BR112013004206B1

BR112013004206B1 - Composição para prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por escherichia coli enterotoxigênica, antibiótico, composição de aditivo de ração e sanitizante ou agente de limpeza

Info

Publication number: BR112013004206B1
Application number: BR112013004206-0A
Authority: BR
Inventors: Jae Won Kim; Young Wook Cho; Eun Mi Shin; Young Sa Kim; Si Yong Yang
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2011-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2021-09-21
Also published as: EP2780447A4; US9358258B2; WO2013073843A1; TW201326395A; BR112013004206A2; EP2780447A1; TWI465570B; KR101260645B1; CN103946375B; EP2780447B1; US20140356330A1; CN103946375A

Abstract

novo bacteriófago isolado contendo atividade bactericida específica de e. coli e composição antibacteriana que compreende o mesmo. a presente invenção refere-se a um novo bacteriófago que tem uma atividade bactericida específica de e. coli, uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por e. coli, enterotoxigênica compreendendo o bacteriófago como um ingrediente ativo, um antibiótico compreendendo o bacteriófago como um ingrediente ativo, uma composição de aditivo alimentar que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo, um desinfetante ou produto de limpeza compreendendo o bacteriófago como um ingrediente ativo, e um método para o tratamento de colibacilose utilizando o bacteriófago. o novo bacteriófago da presente invenção possui uma atividade bactericida específica contra e. coli patogênica, e excelente resistência a ácido e ao calor. portanto, o novo bacteriófago pode ser usado para a prevenção ou tratamento de colibacilose suína, que é uma doença infecciosa causada por e. coli patogênica, e também pode ser amplamente utilizado em composições de aditivos alimentares para animais, desinfetantes, e produtos de limpeza.

Description

Campo técnico

A presente invenção está relacionada a um novo bacteriófago isolado que mostra uma atividade bactericida específica para E.coli, e uma composição antibacteriana que compreende o mesmo.

Técnica de fundamento

E.coli é uma bactéria Gram-negativa, curta em formato de bastonete que pertence ao gênero Escherichia e à família Enterobactériaceae, e é encontrada como parte da flora normal nos intestinos de vários animais que incluem mamíferos. Foi revelado que a maioria das cepas de E. coli são não patogênicas e podem causar infecções oportunistas, mas algumas cepas altamente patogênicas causam diversas doenças intestinais e sepsis em mamíferos que incluem humanos. Dentre essas, as cepas que causam doenças gastrointestinais podem ser classificadas em seis grupos com base em sua virulência, E.coli Enterotoxigênica (ETEC), E.coli Enteropatogênica (EPEC), E.coli Enterohemorrágica (EHEC), E.coli Enteroagregativa (EAEC), E.coli Enteroinvasiva (EIEC), e E.coli Necrotoxigênica (NTEC). E.coli

Enterotoxigênica (ETEC) é conhecida por ser associada com infecções em porcos. Em geral, doenças causadas por infecções bacterianas ou virais podem ser diagnosticadas por identificação dos patógenos. No entanto, uma vez que E.coli está presente nos intestinos de animais saudáveis, o diagnóstico precoce de doenças causadas por infecções com E.coli é difícil (Patente Coreana No. 963157).

ETEC é uma bactéria Gram-negativa formato de bastonete, e é móvel com peritrichous flagella ou não móvel sem flagelo. ETEC é uma bactéria aeróbica ou anaeróbica facultativa que produz ácido e gás a partir de lactose e frutose, e cresce bem em meio comum em uma temperatura entre 7 e 48 °C, temperatura sendo ótima a 35-37 °C, e em pH 4,5-9,0. ETEC produz uma toxina similar à toxina da cólera, e essa toxina pode ser dividida em uma enterotoxina instável em calor (LT) perdendo sua atividade quando aquecida a 60 °C por 10 minutos e uma enterotoxina estável em calor que mostra uma resistência depois de aquecida a 100 °C por 30 minutos. Quando infectado, sintomas semelhantes aos da cólera são mostrados, e ela se prolifera na porção superior do intestino delgado e a concentração bacteriana atinge 107-108 cfu (unidade de formação de colônia) por ml, levando à ocorrência de doenças infecciosas por E.coli.

Recentemente, em vista da tendência para produção suína de grande escala, colibacilose e porcos tem se tornado um problema emergente comum e freqüente em criações de porcos (Park Young-il, Sun-Jin Publishing Co. 353-359, 1998). Na Coréia, a recente ocorrência crescente de colibacilose suína tem causado retardo do crescimento e morte de porcos jovens devido à diarréia, resultando em enormes perdas econômicas para fazendeiros (Hong Eu-Chul, master's thesis, Dankook University, “Addition Effect of Egg Yolk in Early Weaned Piglets”, 2001). Vários antibióticos foram usados para a prevenção e tratamento de colibacilose suína, mas o mau uso e uso demasiado de antibióticos provocou sérios problemas de resistência medicamentosa e resíduos de fármacos em porcos. Portanto, o uso de antibióticos tem sido restrito em vários países por todo o mundo (Mason HS e cols., Trends in Biotech. 13:388-392, 1995).

Enquanto isso, bacteriófago é um tipo especializado de vírus que infecta apenas bactérias particulares e controla o crescimento de bactérias, e pode se auto-replicar apenas no interior de bactérias hospedeiras. Bacteriófago consiste em material genético na forma de DNA ou RNA de filamento único ou duplo. Com base em sua morfologia, os bacteriófagos sao divididos em Myoviridae, Siphoviridae, e Podoviridae, que são caracterizados por caudas contráteis, longas não contráteis, e curtas, respectivamente (Arch Virol (2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter e cols., “Bacteriófagos Biology and Application”; CRC press).

Depois da descoberta de bacteriófagos, foi feito um grande esforço para sua utilização em terapia para doença infecciosa. No entanto, comparado a antibióticos que possuem amplo espectro de ação, os bacteriófagos foram vistos como não necessários devido a possuírem um espectro de ação específico. Todavia, o mau uso e uso excessivo de antibióticos resultou em preocupações a respeito de bactérias resistentes a antibióticos e efeitos danosos de antibióticos residuais em alimentos (Cislo, M e cols. Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183; Kim sunghun e cols., bacteriophage, New Alternative Antibiotics. BRIC).

Essas preocupações crescentes levaram a um ressurgimento do interesse em bacteriófago. Sete bacteriófagos para o controle de E.coli O157:H são revelados na Patente US No. 6.485.902 (2002) e dois bacteriófagos para o controle de vários micro-organismos são revelados na Patente US No. 6.942.858 (emitida para Nymox em 2005).

Revelação da Invenção Problema técnico

Para superar problemas que ocorrem após o mau uso ou uso excessivo de antibióticos de amplo espectro, como bactérias resistentes aos antibióticos e resíduos de antibiótico em alimentos, os presentes inventores isolaram um novo bacteriófago a partir de fontes naturais, em que o bacteriófago tem uma atividade bactericida específica contra E.coli que causa grandes doenças em gado. Foi constatado que o bacteriófago possui uma atividade bactericida específica contra E.coli patogênica, em adição a excelente resistência a ácido e calor, como identificado pelas propriedades morfológicas, bioquímicas e genéticas desse. Também foi constatado que o bacteriófago pode ser aplicado a composições para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas em gado causadas por E.coli patogênica, e a vários produtos para a prevenção e controle eficazes de proliferação de E.coli patogênica, incluindo aditivos de ração de gado, água para gado, sanitizantes de celeiros e produtos de limpeza para produtos a base de carne.

Solução para o problema

Um objetivo da presente invenção é o de fornecer um novo bacteriófago que possui uma atividade bactericida específica contra E.coli Enterotoxigênica.

Outro objetivo da presente invenção é o de fornecer uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por E.coli Enterotoxigênica, que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo.

Ainda outro objetivo da presente invenção é o de fornecer um antibiótico, que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo.

Ainda outro objetivo da presente invenção é o de fornecer uma composição de aditivo de ração, que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo.

Ainda outro objetivo da presente invenção é o de fornecer um sanitizante ou agente de limpeza, que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo.

Ainda outro objetivo da presente invenção é o de fornecer um método para o tratamento de colibacilose com o uso do bacteriófago ou da composição.

Efeitos vantajosos da invenção

O novo bacteriófago da presente invenção tem uma atividade bactericida específica contra E.coli Enterotoxigênica, e excelente resistência a ácido e calor. Portanto, o novo bacteriófago pode ser usado para a prevenção ou tratamento de colibacilose suína, uma doença infecciosa causada por E.coli patogênica, e também pode ser amplamente usada em composições de aditivo de ração animal, sanitizantes, e agentes de limpeza.

Breve descrição dos desenhos

FIG. 1 é uma imagem de microscópio eletrônico de ΦCJ13; FIG. 2 é o resultado de PFGE do bacteriófago isolado ΦCJ13; FIG. 3 é o resultado de SDS-PAGE do bacteriófago isolado ΦCJ13; FIG. 4 é o resultado de um ensaio de resistência ao ácido sobre o bacteriófago ΦCJ13; FIG. 5 é o resultado de um ensaio de resistência ao ácido sobre o bacteriófago ΦCJ13; FIG. 6 é o resultado de comparação de pontuações de consistência fecal entre leitões desmamados alimentados com uma ração padrão suplementada com ΦCJ13 e leitões desmamados alimentados com uma ração padrão apenas, depois de alimentação forçada de ETEC; e FIG. 7 é o resultado de PCR de tempo real para a quantificação de ETEC em fezes.

Melhor maneira de realizar a invenção

Em um aspecto para alcançar os objetivos acima, a presente invenção fornece um novo bacteriófago que possui uma atividade bactericida específica contra E.coli Enterotoxigênica (ETEC).

Os presentes inventores coletaram amostras fecais de Samhwa GPS Breeding Agri., Inc. na área de Kwangcheon, Hong sung-gun, Província de Chung Cheong, e isolaram delas bacteriófagos que podem infectar seletivamente e lisar a ETEC da célula hospedeira. Um exame morfológico sob um microscópio eletrônico confirmou que o bacteriófago possui uma atividade bactericida específica contra Escherichia coli Enterotoxigênica; pertence a Podoviridae que possui características morfológicas que consistem em um capsídeo isométrico e nenhuma cauda (FIG. 1); tem um tamanho total de genoma de aproximadamente 35 kbp; e compreende proteínas estruturais principais de aproximadamente 43 kDa, 38 kDa, 34 kDa, e 33 kDa como medido por uma análise de padrão de proteína (FIG. 3). Além disso, o bacteriófago da presente invenção tem uma especificidade de espécie de infecção seletiva com ETEC entre as E.coli (Tabela 1).

Além disso, os resultados de análise de suas características genéticas mostraram que o bacteriófago inclui moléculas de ácido nucleico representadas por Id. de Seq. Nos: 1 a 6 no genoma total. Com base em Id. de Seq. Nos: 1 a 6, a similaridade genética com outras espécies foi comparada. Foi constatado que várias similaridades de %- 100% foram observadas dependendo de cada fragmento de ácido nucleico, mas não havia bacteriófagos que mostrassem 100 % de similaridade em todos os fragmentos, indicando que o bacteriófago é um novo bacteriófago (Tabela 2). Com base em análise mais detalhada de características genéticas, foi constatado que PCRs que usam os conjuntos de iniciadores específicos para bacteriófago, ou seja, Id. de Seq. Nos: 7 e 8, Id. de Seq. Nos: 9 e 10, Id. de Seq. Nos: 11 e 12, Id. de Seq. Nos: 13 e 14, Id. de Seq. Nos: 15 e 16, e Id. de Seq. Nos: 17 e 18 produzem produtos de tamanhos específicos.

Enquanto isso, quando ETEC foi infectada com o bacteriófago, as placas de fago (zone transparente em ágar macio criadas por lise de célula hospedeira por um bacteriófago) foram observadas e tinham o mesmo tamanho e turbidez, indicando que o bacteriófago inibiu o crescimento de ETEC por lise de ETEC. Por exame da estabilidade do bacteriófago sob várias condições de temperatura e pH, foi constatado que o bacteriófago é estável em uma ampla faixa de ambientes de pH a partir do pH 3 ao pH 10 e ambientes de temperatura de 40 °C a 60 °C, e em particular, ele possui resistência ao calor na temperatura alta (FIG. 5). Tais propriedades de atividade bactericida específica para ETEC, e resistência a ácido e calor permitem a aplicação do bacteriófago da presente invenção sob várias condições de temperatura e pH após a produção de composições profiláticas ou terapêuticas para doenças mediadas por ETEC em porcos e vários produtos que incluem o bacteriófago como um ingrediente ativo.

Portanto, os presentes inventores designaram o bacteriófago que possui uma atividade bactericida específica contra ETEC e as características acima como "Bacteriófago ΦCJ13", e o depositaram no “Korean Culture Center of Microorganisms” (361-221, Honje 1, Seodaemun, Seoul) em 7 de novembro de 2011 sob número de acesso KCCM11217P.

Em outro aspecto para atingir os objetivos acima, a presente invenção fornece uma composição para a prevenção ou tratamento de doença infecciosa causada por E.coli Enterotoxigênica (ETEC), que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo.

Tendo uma atividade bactericida específica contra ETEC, o bacteriófago da presente invenção pode ser usado para o objetivo de prevenção ou tratamento das doenças causadas por ETEC. Preferivelmente, um exemplo destas inclui colibacilose suína causada por ETEC, mas não é limitada a esta.

Como aqui usado, o termo “colibacilose” significa uma doença causada por infecção de gado com E.coli patogênica, e mostra sintomas como sepsis, diarréia (diarréia neonatal e diarréia pós desmame), e toxemia (edema e angiopatia cerebroespinhal). Desses, a sepsis é uma infecção sistêmica aguda que freqüentemente ocorre em porcos de 2-3 dias de idade, e tem uma alta taxa de mortalidade. Diarréia é o resultado mais comum de infecções do trato gastrointestinal que ocorrem durante o período de lactação 1-2 semanas depois do nascimento e imediatamente depois do período de desmame, e causa morte ou retardo do crescimento. Toxemia ocorre em leitões de 8-12 semanas de idade depois do período de desmame, e é acompanhada por edema e sinais neurológicos, seguido por morte súbita.

Como aqui usado, o termo “prevenção” significa todas as ações em que o progresso da doença é contido ou retardado pela administração do bacteriófago ou a composição, e o termo “tratamento” significa todas as ações em que a condição melhorou ou foi contida ou modificada favoravelmente pela administração do bacteriófago ou da composição.

A composição da presente invenção inclui ΦCJ13 em uma quantidade de 5x102 a 5xi012 pfu/ml, e preferivelmente em uma quantidade de 1x106 a 1xio10 pfu/ml.

Por outro lado, a composição da presente invenção may também inclui um carreador farmaceuticamente aceitável.

Como aqui usado, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” refere-se a um carreador ou diluente que não causa irritação significante a um organismo e não abole a atividade biológica e propriedades do composto administrado. Para a formulação da composição em uma preparação líquido, solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina fisiológica tamponada, solução de infusão de albumina, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol, e misturas de um ou mais desses podem ser usadas para um carreador farmaceuticamente aceitável que é estéril e biocompatível. Se necessário, outros aditivos convencionais como antioxidantes, tampões, e agentes bacteriostáticos podem ser adicionados. Além disso, diluentes, dispersantes, tensoativos, ligantes e lubrificantes podem ser adicionalmente adicionados à composição para preparar formulações injetáveis como soluções aquosas, suspensões, e emulsões, ou formulações orais como pílulas, capsules, grânulos ou comprimidos.

As composições profiláticas ou terapêuticas da presente invenção podem ser aplicadas ou pulverizadas à área atingida, ou administradas por via oral ou parenteral. A administração parenteral pode incluir administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou tópica. A dosagem adequada para aplicação, pulverização, ou administração da composição da presente invenção dependerá de vários fatores que incluem método de formulação, o modo de administração, a idade, peso, sexo, condição, e dieta do paciente ou animal sendo tratado, o tempo de administração, a via de administração, a taxa de excreção, e sensibilidade da reação. Um médico ou veterinário que tenha habilidade comum na técnica pode determinar facilmente e prescrever a quantidade eficaz da composição requerida.

Exemplos das formas de dosagem oral que incluem a composição da presente invenção como um ingrediente ativo incluem comprimidos, drágeas, losangos, suspensões aquosas ou em emulsão, pós ou grânulos, emulsões, cápsulas macias ou rígidas, xaropes, ou elixires. Para a formulação de tais comprimidos e cápsulas, um ligante como lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose ou gelatina, um excipiente como fosfato dicálcico, um desintegrante como amido de milho ou amido de batata doce, um lubrificante como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearilfumarato de sódio, ou cera de polietileno glicol podem ser usados. Para cápsulas, um carreador líquido como lipídeo também pode ser usado além dos compostos acima mencionados.

As formas de dosagem parenteral que incluem a composição da presente invenção como um ingrediente ativo podem ser formuladas em injeções por via subcutânea, intravenosa, ou intramuscular, supositórios, ou sprays inaláveis via trato respiratório, como aerossóis. Formas de injeção podem ser preparadas por dissolução ou suspensão da composição da presente invenção, junto com um estabilizante ou um tampão, em água e carregamento da solução ou suspensão em ampolas ou formas unitárias de frasco. Para sprays, como aerossóis, um propelente para pulverização de um concentrado disperso em água ou pó umectante pode ser usado em combinação com um aditivo.

Ainda em outro aspecto para atingir os objetivos acima, a presente invenção fornece um antibiótico que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo.

Como aqui usado, o termo “antibiótico” significa qualquer fármaco que seja aplicado a animais para matar patógenos, e aqui usados como um termo geral para antisséticos, agentes bactericidas e agentes antibacterianos.

Os animais são mamíferos incluindo humanos.

O bacteriófago da presente invenção, diferentemente de antibióticos convencionais, é capaz de matar eficazmente E.coli Enterotoxigênica, e não induz a tolerância e ou resistência medicamentosa de modo que ele possa ser fornecido como um novo antibiótico com um ciclo de vida comparativamente longo.

Ainda em outro aspecto para atingir os objetivos acima, a presente invenção fornece uma composição de aditivo de ração que compreende o bacteriófago da presente invenção como um ingrediente ativo.

Antibióticos em ração usados em criação de gado e peixes são destinados a prevenir infecções. No entanto, a maioria dos antibióticos em ração atualmente disponíveis é problemática por eles serem aptos a induzir a ocorrência de cepas resistentes e podem ser transferidos para humanos uma vez que eles permanecem em produtos derivados do gado. A captação de tais antibióticos residuais pode tornar patógenos humanos resistentes aos antibióticos, resultando na disseminação de doenças. Em adição, uma vez que eles são uma variedade de antibióticos em ração, o surgimento global crescente de cepa resistente a múltiplos fármacos é uma preocupação séria. Portanto, o bacteriófago da presente invenção pode ser usado como um antibiótico em ração que seja mais ecologicamente correto e capaz de solucionar os problemas acima dos antibióticos conhecidos.

A composição de aditivo de ração da presente invenção pode ser preparada como uma composição que compreende o bacteriófago, e então misturada uma ração imediatamente antes da alimentação ou adicionada diretamente no processo de preparação de uma ração. O bacteriófago da presente invenção pode estar contido na ração animal como um líquido ou em uma forma seca, preferivelmente em um pó seco. O processo de secagem pode ser realizado por secagem com ar, secagem natural, secagem por spray, e liofilização, mas não é limitado e estes. O bacteriófago da presente invenção pode ser adicionado como uma forma de pó em uma quantidade de 0,05 a 10 % por peso, preferivelmente 0,1 a 2 % por peso, com base no peso da ração animal. A ração animal também pode incluir outros aditivos convencionais para a preservação de longa duração, além do bacteriófago da presente invenção.

O aditivo de ração da presente invenção pode incluir adicionalmente outros microorganismos não patogênicos. O microorganismo adicional disponível pode ser selecionado do grupo que consiste em Bacillus subtilis que pode produzir protease, lipase e invertase, cepa de Lactobacillus sp. Que pode exercer atividade fisiológica e uma função de decomposição de material orgânico sob condições anaeróbicas, como no estômago do gado, fungos filamentosos incluindo Aspergillus oryzae (J Animal Sci 43:910-926, 1976) que aumenta o peso de animais domésticos, aumenta a produção de leite e ajuda a digestão e absorção de rações, e leveduras que incluem Saccharomyce scerevisiae (J Anim Sci 56:735-739, 1983).

A ração que inclui ΦCJ13 da presente invenção pode incluir rações a base de plantas, como grãos, nozes, subprodutos alimentares, alga-marinha, fibra, subproduto de fármaco, óleo, amido, farinhas, subproduto de grãos, e alimentos de origem animal como proteína, matéria inorgânica, gordura, mineral, proteína de célula única, zooplancton, e restos alimentares, mas não é limitada a estes.

O aditivo de ração que inclui ΦCJ13 da presente invenção pode incluir ligantes, emulsificantes, e conservantes para a prevenção de deterioração da qualidade, aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, flavorizantes, nitrogênio não protéico, silicatos, agentes de tamponamento, agentes colorantes, extratos, e oligossacarídeos para a melhoria da eficiência, e outras pré-misturas de ração, mas não é limitado a estes. Além disso, o suprimento de água de beber misturada com o bacteriófago da presente invenção pode reduzir o número de ETEC no intestino, com isso obtendo gado livre de ETEC.

Ainda em outro aspecto para atingir os objetivos acima, a presente invenção fornece um sanitizante ou agente de limpeza que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo.

Para remover ETEC, o sanitizante que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo também pode ser pulverizado e aplicado a qualquer área em que o gado viva, matadouro, locais onde o gado tenha morrido, espaço de cozimento e instalações de cozinha, mas não é limitado a estes. Além disso, o agente de limpeza que compreende o bacteriófago como um ingrediente ativo pode ser usado na pele e área corporal de animais vivos, que já estão ou são potencialmente contaminados com ETEC.

Ainda em outro aspecto para atingir os objetivos acima, a presente invenção fornece um método para o tratamento de doenças infecciosas causadas por E.coli Enterotoxigênica, preferivelmente ETEC, que usa o bacteriófago ou a composição da presente invenção.

Em detalhes, o método terapêutico da presente invenção inclui a etapa de administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do bacteriófago ou da composição a um indivíduo que possui doenças infecciosas causadas por E.coli patogênica, preferivelmente ETEC. O bacteriófago ou a composição da presente invenção pode ser administrado a animais na forma de uma formulação farmacêutica ou pode ser ingerido como uma mistura com ração animal ou água de beber por animais na forma de uma composição de aditivo de ração. Desde que ela atinja os tecidos desejados, qualquer via, seja oral ou parenteral, pode ser usada para a administração do bacteriófago ou da composição da presente invenção. Em detalhes, a composição da presente invenção pode ser administrada em uma maneira típica por qualquer como oral, retal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, transdérmica, intranasal, e inalação. Estará óbvio para aqueles habilitados na técnica que a dose total diária do bacteriófago ou da composição da presente invenção a ser administrada pelo método terapêutico deve ser determinada através de julgamento médico adequado por um médico. Preferivelmente, a quantidade terapeuticamente eficaz para dados pacientes pode variar dependendo de vários fatores bem conhecidos na prática médica, que incluem o tipo e grau da resposta a ser alcançada, a condição do paciente como idade, peso corporal, estado de saúde, sexo, e dieta, tempo e via de administração, a taxa de secreção da composição, o período de tempo da terapia, composições concretas de acordo com se outros agentes são usados ou não etc.

Modo para a invenção

A seguir, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses Exemplos são apenas para objetivos ilustrativos, e a invenção não é destinada a ser limitada por esses Exemplos.

Exemplo 1: Isolação de bacteriófago que infecta E.coli Enterotoxigênica Exemplo 1-1: Varredura de bacteriófago e isolação de bacteriófago único

50 ml de uma amostra obtida a partir de amostras fecais de galinha e ambientais de Samhwa GPS Breeding Agri., Inc. na área de Kwangcheon, Hong sung-gun, Chung Cheong Province foram centrifugados a 4.000 rpm por 10 minutos. Então, o sobrenadante foi filtrado com o uso de um filtro de 0,45 μm para preparar uma solução da amostra, e usado para método de sobrecamada de ágar macio.

Em detalhes, 18 ml de filtrado da amostra foram misturados com 150 μl de E.coli Enterotoxigênica (ETEC, SNU0105) solução de cultura em agitação (OD600=2) e 2 ml de 1Qx meio LB (triptona 10 g/l; extrato de levedura 5 g/l; NaCl 10 g/l). A mistura foi cultivada a 30°C por 18 horas, e a solução da cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi filtrado com o uso de um filtro de 0,45 μm. 3 ml de 0,7 % agar (p/v) e 150 μl de ETEC (SNU105) solução de cultura em agitação (OD600=2) foram misturados, e plaqueados em uma placa LB, e solidificados. 10 μl do filtrado da cultura foram disseminados nela, e cultivados por 18 horas a 30 °C para observar a formação de placa de fago.

Uma placa única representa um bacteriófago e portanto, bacteriófagos unicos devem ser isolados das placas. Em detalhes, uma placa de fago foi adicionada a 400 μl de solução SM (NaCl, 5,8 g/l; MgSO47H2O, 2 g/l; 1 M Tris-Cl (pH 7,5) 50 ml), e deixada por 4 horas em temperatura ambiente para isolar uma solução de bacteriófago. Subseqüentemente, 100 μl da solução de bacteriófago foram misturados com 12 μl de 0,7% (p/v) ágar e 500 μl de ETEC (SNU105) solução de cultura em agitação (OD600=2), seguido por método de sobrecamada de ágar macio em placa LB que possui um diâmetro de 150 mm. Quando a lise estava completa, 15 ml de solução SM foram adicionados à placa LB. A placa foi deixada em temperatura ambiente por 4 horas para obter uma solução do bacteriófago.

A solução foi recuperada, 1% (v/v) clorofórmio foi adicionado a ela, e bem misturada por 10 minutos. A solução foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante obtido foi filtrado com o uso de um filtro de 0,45 μm para obter uma amostra final.

Exemplo 1-2: Culturas de larga escala e purificação de bacteriófago

Os bacteriófagos obtidos no Exemplo 1-1 foram cultivados em grandes quantidades com o uso de ETEC (SNU105), e os bacteriófagos foram purificados a partir disso.

Em detalhes, ETEC (SNU105) foi cultivada em agitação, e uma alíquota de 1,5x1010 cfu foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos, e o pélete foi ressuspenso em 4 ml de solução SM. O bacteriófago de 1,5x106 pfu foi inoculado a isso, titulado a MOI (multiplicidade de infecção) de 0,0001, e deixado em temperatura ambiente por 20 minutos. Subseqüentemente, a solução foi inoculada em 150 ml de meio LB, e cultivada a 30 °C por 5 horas. Depois do fim da cultura, clorofórmio foi adicionado a um volume final de 1% (v/v), e a solução da cultura foi agitada por 20 minutos. Enzimas de restrição DNase I e RNase A foram adicionadas a uma concentração final de 1 μg/ml, respectivamente. A solução foi deixada a 30°C por 30 minutos. Então, NaCl e PEG (polietileno glicol) foram adicionados a uma concentração final de 1 M e 10 % (p/v), respectivamente e deixada a 4 °C por mais 3 horas. A solução foi centrifugada a 4 °C e 12.000 rpm por 20 minutos para obter um pélete. O pélete foi ressuspenso em 5 ml de solução SM, e deixado em temperatura ambiente por 20 minutos. 4 ml de clorofórmio foram adicionados a isso e bem misturados, seguido por centrifugação a 4 °C e 4.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi filtrado com o uso de um filtro de 0,45 μm, e o bacteriófago foi purificado por ultracentrifugação de gradiente de densidade de glicerol (densidade: 40 %, 5 % glicerol a 35.000 rpm e 4 °C por 1 hora).

Os presentes inventores designaram o bacteriófago como “Bacteriófago ΦCJ13”, em que o bacteriófago que possui uma atividade bactericida específica contra ETEC e as características acima foi isolado a partir de amostras fecais em abatedouros de galinhas, e depositado no “Korean Culture Center of Microorganisms” (361-221, Honje 1, Seodaemun, Seoul) em 7 de novembro de 2011 sob número de acesso KCCM11217P.

Exemplo 2: Examine em infecção de ΦCJ13 de E.coli

Para analisar o bacteriófago ΦCJ13 purificado no Exemplo 1 para atividade lítica em espécies de E.coli diferentes de ETEC (SNU105), foram feitas tentativas de infecção cruzada com outras espécies de E.coli.

Em detalhes, dois tipos de ETEC (SNU105) e ETEC (CANRO8) e oito tipos de E.coli não patogênica (DH5a, MC4100, Rosetta (DE3), GM2929, K12G, W3110, BL21 (DE3),

Tuner (DE3)) foram cultivados para obter soluções de cultura. Cada solução de cultura e ΦCJ13 purificada foram usadas para realizar o método de sobrecamada de ágar macio, e a formação de placas de fago foi examinada (Tabela 1). [Tabela 1] Infecção de ΦCJ13 de E.coli

* fonte de 'SNU': “College of Veterinary Medicine”, Seoul National University * fonte de 'CAN': “University of Guelph in Canada”

Como mostrado na Tabela 1, o bacteriófago ΦCJ13 purificado no Exemplo 1 não mostrou atividade lítica em E.coli não patogênica.

Exemplo 3: Morfologia de ΦCJ13

O ΦCJ13 purificado no Exemplo 1 foi diluído em uma solução de gelatina a 0,01 %, e então fixado em uma solução de glutaraldeído a 2,5 %. A amostra foi gotejada em uma placa de mica revestida com carbono (ca. 2,5*2,5 mm), adaptada por 10 minutos, e lavada com água destilada estéril. Um filme de carbono foi montado em uma rede de cobre, corado com 4 % uranil acetato por 30-60 segundos, e seco. Exame sob um microscópio eletrônico de transmissão JEM-1011 (a 80 kV, aumento de X120.000 ~ x200.000) foi realizado (FIG. 1). FIG. 1 é uma fotografia de microscopia eletrônica de ΦCJ13. Foi constatado que o ΦCJ13 purificado pertence à família Podoviridae de morfotipo, caracterizado por um capsídeo isométrico e nenhuma cauda.

Exemplo 4: Análise de tamanho de DNA genômico total de ΦCJ13

DNA genômico foi extraído do ΦCJ13 purificado no Exemplo 1.

Em detalhes, à solução de cultura de ΦCJ13 purificado foram adicionado 20 mM EDTA, 50 μg/ml proteinase K, e 0,5 % (p/v) SDS, seguido por incubação a 50 °C por 1 hora. Um volume igual de fenol (pH 8,0) foi adicionado e bem misturado. Depois de centrifugação em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi misturado bem com um volume igual de PC (fenol:clorofórmio = 1:1).

Outra centrifugação foi realizada em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos. Então, o sobrenadante obtido foi misturado com um volume igual de clorofórmio, seguido por centrifugação em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante obtido foi misturado com 10 % (v/v) de 3 M acetato de sódio e então dois volumes de etanol frio a 95% e deixado a -20 °C por 1 hora. Depois da centrifugação a 0 °C e 12.000 rpm por 10 minutos, um pélete foi obtido, e o pélete de DNA foi dissolvido em 50 μl de tampão TE (Tris-EDTA (pH 8,0)), e sua concentração foi medida. 1 μg de DNA foi carregado em 1% PFGE (eletroforese em gel de campo de pulso) agarose gel, e eletroforese em temperatura ambiente por 20 horas com o uso de um sistema BIORAD PFGE programa 7 (faixa de tamanho 25 - 100 kb; troca de time ramp 0,4 - 2,0 segundos, formato linear; voltagem adiante 180 V; voltagem reversa 120 V) (FIG. 2). FIG. 2 é o resultado de eletroforese de DNA genômico do bacteriófago ΦCJ13, indicando seu tamanho de aproximadamente 35 kbp.

Exemplo 5: Análise de padrão de proteína de ΦCJ13

15 μl de uma solução de ΦCJ13 purificado em um título de 1010 pfu/ml foi misturada com 3 μl de solução 5*SDS da amostra, e aquecida por 5 minutos. 15 % SDS-PAGE foi realizada (FIG. 3). A FIG. 3 é o resultado de SDS-PAGE do bacteriófago ΦCJ13. Como mostrado na FIG. 3, as proteínas principais foram detectadas a 43 kDa, 38 kDa, 34 kDa e 33 kDa.

Exemplo 6: Análise genética de ΦCJ13

Para a análise genética do ΦCJ13 purificado no Exemplo 1, 5 μg do DNA genômico de ΦCJ13 foi duplamente digerido com as enzimas de restrição EcoRV, ScaI e NruI, e PvuII, HincII e StuI. O vetor pCL1920 (Promega) foi digerido com a enzima de restrição SmaI, e então tratado com CIP (fosfatase alcalina intestinal de bezerro). O DNA genômico digerido foi misturado em uma proporção de 3:1 com o vetor, e ligado a 16 °C por 5 horas. O vetor recombinante resultante foi transformado em E. coli DH5α que foi então plaqueado em uma placa LB contendo ampicilina e X-gal (5- bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranosida) para seleção de colônias azuis/brancas. Duas colônias foram selecionadas, e cultivadas com agitação por 16 horas em um meio de cultura contendo ampicilina. Então, os plasmídeos foram extraídos com o uso de um kit de purificação de plasmídeo (Solgent).

A clonagem dos plasmídeos foi confirmada por PCR com o uso de conjuntos de iniciador de M13 adiante e M13 reverso e a seleção foi feita apenas de inserto tendo um tamanho de 1 kb ou maior. Suas sequências de base foram analisadas com o uso dos conjuntos de iniciador de M13 adiante e M13 reverso (Tabela 2). [Table 2] Comparação de homologia de seqüência entre ΦCJ13 e outros bacteriófagos

Exemplo 7: Desenho de Seqüências de iniciador específicas para ΦCJ13

Para identificar ΦCJ13, iniciadores específicos para ΦCJ13 foram desenhados.

Em detalhes, os conjuntos de iniciador de Id. de Seq. Nos: 7 e 8 e Id. de Seq. Nos: 9 e 10 foram construídos com base em Id. de Seq. Nos: 1 e 2, respectivamente. Além disso, os conjuntos de iniciador de Id. de Seq. Nos: 11 e 12, Id. de Seq. Nos: 13 e 14. Id. de Seq. Nos: 15 e 16, e Id. de Seq. Nos: 17 e 18 foram construídos com base em Id. de Seq. Nos: 3, 4, 5 e 6, respectivamente. PCR foi realizada. 0,1 μg do DNA genômico de bacteriófago e 0,5 pmol de cada iniciador foram adicionados a um pré-mix (Bioneer), e o volume final foi ajustado a 20 ml. PCR foi realizada com 30 ciclos de desnaturação; 94 °C 30 segundos, anelamento; 60 °C 30 segundos, e polimerização; 72 °C, 1 minuto. Como um resultado, os produtos de PCR assim obtidos tinham um tamanho de aproximadamente 170 bp, 180 bp, 200 bp, 205 bp, 240 bp and 200 bp, com os conjuntos de iniciador de Id. de Seq. Nos: 7 e 8, Id. de Seq. Nos: 9 e 10, Id. de Seq. Nos: 11 e 12, Id. de Seq. Nos: 13 e 14, Id. de Seq. Nos: 15 e 16, e Id. de Seq. Nos: 17 e 18,respectivamente.

Exemplo 8: Estabilidade em pH do bacteriófago

Para determinar se ΦCJ13 sobrevive com estabilidade sob o embiente de baixo pH no estômago de porco, ΦCJ13 foi analisado para estabilidade em uma ampla escala de pH (pH 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,2, 9,0, 9,8 e 11,0). Várias soluções de pH (tampão de acetato de sódio (pH 2,1, pH 4,0, pH 5,5, e pH 6,4), tampão de citrato de sódio (pH 2,5, pH 3,0, e pH 3,5), tampão de fosfato de sódio (pH 6,9 e pH 7,4) e Tris-HCl (pH 8,2, pH 9,0, pH 9,8 e pH 11,0)) foram preparadas para ter uma concentração de 0,2 M. 90 μl de cada solução de pH foram misturados com 10 μl de uma solução do bacteriófago (1,0x1o11 pfu/ml) para gerar cada solução de pH em uma concentração de 1 M, seguido por incubação em temperatura ambiente por 2 horas.

A solução da reação foi diluída em série, e 10 μl de cada diluição foram cultivados a 37 °C por 18 horas por um método de sobrecamada de ágar macio para determinar os títulos dos lisados de fago (FIG. 4). A FIG. 4 é o resultado de ensaio de resistência em ácido no bacteriófago ΦCJ13. Como mostrado na FIG. 4, o bacteriófago ΦCJ13 nao perdeu sua atividade e permaneceu estável entre pH 3,0 e pH 10,0, comparado ao grupo de controle.

Exemplo 9: Estabilidade em calor do bacteriófago

Para uso como um aditivo de ração, o bacteriófago foi analisado para estabilidade ao calor gerado durante um processo de formulação. Com relação a isso, 100 μl de uma solução de ΦCJ13 com uma titulação de 1,0x108 pfu/ml foram incubados a 40 °C, 50 °C, 60 °C, e 70 °C por 0 minuto, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos. A solução foi diluída em série, e 10 μl de cada diluição foram cultivados a 30 °C por 18 horas por um método de sobrecamada de ágar macio para determinar os títulos de lisados de fago (FIG. 5). A FIG. 5 é o resultado de ensaio de resistência ao calor no bacteriófago ΦCJ13. Como mostrado na FIG. 5, o bacteriófago ΦCJ13 manteve sua atividade embora exposto a 50 °C até 2 horas, mas sua atividade foi reduzida de acordo com tempo, quando exposto a 60 °C por 30 minutos ou mais.

Exemplo 10: Espectro de infecção de bacteriófago em ETEC do tipo selvagem

CJ13 foi analisado para atividade lítica contra 10 cepas de ETEC do tipo selvage, obtidas do “College of Veterinary Medicine, Seoul National University and University of Guelph in Canada”, além de ETEC (SNU105) usada no experimento. 150 μl de cada solução de cultura em agitação de cepa (OD600=2) foram misturados, e 10 μl de solução de ΦCJ13 tendo uma titulação de 108 pfu/ml foram gotejados e cultivados a 30 °C por 18 horas com o uso de um método de sobrecamada de ágar macio para monitorar a formação de placas (Tabela 3). Tabela 3 Formação de placas de fago para cepas de ETEC do tipo selvagem coreanas

* fonte de 'SNU': College of Veterinary Medicine, Seoul National University * fonte de 'CAN': University of Guelph in Canada

Como mostrado na Tabela 3, o bacteriófago mostrou infetividade em ETEC sorotipo O O149 (SNU107, SNUF4, SNUJG280, CAN3220, SNUR08) que é a causa mais comum de diarréia em porcos, e também sorotipo F K88 (SNU105, SNU107, SNU160, SNU162, SNU193, SNUF4, CAN3220, SNUR08, SNUJG280), K99 (SNU2618) e assim, pode ser esperado o bacteriófago mostre excelente eficiência quando aplicado.

Exemplo 11: Availability of ETEC bacteriófago in feed for weaned piglets

50 leitões desmamados (Landrace X Yorkshire) que tinham 25 dias de idade e determinados como saudáveis negativos para antígeno de ETEC por exame e achados clínicos (diarréia, depressão etc.) e PCR fecal foram divididos de acordo com peso, sexo. O experimento foi realizado por 14 dias. Primeiramente, a cepa de ETEC foi inoculada em TSB, e cultivada a 37 °C por 18 horas. A solução da cultura foi diluída com PBS (pH 7,2) e um título foi ajustado a 108 pfu/ml, e oralmente administrada em porcos de 5 semanas com o uso de uma sonda 7 dias depois do início do experimento.

A partir do dia inicial do experimento, os grupos tratados com bacteriófago foram alimentados com uma mistura de ração de 1 g de bacteriófago (106 pfu/g ou 108 pfu/g) por 1 kg de ração duas vezes ao dia em momentos predeterminados a cada manhã e tarde. O grupo de controle de bacteriófago foi alimentado com uma ração padrão apenas ao mesmo tempo (FIGs. 6 e 7).

Primeiramente, a FIG. 6 é o resultado de comparação de pontuações da consistência fecal entre leitões desmamados alimentados com uma ração padrão suplementada com ΦCJ13 e leitões alimentados com uma ração padrão apenas, depois de alimentação forçada de ETEC. Os leitões desmamados que não tiveram alimentação forçada com cepa de ETEC foram definidos como um grupo de controle negativo. Os leitões desmamados que tiveram alimentação forçada com cepa de ETEC (1,0x108 pfu/ml) e alimentados com uma ração apenas foram definidos como um grupo de controle positivo. Iniciando 7 dias antes da alimentação da cepa de ETEC, os grupos experimentais foram alimentados com a ração suplementada com o bacteriófago. Os leitões desmamados alimentados com a ração suplementada com o bacteriófago mostraram menores pontuações de consistência fecal que os grupos alimentados com a ração padrão apenas. Como mostrado na FIG. 6, a pontuação de consistência fecal foi baseada no seguinte índice usado por Sherman e cols. (1983) (fezes normais, 0; fezes macias, 1; diarréia fluidas, 2; diarréia severa, 3). O grupo de controle positivo alimentado com o bacteriófago de ETEC (alimentado com uma ração padrão depois de ingesta de ETEC) mostrou altas pontuações de consistência fecal, mas o grupo experimental alimentado com a ração suplementada com o bacteriófago mostrou altas pontuações até 3-4 dias e então normalizou.

A FIG. 7 é o resultado de PCR de tempo real para a quantificação de ETEC em fezes. Uma menor quantidade de ETEC foi observada nas fezes dos leitões desmamados alimentados com a ração suplementada com o bacteriófago que naquelas dos leitões desmamados alimentados com a ração padrão apenas. Como mostrado na FIG. 7, o resultado de PCR de tempo real para a quantificação de ETEC em fezes mostrou que as fezes do grupo experimental alimentado com o bacteriófago teve menor teor de ETEC que o grupo de controle positivo.

Exemplo 12: Análise no comprimento do vilo intestinal de leitões desmamados

Tipicamente, leitões expostos a ETEC são caracterizados por terem vilo intestinal mais curto que o de leitões normais, e mostram absorção anormal de água, que resulta em diarréia (Gaastra W. e cols., Microbial Rev. 46,129-161, 1982). Com base neste fato, os efeitos de ΦCJ13 sobre o comprimento do vilo intestinal de leitões expostos a ETEC foram examinados.

Depois do fim do experimento do Exemplo 11, os leitões experimentais foram sacrificados, e cada 3 cm dos tecidos do duodeno, jejuno, íleo e cólon foi coletado, e fixado em 10% formalina normal por 48 horas. Depois de procedimento geral de tratamento de tecido, os tecidos foram incrustrados em parafina, e seccionados em espessura de 3 μm. As secções de tecido foram desparafinizadas e reidratadas, e então coradas com H&E (hematoxilina e eosina). A seguir, a altura do vilo e o comprimento de cripta foram medidos para analisar a morfologia intestinal. Neste momento, para medição da altura do vilo e comprimento da cripta, as imagens dos tecidos corados do duodeno, jejuno, e íleo foram adquiridas da esquerda para a direita e de cima para baixo com o uso de “spot diagnostic insight” (Olympus, USA). A altura do vilo (V), a profundidade da cripta (C), e uma proporção da altura do vilo para a profundidade da cripta (proporção V/C) foi medida, seguido por análise estatística (Tabela 4). Tabela 4 Análise sobre o comprimento do vilo intestinal

a, b, c: valores médios são claramente distinguíveis acima da faixa de desvio padrão

Como mostrado na tabela. 4, o grupo de ataque com ETEC (grupo positivo) teve vilos mais curtos e criptas mais profundas no duodeno que o grupo que não sofreu ataque, grupo negativo (P < 0,05). O grupo do fago tratado com bacteriófago (1E+8) teve comprimento dos vilos de 128,5 μm no jejuno, indicando 52,5 μm mais longo que o grupo positivo de ataque com ETEC (P < 0,05). Nao houve diferença significativa na profundidade das criptas. Os grupos do fago tratado com bacteriófago (1E+6) e (1E+8) tiveram uma proporção V/C de 1,013 e 1,747, respectivamente, indicando proporção significativamente maior que 0,885 do grupo positivo de ataque com ETEC. O grupo de fago (1E+8) mostrou uma maior proporção que o grupo de fago (1E+6) (P < 0,05). O grupo de fago (1E+6) e o grupo de fago (1E+8) tiveram uma proporção V/C de 1,235 e 1,868 no íleo, respectivamente, indicando proporção significativamente maior que 0,804 de grupo positivo (P < 0,05). Considerando que os porcos saudáveis possuem vilos longos, foi constatado que os efeitos do bacteriófago são significantes.

Claims

1. Composição para prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Escherichia coli Enterotoxigênica caracterizada pelo fato de que compreende um bacteriófago, o qual é identificado pelo número de acesso KCCM11217P, em que o bacteriófago é apresentado em uma quantidade de 5x102 a 5x1012 PFU/mL e a composição compreende ainda um carreador, diluente, aditivo, dispersante, surfactante, aglutinante ou lubrificante.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a doença infecciosa causada por Escherichia coli Enterotoxigênica é colibacilose.

3. Antibiótico caracterizado pelo fato de que compreende a composição, conforme definida na reivindicação 1.

4. Composição de aditivo de ração caracterizada pelo fato de que compreende a composição, conforme definida na reivindicação 1.

5. Sanitizante ou agente de limpeza caracterizado pelo fato de que compreende a composição, conforme definida na reivindicação 1.