CN107099511B - 一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体及其应用 - Google Patents

一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体，所述噬菌体的分类命名为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体（Salmonella typhimuriumphage）ΦSa‑1，已于2017年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017217，地址：中国武汉，武汉大学。本发明的噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌具有特异性的杀伤活性，能够选择性的杀死特定的致病菌，而不会杀死有益细菌，不会引起药物的抗性。该噬菌体还具有优异的耐酸性和耐热性，可以被制备成饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、清洁剂或消毒剂各种形式的产品，能够在较宽的温度范围和pH条件下对鼠伤寒沙门氏菌进行杀灭。

Description

一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体及其应用。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一群非适应性或泛嗜性的沙门氏菌，具有广泛的宿主，是目前世界各国分离率最高的菌型之一。能引起各种家禽、犬、猫的副伤寒，表现为胃肠炎或败血症；在牛、羊和马中引起流产和急性胃肠炎；也可引起人类食物中毒。目前世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒是1953年于瑞典由猪肉中的沙门氏菌引起的，造成7717人中毒，90人死亡。因此，对鼠伤寒沙门氏菌进行防治具有重要的公共卫生意义。
目前，预防和控制鼠伤寒沙门氏菌最常用的方法是使用抗生素，但是随着抗生素的滥用，鼠伤寒沙门氏菌的耐药性不断增强，已成为严重的公共卫生问题。因此，亟需研究开发一种新型的产品，以解决抗生素滥用导致的细菌耐药性增强问题。
噬菌体是一类细菌性病毒，其中裂解性噬菌体在感染宿主菌后能快速复制、增殖，并最终裂解细菌从而达到抗菌效果。早在1917年，法裔加拿大微生物学家Felixd Herelle首次发现噬菌体后，科学界就一直尝试将其用于治疗人或动物的细菌性感染；2013年2月由美国Intralytix公司研发的针对沙门菌的噬菌体制剂SalmoFreshTM被美国食品药品监督管理局(FDA)认定为公认安全级产品(GRAS)，并获批准上市。随着经济发展和人们对动物性食品安全问题广泛关注，噬菌体作为一种天然绿色、安全有效的抗生素替代品，具有广阔的应用前景。
然而，大多数噬菌体生物控制研究集中在大肠杆菌、李斯特氏菌和梭菌的控制上，而针对鼠伤寒沙门氏菌能够进行特异性防治的噬菌体的相关报道较少。因此，开发新型对鼠伤寒沙门氏菌具有防治效果的噬菌体具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体。
本发明的另一目的是提供该噬菌体在杀灭畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、养殖器具或养殖空间环境中的鼠伤寒沙门氏菌中的用途。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体，所述噬菌体的分类命名为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella typhimurium phage)ΦSa-1，已于2017年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017217，地址：中国武汉，武汉大学。
本发明的噬菌体分离自粪液污水，噬菌体的形态特征为：该噬菌体具有呈正多面体的头部结构，没有尾部，头部直径约65nm，应属于复层噬菌体科(Tectiviridae)；噬菌体株在固体培养基上可以形成较大空斑，周围有晕环，边缘清晰规则，直径为2～3mm。
上述的噬菌体在制备用于预防和/或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病的药物中的用途也是本发明的保护范围。
本发明的第二方面，提供一种用于预防和/或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物，其包含上述的噬菌体作为有效成分。
上述组合物可以以本发明的噬菌体作为唯一活性成分；还可以含有除本发明的噬菌体以外的其他噬菌体，其与本发明的噬菌体复配使用可以得到与之相当或者更好的防治鼠伤寒沙门氏菌的效果。
上述组合物可以被制备成各种使用形式，如液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂等，经口服、喷雾或注射等方式用于杀灭鼠伤寒沙门氏菌。
本发明的第三方面，提供包含上述噬菌体作为有效成分的饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、清洁剂或消毒剂。
本发明的第四方面，提供利用上述噬菌体或包含上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和/或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病的方法。
上述技术方案具有如下有益效果：
本发明的噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌具有特异性的杀伤活性，能够选择性的杀死特定的致病菌，而不会杀死有益细菌，不会引起药物的抗性。
本发明的噬菌体具有优异的耐酸性和耐热性，可以被制备成饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、清洁剂或消毒剂各种形式的产品，能够在较广的温度范围和pH条件下对鼠伤寒沙门氏菌进行杀灭。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为噬菌体ΦSa-1电镜图；
图2为噬菌体ΦSa-1双层平板；
图3为不同温度对噬菌体ΦSa-1的作用结果；
图4为不同pH条件对噬菌体ΦSa-1的作用结果；
图5为噬菌体ΦSa-1一步生长曲线图；
图6为噬菌体ΦSa-1对小鼠鼠伤寒沙门氏菌感染的预防和治疗效果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对目前禽业养殖中鼠伤寒沙门氏菌引起的疾病并没有有效的控制措施。基于此，本发明提出了一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体及其应用。
在本发明的一种实施方案中，提供了对鼠伤寒沙门氏菌具有特异性杀伤活性的新型噬菌体。
噬菌体是能够感染特定细菌并抑制细菌生长的细菌特异性病毒，并且是包含单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)作为遗传物质的病毒。
具体而言，本发明的噬菌体是由发明人分离自粪液污水的新型噬菌体，该噬菌体具有呈正多面体的头部结构，没有尾部，头部直径约65nm，应属于复层噬菌体科；噬菌体株在固体培养基上可以形成较大空斑，周围有晕环，边缘清晰规则，直径为2～3mm。已于2017年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017217，地址：中国武汉，武汉大学。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种用于预防和/或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物，其包含上述的噬菌体作为有效成分。
由于本发明的噬菌体展现了能够特异性的杀死鼠伤寒沙门氏菌的抗菌活性，因此，本发明的噬菌体能够用于预防和/或治疗由鼠伤寒沙门氏菌的感染引起的疾病。
本文中，术语“预防”指的是通过给动物施用噬菌体作为有效成分的组合物抑制相应疾病或者延缓相应疾病发生的所有措施。
本文中，术语“治疗”指的是通过给动物施用噬菌体作为有效成分的组合物改善或减轻感染性疾病的症状的所有措施。
本文中，术语“鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病”指的是鼠伤寒沙门氏菌感染后的症状，如发烧、头疼、腹泻和呕吐等。
本实施方案中，用于预防和/或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物中，噬菌体的含量为3×109PFU/mL。
根据该实施方案，本发明的组合物中还可以包含其他非致病性的噬菌体，与本发明的噬菌体复配使用，以达到对鼠伤寒沙门氏菌更好的杀灭效果。
本发明的又一种实施方案中，提供饲料添加剂或饮用水添加剂，其包含本发明的噬菌体为有效成分。
饲料用添加剂或饮用水用添加剂可以通过如下来使用：使用本发明的噬菌体或包含其的组合物单独制备饲料用添加剂或饮用水用添加剂，并将饲料或饮用水与添加剂混合，或者在制备饲料或饮用水的过程中直接添加本发明的噬菌体或包含其的组合物。
本实施方案中，饲料用或饮用水用的添加剂的形式为：将所述的噬菌体制备成液体、冻干粉或药片形式，单独使用或与其他噬菌体复配后，经口服、喷雾或注射等方式，用于杀灭畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、养殖器具或养殖空间环境中的鼠伤寒沙门氏菌。
在本发明的再一种实施方案中，提供通过向饲料或饮用水添加包含本发明的噬菌体作为有效成分的饲料用添加剂或饮用水用添加剂。
在该实施方式中使用的饲料不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何饲料；在该实施方式中使用的饮用水不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何饮用水。
在本发明的又一种实施方案中，提供包含本发明的噬菌体作为有效成分的消毒剂或清洁剂。消毒剂或清洁剂的剂型不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何剂型。
为了去除鼠伤寒沙门氏菌，可以将消毒剂喷洒于动物的住处、屠宰场，死亡区域、厨房和烹饪设备，但不限于此。
清洁剂可以被用于洗涤暴露于或有可能暴露于鼠伤寒沙门氏菌的动物的身体部位或真皮的表面上，但不限于此。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：噬菌体的分离制备
本发明中的粪液污水样品采自山东省泰安市农贸市场；
宿主菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028。
在50mL离心管中装入20mL Tris-HCl缓冲液，然后加入少量粪液污水样品，4℃静置过夜。将样品以8000r/min离心10min去除杂质，上清液4000r/min离心10min并以0.22μm微孔滤器过滤得到滤液并保存。
取上述20mL滤液加入20mL TSB培养基中，再加入lmL处于对数生长期的宿主菌悬液，混匀37℃振荡培养过夜。次日8000r/min离心30min，取上清9mL加10mL TSB培养基及宿主菌悬液0.3mL，室温放置lh，37℃振荡(180r/min)3h，取出后再次离心(12000r/min，30min)，将上清液0.3mL和0.3mL宿主菌悬液一并加入3mL 45℃半固体培养基中，充分混匀后，倾倒于固体琼脂培养基上制成双层平板，放置37℃温箱中孵育4-6h，观察噬菌斑生长。
实施例2：噬菌体的扩增培养和纯化
用枪头挑取直径较大的噬菌斑，置于缓冲液中，4℃放置3h，用缓冲液作10倍梯度稀释，双层平板法作单斑培养。从其中挑直径较大的单个噬菌斑于含宿主菌液(菌量约为108CFU/mL)的液体TSB培养基内培养6h作少量增殖，再用双层平板法观察噬菌斑的形态，重复操作3～5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。挑取单个噬菌斑置于缓冲液中，并将其转接入3～5mL TSB培养基中，加入噬菌体宿主菌液0.1mL，混匀，室温作用15min，37℃培养10～14h，12000rpm，4℃，离心10min，取上清，加入0.3％氯仿。
取1mL新鲜培养的宿主菌，加0.1mL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1∶1、1∶10和1∶100的比例)，37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mL TSB液体培养基，再加入CaCl2母液至终浓度1mM，37℃摇振培养12～16h，12000rpm，4℃，离心10min，取上清，得到噬菌体裂解液。
在裂解液中分别加入RNaseA、DNaseⅠ至1μg/mL，37℃温育30min；加9.3g PEG8000，5.8gNaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000rpm10min，去上清液；加2mL SM液，充分洗涤管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃，5000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(图2)。
纯化的噬菌体在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2017217，保藏日期为2017年4月28日，保藏单位地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072。
该保藏的噬菌体具有以下微生物学特征：
1.形态学特性
在透射电子显微镜下观察噬菌体颗粒(见图1)，该噬菌体具有呈正多面体的头部结构，没有尾部，头部直径约65nm，应属于复层噬菌体科。
2.培养学特性
噬菌体菌株在固体培养基上可以形成较大空斑，周围有晕环，边缘清晰规则，直径为2～3mm(见图2)。
实施例3：温度及pH对噬菌体稳定性的影响
各取0.5mL109PFU/mL的噬菌体液于无菌EP管中，分别于30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃的水浴中作用60min，待作用时间结束后取样，并立即将样品置于水浴中冷却，经过稀释后测定噬菌体的效价。结果见图3，鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ΦSa-1经30℃、40℃、50℃、60℃处理1h后效价基本不变，70℃处理1h后效价下降了1个数量级，80℃处理1h后效价下降了2个数量级，90℃处理1h后全部失活。
取无菌EP管加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)的液体TSB900μL，然后将上述EP管置于37℃的水浴中，待温度平衡后加入100μL 109PFU/mL的噬菌体液混匀，37℃作用2h。每管各取样测定噬菌体的效价。结果见图4，鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ΦSa-1在pH值为2-10的范围内存活率较高，在pH值为1和11时全部失活，总体上来看鼠伤寒沙门氏菌噬菌体对pH值的耐受范围比较宽。
实施例4：噬菌体ΦSa-1最佳感染复数实验
培养宿主菌至对数生长期，按照感染复数分别为0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001的比例，加噬菌体液和宿主菌至液体TSB中，37℃振荡培养3.5h，4000rpm离心30min去除菌体，测定上清液中噬菌体的滴度，以产生最高滴度的感染复数为最佳感染复数。结果见表1。噬菌体ΦSa-1在感染复数为0.0001时所产生子代噬菌体的滴度最高，为4.1×1010PFU/mL，表明噬菌体ΦSa-1最佳感染复数为0.0001。
表1ΦSa-1最佳感染复数试验
实施例5：噬菌体ΦSa-1一步生长曲线测定
一步生长曲线的测定采用Lur等改进的方法。将噬菌体(3×104PFU/mL)和宿主菌(3×108CFU/mL)各400μL至40mL液体TSB中，37℃孵育10min，迅速置于37℃、180rpm振荡培养，同时开始计时，在0时刻和每隔20min取样，测定噬菌体的滴度。以感染时间为横坐标，噬菌体滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线。结果见图5，噬菌体ΦSa-1感染宿主菌的潜伏期为20min左右，爆发时间为180min左右，爆发量为43333PFU/cell。爆发量＝爆发末期噬菌体滴度(1.3×1011PFU/mL)/初期宿主菌浓度(3×106CFU/mL)。
实施例6：噬菌体ΦSa-1宽宿主谱检测
试验选择18株细菌(包括沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌)对噬菌体ΦSa-1的宿主谱进行分析。具体操作如下：分别取18株细菌的过夜培养物100μL，滴加在1.5％TSB-YE平板(针对沙门氏菌)或1.5％LB平板(针对大肠杆菌和志贺氏菌)中央，用涂棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域，取10μL噬菌体ΦSa-1滴加在菌苔表面，另一个区域滴加10μL生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12～16h，观察结果。
结果表明(表2)：试验选择的细菌菌液在平板上均生长良好。滴加噬菌体ΦSa-1的区域在ATCC 13311生长的平板出现不长细菌的透明区域，并且对所收集的18株细菌中的10株有裂解作用，裂解率为55.55％。说明分离到的噬菌体ΦSa-1是一种宽宿主谱的噬菌体。
表2噬菌体ΦSa-1噬菌谱检测
实施例7：噬菌体在小鼠上的安全性实验
选用雌性BALB/c小鼠(20～22克)20只，预饲两天后随机分为2组(噬菌体组、对照组)，每组10只。噬菌体组采用腹腔注射的方式接种0.3mL噬菌体ΦSa-1，剂量为2.25×109PFU/kg；对照组接种0.3mL生理盐水；连续观察15d，分别在处理后第1天和第15天检测小鼠盲肠内噬菌体含量及内脏情况。
观察结果显示，此剂量的噬菌体ΦSa-1对小鼠日常行为没有影响，处理后第一天各组小鼠盲肠pH值相差不大(见表3)，噬菌体组盲肠内容物噬菌体效价为1.6×103PFU/g；处理后第十五天噬菌体组盲肠内容物已检测不到噬菌体的效价；说明噬菌体ΦSa-1进入小鼠体内后会逐渐排出体外，不会引起残留。各组小鼠解剖检查未见异常。
表3各组小鼠盲肠内容物检测结果
实施例8：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028最小致死剂量的确定
选用雌性BALB/c小鼠(20～22克)40只，共设4组，每组10只小鼠。每个试验组分别腹腔注射0.3mL不同剂量的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028(6.5×108CFU/只；3.25×108CFU/只；6.5×107CFU/只)；对照组注射0.3mL的生理盐水。定期观察小鼠的死亡个数，将导致一组小鼠全部死亡的最小剂量定为最小致死量(MLD)。
结果显示，用高剂量(6.5×108CFU/只)和中剂量(3.25×108CFU/只)的鼠伤寒沙门氏菌腹腔感染小鼠时可以在3d内使小鼠的死亡率达到100％，而当腹腔注射低剂量(6.5×107CFU/只)的鼠伤寒沙门氏菌时，小鼠的死亡率为60％。因此，可以确定鼠伤寒沙门氏菌的MLD为3.25×108CFU/只。
实施例9：噬菌体ΦSa-1对小鼠鼠伤寒沙门氏菌感染的预防和治疗实验
选用雌性BALB/c小鼠(20～22克)40只，分为治疗组(Treatment group)、阳性对照组(Positive control group)、预防组(Preventive group)和空白对照组(Blankcontrol)4组，每组10只。其中，治疗组小鼠右侧腹腔按3.25×108CFU/只接种0.3mL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，5min后，对小鼠左侧腹腔按109PFU/只接种0.3mL噬菌体ΦSa-1；阳性对照组小鼠右侧腹腔按3.25×108CFU/只接种0.3mL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，左侧腹腔接种0.3mL生理盐水；预防组小鼠左侧腹腔按109PFU/只接种0.3mL噬菌体ΦSa-1，1个小时后对小鼠右侧腹腔按3.25×108CFU/只接种0.3mL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028。空白对照组小鼠左右侧腹腔分别接种0.3mL生理盐水。对小鼠进行全天候监视，观察临床表现，记录死亡时间，统计存活率。试验期为攻毒后的14天。
结果见图6，处理14天后，阳性对照组小鼠存活率为0％，预防组小鼠存活率为90％，治疗组小鼠存活率为80％。说明与阳性对照组相比，预防组和治疗组都对小鼠抵抗沙门氏菌感染有一定的作用。其中预防组的效果要优于治疗组。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一株具有鼠伤寒沙门氏菌防治效果的噬菌体，所述噬菌体的分类命名为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体（Salmonella typhimuriumphage）ΦSa-1，已于2017年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017217，地址：中国武汉，武汉大学。
2.权利要求1所述的噬菌体在制备用于预防和/或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病的药物中的用途。
3.一种用于预防和/或治疗由鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病的组合物，其包含权利要求1所述的噬菌体作为有效成分。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。
5.一种饲料添加剂，其包含权利要求1所述的噬菌体作为有效成分。
6.一种饲料，其包含权利要求5所述的饲料添加剂。
7.一种饮用水添加剂，其包含权利要求1所述的噬菌体作为有效成分。
8.一种饮用水，其包含权利要求7所述的饮用水添加剂。
9.一种消毒剂或清洁剂，其包含权利要求1所述的噬菌体作为有效成分。
10.权利要求1所述的噬菌体或权利要求3所述的组合物在制备用于杀灭畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、养殖器具或养殖空间环境中的鼠伤寒沙门氏菌的饲料添加剂、饲料、饮用水添加剂、饮用水、消毒剂或清洁剂中的用途。
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