CN101970644B

CN101970644B - 新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物

Info

Publication number: CN101970644B
Application number: CN2009800003187A
Authority: CN
Inventors: 姜寅惠; 朴敏兑; 赵英郁; 申秀安; 崔香
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-09-07
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2029-09-07
Also published as: KR101151516B1; US20100158870A1; BRPI0902901B1; JP5103531B2; BRPI0902901B8; MY148890A; CN101970644A; US8288146B2; KR20100075263A; JP2011511626A; BRPI0902901A2; WO2010074388A1

Abstract

本发明涉及新型的噬菌体，更具体地，本发明涉及对鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性的噬菌体，还涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的组合物，其用于预防或治疗包括由鼠伤寒沙门氏菌引起的沙门氏菌病或沙门氏菌食物中毒、由鸡沙门氏菌引起的禽伤寒和由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢在内的传染病，并涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的动物饲料、饮用水、清洁剂和消毒剂。

Description

新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物

技术领域

本发明涉及新型噬菌体，更具体地，本发明涉及对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、鸡沙门氏菌(Salmonella gallinarum)或鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)具有特异杀菌活性的噬菌体，还涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的组合物，其用于预防或治疗包括由鼠伤寒沙门氏菌引起的沙门氏菌病(salmonellosis)或沙门氏菌食物中毒(Salmonella food poisoning)、由鸡沙门氏菌引起的禽伤寒(Fowl Typhoid)和由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢(Pullorum)在内的传染病(infectious diseases)，以及涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的动物饲料、饮用水、清洁剂和消毒剂。

背景技术

沙门氏菌是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的一个属，其特征为革兰氏阴性、兼性厌氧、无芽孢形成、杆状细菌且大多数菌株均通过鞭毛活动。沙门氏菌基因组的平均GC含量为50-52％，这与大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella)相似。沙门氏菌属是在家畜和人中引起传染的病原微生物。作为沙门氏细菌的一种，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)具有多个血清型，包括鸡血清型(Gallinarum)、鸡白痢血清型(Pullorum)、鼠伤寒血清型(Typhimurium)、肠炎血清型(Enteritidis)、伤寒血清型(Typhi)、猪霍乱血清型(Choleraesuis)和德尔卑血清型(derby)(Bopp CA，Brenner FW，Wells JG，Strokebine NA.Escherichia，Shigella，Salmonella.In Murry PR，Baron EJ，et aleds Manual of clinical Microbiology.7th ed.Washington DC American Societyfor Microbiology 1999；467-74；Ryan KJ.Ray CG(editors)(2004).SherrisMedical Microbiology(4th ed).McGraw Hill.ISBN 0-8385-8529-9)。其中，鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌是特异于禽的病原体，伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphi)是特异于人的病原体，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)和德尔卑沙门氏菌(Salmonella derby)是特异于猪的病原体，而肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是人和动物二者的病原体。所述各种血清型都会引起疾病，对农民和消费者产生严重的不良影响。

由沙门氏菌引起的家禽疾病为禽伤寒(FT)，其由鸡沙门氏菌(下文称为SG)病原体引起。禽伤寒(FT)是家禽(如鸡和鸭)的败血症，其病程可能为急性或慢性的，并伴有高死亡率。最近报道禽伤寒常常发生在欧洲、南美洲、非洲和东南亚，并且其破坏性逐渐增加。韩国自1992年开始有FT爆发的报道，FT在褐色蛋鸡中引起的经济损失非常严重(Kwon Yong-Kook.2000 annualreport on avian diseases.Information publication by National Veterinary Research& Quarantine Service.March，2001；Kim Ae-Ran et al.，The prevalence ofpullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea，2003，Korean J Vet Res(2006)46(4)：347～353)。

鸡白痢也是由一种沙门氏细菌，即鸡白痢沙门氏菌(下文称为SP)引起的。鸡白痢发生在任何年龄或季节，但雏鸡特别容易感染此病。上世纪期间，作为由鸡蛋传播的传染病，鸡白痢在世界和韩国严重感染了1-2周龄或更年幼的雏鸡。在二十世纪八十年代，该病的发病率急剧降低。然而，在二十世纪九十年代中期，其发病率又开始增加(Kwon Yong-Kook.2000 annual report onavian diseases.Information publication by National Veterinary Research &Quarantine Service.March，2001；Kim Ae-Ran et al.，The prevalence of pullorumdisease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea，2003，Korean J Vet Res(2006)46(4)：347～353)。在韩国，禽伤寒和鸡白痢的爆发从二十世纪九十年代开始增加，给农民造成了经济损失。为此，尽管其功效尚不确定，但已经从2004年开始在用于烤焙的鸡(broiler)中使用减毒活SG疫苗以预防禽伤寒(Kim Ae-Ran et al.，The prevalence of pullorum disease-fowltyphoid in grandparent stock and parent stock in Korea，2003，Korean J VetRes(2006)46(4)：347～353)，然而由于存在由鸡蛋传播传染病的风险，不允许活疫苗用于蛋鸡。遗憾的是，与禽伤寒不同，对于鸡白痢仍没有在商业上可行的预防策略。因此，迫切需要预防禽伤寒和鸡白痢的新方法。

此外，与SG或SP不同，鼠伤寒沙门氏菌(下文称为ST)是没有宿主特异性的人畜共患病病原体(Zoobises Report；United Kingdom 2003)。

ST是家禽、猪和牛等沙门氏菌病的起因。沙门氏菌病是由沙门氏细菌在家畜中引起的急性或慢性消化道传染病，并表现为发烧、肠炎和败血症等主要症状，偶尔伴有肺炎、关节炎、流产和乳腺炎。沙门氏菌病全世界范围内都有发生，且多发于夏季(T.R.Callaway et al.Gastrointestinal microbial ecologyand the safety of our food supply as related to Salmonella.J Anim Sci2008.86：E163-E172)。在牛中的典型症状包括食欲下降、发烧、黑褐色腹泻物或粘液状血便。在小牛中的急性感染可导致其迅速死亡，在妊娠期的感染可因败血症而导致的胎牛死亡，引起早产(www.livestock.co.kr)。在猪中的沙门氏菌病在临床上表征为三个主要症状：急性败血症、急性肠炎和慢性肠炎。急性败血症发生在2-4月龄仔猪中，且常在症状出现后2-4天内死亡。急性肠炎发生在肥育期，并且伴随有腹泻、高烧、肺炎和神经症状。在某些严重的病例中可能发生皮肤变色。慢性肠炎伴有持续性腹泻(www.livestock.co.kr)。

沙门氏菌病一旦在家禽、猪和牛中爆发，将难以用治疗剂控制。原因是沙门氏细菌对各种药物具有很强的抗性，并且在细胞内存活而抗生素不能渗入其中。目前为止，包括抗生素在内，还没有有效治疗由ST引起沙门氏菌病的方法(www.lhca.or.kr)。

除家畜外，ST还通过家畜产品引起人的感染，导致沙门氏菌食物中毒。食用被感染且烹饪不当的家畜产品(例如肉制品、家禽产品、蛋和副产品)是人感染的原因。沙门氏菌食物的人中毒症状常包含头痛、发烧、腹痛、腹泻、恶心和呕吐的立即发作。通常在摄入该生物体后6-72小时内出现症状，并可能持续4-7天或者更长(NSW+HEALTH.2008.01.14.)。

根据CDC(美国疾病控制和预防中心)的报道，在2005年至2008年间发生的人食物中毒中，有16％是由沙门氏细菌引起的，其中有18％是ST(鼠伤寒沙门氏菌)。对于1973年至1984年间的人沙门氏菌食物中毒，据报道所涉及的食物传播载体有鸡肉(5％)、牛肉(19％)、猪肉(7％)、乳制品(6％)和火鸡肉(9％)。在1974-984年，在屠宰过程中对用于烤焙的鸡的细菌污染检测显示35％或更多的沙门氏菌发生率。1983年，在50.6％的鸡肉、68.8％的火鸡肉、60％的鹅肉、11.6％的猪肉和1.5％的牛肉中分离到沙门氏菌。此外，2007年进行的调查显示，在5.5％的生禽肉和1.1％的生猪肉中都发现了沙门氏菌。具体而言，这表明ST常来源于受污染的猪肉、禽肉和牛肉(www.cdc.gov(疾病控制和预防中心(CDC))。FAO和WHO在2002年进行的风险评估表明，通过蛋和禽肉传播的沙门氏菌病在人中的发病率似乎与在家禽中观察到的沙门氏菌的流行度呈线性关系。这意味着，通过降低沙门氏菌在家禽中的流行度，可以相应的降低沙门氏菌病在人中的发病率(Salmonella control at thesource；World Health Organization.International Food Safety AuthoritiesNetwork(INFOSAN)Information Note No.03/2007)。由于近期在花生、菠菜、马铃薯、开心果、胡椒和甜酥饼干面团等产品中发现沙门氏菌而引起人们对食品安全的担忧(Jane Black and Ed O’Keefe.Overhaul of Food Safety Rules inthe Works.Washington Post Staff Writers Wednesday，July 8，2009)。

由于这些原因，在德国，沙门氏菌感染必须上报(§6 and§7 of the Germanlaw on infectious disease prevention，Infektionsschutzgesetz)。在1990年至2005年间，官方记载的病例数量由约200,000例下降至约50,000例。据估计，在德国每5人中就有1人是沙门氏菌携带者。在美国，每年报道的沙门氏菌感染约有40,000例(en.wikipedia.org/wiki/Salmonella#cite_note-2)。

因此，迫切需要控制在家畜和人中引起沙门氏菌病的ST。通过USDA和FDA的共同努力，在美国已经开发出多种有效预防引起百万例以上食源性疾病的沙门氏菌病的策略。在丹麦，对在生产环节控制沙门氏菌的花费和沙门氏菌病公共健康总花费进行比较的成本效益分析的保守估计表明，在2001年沙门氏菌控制方案为丹麦社会挽回1.41千万美元(Salmonella control at thesource.World Health Organization.International Food Safety AuthoritiesNetwork(INFOSAN)Information Note No.03/2007)。

噬菌体是仅感染并破坏细菌，并且仅能在宿主细菌内进行自我复制的一种特殊类型的病毒。噬菌体由被蛋白质外壳包围的遗传物质(单链或双链DNA或RNA)构成。噬菌体有三种基本的结构类型：有尾部的二十面体头部、无尾部的二十面体头部和丝状体。根据其形态结构和遗传物质对噬菌体进行分类。根据其尾部结构，具有二十面体头部并以线状双链DNA为遗传物质的噬菌体被分成三个科：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)和短尾噬菌体科(Podoviridae)，其特征分别在于收缩性尾部、无收缩性的长尾和无收缩性的短尾。可以根据其头部形状和成分以及外壳的存在对具有无尾部的二十面体头部并以RNA或DNA为遗传物质的噬菌体进行分组。根据其大小、形状、外壳和纤丝(filament)成分对以DNA为其遗传物质的丝状噬菌体进行分组(H.W.Ackermann.Frequency of morphological phagedescriptions in the year 2000；Arch Virol(2001)146：843-857；Elizabeth Kutter etal.Bacteriophages biology and application；CRC press)。

在感染过程中，噬菌体附着在细菌上，并将其遗传物质注入到所述细胞中。之后，噬菌体进入两个生命周期之一：裂解性或溶源性周期。裂解性噬菌体接管所述细胞的运转以制备噬菌体成分，随后使细胞破裂或裂解，以释放新的噬菌体颗粒。溶源性噬菌体将其核酸并入到宿主细胞的染色体中，将其作为一个单元进行复制，而不破坏所述细胞。在某种情况下，溶源性噬菌体可以被诱导进入裂解周期(Elizabeth Kutter et al.Bacteriophages biology andapplication.CRC press)。

在发现噬菌体后，人们最初对于其在传染病治疗中的应用给予了极大地信心。然而，在广谱抗生素得到普遍使用后，噬菌体因具有特异靶标谱而被认为是不必要的。但是，抗生素的误用和滥用使得人们对抗生素的耐药性和食品中残留抗生素的不良影响的担忧增加(Cislo，M et al.Bacteriophagetreatment of suppurative skin infections.Arch Immunol.Ther.Exp.1987.2：175-183；Kim sung-hun et al.，Bacteriophage；New Alternative Antibiotics.biological research information center，BRIC)。特别地，加入到动物饲料以促进生长的抗生素类生长促进剂(AGP)可诱导抗生素耐药性，因此最近提出禁止使用AGP的禁令。在欧盟，从2006年开始禁止使用所有抗生素类生长促进剂(AGP)。韩国从2009年开始禁止使用一些AGP，并且考虑至2013-2015年限制使用所有的AGP。

这些逐渐增加的对抗生素使用的担忧已经引起人们再度提起对作为抗生素替代物的噬菌体的兴趣。在美国专利第6,485,902号公开了控制大肠杆菌O157:H的7种噬菌体(2002年申请-Use of bacteriophages for control ofEscherichia coli O157)。在美国专利第6,942,858号公开了用于控制多种微生物的两种噬菌体(2005年由Nymox申请)。许多公司已经积极尝试利用噬菌体开发各种产品。EBI food system(欧洲)开发了用于预防由单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)引起的食物中毒的食品添加剂，命名为Listex-P100，这是得到美国FDA批准的首个噬菌体产品。研发的产品LMP-102也是基于噬菌体的抗单核细胞增生李斯特氏菌食品添加剂，并被批准为GRAS(公认安全)级。在2007年，OmniLytics生产的基于噬菌体的洗剂被开发用于预防屠宰过程中牛肉的大肠杆菌O157污染，并得到美国农业部(USDA)的食品安全监督服务局(FSIS)的批准。在欧洲，产胞梭菌(Clostridium sporogenes)噬菌体NCIMB 30008和Clostridium tyrobutiricum噬菌体NCIMB 30008分别在2003年和2005年被注册为抗梭菌的饲料防腐剂。这些研究表明，目前正在对将噬菌体作为抗人畜共患病病原体的抗生素用于家畜产品中进行深入的研究。

然而，多数噬菌体生物控制研究都集中于对大肠杆菌、李斯特氏杆菌和梭菌的控制。沙门氏菌也是一种人畜共患病病原体，并且由该病原体造成的损失也非常显著。如上所述，由于ST具有多药耐性，韩国已经根据预防传染病的强制条例(执行号16961)、预防传染病的强制条令(卫生和福利部法令第179号)和国家卫生研究所组织法(执行号17164)进行了全国范围内的抗菌耐性监察。因此，需要开发出控制沙门氏菌的噬菌体。

发明内容

技术问题

为了解决包括由于误用和滥用抗生素引起的抗生素耐性、食品中残留的抗生素的有害作用在内的问题以及由使用广谱抗生素产生的问题，本发明人从自然源中分离了对在家畜中引起主要疾病的沙门氏菌具有特异杀菌活性的新型沙门氏菌噬菌体，并鉴定了其形态、生化特性和遗传特性。本发明人发现，所述噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌(ST)、鸡沙门氏菌(SG)和鸡白痢沙门氏菌(SP)具有特异杀菌活性且不影响有益细菌，并且具有良好的耐酸性、耐热性和耐干燥性，并因此可应用于能够用于预防或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的家畜沙门氏菌病、由污染家畜产品引起的沙门氏菌食物中毒和由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病(特别是禽伤寒或鸡白痢)的组合物中，并且可应用于各种控制沙门氏菌的产品中，例如动物饲料添加剂和家畜饮用水、畜棚消毒剂和肉制品清洁剂，从而完成本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供对鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有抗菌活性的新型噬菌体。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗由鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病的组合物，该组合物包含作为活性成分的所述噬菌体，特别是作为抗生素使用以预防或治疗传染病的组合物。

本发明的另一个目的是提供包含作为活性成分的所述噬菌体的动物饲料和饮用水。

本发明的另一个目的是提供包含作为活性成分的所述噬菌体的消毒剂和清洁剂。

本发明的另一个目的是提供利用包含作为活性成分的所述噬菌体的组合物来预防或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的家畜沙门氏菌病或由污染家畜产品引起的沙门氏菌食物中毒的方法。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗传染病(由鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌引起的禽伤寒或鸡白痢)的方法。

有益效果

本发明的新型噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有特异抗菌活性，该噬菌体还具有优异的耐酸性、耐热性和耐干燥性。因此，其可用于预防或治疗由鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病(包括沙门氏菌病、沙门氏菌食物中毒、禽伤寒或鸡白痢)，还可用于控制鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。

附图说明

图1为ΦCJ2的电子显微镜照片，其中ΦCJ2符合长尾噬菌体科的形态，特征为等轴衣壳(isometric capsid)和非收缩性长尾；

图2为所分离的噬菌体ΦCJ2的SDS-PAGE结果，其中显示了所述噬菌体的蛋白图谱，包括约40kDa的主要蛋白和约65kDa、17kDa和15kDa的其它蛋白(参见作为标记的蓝色plus 2预染标准物(Invitrogen))；

图3为所分离的噬菌体ΦCJ2的PFGE结果，其显示全基因组大小约为43kbp(使用5kbp DNA大小标准物(Bio-rad)作为大小标记)；

图4为利用ΦCJ2基因组DNA的各对引物对进行PCR的结果，其中，A、B和C泳道(A：利用引物对SEQ ID Nos.4和5进行PCR扩增，B：利用引物对SEQ ID Nos.6和7进行PCR扩增，C：利用引物对SEQ ID Nos.8和9进行PCR扩增)分别表示约1kbp的PCR产物；

图5为噬菌体ΦCJ2的耐酸性试验结果，显示噬菌体在pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.0和9.0时存活噬菌体的数量，其中，与对照相比，噬菌体ΦCJ2在pH 2.5时保留其传染性，但在pH 2.1时完全丧失其传染性；

图6为噬菌体ΦCJ2的耐热性试验结果，表明在37℃、45℃、53℃、60℃、70℃和80℃和0、10、30、60、120分钟的时间点时存活噬菌体的数量，其中，即便在60℃温育2小时后噬菌体ΦCJ2依然保持其传染性，但在70℃温育10分钟后则完全丧失其传染性；

图7为利用加速真空干燥器(SVD)在60℃持续120分钟进行的噬菌体ΦCJ2耐干燥性试验的结果，其中，比较干燥前后病毒滴度的变化从而确定其相对稳定性，且显示噬菌体的传染性没有下降；

图8为对大鼠单剂量口服给药进行的ΦCJ2毒性研究结果，其显示了体重的变化(○：用20mM Tris-HCl和2mM MgCl₂的混合溶液处理的雄性对照组，●：用1x10¹²pfu的ΦCJ2处理的雄性试验组，■：用20mM Tris-HCl和2mM MgCl₂的混合溶液处理的雌性对照组，□：用1x10¹²pfu的ΦCJ2处理的雌性对照组)，其中，即便在14天后也没有观察到体重的显著变化；和

图9为对大鼠单剂量静脉给药进行的ΦCJ2毒性研究的结果，其显示了体重的变化(○：用20mM Tris-HCl和2mM MgCl₂的混合溶液处理的雄性对照组，●：用1x10¹²pfu的ΦCJ2处理的雄性试验组，■：用20mM Tris-HCl和2mM MgCl₂的混合溶液处理的雌性对照组，□：用1x10¹²pfu的ΦCJ2处理的雌性试验组)，其中，即便在14天后也没有观察到体重的显著变化。

最佳实施方式

一方面，本发明涉及对鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性的噬菌体。

本发明的噬菌体符合长尾噬菌体科的形态，其特征在于等轴衣壳和非收缩性长尾，其全基因组大小为43kbp，主要结构蛋白的大小为40kDa。

特别地，本发明的噬菌体具有可选择感染鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的能力，即具有这些细菌的种特异性。

本发明噬菌体在遗传上具有大小为43kbp的全基因组，并且所述全基因组可包含选自由SEQ ID Nos.1、2和3组成的组中的一种或多种核酸分子，优选所述全基因组包含SEQ ID Nos.1-3所示的核酸分子。

当利用选自由SEQ ID Nos.4和5、SEQ ID Nos.6和7以及SEQ ID Nos.8和9组成的组中的一对或多对引物对对本发明的噬菌体进行PCR时，每种PCR产物的大小约为1kbp。优选地，当利用上述所有引物对进行PCR时，每种PCR产物的大小约为1kbp。

本文所使用的术语“核酸分子”包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子，作为核酸的基本结构单元，术语“核苷酸”包括天然核苷酸及其糖或碱基被修饰的类似物。

本发明噬菌体的基因组编码大小为40kDa的主要结构蛋白。

此外，本发明的噬菌体具有耐酸性和耐热性的生化特性，其中，所述噬菌体可以在pH 2.5-pH 9.0的宽范围pH环境中和37℃-60℃的高温环境中稳定保持其传染性。此外，本发明的噬菌体还具有耐干燥性，从而即使在高温干燥后仍能稳定保持其传染性。这种耐酸性、耐热性和耐干燥性的特性允许本发明的噬菌体应用于在各种温度和pH环境下生产用于由ST、SG和SP引起的家畜疾病或由受污染家畜引起的人类疾病的预防性或治疗性组合物中。

本发明的发明人收集了鸡屠宰场的污水样品，并从其中分离出对ST、SG和SP具有特异杀菌活性和上述性质的本发明噬菌体，将其命名为噬菌体ΦCJ2，并于2008年12月17日保藏在韩国微生物培养中心(361-221，Honje 1，Sudaemun，Seoul)，保藏号为KCCM10976P。

根据本发明的具体实施例，本发明人收集了鸡屠宰场的污水样品以分离裂解宿主细胞ST的噬菌体，并且证实所述噬菌体能够特异性地裂解SG和SP(表1)。本发明人还进一步在电子显微镜下观察了所述噬菌体(ΦCJ2)，发现其符合长尾噬菌体科的形态(图1)。

本发明人还进一步分析了所述噬菌体ΦCJ2的蛋白图谱，发现了大小约为40kDa的主要结构蛋白(图2)。

此外，还分析了所述噬菌体ΦCJ2的全基因组大小，发现其全基因组大小约为43kbp(图3)。对其遗传特性的分析结果表明，所述噬菌体的全基因组包含SEQ ID NOs.1-3所示的核酸序列(实施例6)。在这些结果的基础上，比较与其它种的遗传相似性。结果发现所述噬菌体与已知噬菌体的遗传相似性非常低，这表明所述噬菌体是新型噬菌体(表2)。更具体地，使用ΦCJ2特异性引物对(具体而言为SEQ ID Nos.4和5，SEQ ID NOs.6和7，SEQ ID NOs.8和9)进行PCR，发现每种PCR产物的大小均约为1kbp(图4)。

此外，当用ΦCJ2感染SG和SP时，显示噬菌斑(由一个噬菌体裂解宿主细胞在软琼脂上产生的清澈区域)具有相同的大小和浊度。

此外，测定了ΦCJ2在各种温度和pH条件下的稳定性，发现ΦCJ2在pH 2.5-pH 9.0的宽范围pH环境下(图5)和37℃-60℃的高温环境下(图6)都能保持其传染性，即便在60℃的高温下干燥120分钟后仍能保持其传染性(图7)。这些结果表明，可以容易地将本发明的噬菌体ΦCJ2应用于各种用于控制沙门氏菌的产品中。

另一方面，本发明涉及用于预防或治疗由选自鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌组成的组中的一种或多种细菌引起的传染病的组合物，所述组合物包含作为活性成分的所述噬菌体。

在一个优选的实施方案中，所述治疗性组合物可以包含抗生素。

本发明的噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性，并因此可以用于预防或治疗由这些细菌引起的疾病。优选地，由鼠伤寒沙门氏菌引起的疾病的实例可以包括沙门氏菌病或沙门氏菌食物中毒，由鸡沙门氏菌引起的疾病的实例可以包括禽伤寒，由鸡白痢沙门氏菌引起的疾病的实例可以包括鸡白痢，但均不限于此。

本文所使用的术语“沙门氏菌病”表示由沙门氏菌感染引起的症状，包括发烧、头痛、腹泻和呕吐，即，由沙门氏菌属细菌引起的疾病被定义为两种临床类型：急性败血症型(与伤寒热类似)和急性肠胃炎，包括肠炎、食物中毒和急性败血症。

本文所使用的术语“预防”是指包括通过施用所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文所使用的术语“治疗”是指包括通过施用所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

本发明的组合物包含5x 10²-5x10¹²pfu/ml的ΦCJ2，优选为1x10⁶-1x10¹⁰pfu/ml。

本发明的组合物还可以进一步包含药学上可接受的载体，并可以与所述载体一起配制，从而提供食品、药物和饲料添加剂。

本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述组合物配制成液体制剂，可以使用无菌且具有生物相容性的药学上可接受的载体，例如盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。这些物质可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。此外，还可以向所述组合物中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，从而制备可注射制剂(例如水溶液、悬浮液和乳液)，或者口服制剂(例如丸剂、胶囊、粒剂或片剂)。

本发明的预防性或治疗性组合物可以涂覆或喷施到受影响的区域或者通过口腔或肠胃外途径施用。所述肠胃外施用可以包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下或外用施用。

适合涂覆、喷施或施用本发明组合物的剂量依赖于多种因素，包括配制方法、施用方式，接收治疗的患者或动物的年龄、体重、性别、病情，和施用时间、施用途径、排泄速率和反应敏感度。掌握本领域常规技术的医师或兽医可以容易地确定所需组合物的有效量并开具处方。

适合本发明组合物的口服剂型的实例包括片剂、锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、水悬液或乳悬液、散剂或粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂。对于诸如片剂和胶囊的制剂，可使用粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰延胡索酸钠或聚乙二醇蜡。对于胶囊，除了上述化合物外，还可以进一步使用诸如脂质的液体载体。

对于非口服施用，可以将本发明的组合物配制成用于经皮下、静脉内或肌内途径施用的注射剂，配制成栓剂、或经呼吸道施用的喷雾吸入剂，例如气雾剂。可以通过将本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂一起溶解或悬浮在水中，并将所述溶液或悬浮液分装在安瓿或单位小瓶中而获得注射制剂。对于喷剂，例如气雾剂，可以将用于喷射水分散浓缩物或湿粉末的推进剂与添加剂组合使用。

本文所使用的术语“抗生素”是指可应用于动物以杀灭病原体的任何药物，用在本文中作为防腐剂、杀菌剂和抗菌剂的通用术语。所述动物为包括人在内的哺乳动物。与传统抗生素不同，本发明的噬菌体对于沙门氏菌具有高特异性，从而可以杀灭特定病原体而不影响有益细菌，并且不诱导耐性，因此其生命周期相当长。

根据本发明的一个具体实施方案，我们进行了单剂量口服毒性和静脉内毒性研究，以及对正常肠细菌的毒性研究，从而评估其在大鼠中的安全性。当以1x10¹²pfuΦCJ2的剂量水平进行单剂量口服毒性研究时，没有明显的临床体征或动物死亡(表4和5)。当以1x10¹²pfuΦCJ2的剂量水平进行单剂量静脉内毒性研究时，没有明显的临床体征或动物死亡(表6和7和图9)。当利用1x10¹¹pfu/mlΦCJ2的系列稀释液进行对正常肠细菌的毒性研究时，发现即使最大剂量的ΦCJ2也没有抑制正常肠细菌的生长(表8)，这表明了ΦCJ2具有安全性。

此外，当用添加ΦCJ2的饲料饲养SG感染的鸡时，ΦCJ2-处理组的受保护率显著高于非处理组(表9)，这表明ΦCJ2对SG感染具有预防和治疗功效。

根据另一方面，本发明涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的动物饲料或家畜饮用水。

在渔业和家畜业中使用饲料抗生素添加剂的目的是为了抑制感染，但却导致细菌耐性株的增多，并且家畜产品中残留的抗生素可能被人摄入，从而使人体内病原体产生抗生素耐性并导致疾病的传播。此外，由于存在多种饲料抗生素添加剂，多药耐性株在全球出现的增加是一个严重的问题。因此，可以将本发明的噬菌体作为饲料抗生素添加剂使用，其对生态更为友好且能解决上述问题。

可以将本发明的噬菌体单独制备成饲料添加剂，随后添加到动物饲料中，或直接添加到动物饲料中。本发明的噬菌体可以以液体或干燥形式包含在动物饲料中，其中优选干燥粉末的形式。所述干燥过程可以通过风干、自然干燥、喷雾干燥或冻干而进行，但并不限于此。基于动物饲料的重量，可以以粉末的形式添加0.05-10重量％，优选0.1-2重量％的本发明噬菌体。除了本发明的噬菌体外，所述动物饲料中还可以包含用于长期保存的其它常用添加剂。

本发明的饲料添加剂还可以包含其它非病原微生物。所述其他微生物可以选自以下组成的组：可以产生蛋白酶、脂肪酶和转化酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；具有分解有机化合物的能力并在厌氧条件下具有生理活性的乳杆菌(Lactobacillus sp.)；能够增加家养动物体重、提高产奶量并有助于饲料消化和吸收的丝状真菌，如米曲霉(Aspergillus oryzae)(J AnimalSci 43：910-926，1976)；和酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(J Anim Sci56：735-739，1983)。

本发明的包含ΦCJ2的饲料可以包括基于植物的饲料，例如谷物、坚果、食品副产物、海草、纤维、药物副产物、油、淀粉、粗粉和谷物副产物；基于动物的饲料，例如蛋白质、矿物质、脂肪、单细胞蛋白质、浮游动物和食品废料，但并不限于此。

本发明的包含ΦCJ2的饲料添加剂可以包含粘合剂、乳化剂和防腐剂(用于防止质量退化)、氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白氮、硅酸盐/酯、缓冲剂、着色剂、提取物和用于提高工艺效率的寡糖以及其它饲料预混料，但并不限于此。

此外，提供混合有本发明噬菌体的饮用水可以降低家畜肠内沙门氏菌的数量，由此获得不含沙门氏菌的家畜。

根据另一方面，本发明涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的消毒剂或清洁剂。

包含作为活性成分的所述噬菌体的消毒剂可以用作食品消毒剂，从而用于预防食物中毒。特别地，在食品工业中，其可以用作预防沙门氏菌感染的食品消毒剂或食品添加剂，在家畜业中，其还可以用于生产不含沙门氏菌的家畜。为了除去沙门氏菌，所述消毒剂可以用在污水处理厂，也可以用在家禽舍、屠宰场、污染区域和其它生产设施上，但并不限于此。

此外，包含作为活性成分的所述噬菌体的清洁剂可以涂覆在动物活体的受污染皮肤、羽毛和其它受污染的身体部分，从而除去沙门氏菌。

另一方面，本发明涉及对鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性的噬菌体治疗由鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病的方法。

另一方面，本发明涉及用于预防或治疗由鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病的组合物治疗由鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病的方法。

可以将本发明的组合物含在药物制剂中或将其作为动物饲料的成分或含在饮用水中施用于动物，优选通过将其作为饲料添加剂混入动物饲料中来施用。

可以以通常方式通过各种途径施用本发明的组合物，例如口服或肠胃外途径，特别是口服、经直肠、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、透皮、鼻内和吸入途径。

本发明的治疗疾病的方法包括施用药学有效量的本发明组合物。对于本领域技术人员显而易见的是，医师通过适当的医学判断应当可以确定单日总剂量。对于患者来说，治疗有效量可能根据医学领域熟知的各种因素而变化，包括要获得的应答的种类和程度；患者的状况，例如年龄、体重、健康状况、性别和饮食；施用时间和途径、组合物的分泌率、治疗时间周期、根据是否使用其它试剂的具体组合物等。

下文将参考以下实施例对本发明进行更详细的阐述。然而，这些实施例仅出于说明的目的，本发明并不限于这些实施例。

具体实施方式

实施例1：沙门氏菌噬菌体的分离

1-1.噬菌体的筛选和单噬菌体的分离

将来自鸡屠宰场和排水沟污水的50ml样品转移到离心管中，并以4000rpm离心10分钟。随后，利用0.45μm滤器过滤上清。将18ml所述样品滤液与150μl ST振荡培养基(OD₆₀₀＝2)和2ml的10×Luria-Bertani培养基(下文称为LB培养基，蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，终体积为1L)混合。将混合物在37℃培养18小时，并将培养基以4000rpm离心10分钟。利用0.2μm滤器过滤上清。将3ml 0.7％琼脂(w/v)和150μl ST振荡培养基(OD₆₀₀＝2)混合，并铺在LB平板上，使其转变成固体培养基。在其上涂布10μl培养滤液，并在37℃培养18小时(将0.7％的琼脂用作“上层琼脂”，并在所述上层琼脂上进行噬菌体裂解物的滴定，称为软琼脂覆层法)。

将含有噬菌体裂解物的样品培养液稀释，并与150μl ST振荡培养基(OD₆₀₀＝2)混合，随后进行软琼脂覆层法，从而获得单个噬菌斑。由于单个噬菌斑代表一个噬菌体，为了分离单噬菌体，将一个噬菌斑加入到400μl SM溶液(NaCl，5.8g；MgSO₄·7H₂O，2g；1M Tris-Cl(pH7.5)，50ml；H₂O，终体积为1L)中，在室温下静置4小时，以分离单噬菌体。为了大量纯化噬菌体，从所述单噬菌体溶液中取出100μl上清，并与12ml 0.7％琼脂和500μl ST振荡培养基混合，随后在LB平板(直径为l 50mm)上进行软琼脂覆层法。当裂解完成后，向平板中加入15ml SM溶液。将平板在室温下温和振荡4小时，以从上层琼脂中洗脱噬菌体。回收含有洗脱的噬菌体的SM溶液，并加入1％终体积的氯仿，充分混合10分钟。将溶液在4000r pm下离心10分钟。利用0.2um滤器过滤所获得的上清，并贮存在冰箱中。

1-2.大批量的噬菌体

利用ST大量培养所选择的噬菌体。振荡培养ST，将1.5×10¹⁰cfu(集落形成单位)的等分试样在4000rpm离心10分钟，随后将沉淀重悬在4ml SM溶液中。在其中接种7.5×10⁷pfu(噬菌斑形成单位)的噬菌体(MOI：感染倍数＝0.005)，在37℃静置20分钟。将所述溶液接种到150ml LB培养基中，并在37℃培养5小时。加入1％终体积的氯仿，并将培养溶液振荡20分钟。分别加入终浓度为1μg/ml的Dnase I和Rnase A。将溶液在37℃静置30分钟。分别加入终浓度为1M和10％(w/v)的NaCl和PEG(聚乙二醇)，并再在4℃静置3小时。将所述溶液在4℃以12000rpm离心20分钟，以舍弃上清。将沉淀重悬在5ml SM溶液中，并在室温下静置20分钟。向其中加入4ml氯仿，并混合均匀，随后在4℃以4000rpm离心20分钟。利用0.2μm滤器过滤上清，并通过甘油密度梯度超离心(密度：40％，5％甘油在4℃以35,000rpm离心1小时)纯化噬菌体。将纯化的噬菌体命名为噬菌体ΦCJ2，并重悬在300μlSM溶液中，随后进行滴定。噬菌体ΦCJ2于2008年12月17日保藏到韩国微生物培养中心(361-221，Honje 1，Seodaemun，Seoul)，保藏号为KCCM10976P。

实施例2：检测ΦCJ2对沙门氏菌的感染

为了检测所选噬菌体对其它沙门氏菌种以及ST的裂解活性，利用其它沙门氏菌种进行了交叉感染的试验。结果，ΦCJ2没有感染SE(肠道沙门氏菌肠炎血清型，Salmonella enterica Serotype Enteritis)、SC(肠道沙门氏菌猪霍乱血清型，Salmonella enterica Serotype Choleraesuis)、SD(肠道沙门氏菌德尔卑血清型，Salmonella enterica Serotype Derby)和SA(肠道沙门氏菌亚利桑那亚种，Salmonella enterica subsp.Arizonae)、SB(肠道沙门氏菌邦戈亚种，Salmonella entericl subsp Bongori))。与SG和SP不同，当利用除ST ATCC 14028株以外的其它沙门氏菌种进行交叉传染的试验时，裂解活性为40％或更小。该结果表明ΦCJ2是特异于SG和SP的噬菌体(参见实施例11)。所述结果示于下表1中。利用SG作为宿主细胞产生的噬菌体ΦCJ2具有与利用ST作为宿主细胞所产生的噬菌体相同的噬菌斑大小和噬菌斑浊度，以及相同的蛋白谱和基因组大小。

表1

ΦCJ2对沙门氏菌的感染

血清型	菌株名称	噬菌斑的形成	血清型	菌株名称	噬菌斑的形成
						SG	SGSC 2293	O	SC	ATCC 13312	X
SP	SGSC 2295	O	SD	SCSG 2467	X
						ST	ATCC 14028	O	SA	ATCC 13314	X
SE	SGSC 2282	X	SB	ATCC 43975	X

^*ATCC：全球生物资源中心(The Global Bioresource Center)

^*SGSC：沙门氏菌遗传库中心(salmonella genetic stock center)

实施例3：噬菌体ΦCJ2的形态检测

利用0.01％明胶溶液稀释经纯化的ΦCJ2，随后固定在2.5％的戊二醛溶液中。将样品滴在碳包被的云母板(ca.2.5×2.5mm)上并使其适应10分钟后，用无菌的蒸馏水洗涤。将碳膜封装在铜栅(copper grid)上，并用4％的乙酸铀酰染色30-60秒，干燥，并在JEM-1011透射式电子显微镜(80kV，放大倍率为×120,000-×200,000)下观察。结果如图1所示，发现纯化的ΦCJ2具有包括等轴衣壳和非收缩性长尾在内的形态特征，这表明其属于长尾噬菌体科的形态型。

实施例4：噬菌体ΦCJ2的蛋白谱分析

利用3μl 5×SDS样品溶液处理15μl纯化的ΦCJ2溶液(10¹¹pfu/ml滴定度)，并加热5分钟。将ΦCJ2的总蛋白在4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中进行电泳，随后用考马斯亮蓝将凝胶在室温下染色1小时。如图2所示，所述蛋白谱显示观察到作为主要蛋白的约40kDa的条带，同时还观察到约65kDa、17kDa和15kDa的条带。

实施例5：噬菌体ΦCJ2的全基因组DNA大小的分析

通过超速离心法从纯化的ΦCJ2分离基因组DNA。具体而言，向纯化的ΦCJ2的培养液中分别加入终浓度为20mM、50μg/ml和0.5％(w/v)的EDTA(乙二胺四乙酸，pH8.0)、蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸钠)，并在50℃下静置1小时。加入等量的苯酚(pH8.0)并混合均匀，随后在室温下以12000rpm离心10分钟。将上清与等量PC(苯酚∶氯仿＝1∶1)混合均匀，随后在室温下以12000rpm离心10分钟。将上清与等量氯仿混合均匀，随后在室温下以12000rpm离心10分钟。再次向上清中加入1/10体积的3M乙酸钠和2体积95％的冷乙醇，并在-20℃静置1小时。在0℃以12000rpm离心10分钟后，彻底除去上清，并将DNA沉淀溶解在50μl TE(Tris-EDTA，pH 8.0)中。将所提取的DNA稀释10倍，并测量其在OD₂₆₀的吸光度。将1μg全基因组DNA上样到1％PFGF(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶中后，利用BIORAD PFGE系统程序7(大小范围为25-100kbp；转换时间梯度(switch time ramp)为0.4-2.0秒，线形；正向电压为180V；反向电压为120V)在室温下进行电泳20小时。如图3所示，ΦCJ2的基因组大小约为43kbp。

实施例6：噬菌体ΦCJ2的遗传分析

为了分析纯化的ΦCJ2的遗传特征，利用限制性酶EcoR V对5μgΦCJ2基因组DNA进行处理。利用Sma I酶切载体pCL(Promega)，并用CIP(小牛肠碱性磷酸酶)处理。经酶切的基因组DNA和载体以3∶1的比例混合，并在16℃连接5小时。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。将转化的细胞涂布在含壮观霉素和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的LB平板上，以进行蓝/白斑筛选，由此选出3个克隆。将所选克隆在含壮观霉素的培养基中振荡培养16小时。随后，利用质粒提取试剂盒(Promega)提取质粒。利用M13正向和M13反向引物对通过PCR确定质粒克隆，并选择1kbp或更长的插入片段，利用M13正向和M13反向引物对对其序列进行分析。如SEQ IDNOs.1、2和3所示，其大小分别为约3.1kbp、1.7kbp和800bp。利用NCBI blastx程序进行序列相似性分析，结果示于下表2中。

如下表2所示，ΦCJ2的SEQ ID NO.1的前部分序列显示与沙门氏菌噬菌体KS7的BPKS7gp07以及SETP3的包被蛋白具有90％的序列相似性。SEQID NO.1的后部分序列也显示分别与沙门氏菌噬菌体KS7和噬菌体SET3的BPKS7gp04和SPSV3_gp41具有75％和66％的序列相似性。在SEQ ID NO.2中，前部分序列显示与沙门氏菌噬菌体SETP3的假定蛋白SPSV3_gp02具有91％的序列相似性，后部分序列显示与沙门氏菌噬菌体SETP3的尾部组成蛋白具有94％的序列相似性。序列SEQ ID NO.3也显示与沙门氏菌噬菌体KS7的BPKS7gp41和噬菌体SETP3的DNA聚合酶具有69％的序列相似性。通过NCBI blastn程序对SEQ ID NOs.1、2和3的碱基序列进行分析，结果显示与沙门氏菌噬菌体KS7和SETP3具有60-70％的序列相似性。然而，它们彼此并不完全相同，这表明ΦCJ2是感染沙门氏菌的新型噬菌体。

表2：ΦCJ2与其它噬菌体的序列相似性比较

实施例7：ΦCJ2特异性引物序列的构建

为了鉴定ΦCJ2，以SEQ ID Nos.1、2和3为基础构建了ΦCJ2-特异性引物。利用SEQ ID NOs.4和5、SEQ ID NOs.6和7、SEQ ID NOs.8和9的每对引物对进行PCR。向预混物(Bioneer)中加入0.1μg噬菌体基因组DNA、0.5pmol引物，并将终体积调整至20μl。利用30个以下循环进行PCR：94℃变性1分钟、53℃退火1分钟、72℃聚合1分钟。当使用SEQ ID NOs.4和5、SEQ ID NOs.6和7，SEQ ID NOs.8和9作为引物对时，所有PCR产物的大小都约为1kbp。结果示于图4中。

实施例8：噬菌体的pH稳定性试验

为了检测ΦCJ2在低pH环境下(例如鸡胃)中的稳定性，在宽pH范围(pH2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0)内进行了稳定性试验。制备了浓度为2M的各种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH 2.1、pH 4.0、pH5.5、pH6.4))、柠檬酸钠缓冲液(pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5)、磷酸钠缓冲液(pH 6.9、pH7.4)、Tris-HCl(pH 8.2、pH 9.0))。将100μl pH溶液与等量的噬菌体溶液(1.0×10¹¹pfu/ml)混合，从而使各pH溶液的浓度为1M，并在室温下静置1小时。对反应溶液进行连续稀释，并按照软琼脂覆层法将10μl的各稀释样品在37℃培养18小时并进行噬菌体裂解物的滴定。比较滴定度随pH变化的变化，以测定相对稳定性。结果显示，所述噬菌体没有丧失其传染性，直至pH2.5都保持其稳定性。然而，其在pH 2.1时丧失了传染性。结果示于图5中。

实施例9：噬菌体的热稳定性试验

为了测定噬菌体在用作饲料添加剂时对配制过程中产生的热的稳定性，进行了以下试验。将200μl的ΦCJ2溶液(1.0×10¹¹pfu/ml)分别在37℃、45℃、53℃、60℃、70℃和80℃静置0分钟、10分钟、30分钟、60分钟和120分钟。对所述溶液进行连续稀释，并根据软琼脂覆层法将10μl的各稀释样品在37℃培养18小时，并进行噬菌体裂解物的滴定。比较滴定度随温度和暴露时间的变化，以测定相对稳定性。结果显示所述噬菌体在60℃温育2小时后仍保持其传染性。然而，所述噬菌体在70℃或更高温度温育10分钟后迅速丧失其传染性。结果示于图6中。

实施例10：噬菌体的干燥稳定性试验

为了测定噬菌体在用作饲料添加剂时对配制过程中的干燥条件的稳定性，进行了以下试验。基于热稳定性试验的结果，本试验在高温干燥条件(60℃持续120分钟)下进行。利用加速真空(加速-真空浓缩器5301，Eppendorf)对200μl的ΦCJ2溶液(1.0×10¹¹pfu/ml)进行干燥。将所得的沉淀完全重悬在等量的4℃SM溶液中持续1天。对所述溶液进行连续稀释，并按照软琼脂覆层法将10μl的各稀释样品在37℃培养18小时，并进行噬菌体裂解物的滴定。比较滴定度在干燥前后的变化，以测定相对稳定性。结果显示其活性没有降低。结果示于图7中。

实施例11：测定噬菌体对野生型菌株的感染

除了在本发明中使用的SG(SG SGSC2293)、SP(SP SGSC2295)和ST(STATCC14028)外，还测定了噬菌体ΦCJ2对首尔国立大学兽医药学院鸟类疾病实验室(Laboratory of Avian Disease，College of Veterinary Medicine，SeoulNational University)分离的韩国野生型SG和SP(各20株)的裂解活性。将150μl各菌株振荡培养液(OD₆₀₀＝2)与10μl的ΦCJ2溶液(10¹⁰pfu/ml)混合，并按照软琼脂覆层法在37℃培养18小时，测定噬菌斑的形成。发现噬菌体ΦCJ2对野生型SG和SP具有100％的裂解活性。结果示于下表3中。还测定了其对20株野生型ST的裂解活性，发现噬菌体ΦCJ2显示出80％的裂解活性(未在下表3中示出)。因此，结果表明ΦCJ2是特异于SG、SP和ST的噬菌体。

表3

对野生型SG、SP和ST的裂解活性

^*SG/SP来源：首尔国立大学兽医药学院鸟类疾病实验室

^*SGSC：沙门氏菌遗传库中心

实施例12：噬菌体毒性试验

为了评价ΦCJ2在大鼠中的安全性，进行了毒性研究。进行了单剂量口服和静脉内毒性研究以及对正常肠细菌的毒性研究。

为了检测大鼠单次口服施用的急性毒性和死亡率，进行了单剂量口服毒性研究。在施用ΦCJ2前，使7周龄、无特定病原体(specific pathogen free，SPF)的雄性和雌性大鼠(各12只)禁食一天。在施用当天，通过口腔区向雄鼠和雌鼠(各6只)施用1×10¹²pfuΦCJ2，通过口服向作为对照组的6只大鼠施用20mM Tris-HCl和2mM MgCl₂的混合溶液，4小时后开始恢复喂食。在施用当天，在施用后30分钟和每隔4小时对大鼠进行检查。每天检查一次并记录临床体征，持续14天。结果没有动物死亡，也没有观察到ΦCJ2毒性引起的临床体征。结果示于表4和5中。在施用前和施用后1、3、7、10和14天测定并记录体重变化。结果示于图8中，与对照组相比，体重没有显著变化。结果表明ΦCJ2没有诱导引起动物体重改变的食欲下降或毒性体征。对存活的鼠进行尸体解剖，并检测是否明显的损伤。没有观察到明显异常。

表4

口服施用ΦCJ2后的死亡率

表5

口服施用ΦCJ2后的临床体征

^a表示死亡动物数/动物总数的值。

^b表示具有临床体征的动物数/动物总数的值。

为了测定噬菌体在血液中的毒性，进行了单剂量静脉内毒性研究。利用7周龄、无特定病原体(SPF)的雄性和雌性大鼠(各10只)进行所述试验。在施用当天，利用3ml注射器通过雄鼠和雌鼠(各5只)的尾侧静脉施用1×10¹²pfuΦCJ2，向作为对照组的5只鼠的尾侧静脉施用20mM Tris-HCl和2mM MgCl₂的混合溶液。在与口服毒性的研究相同的条件下，检测动物死亡和临床体征、体重变化和尸检结果，并分别示于表6和7以及图9中。在试验期间，没有动物死亡，也没有观察到由ΦCJ2毒性引起的临床体征。此外，与对照组相比，体重没有显著变化。结果表明ΦCJ2没有诱导毒性。此外，对存活的鼠进行尸体解剖，并检测是否有明显的损伤。没有观察到明显异常。

表6

静脉内施用ΦCJ2后的死亡发生率

表7

静脉内施用ΦCJ2后的临床体征

^a表示死亡动物数/动物总数的值。

^b表示具有临床体征的动物数/动物总数的值。

为了测定ΦCJ2对正常肠道细菌的毒性，利用在动物药物毒性试验手册中确定的9种正常肠道细菌(脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，ATCC25285)，卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus，ATCC8483)，普拉氏梭杆菌(Fusobacteriumprausnitzii，ATCC 27766)，长双歧杆菌(Bifidobacterium Longum，KACC 20597，ATCC15697)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，ATDD13124)，厌氧消化球菌(Peptococcus anaerobius，ATCC27337)，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis，KACC 11304，ATCC35308)，嗜酸乳杆菌(Lactovacillus acidophilus，KACC12419，ATCC 4356)，大肠杆菌(Escherichia coli，KACC 10005，ATCC35607))进行所述毒性研究。对1x10¹¹pfu/mlΦCJ2进行连续稀释，并将100μl稀释液按等份加入到96孔平板中，随后，向平板中加入上述9个种的培养液，并在预定条件下培养18-48小时。测定细胞密度以确定最小抑制浓度。如表8所示，发现即使最大浓度的ΦCJ2也没有抑制肠道细菌的生长。结果表明ΦCJ2没有影响正常的肠道细菌。

表8

实施例13：噬菌体的功效试验

为了评价ΦCJ2预防和治疗ST、SG和SP的功效，利用鸡进行了功效试验。

将20只褐色蛋鸡(1日龄)分成10个实验组，每组10只(ΦCJ2处理组和非处理组)。在第1周，用补充有10⁷pfu ΦCJ2(每克)的饲料和补充有10⁷pfuΦCJ2(每ml)的饮用水喂养试验鸡。1周后，10⁶cfu SG0197(每只鸡)和10⁷pfu(MOI＝10)的每种噬菌体与500μl TSB混合，并在冰上静置1小时或更短，随后通过口服施用。2周后测定死亡率。对存活的小鸡进行尸检，检测是否有明显的损伤，并分离细菌。如表9所示，发现ΦCJ2处理组显示出显著高于非处理组的受保护率(P＜0.05)。

表9

采用鸡进行ΦCJ2的功效试验

	ΦCJ2-处理组	未处理组
			存活	9	3
死亡率	10％	70％
			临床体征	1/9	1/3
SG的再分离	0/9	0/3
			受保护率	80％	20％

工业应用性

本发明的噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性而不影响有益细菌，并且具有优异的耐酸性、耐热性和耐干燥性，并由此可以应用于可用于抑制或预防包括由鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌引起的传染病(特别是沙门氏菌病、沙门氏菌食物中毒、禽伤寒和鸡白痢)的组合物中，并可应用于治疗剂、抗生素、动物饲料、动物饮用水、清洁剂和消毒剂中。

序列表

<110>CJ第一制糖株式会社

<120>新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物

<130>OPA09073/PCT

<150>KR10-2008-0133909

<151>2008-12-24

<160>9

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>3083

<212>DNA

<213>噬菌体KCCM 10976P

<400>1

tggataactt ctggcagcgc caggcacagc gtcgtctgat tgctaccgct ctcggcctgt 60

acaacgataa cgttgctgca accgacgaat accacaccca gaacgacatg gttatcgatg 120

tatccgccac catgggcttt gatgcgggtg cctttatcga cgccacccag actatgggcg 180

acgcgctgat gggctcaact ggtgaagtgc tcggtgctat tgcgatgcac agcttcgtgt 240

acggccaggc acgtaaagcc aacctgattg acttcatccg tgactccgaa aataacacca 300

tgtttgctac atatcagggc taccgcgtgg ttgttgatga tagcatgacc gttgtaggca 360

ccggtaatga ccgcaagttt atcagcatca ttttcggcaa cggcgcaatc ggctacggcg 420

aaggtactcc ggagaaccca ctggaatatg agcgtgaagc ctcacgcggt aacggcggcg 480

gtgttgaaac cctgtggacc cgtaaaacct ggctgctgca cccgctgggc tacagcttca 540

ctagcgcggt aatcaccggt aacggctccg aaaccatcgc ccgctccgct tcctggcagg 600

acctggcgaa cgccgccaac tggaatcgcg tagtagagcg caaacacgtt ccaatcgcgt 660

tcctggttac tggcgtaggc gcgtaacagt agcgtataat caggaggggc tacggcccct 720

cttttcacat tcatacggga gaaatgtatg ggcaccacag gtaaagggct gccacgcagt 780

ctgaaagacg ccaaactgaa catccctatg gcgactacat cggatgttgg tggcgtaaaa 840

aagtcagcta ctgtagcctc gccagccgct attactgctg ccgcaggaac ccaatcagtc 900

gccgacccta ctaaggccga atttgatgca ctcgtggcgg agtacaacaa actccgaacc 960

gatgtcacag cgctgcgcac taccgtagca aacctgttaa ccgcgcttaa aaacgctgga 1020

actgtaagct aaaggagctt aaaaatggtt gatgtaatta aacgccgtat ggtaggcgtc 1080

tccgacgact cccctgctga tggtcaggta gaaatcgaca tggtaaacat ttccccagcg 1140

tcgttttcta caggcctgaa tgacactacg gcagtaaccg caccggcggc gctgacactc 1200

accgtagcgg cggcaggggg ccgagagcca tacagctatc agtggttcaa aaacggtaac 1260

gccatttctg gcgcaacggc ggcgacttac actaagacgc ctaccgttgc cacggttgat 1320

tccggcactt acaaagttgt tgcccaggat ggttatggta atatcatctc agacagcact 1380

attgtcacag tatcttaatt aaacggccct tcggggccgt catagggaaa cataatggtt 1440

aatgacaatt acgtaatccg cgagaaatat aacggtctgg tagagattga cggccagctc 1500

gtaccacagc gcggaaatgt tctgccggaa gaactggtgg caacgcaacc ggataacgaa 1560

gaagcgcaca ataacggtgg cggcgccgag cctaaacgcc gtcgtcgtcg cacgttcgag 1620

gaataaccaa tggctttagt cgtcgaagat ggttctatag ttgcaggagc tgacagctat 1680

cttagcctgg aggacgcccg cgcactggcg gctaaatacg gctatgtgtt acccgctgag 1740

ggtaatgagg ctgaagccgc gctccgcaat ggtgcgatgt acgtcggttt acaagagcct 1800

gctatgtgtg gtcgtcgtgt atccgcgacg cagtccttat cgtttccgcg cactggaatt 1860

agtctgtacg gtttccctgt ggcgagtaat gttatcccgg accaggttaa actcgcgcag 1920

cttatcgctg gcgtagagta cggtaacggt gcggatgtgc gcgccagttc agacgggcgt 1980

gttacgacta tggagcgcgt agaaggtgcg gtgacagtac agtacgccaa caacggcaac 2040

accgggtcga caatcactat cacggcatct atggacgcat tacgcccgct gctgtgtggc 2100

tccaacaacg ctttctcttt taatgtttat cggggttaga gatggctaaa acgaagagtg 2160

aaatgtttgc gcttatcggg ggcaattttc cggataacac gaccggagcc atcacaccag 2220

aaaagctaag agaagtaaca acgcaactgg cagactctat gttgtatgct gccactggag 2280

tgaaagaggt ggaagtactg agggcctctt ctactgtcgc acaagcacca acggcagttg 2340

acactgcgtt acagttatct tttggcgcag ctcagggcgc ggcatctaac ccagttatga 2400

ttaacgcggc cggtcttgtt acgtttaaca ccgcgggtaa ttatgcggtt cgcatcaaat 2460

tacaggcggg gcgcacaggg gccagtggga cttctattct gttatcgcgc attcttgtga 2520

acgggtctca atacggttca cctgcggcta ccaagctagt aagcgcggac gttacgatac 2580

ctatagaatc ccgcgtcgtt attaacgctg ccgcagggca gactatggct gtgcagatta 2640

tgagagatag cgcaggcact aattttggcg gtgtatatcc gcagactgcg accgtagctg 2700

cgtggggcat cgctccgtct gcgttactcg tcatctcaag actggagccc gcctaatgag 2760

cactgctttc agcaagaaaa tgcagggcgt ggagacacgc ctgttaggca aatatggcag 2820

cactgtaacg ctggttcgcg ctggttctaa ggtctgggac gaaagccttg gcgaatacgt 2880

gcgacagcca gatactcaga ttcctcttac cgccgtcccg gtgccgatta acgcggggct 2940

tgtcaacgga actaccattc aggtggggga tatggtggtg aaagcggact atagtgtgct 3000

gccgaagatg gaagataagg tagaattttc tggggagcaa tggtcagttg tcggtatcga 3060

gaagaaaatc gttaacgatg ata 3083

<210>2

<211>1670

<212>DNA

<213>噬菌体KCCM 10976P

<400>2

atcgggatac cccgatgaac ttcgttgtca ataatatacc ggatggagtg ccggtgcgtg 60

tctttatcga tgagataggc gaagacaacg atgttactga ggatttcgaa gcattgaaag 120

aagacgcaat ctttcatgtt gttgagtccg cgggtggcgg agctattaaa ggtgtcatga 180

agattttcag tgtagtttta aaaccactgg cgaagctttt gtccccttca gtaaaaggtg 240

cgtcgtcaaa cctcgctaac tcgcaagcag actcccccaa caacagtctt tctgaccgca 300

ataataaagc gcgtccctat gagcgtagct atgacatttg cgggacggtg caaacgatac 360

caaacaacct tatgtcaact tataaggtgt ttaacgcagc gggtcgcatt atagaatatg 420

gatactacga tgctggtaga ggttatcttg acatacaccc tgacggaata acagacggtg 480

atacccgtgt atctgacatc acagggacat cagttgccgt ctacgcgccg tacacgtcac 540

cgaataacac ggcaacgccg caagtactgg ttggagaccc gatagagcag gggttatatc 600

tgactgtcga atcaaatgaa gtagacggcg tggttctgaa agcacaaaac ggacttggca 660

tctcgttttc ttacatgtcc ggataccctt cgttatccgg ttccaccggc actatatacg 720

acccgtcagg ggggtctgac ttctccggtg ttcttgtgcc gaatgatacg ttttctctcg 780

tatccgcctg gacaaataca gatgttgacc tttccggtgg tggttatcag gtaataagtg 840

tttccgaagg aactgttact ttcgtagtcc ccggtaatct tataagtaaa tggcaacaaa 900

tacagccggg ttcgtttttt cgtggagacg gcgaagcctc gttgcaaccg gataacacat 960

atgaaaaaac gttaactgat tgggtgtcca taaaccgaac tgaggtggaa cgtattgtcg 1020

ctaacatagc ggccgcaaac gggatgtata aagacaatgg tcgttccaaa acgttggctt 1080

cggtaacagc agaaatacaa taccaacttc ttgacgaaaa tagcgtgccc tacggcccga 1140

tttacgcggc gcaaggaacc gtatccgggc gcacttctga ctataacggc gtgactatat 1200

acgcagattt acccgtagcg tctcgtgttc gcgtcagggc gaggagagta acagaccttg 1260

atttcaattt cgaaggctca gttgtcgacg aaataaccta cgttaacctg tacgggcaga 1320

ctagagacaa caccccacac tacggcaacc gaaccactgt gcactcaatg cgtaagcaga 1380

cgccgcgcgc tgccgaagtt aagcaacctc agttgcgcat gattgcgacc gagatggtat 1440

ataaatatct tgggaatgga gtgtttgagg atacgatgtc gcctaataac caggcagtcc 1500

aatcgttaat tcgcctcgca agggaccctg acgtcggcgg gctcgattta acagtaagga 1560

atatggataa gttgcttgct gtacaaaagg aaatagagga ttacttcggc gacaagcaag 1620

ccggagaatt ctgttacacc ttcgatgatt ataaaacaac gatgcaggat 1670

<210>3

<211>790

<212>DNA

<213>噬菌体KCCM 10976P

<400>3

atcgaggcca gcttcgaagg tcgcaagagc cgtcttttca ccagccagcc atgcaagacc 60

gcgcccttcc acgttggaat aatcggcaac cagtagctta ttaccgggtg taggcaccac 120

gcagctacga acagttgtgg ctgttaattt cgatacgtca taggcccagt gcgctcgacc 180

ttttagcagc atgtcaatgc cagttgatag cgcgtgctta cgcaacaggt aattacgctc 240

agactcaccg ggcatccgaa ttactttatc ctccgggtca tcatcgtaat agccacgagc 300

taagttctga ggctggaagc ctttacccgc aaaacgtaaa gtcctggacg ctccgccgta 360

ctggagacaa ccacgacgac gaccgtcggc ggacagacca agcaggagcg ggttgtactt 420

ggtcgatgcc gtggagctgg cccccagacg catttcgata agtgtacgag cgtcgtcagg 480

caggtcatcg tcagccagca agtcgtttag cgtggacttc tgcgcgttga gaatctcatg 540

acctggtgcg aggtctcgca gcgtaggcag aaaatcagca ccggtaagac ccgcgcccca 600

tttggcgttt gcttcagcct gtagttcaat cttgtgctgc ttcaccgcgt cgattgccgc 660

attagccagc gccgtgtcga cgtagaagcc gcggtcgttg atgcgctggt cgacagccag 720

gacggtgttc tcgaactcgg tgttgcccca ctgcggcagc gagtgataaa cctcgcgcat 780

agatgtgata 790

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

aagacttcgc attataataa gtg 23

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ttaaagtttg taactcgtac ac 22

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

ccgaaactcc catgaataaa t 21

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

ttatagttct catcgtcgag 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

cgcataactg ggttgcagga 20

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

gagagtactg tgttgctatt ta 22

Claims

1.对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、鸡沙门氏菌(Salmonellagallinarum)或鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)具有特异杀菌活性且保藏号为KCCM10976P的噬菌体ΦCJ2(bacteriophageΦCJ2)。

2.用于抑制或预防由选自鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌组成的组中的一种或多种细菌引起的传染病的组合物，其包含作为活性成分的权利要求1所述的噬菌体。

3.如权利要求2所述的组合物，其中由鼠伤寒沙门氏菌引起的传染病为沙门氏菌病或沙门氏菌食物中毒，由鸡沙门氏菌引起的传染病为禽伤寒，由鸡白痢沙门氏菌引起的传染病为鸡白痢。

4.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物被用作抗生素。

5.动物饲料，其包含作为活性成分的权利要求1所述的噬菌体。

6.饮用水，其包含作为活性成分的权利要求1所述的噬菌体。

7.消毒剂，其包含作为活性成分的权利要求1所述的噬菌体。

8.清洁剂，其包含作为活性成分的权利要求1所述的噬菌体。

9.权利要求1所述的噬菌体在制备用于治疗由选自鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌组成的组中的一种或多种细菌引起的传染病的药物中的应用。

10.权利要求2-4中任一项所述的组合物在制备用于治疗由选自鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌组成的组中的一种或多种细菌引起的传染病的药物中的应用。