) foi adicionado, agitou-se, seguida de centrifugação em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante.

O sobrenadante foi misturado com um volume igual de PC (fenol: clorofórmio =1:1) e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante foi misturado com um volume igual de clorofórmio e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante obtido foi misturado sequencialmente com 10% (v/v) de acetato de sódio 3M e um duplo volume de etanol frio a 95%, com base no volume total, e deixado a -20°C durante 1 hora. Subsequentemente, a centrifugação foi realizada a 0°C e 12.000 rpm por 10 minutos, e o precipitado foi obtido por remoção do sobrenadante. Em seguida, 50μβ de Tris-EDTA (TE) solução tampão (pH 8,0) foi adicionado à mesma, para assim dissolver o precipitado obtido. O DNA extraído foi diluído 10 vezes e uma concentração foi mensurada medindo-se a absorção em ODsβo-

Em seguida, 1 μg de DNA foi carregado em 1% de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), em gel de agarose, e a eletroforese foi realizada em temperatura ambiente durante 20 horas utilizando um programa de sistema BIORAD PFGE programa 7 (tamanho: 25-100 kb; tempo de comutação rampa: 0,4-2,0 segundos, forma linear; tensão direta: 180V; tensão inversa: 120 V) (FIG. 2).

A FIG. 2 é uma fotografia da eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do DNA genômico do bacteriófago ΦCJ20, onde pode ser confirmado que o DNA genômico do bacteriófago ΦCJ20 tem um tamanho de cerca de 40kb. Na FIG. 2, Méo DNA que se torna padrão para medir o peso molecular.

<Exemplo 5> 15μt? da solução do bacteriófago ΦCJ20 purificado em título IO10 pfu/W foi misturada com 3μ£ de uma solução de amostra 5X SDS, e aquecida durante 5 minutos. Em seguida 12% de SDS-PAGE foram processados (FIG. 3).

FIG. 3 é uma fotografia da eletroforese mostrando o resultado da SDS-PAGE realizada no bacteriófago ΦCJ20, e proteínas principais com tamanhos de cerca de 46,5 kDa, 43kDa, 39,5kDa e I 7,1 kDa foram observadas.

<Exeinplo 6> Análise das características genéticas do ΦCJ20

A fim de confirmar as características genéticas do bacteriófago ΦCJ20 purificado no Exemplo I. o DNA do bacteriófago ΦCJ20 foi analisado utilizando um sequenciador de titânio FLX (Roche), que é um aparelho de análise do gene. Genes foram montados em Macrogen INC. utilizando GS e o software ‘We novo assembler" (Roche). A análise da sequência de um quadro aberto de leitura foi realizada utilizando GeneMArk.hmm. Glimmer v3.02, e o software FGENESB. A identificação do quadro aberto de leitura foi realizada usando BLASTP e o programa InterProScan.

A sequência do genoma do bacteriófago obtido apresentou várias semelhanças com as dos bacteriófagos existentes, mas foi confirmado que um bacteriófago com todas as frações foram totalmente (100%) iguais às do bacteriófago da presente invenção não existia. Deste modo, ficou confirmado que um novo bacteriófago de acordo com a presente invenção foi isolado.

A Tabela 2 representada a seguir mostra os resultados obtidos pela comparação de homólogos da sequência do genoma do bacteriófago ΦCJ20 e sequências decodificadas de genomas de outros bacteriófagos, estando a sequência parcial do genoma do ΦCJ20 ilustrada a seguir. [Tabela 2]

Veja [sequência do genoma parcial do ΦCJ20] em anexo.

<Exempio 7> Teste de estabilidade do ΦCJ20 dependendo do pH

A fim de confirmar a estabilidade do bacteriófago ΦCJ20 em um ambiente de baixo pH no estômago, foi realizado o teste de estabilidade sobre uma larga gama de pH (pH 3,0 / 3,5 / 4,0 / 5,5 / 6,4 / 7,5 / 8.3 / 9,2 e 11.0).

Para o teste, várias soluções de pH [solução tampão de acetato de sódio (pH 4,0 / pH 5,5 e pH 6,4), solução tampão de citrato dc sódio (pH 3,0 e pH 3,5), solução tampão de fosfato de sódio (pH 6,9 e pH 7.4). e uma solução de Tris-HCI (pH 8.2 / pH 9.0 / pH 9,8 e pH 11,0)] foram preparadas a uma concentração de 0,2 M, respectivamenle.

Em seguida. 180tá? de cada urna das soluções de pH foi misturada com 2Qué‘ de solução do bacteriófago com um título de 2.1XIO10 pfu/mí de modo que uma concentração de cada solução de pH tornou-se I M. e cada uma das soluções de pll foi deixada em temperatura ambiente durante 2 horas. Em um grupo de controle, 20μ£ da solução do bacteriófago (2.1x1010 pfu/mé') foi misturada com 18CW da solução SM e deixada em temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, a solução reacional foi diluída passo a passo, 1 μl da solução diluída em cada passo foi derramada e cultivada a 30°C durante 18 horas através do método de sobreposição em ágar macio, e o título foi medido através da presença ou ausência de lise (FIG. 4).

A FIG. 4 mostra um resultado do teste de resistência ao ácido do bacteriófago ΦCJ20. Como mostrado na FIG. 4, pode ser confirmado que o bacteriófago ΦCJ20 não perde a sua atividade e permaneceu estável em um intervalo de pH de 5.0 a 1 E0 quando comparado ao grupo de controle.

<Exemplo 8> Teste de estabilidade do ΦCJ20 dependendo da temperatura

Foi realizado um teste para confirmar a estabilidade contra o calor gerado durante o processo de formulação do bacteriófago no caso de usar o bacteriófago como uma formulação de aditivo alimentar dentre as formulações do bacteriófago.

Especificamente, lOOçá? da solução do bacteriófago ΦCJ20 com uma concentração de 2,0X1010 pfu/mt? foi deixada a 37°C, 42°C, 53°C e 60°C durante 0, 30. 60 e 120 minutos, respectivamente. Então as soluções acima foram diluídas passo a passo, 1μl de cada uma das soluções diluídas em cada passo foram derramadas e cultivadas a 30°C durante 18 horas através de um método de sobreposição em ágar macio, e o título foi medido através da presença ou ausência de lise (FIG. 5).

A FIG. 5 mostra um resultado de um teste de resistência ao calor do bacteriófago ΦCJ20. Como mostrado na FIG. 5, o bacteriófago ΦCJ20 manteve sua atividade mesmo quando foi exposto a 53°C por mais de 2 horas, mas sua atividade foi reduzida quando exposto à temperatura de 60°C.

<Exemplo 9> Teste de espectro de infecção de ΦCJ20 com relação a estirpes do tipo selvagem de ETEC

A fim de determinar se o bacteriófago ΦCJ20 possui ou não atividade lítica, foram realizados testes em 15 estirpes selvagens de ETEC obtidas da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Nacional de Seoul e da Universidade de Guelph no Canadá, outras que a ETEC(SNU 105) utilizada no experimento.

Especificamente, 10μl de solução do bacteriófago ΦCJ20 com um título de 109pfu/ml foi misturada com uma solução de 15μl de cultura agitada (ODÔOO — 2) de cada uma das estirpes, e em seguida foram derramadas e cultivadas a 30°C durante 18 horas através de um método de sobreposição em ágar macio. Em seguida, observou-se se uma placa foi ou não formada.

Os resultados estão ilustrados na Tabela 3 a seguir. [Tabela 3]

Conforme demonstrado na Tabela 3, o bacteriófago demonstra infectividade em F- serotipo K88 (SNU105, SNU107, SNUI60, SNUI62, SNUF4, SNU3220, CANR08. e SNUJG280) assim como ETEC 0-serotipo 0149 (SNU107, SNUF4, SNUFG280, SNU3220. CANR08, e SNU0149). que são as causas mais comuns de diarreia em suínos nas fazendas em geral. Portanto, podemos concluir que esperar que o bacteriófago apresentará excelente eficiência no momento da efetiva aplicação do bacteriófago.

Claims

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender o bacteriófago ΦCJ20 (KCCM11362P) como um ingrediente ativo e um aglutinante selecionado do grupo consistindo de lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose e gelatina.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser para prevenir e tratar uma doença infecciosa causada por Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC).

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela doença infecciosa ser a colibacilose.

4. ADITIVO ALIMENTAR OU ADITIVO PARA ÁGUA POTÁVEL, caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

5. DESINFETANTE OU PRODUTO DE LIMPEZA, caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 1, como um ingrediente 15 ativo.