CN103946375B - 新的分离的具有大肠杆菌特异性杀菌活性的噬菌体和包括其的抗菌组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的具有大肠杆菌的特异杀菌活性的噬菌体；用于预防或治疗由肠产毒性大肠杆菌引起的传染病的组合物——包括噬菌体作为活性成分；包括噬菌体作为活性成分的抗生素；包括噬菌体作为活性成分的饲料添加剂组合物；包括噬菌体作为活性成分的消毒剂或清洁剂；和利用噬菌体治疗大肠杆菌病的方法。本发明的新的噬菌体具有针对致病性大肠杆菌的特异的杀菌活性，和优良的耐酸性和耐热性。因此，新的噬菌体可用于猪大肠杆菌病——其是由致病性大肠杆菌引起的传染病——的预防或治疗，并还可广泛用于动物饲料添加剂组合物、消毒剂和清洁剂。
Description
[技术领域]
本发明涉及新的分离的显示大肠杆菌(E.coli)特异性杀菌活性的噬菌体，和包括其的抗菌组合物。
[背景技术]
大肠杆菌是革兰氏阴性的、短的杆状细菌——属于埃希氏菌属(Escherichia)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，并发现作为包括哺乳动物在内的多种动物的肠正常菌群的部分。据显示，大肠杆菌的大多数菌株是非致病的和可引起机会感染，但是一些高致病性菌株在包括人在内的哺乳动物中引起种种肠疾病和败血病。它们之中，引起胃肠疾病的菌株可基于它们的毒力主要分成六组：肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli)(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli)(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli)(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(Enteroaggregative E.coli)(EAEC)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli)(EIEC)、和产坏死性毒素大肠杆菌(Necrotoxigenic E.coli)(NTEC)。已知肠产毒性大肠杆菌(ETEC)与猪中的感染有关。一般而言，由细菌或病毒感染引起的疾病可通过病原体的识别而诊断。然而，由于大肠杆菌存在于健康动物的肠中，由大肠杆菌感染引起的疾病的早期诊断是困难的(韩国专利号963157)。
ETEC是革兰氏阴性的杆状细菌，或具有周生鞭毛能动的，或无鞭毛不能动的。ETEC是需氧或兼性厌氧菌——从乳糖和果糖产生酸和气体，并在7-48℃之间的温度——温度最佳在35-37℃——和在pH4.5-9.0在普通培养基上生长良好。ETEC产生与霍乱毒素相似的毒素，并且该毒素可被分成热不稳定肠毒素(LT)——当在60℃加热10分钟时丧失其活性——和热稳定肠毒素——在100℃加热30分钟之后显示抵抗力。当被感染时，显示霍乱样症状，并且它在小肠上部增殖，细菌浓度达到每ml为107-108cfu(集落形成单位)，导致大肠杆菌感染疾病的发生。
最近，鉴于大规模企业猪生产的趋势，猪中大肠杆菌病已成为猪舍中常见和频繁出现的问题(Park Young-il,Sun-Jin Publishing Co.353-359,1998)。在韩国，最近猪大肠杆菌病的渐增发生已由于腹泻而引起幼猪的生长迟缓和死亡，导致农户巨大的经济损失(Hong Eu-Chul,master's thesis,Dankook University,Addition Effect of Egg Yolkin Early Weaned Piglets,2001)。许多抗生素已用于猪大肠杆菌病的预防和治疗，但是抗生素的误用和过度使用已引起猪中抗药性和药物残留的严重问题。因此，抗生素的使用已在全世界许多国家中被限制(Mason HS et al.,Trends in Biotech.13:388-392,1995)。
同时，噬菌体是特化的病毒类型，其只感染特定细菌和控制细菌生长，并只可在宿主细菌内自我复制。噬菌体由单链或双链DNA或RNA形式的遗传物质组成。基于它们的形态学，噬菌体被分成肌病毒科、管状病毒科、和短尾病毒科，其被分别表征为收缩的、长的非收缩的和短的尾(Arch Virol(2001)146:843-857；Elizabeth Kutter et al.,Bacteriophages Biology and Application；CRC press)。
发现噬菌体之后，最初大量努力放在利用它们用于传染病治疗。然而，与具有广泛目标谱的抗生素相比，噬菌体由于具有特异的目标谱而被看作不必要的。然而，抗生素的误用和过度使用引起了关于抗生素抗性菌和食物中残留抗生素的有害作用的日益高涨的关注(Cislo,M et al.Arch Immunol.Ther.Exp.1987.2:175-183；Kim sung-hun et al.,bacteriophage,New Alternative Antibiotics.BRIC)。
这些日益增长的关注已导致对噬菌体注意的再现。控制大肠杆菌O157:H的七种噬菌体在美国专利号6,485,902(2002)中公开，控制多种微生物的两种噬菌体在美国专利号6,942,858中公开(2005年授予Nymox)。
[发明内容]
[技术问题]
为了克服广谱抗生素的误用和过度使用之后出现的问题，如抗生素抗性菌和食物中抗生素残留，本发明人从天然来源分离了新的噬菌体，其中噬菌体具有针对引起家畜中主要疾病的大肠杆菌的特异杀菌活性。发现除了优良的耐酸性和耐热性外，噬菌体具有针对致病性大肠杆菌的特异杀菌活性，如通过其形态学、生物化学和遗传性质所鉴定的。还发现噬菌体可应用于用于家畜中由致病性大肠杆菌引起的传染病的预防或治疗的组合物，和应用于用于致病性大肠杆菌增殖的有效预防和控制的多种产品，包括家畜饲料添加剂、家畜的饮用水、畜棚消毒剂和肉产品的清洁剂。
[技术方案]
本发明的目的是提供具有针对肠产毒性大肠杆菌的特异杀菌活性的新的噬菌体。
本发明的另一个目的是提供用于由肠产毒性大肠杆菌引起的传染病的预防或治疗的组合物，包括噬菌体作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供抗生素，包括噬菌体作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供饲料添加剂组合物，包括噬菌体作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供消毒剂或清洁剂，包括噬菌体作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供利用噬菌体或组合物治疗大肠杆菌病的方法。
[有益效果]
本发明的新的噬菌体具有针对肠产毒性大肠杆菌的特异杀菌活性，和优良的耐酸性和耐热性。因此，新的噬菌体可用于预防或治疗猪大肠杆菌病、致病性大肠杆菌引起的传染病，和还可广泛用于动物饲料添加剂组合物、消毒剂和清洁剂。
[附图简述]
图1是ΦCJ13的电子显微镜图像；
图2是分离的噬菌体ΦCJ13的PFGE结果；
图3是分离的噬菌体ΦCJ13的SDS-PAGE结果；
图4是对噬菌体ΦCJ13的耐酸性试验的结果；
图5是对噬菌体ΦCJ13的耐热性试验的结果；
图6是ETEC的强制喂养之后，比较用添加有ΦCJ13的标准饲料喂养的断奶小猪和仅用标准饲料喂养的断奶小猪之间粪便稠度评分的结果；和
图7是粪便中ETEC定量的实时PCR的结果。
[实施本发明的最佳方式]
在实现以上目的的一个方面，本发明提供新的具有针对肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的特异杀菌活性的噬菌体。
本发明人从Chung Cheong省，Hong sung-gun，Kwangcheon地区的Samhwa GPSBreeding Agri.,Inc.收集粪便样品，并从中分离可选择性地感染和裂解宿主细胞ETEC的噬菌体。电子显微镜下的形态学检查证实，噬菌体具有针对肠产毒性大肠杆菌的特异杀菌活性；属于具有以下形态学特征的短尾病毒科：同质的壳体和没有尾(图1)；具有大约35kbp的总基因组大小；和包括大约43kDa、38kDa、34kDa和33kDa的主要结构蛋白质，如蛋白质模式分析所测量的(图3)。另外，本发明的噬菌体具有选择性地感染大肠杆菌中ETEC的种特异性(表1)。
此外，分析其遗传特征的结果显示，噬菌体包括总基因组内SEQ ID NOs.1至6表示的核酸分子。基于SEQ ID NOs.1至6，比较与其它物种的遗传相似性。发现86％-100％的各种的相似性——取决于每个核酸片段，但是在所有片段上都没有显示100％相似性的噬菌体，提示该噬菌体是新的噬菌体(表2)。基于更详细的遗传特征分析，发现利用噬菌体-特异性引物组，即，SEQ ID NOs.7和8、SEQ ID NOs.9和10、SEQ ID NOs.11和12、SEQ ID NOs.13和14、SEQ ID NOs.15和16以及SEQ ID NOs.17和18的PCRs，产生特异大小的产物。
同时，当用噬菌体感染ETEC时，观察到噬菌斑(在软琼脂上由一个噬菌体引起的宿主细胞溶解产生的亮区)，并且其具有相同的大小和浊度，提示噬菌体通过溶解ETEC抑制ETEC生长。通过在多种温度和pH条件下检查噬菌体的稳定性，发现噬菌体在pH3至pH10的宽范围pH环境和40℃至60℃的温度环境是稳定的，特别地，它在高温具有耐热性(图5)。ETEC-特异杀菌活性的这种性质、和耐酸和耐热性允许本发明的噬菌体在用于猪中ETEC-介导的疾病的预防或治疗组合物和多种包括噬菌体作为活性成分的产物的产生时在多种温度和pH条件下应用。
相应地，本发明人将具有针对ETEC的特异杀菌活性和以上特性的噬菌体称作“噬菌体ΦCJ13”，并在2011年11月7日以KCCM11217P登录号保存在韩国微生物培养中心(361-221,Honje1,Seodaemun,Seoul)。
在达到以上目的的另一方面，本发明提供用于肠产毒性大肠杆菌(ETEC)引起的传染病的预防或治疗的组合物，其包括噬菌体作为活性成分。
具有针对ETEC的特异杀菌活性，本发明噬菌体可用于预防或治疗ETEC引起的疾病的目的。优选，其实例包括ETEC引起的猪大肠杆菌病，但是不限于此。
如本文所用，术语“大肠杆菌病”指致病性大肠杆菌感染家畜引起的疾病，并显示症状如败血病、腹泻(新生家畜腹泻和断奶后腹泻)和毒血症(水肿和脑脊髓血管病)。它们之中，败血病是在2-3天大的新生猪中频繁发生的急性全身感染和具有高死亡率。腹泻是出生1-2周后内泌乳期期间和断乳期之后立即发生的胃肠道感染最常见的结果，并引起死亡或生长迟缓。毒血症发生在断乳期后8-12周大的小猪中，并伴随水肿和神经体征，之后突然死亡。
如本文所用，术语“预防”指所有这样的行为，其中疾病过程被噬菌体或组合物的施用抑制或减缓，术语“治疗”指所有这样的行为，其中状况向着更好方面发生转变或由噬菌体或组合物的施用抑制或有利地改变。
本发明的组合物包括5×102至5×1012pfu/ml，优选1×106至1×1010pfu/ml量的ΦCJ13。
另一方面，本发明的组合物可进一步包括药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指对生物体不引起显著刺激和不消除施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。为了将组合物配制成液体制剂，盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、和其一种或多种混合物可用于药学上可接受的载体——其是无菌和生物相容的。需要时，可加入其它常规添加剂如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。进一步，可另外将稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂加入组合物以制备可注射的制剂如水溶液、悬浮液和乳状液，或口服制剂如丸剂、胶囊、颗粒或片剂。
本发明的预防或治疗性组合物可施加于或喷雾到受害区域，或通过口服或肠胃外途径施用。肠胃外施用可包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或局部施用。施加、喷雾或施用本发明的组合物的适合剂量将取决于许多种因素，包括配制方法、施用方式、正被治疗的患者或动物的年龄、重量、性别、状况和饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和反应敏感性。具有本领域普通技术的医师或兽医可容易地确定和开出需要的组合物的有效量。
包括本发明的组合物作为活性成分的口服剂型的实例包括片剂、锭剂、糖锭、水性或乳状悬浮剂、粉末或颗粒、乳状剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。对于制剂如片剂和胶囊，可使用粘合剂如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶、赋形剂如磷酸二钙，崩解剂如玉米淀粉或甘薯淀粉，润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇蜡。对于胶囊，除了上面提到的化合物，可进一步使用液体载体如脂质。
包括本发明的组合物作为活性成分的胃肠外剂型可被配制成通过皮下、静脉内或肌肉内途径的注射剂、栓剂、或通过呼吸道可吸入的喷雾剂，如气雾剂。注射形式可通过使本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂在水中溶解或悬浮和将溶液或悬浮液装入安瓿或小瓶单位形式而制备。对于喷雾剂，如气雾剂，用于喷雾水分散的浓缩物或润湿粉剂的推进剂可与添加剂组合使用。
仍在达到以上目的的另一方面，本发明提供包括噬菌体作为活性成分的抗生素。
如本文所用，术语“抗生素”指施加给动物以杀死病原体的任何药物，并在本文用作防腐剂、杀菌剂和抗菌剂的统称。
动物是包括人在内的哺乳动物。
本发明的噬菌体，与常规的抗生素不同，能有效地杀死肠产毒性大肠杆菌，而且不引起耐药性或抗药性，以便它可作为具有相对长的生命周期的新抗生素而被提供。
在达到以上目的的另一方面，本发明提供包括本发明的噬菌体作为活性成分的饲料添加剂组合物。
期望畜牧业和渔业中使用的饲用抗生素预防感染。然而，大多数目前可用的饲用抗生素是有问题的，因为它们易于引起抗性株的出现，并且当它们残留在畜产品中时可传递给人。这样的残留抗生素可的摄取使人病原体的对抗生素有抵抗力，导致疾病传播。另外，由于存在许多种饲用抗生素，多药抗性株的渐增的全球性出现是严重的忧虑。因此，本发明的噬菌体可用作饲用抗生素，其是更生态友好的和能解决已知抗生素的以上问题。
本发明的饲料添加剂组合物可被制备为包括噬菌体的组合物，然后在喂食前直接与饲料混合或直接加入饲料的制备工艺。本发明的噬菌体可作为液体或以干的形式，优选以干粉包含在动物饲料中。干燥处理可通过空气干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥进行，但不限于此。本发明的噬菌体可作为粉末形式以基于动物饲料的重量按重量计0.05至10％，优选按重量计0.1至2％的量加入。除了本发明的噬菌体，动物饲料还可包括其它常规添加剂用于长期保存。
本发明的饲料添加剂可另外包括其它非致病性微生物。可用的另外的微生物可选自枯草杆菌(Bacillus subtilis)——其可产生蛋白酶、脂肪酶和转化酶，乳杆菌属某种(Lactobacillus sp.)菌株——其可在缺氧条件下，如在牛胃中发挥分解有机物质的生理活性和功能，丝状真菌——包括米曲霉菌(Aspergillus oryzae)(J Animal Sci43:910-926,1976)，其可增加家养动物的重量，提高奶产生和辅助饲料的消化和吸收，和酵母——包括酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)(J Anim Sci56:735-739,1983)。
本发明的包括ΦCJ13的饲料可包括植物基饲料，如谷类、坚果、食物副产品、海藻、纤维、药物副产品、油、淀粉、膳食和谷类副产品，和动物基饲料如蛋白质、无机物质、脂肪、矿物、单细胞蛋白、浮游动物，和食物废物，但不限于此。
本发明的包括ΦCJ13的饲料添加剂可包括粘合剂、乳化剂和用于预防品质退化的防腐剂、氨基酸、维生素、酶、有益菌种、调味料、非蛋白质氮、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取物、和用于有效性改善的寡糖、和其它饲料预混合物，但是不限于此。另外，混合有本发明的噬菌体的饮用水的供应可减少肠中ETEC的数目，由此获得无ETEC的家畜。
在达到以上目的的另一方面，本发明提供包括噬菌体作为活性成分的消毒剂或清洁剂。
为了去除ETEC，包括噬菌体作为活性成分的消毒剂还可喷雾和应用到家畜活动的任何区域、屠宰场、家畜死亡地点、烹饪空间和烹饪设施，但是不限于此。另外，包括噬菌体作为活性成分的清洁剂可用在已经或潜在受ETEC污染的活的动物的皮肤和身体区域上。
在达到以上目的的另一方面，本发明利用噬菌体或本发明的组合物提供用于治疗肠产毒性大肠杆菌，优选ETEC引起的传染病的方法。
详细地，本发明的治疗方法包括将药学有效量的噬菌体或组合物施加给具有致病性大肠杆菌，优选ETEC引起的传染病的个体的步骤。本发明的噬菌体或组合物可以以药物制剂的形式施用给动物或可以以饲料添加剂组合物的形式作为与动物饲料或饮用水的混合物由动物摄取。只要它到达靶组织，任何途径，不论口服或胃肠外，都可采用用于施用本发明的噬菌体或组合物。详细地，本发明的组合物可以以通常方式通过任何途径如口服、直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、经皮、鼻内和吸入途径施用。对本领域技术人员将是明显的是，将通过治疗方法施用的本发明的噬菌体或组合物的日总剂量应通过医师的适当医学判断来确定。优选，给定患者的治疗有效量可根据医学领域中所周知的多种因素而改变，该多种因素包括将接受的反应的种类和程度、患者状况如年龄、体重、健康状态、性别和饮食、施用时间和途径、组合物的分泌速度、治疗时期、根据是否其它剂与其使用或不与其使用的具体组合物等。
[发明方式]
在下文中，本发明将参考实施例更详细地描述。然而，这些实施例仅用于说明的目的，本发明不意欲受这些实施例的限制。
实施例1：感染肠产毒性大肠杆菌的噬菌体的分离
实施例1-1：噬菌体筛选和单个噬菌体分离
将50ml获自鸡粪便的样品和Chung Cheong省，Hong sung-gun，Kwangcheon地区的Samhwa GPS Breeding Agri.,Inc.的环境样品以4000rpm离心10分钟。然后，将上清液利用0.45μm滤器过滤以制备样品溶液，和用于软琼脂覆盖方法。
详细地，将18ml样品滤液与150μl肠产毒性大肠杆菌(ETEC,SNU0105)振荡培养溶液(OD600＝2)和2ml10×LB培养基(胰蛋白胨10g/L；酵母抽提物5g/L；NaCl10g/L)混合。将混合物在30℃培养18小时，并将培养溶液以4000rpm离心10分钟。将上清液利用0.45μm滤器过滤。将3ml0.7％琼脂(w/v)和150μl ETEC(SNU105)振荡培养溶液(OD600＝2)混合，和置于LB板上，并允许固化。将10μl培养滤液铺在其上，并在30℃培养18小时以观察噬菌斑的形成。
单个蚀斑表示一个噬菌体，因此，期望从蚀斑分离单个噬菌体。详细地，将一个噬菌斑加入到400μl SM溶液(NaCl,5.8g/L；MgSO47H2O,2g/L；1M Tris-Cl(pH7.5)50ml)，和置于室温4小时以分离噬菌体溶液。随后，将100μl噬菌体溶液与12ml0.7％(w/v)琼脂和500μlETEC(SNU105)振荡培养溶液(OD600＝2)混合，然后，在具有150mm直径的LB板上进行软琼脂覆盖方法。当溶解结束时，将15ml SM溶液加入LB板。将板置于室温4小时以获得噬菌体溶液。
将溶液回收，将1％(v/v)氯仿加入其中，并充分混合10分钟。将溶液以4000rpm离心10分钟。将获得的上清液利用0.45μm滤器过滤以获得最终样品。
实施例1-2：噬菌体的大规模培养和纯化
利用ETEC(SNU105)将实施例1-1中获得的噬菌体大量培养，并将噬菌体从中纯化。
详细地，将ETEC(SNU105)振荡培养，并将1.5×1010cfu的等分部分以4000rpm离心10分钟，并将沉淀重悬于4ml SM溶液中。将1.5×106pfu的噬菌体接种其中，滴定到0.0001的MOI(感染复数)，和置于室温20分钟。随后，将溶液接种进150mlLB培养基中，并在30℃培养5小时。在培养结束之后，加入氯仿到1％(v/v)的终体积，并将培养溶液搅动20分钟。分别加入限制性内切酶DNase I和RNase A到1μg/ml的终浓度。将溶液置于30℃30分钟。然后，分别加入NaCl和PEG(聚乙二醇)到1M和10％(w/v)的终浓度，并另外置于4℃3小时。将溶液在4℃，12000rpm离心20分钟以获得沉淀物。将沉淀物重悬于5ml SM溶液，并置于室温20分钟。将4ml氯仿加入其中和充分混合，之后在4℃，4000rpm离心20分钟。将上清液利用0.45μm滤器过滤，并将噬菌体通过甘油密度梯度超速离心(密度：40％、5％甘油，在35,000rpm，4℃1小时)纯化。
本发明人将噬菌体称作“噬菌体ΦCJ13”，其中将具有针对ETEC的特异杀菌活性和以上特性的噬菌体在鸡屠宰场从粪便样品分离，并在2011年11月7日保藏在韩国微生物培养中心(361-221,Honje1,Seodaemun,Seoul)登录号KCCM11217P下。
实施例2：对大肠杆菌的ΦCJ13感染的检查
为了分析实施例1中纯化的噬菌体ΦCJ13对除ETEC(SNU105)外的大肠杆菌种类的溶解活性，进行了与其它大肠杆菌种类的交叉感染的尝试。
详细地，培养两种ETEC(SNU105)和ETEC(CANRO8)和八种非致病性大肠杆菌(DH5a、MC4100、Rosetta(DE3)、GM2929、K12G、W3110、BL21(DE3)、Tuner(DE3))以获得培养溶液。将每个培养溶液和纯化的ΦCJ13用于进行软琼脂覆盖方法，并检查其噬菌斑的形成(表1)。
[表1]
大肠杆菌的ΦCJ13感染
| 菌株名称 | 噬菌斑形成 |
| ETEC(SNU105) | O |
| ETEC(CANRO8) | O |
| 大肠杆菌DH5a | X |
| 大肠杆菌MC4100 | X |
| 大肠杆菌Rosetta(DE3) | X |
| 大肠杆菌GM2929 | X |
| 大肠杆菌K12G | X |
| 大肠杆菌W3110 | X/O |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | X |
| 大肠杆菌Tuner(DE3) | X |
*‘SNU’来源：首尔国立大学兽医学学院
*‘CAN’来源：加拿大圭尔夫大学
如表1所示，实施例1中纯化的噬菌体ΦCJ13没有显示对非致病性大肠杆菌的溶解活性。
实施例3：ΦCJ13的形态学
将实施例1中纯化的ΦCJ13稀释在0.01％明胶溶液中，然后在2.5％戊二醛溶液中固定。将样品滴到碳涂布的云母板(约2.5×2.5mm)上，适应10min，并用无菌蒸馏水洗。将碳膜安放在铜载网上，用4％乙酸双氧铀染色30-60秒，并干燥。检查在JEM-1011透射电子显微镜(在80kV，×120,000～×200,000的放大率)下进行(图1)。图1是ΦCJ13的电子显微镜检查照片。发现纯化的ΦCJ13属于形态型的短尾病毒科，其特征是同轴的壳体和没有尾。
实施例4：ΦCJ13总基因组DNA大小的分析
从实施例1中纯化的ΦCJ13提取基因组DNA。
详细地，向纯化的ΦCJ13培养溶液加入20mM EDTA、50μg/ml蛋白酶K和0.5％(w/v)SDS，之后在50℃温育1小时。加入等体积的苯酚(pH8.0)和充分混合。在室温，和12,000rpm离心10分钟之后，将上清液与等体积的PC(苯酚:氯仿＝1:1)充分混合。在室温和12,000rpm进行另一次离心10分钟。然后，将获得的上清液与等体积氯仿混合，之后在室温和12,000rpm离心10分钟。将获得的上清液与10％(v/v)3M乙酸钠，然后是2体积的冷的95％乙醇混合，并置于-20℃1小时。在0℃和12,000rpm离心10分钟之后，获得沉淀物，并将DNA沉淀物溶解于50μL TE缓冲液(Tris-EDTA(pH8.0))，并测量其浓度。将1μg DNA装载到1％PFGE(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶上，并在室温电泳20小时，利用BIORAD PFGE系统程序7(大小范围25-100kb；转换时间斜率(switch time ramp)0.4-2.0秒，线性形状；正向电压180V；反向电压120V)(图2)。图2是噬菌体ΦCJ13的基因组DNA的电泳结果，指示其大约35kbp的大小。
实施例5：ΦCJ13的蛋白模式分析
将15μL纯化的1010pfu/ml滴度的ΦCJ13溶液与3μL5×SDS样品溶液混合，并加热5分钟。进行15％SDS-PAGE(图3)。图3是噬菌体ΦCJ13的SDS-PAGE结果。如图3所示，主要蛋白质在43kDa、38kDa、34kDa和33kDa检测到。
实施例6：ΦCJ13的遗传分析
为了实施例1中纯化的ΦCJ13的遗传分析，将5μgΦCJ13的基因组DNA用限制性内切酶EcoRV、ScaI和NruI以及PvuII,HincII和StuI双重消化。将载体pCL1920(Promega)用限制性内切酶SmaI消化，然后用CIP(小牛小肠碱性磷酸酶)处理。将消化的基因组DNA以3:1的比与载体混合，并在16℃连接5小时。将产生的重组载体转化进大肠杆菌DH5α，然后将大肠杆菌DH5α铺到含有氨苄西林和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)的LB板上用于蓝/白菌落的选择。选择两个菌落，并在含有氨苄西林的培养基中震荡培养16小时。然后，利用质粒纯化试剂盒(Solgent)提取质粒。
质粒的克隆通过利用M13正向和M13反向引物组的PCR证实，并仅针对具有1kb或更长大小的插入进行选择。它们的碱基序列利用M13正向和M13反向引物组来分析(表2)。
[表2]
ΦCJ13和其它噬菌体之间序列同源性的比较
实施例7：ΦCJ13-特异的引物序列的设计
为了鉴定ΦCJ13，设计ΦCJ13-特异的引物。
详细地，在SEQ ID NOs.1和2的基础上分别构建SEQ ID NOs.7和8以及SEQ IDNOs.9和10引物组。另外，分别在SEQ ID NOs.3、4、5和6的基础上构建SEQ ID NOs.11和12，SEQ ID NOs.13和14，SEQ ID NOs.15和16，和SEQ ID NOs.17和18的引物组。进行PCR。将0.1μg噬菌体基因组DNA和0.5pmol每种引物加入预混合物(Bioneer)，并将终体积调节到20mL。PCR进行30个循环：变性；94℃30秒，退火；60℃30秒，和聚合；72℃，1分钟。因此，用引物组SEQ ID NOs.7和8、SEQ ID NOs.9和10、SEQ ID NOs.11和12、SEQ ID NOs.13和14、SEQ IDNOs.15和16以及SEQ ID NOs.17和18这样获得的PCR产物分别具有大约170bp、180bp、200bp、205bp、240bp和200bp的大小。
实施例8：噬菌体的pH稳定性
为了测定ΦCJ13在猪胃中低pH环境下是否稳定存活，测定宽范围pH(pH2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0、9.8和11.0)的ΦCJ13稳定性。制备多种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH2.1、pH4.0、pH5.5和pH6.4)、柠檬酸钠缓冲液(pH2.5、pH3.0和pH3.5)、磷酸钠缓冲液(pH6.9和pH7.4)和Tris-HCl(pH8.2、pH9.0、pH9.8和pH11.0))以具有0.2M的浓度。将每种pH溶液90μL与10μL噬菌体溶液(1.0×1011pfu/ml)混合，产生每种1M浓度的pH溶液，之后在室温温育2小时。将反应溶液连续稀释，并将每种稀释物10μL通过软琼脂覆盖方法在37℃培养18小时，测定噬菌体裂解物的滴度(图4)。图4是对噬菌体ΦCJ13耐酸性测定的结果。如图4所示，与对照组相比，噬菌体ΦCJ13在pH3.0和pH10.0之间没有丧失其活性并保持稳定。
实施例9：噬菌体的热稳定性
为了作为饲料添加剂用途，测定噬菌体对配制过程期间产生的热的稳定性。就此而言，将100μL具有1.0×108pfu/ml滴度的ΦCJ13溶液在40℃、50℃、60℃、和70℃温育0分钟、30分钟、60分钟和120分钟。将溶液连续稀释，并将每种稀释物10μL通过软琼脂覆盖方法在37℃培养18小时，测定噬菌体裂解物的滴度(图5)。图5是噬菌体ΦCJ13耐热性测定的结果。如图5所示，即使暴露在50℃达2小时，噬菌体ΦCJ13仍保持其活性，但是当暴露在60℃30分钟或更多时，其活性依照时间减少。
实施例10：噬菌体对野生型ETEC的感染谱
除实验中使用的ETEC(SNU105)外，测定ΦCJ13对获自首尔国立大学兽医学学院和加拿大圭尔夫大学的10个野生型ETEC菌株的溶解活性。将每个菌株150μL振荡培养溶液(OD600＝2)混合，并将10μL具有108pfu/ml滴度的ΦCJ13溶液滴下和利用软琼脂覆盖方法在30℃培养18小时，监测蚀斑形成(表3)。
[表3]
针对韩国野生型ETEC菌株的噬菌斑形成
| 菌株名称 | 噬菌斑形成 |
| ETEC SNU105 | O |
| ETEC SNUF4 | O |
| ETEC SNU162 | O |
| ETEC SNU160 | O |
| ETEC SNUJG280 | O |
| ETEC SNU107 | O |
| ETEC SNU2618 | O |
| ETEC SNU193 | O |
| ETEC CAN3220 | O |
| ETEC SNUR08 | O |
*‘SNU’来源：首尔国立大学兽医学学院
*‘CAN’来源：加拿大圭尔夫大学
如表3所示，噬菌体显示对ETEC O-血清型O149(SNU107、SNUF4、SNUJG280、CAN3220、SNUR08)——其是猪腹泻的最常见原因——和F-血清型K88(SNU105、SNU107、SNU160、SNU162、SNU193、SNUF4、CAN3220、SNUR08、SNUJG280)、K99(SNU2618)的感染性，因此，可期望当应用时噬菌体将显示极好的有效性。
实施例11：断奶小猪饲料中ETEC噬菌体的可用性
将50只断奶小猪(Landrace X Yorkshire)——其是25天大的和通过肉眼检查和临床发现(腹泻、抑郁等)和粪便PCR被测定为ETEC抗原阴性健康的——根据重量、性别分开。实验进行14天。
首先，将ETEC菌株在TSB中接种，和在37℃培养18小时。将培养溶液用PBS(PH7.2)稀释和将滴度调节到108pfu/ml，并在实验开始后7天利用探子口服施用给5周大的猪。从实验开始那天，给噬菌体处理组在每个上午和下午的预设时间一天两次喂每1kg饲料1g噬菌体(106pfu/g或108pfu/g)的饲料混合物。给噬菌体对照组在相同时间仅喂标准饲料(图6和7)。
首先，图6是强制喂养ETEC之后比较喂添加ΦCJ13的标准饲料的断奶小猪和仅喂标准饲料的小猪之间粪便稠度评分的结果。将没有强制喂养ETEC菌株的断奶小猪定义为阴性对照组。将强制喂养ETEC菌株(1.0×108pfu/ml)和仅喂养标准饲料的断奶小猪定义为阳性对照组。在喂养ETEC菌株之前7天开始，给实验组喂添加噬菌体的饲料。喂养添加噬菌体的饲料的断奶小猪较仅喂养标准饲料的组显示更低的粪便稠度评分。如图6所示，粪便稠度评分基于Sherman等(1983)使用的以下指标(正常粪便，0；软便，1；流体腹泻，2；严重腹泻，3)。喂养ETEC噬菌体(喂给ETEC之后喂养标准饲料)的阳性对照组显示高的粪便稠度评分，但是喂养添加噬菌体的饲料的实验组直到第3-4天才显示高的评分，然后正常化。
图7是粪便中ETEC定量的实时PCR结果。在喂养添加噬菌体的饲料的断奶小猪粪便中较仅喂养标准饲料的断奶小猪粪便中观察到更低量的ETEC。如图7所示，粪便中ETEC定量的实时PCR结果显示喂养噬菌体的实验组粪便较阳性对照组具有更低的ETEC含量。
实施例12：断奶小猪肠绒毛长度分析
通常，暴露于ETEC的小猪的特征是它们较正常小猪具有短的肠绒毛，和显示异常的吸水率，导致腹泻(Gaastra W.et al.,Microbial Rev.46,129-161,1982)。在该事实的基础上，检查ΦCJ13对暴露于ETEC的小猪肠绒毛长度的影响。
实施例11的实验结束之后，处死实验小猪，并采集每3cm十二指肠、空肠、回肠和结肠组织，并固定在10％标准福尔马林中48小时。通常的组织处理操作之后，将组织包埋在石蜡中和以3-μm厚度切片。将组织切片脱蜡和再水合，然后用H&E(苏木素和伊红)染色。接下来，测量绒毛高度和隐窝长度以分析肠形态学。此时，为了测量绒毛高度和隐窝长度，利用斑点诊断洞察力从左至右和从上至下从染色的十二指肠、空肠和回肠组织切片获得图像(Olympus,USA)。测量绒毛(V)高度、隐窝(C)长度和绒毛高度与隐窝长度之比(V/C比)，之后是统计学分析(表4)。
[表4]
肠绒毛长度分析
a、b、c：平均值在标准偏差范围之上是明显可区别的。
如表4所示，ETEC攻击组(阳性组)较非攻击阴性组在十二指肠中具有更短的绒毛和更深的隐窝(P<0.05)。噬菌体处理的噬菌体(1E+8)组在空肠中具有128.5μm的绒毛长度，指示比ETEC攻击阳性组长52.5μm(P<0.05)。在隐窝深度上没有显著差异。噬菌体处理的噬菌体(1E+6)和(1E+8)组分别具有1.013和1.747的V/C比，指示比ETEC攻击阳性组的0.885显著更高的比。噬菌体(1E+8)组显示比噬菌体(1E+6)组更高的比(P<0.05)。噬菌体(1E+6)组和噬菌体(1E+8)组在回肠中分别具有1.235和1.868的V/C比，指示比阳性组的0.804显著更高的比(P<0.05)。考虑健康猪具有长绒毛，发现噬菌体的作用是显著的。
Claims (7)
1.噬菌体，由登录号KCCM11217P确定。
2.用于预防或治疗由肠产毒性大肠杆菌引起的传染病的组合物，包括权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述由肠产毒性大肠杆菌引起的传染病是大肠杆菌病。
4.抗菌组合物，包括权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
5.饲料添加剂组合物，包括权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
6.消毒剂或清洁剂，包括权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。
7.权利要求1所述的噬菌体在制备预防或治疗由肠产毒性大肠杆菌引起的传染病的药物中的应用。
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