JP6069533B2 - 新規のバクテリオファージ及びこれを含む抗菌組成物 - Google Patents

Description

本発明は、鳥類病原性大腸菌に特異的な死滅効果を奏する新規のバクテリオファージ及びこれを含む抗菌組成物に関する。また、本発明は、前記新規のバクテリオファージ又は前記抗菌組成物を用いて鳥類の疾病を予防又は治療する方法に関する。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ」ともいう）は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属するグラム陰性の短桿菌で、哺乳動物をはじめ様々な動物の腸管内に存在する正常細菌叢の一つである。ほとんどの大腸菌は、日和見感染を誘発することもあるが、非病原性である。しかしながら、一部の高病原性菌株は、ヒトをはじめ動物内で様々な腸疾患及び敗血症などを誘発することが知られている。

このような大腸菌のうち、特に、鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＰＥＣ）は、鳥類、例えば、ニワトリ、カモ、シチメンチョウなどの呼吸器を介して感染する大腸菌であって、呼吸器粘膜を介して体内に侵入することが知られている。前記鳥類病原性大腸菌は、鳥類内に敗血症、肉芽腫、気嚢炎、卵管炎、関節炎などの様々な疾病を誘発し、特に、呼吸器性疾病に関しては、家禽類に主に発病することなどにより、家禽産業に莫大な経済的被害をもたらし、問題となっている。

一方、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は、特定の細菌に感染して細菌の成長を抑制し、阻害する細菌特異的ウイルスを意味する。バクテリオファージは、抗生剤に比べて宿主特異性が強いだけでなく、近年、抗生剤の使用に対する耐性菌出現の問題が深刻になるにつれて、その活用への関心が高まっている（非特許文献１及び２）。

そこで、世界各国においてバクテリオファージに関する研究が活発に行われており、バクテリオファージに関する特許出願は勿論、これを活用した組成物に対してアメリカ食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）の承認などを取得するための動きが増加している。

バクテリオファージに関する先行技術として特許文献１には、Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７：Ｈ菌を統制するための７種のバクテリオファージについて開示されており、特許文献２には、黄色ブドウ球菌に特異的な死滅効果を奏するバクテリオファージについて開示されている。特許文献３には、細菌細胞膜のペプチドグリカン構造物を特異的に破壊するバクテリオファージ由来溶菌タンパク質及びこれによる細菌破砕物について開示されている。

しかし、前記のような先行技術があるにもかかわらず、養鶏をはじめ鳥類の飼育において重要な問題となっている鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防及び／又は治療するためのバクテリオファージ関連先行技術は依然として足りておらず、そのため、このようなバクテリオファージ及びその関連技術の開発が求められている。

米国特許第６４８５９０２号明細書 韓国特許第１０−０９１０９６１号公報 韓国公開特許第１０−２００９−００２１４７５号公報

Cislo M, et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. 2:175-183, 1987 Sung Hun Kimら、バクテリオファージ、新たな代替抗生剤.BioWave Vol.7 No.15, 2005, BRIC

本発明者らは、抗生剤の使用による耐性菌の出現及び抗生剤の肉類内の残留問題などを解決し、鳥類の感染性疾病を効率よく予防及び治療するために鋭意研究を重ねた結果、家禽類の呼吸器性疾病を起こす鳥類病原性大腸菌に対して特異的な死滅効果を奏する新規のバクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）を自然界から分離するに至った。

また、本発明者らは、前記新規のバクテリオファージの形態的、生化学的、遺伝子的特性を同定し、前記バクテリオファージが耐酸性及び耐熱性などに優れることを確認して、これを活用した抗生剤、消毒剤、飼料添加剤、その他の組成物を開発し、さらに、鳥類に発病する感染性疾病の予防又は治療のための組成物及びこれを用いた疾病の予防又は治療方法を開発した。

本発明は、鳥類病原性大腸菌に特異的な死滅効果を奏する新規のバクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）を有効成分として含む鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防及び／又は治療用組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）を有効成分として含む抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、消毒剤又は洗浄剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を用いて、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防及び／又は治療する方法を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的な死滅効果を奏する新規のバクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）を提供する。

本発明の他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）を有効成分として含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明のさらに他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）を有効成分として含む抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、消毒剤又は洗浄剤を提供する。

本発明のさらに他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を鳥類に投与する段階を含む鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法を提供する。

本発明のバクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）は、鳥類病原性大腸菌を特異的に死滅させる効果を奏する。

また、本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）は、耐酸性、耐熱性及び耐乾燥性に優れ、様々な温度及びｐＨ範囲で鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用物質として活用されるだけでなく、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、消毒剤及び洗浄剤などに活用されることができるという効果を奏する。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を鳥類に投与することで、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する効果を奏する。

新規のバクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）（以下、「ΦＣＪ２３」ともいう）の電子顕微鏡写真である。 新規のバクテリオファージΦＣＪ２３のＰＦＧＥ結果を示す図である。 新規のバクテリオファージΦＣＪ２３のＳＤＳ-ＰＡＧＥ結果を示す図である。 新規のバクテリオファージΦＣＪ２３の耐酸性実験結果を示すグラフである。 新規のバクテリオファージΦＣＪ２３の耐熱性実験結果を示すグラフである。

以下、本発明についてより詳細に説明する。本明細書に記載されていない内容は、当該技術分野又は類似分野における当業者であれば、十分に認識して類推することができるため、その説明を省略する。

具体的には、本発明の一態様は、鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ＡＰＥＣ）に特異的な死滅効果を奏する新規のバクテリオファージΦＣＪ２３（ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ）を提供する。

鳥類病原性大腸菌は、ニワトリ、カモ、シチメンチョウなどの鳥類の呼吸器を介して感染する大腸菌であって、呼吸器粘膜を介して鳥類の体内に侵入して、敗血症、肉芽腫、気嚢炎、卵管炎、関節炎などの様々な疾病を誘発する大腸菌である。前記鳥類病原性大腸菌は、一般の大腸菌のようにグラム陰性の桿菌であり、周毛性鞭毛があることから運動性があり、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を分解して、酸とガスを生成する好気性又は通性嫌気性菌である。

前記鳥類病原性大腸菌は、普通の培地でもよく育ち、約７℃〜４８℃の温度で発育可能で、発育最適温度は約３５℃〜３７℃である。特に、鳥類の体温に近い約４２℃で病原因子を効果的に発現させることができる。また、鳥類病原性大腸菌は、ｐＨ４．５〜ｐＨ９．０の範囲で発育可能である。

バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は、特定の細菌に感染して当該細菌の成長を抑制し阻害する細菌特異的ウイルスであり、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又はＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を遺伝物質として含むウイルスを意味する。

本発明のバクテリオファージΦＣＪ２３は、鳥類病原性大腸菌に選択的に感染する種特異性を有するバクテリオファージであって、正２０面体のカプシド（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｃａｐｓｉｄ）を有し、尾（ｔａｉｌ）が観察されない構造（図１）の、形態学的にポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するバクテリオファージである。バクテリオファージΦＣＪ２３の塩基配列と異なるバクテリオファージの塩基配列解読の相同性を比較した結果は、表２の通りである。バクテリオファージΦＣＪ２３の耐酸性においては、ｐＨ３．５〜ｐＨ１１．０まで活性を失わず、安定しており（図４）、耐熱性においては、６０°で１時間暴露する際に１ログ（ｌｏｇ）以上減少しなかった。

前記バクテリオファージΦＣＪ２３は、本発明者らが新規分離したバクテリオファージであって、２０１３年１月３０日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ１１３６５Ｐで寄託された。

本発明の他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物を提供する。

前記バクテリオファージΦＣＪ２３は、鳥類病原性大腸菌を特異的に死滅させることができる抗菌活性を示すことから、鳥類病原性大腸菌による感染によって誘発される疾病を予防又は治療することを目的として用いることができる。前記鳥類病原性大腸菌感染性疾病の例として、好ましくは、鳥類大腸菌症（Ａｖｉａｎ ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）が挙げられるが、これに制限されるものではない。

前記鳥類大腸菌症とは、鳥類の呼吸器などが病原性大腸菌に感染して発生する疾病であって、その症状として、気嚢炎（ａｉｒｓａｃｃｕｌｉｔｉｓ）、肝周囲炎（ｐｅｒｉｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、腹膜炎（ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ）、心膜炎（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｔｉｓ）、卵管炎（ｓａｌｐｉｎｇｉｔｉｓ）、臍炎（ｏｍｐｈａｌｉｔｉｓ）、骨髄炎（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）又は敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）など、様々な病変を示し、感染した鳥類の成長低下及び斃死を誘発する疾病である。前記鳥類は、ニワトリ、カモ及びシチメンチョウからなる群から選択される１種以上を含み、これに制限されない。

本発明で使用される用語「予防」とは、前記バクテリオファージΦＣＪ２３及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む組成物を対象体に提供して、前記疾病を抑制させるか発病を遅延させるすべての行為を意味する。

本発明で使用される用語「治療」とは、前記バクテリオファージΦＣＪ２３及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む組成物を対象体に提供して、既に感染した前記疾病の症状を好転又は改善するすべての行為を意味する。

本発明の前記鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物は、好ましくは、前記バクテリオファージΦＣＪ２３を５×１０²〜５×１０¹²ｐｆｕ／ｍｌ含有してもよく、より好ましくは、前記バクテリオファージΦＣＪ２３を１×１０⁶〜１×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌ含有してもよい。

本発明の前記鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよく、前記担体とともに製剤化して、食品、医薬品、飼料添加剤又は飲用水添加剤などとして提供することができる。本発明で使用される用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激することなく、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。

本発明において使用可能な前記担体の種類は特に制限されず、当該技術分野において通常使用され、薬学的に許容される担体であればいずれも使用可能である。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。これらは、単独で使用するか、２種以上を混合して使用してもよい。

また、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び／又は静菌剤など、他の通常の添加剤を添加して使用してもよく、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び／又は潤滑剤などを付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤などに製剤化して使用してもよい。

本発明の前記鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物の投与方式は、特に制限されず、当該技術分野において通常使用する方式に従ってもよい。前記投与方式の非制限的な例として、組成物を経口投与又は非経口投与方式で投与してもよい。

前記経口投与用剤形の非制限的な例としては、トローチ（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、錠剤、水溶性懸濁液、油性懸濁液、調剤粉末、顆粒、エマルジョン、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップ又はエリキシル剤などが挙げられる。

本発明の組成物を錠剤又はカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ）、ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（Ｍａｎｎｉｔｏｌ）、デンプン、アミロペクチン（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）又はゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）などの結合剤；リン酸二カルシウム（ｄｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの賦形剤；トウモロコシデンプン又はサツマイモデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、ステアリン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、フマル酸ステアリルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｙｌ ｆｕｍａｒａｔｅ）又はポリエチレングリコールワックス（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｗａｘ）などの潤滑油などを含んでもよく、カプセル剤形の場合、上述の物質の他にも脂肪油のような液体担体などをさらに含んでもよい。

本発明の組成物を非経口投与する方法としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与又は局所投与などを利用してもよく、前記組成物を疾患部位に塗布するか噴霧する方法を利用してもよいが、これらに制限されるものではない。

前記非経口投与のための剤形としては、例えば、皮下注射、静脈注射又は筋肉内注射などの注射用形態；坐剤注入方式；又は呼吸器を介して吸入を可能とするエアロゾール剤などのスプレー用に製剤化してもよいが、これらに制限されない。前記注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤又は緩衝剤とともに水に混合して溶液又は懸濁液を製造し、これをアンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）又はバイアル（ｖｉａｌ）の単位投与用に製剤化してもよい。前記エアロゾール剤などのスプレー用に剤形化する場合、水分散された濃縮物又は湿潤粉末が分散されるように推進剤などが添加剤とともに配合されてもよい。

本発明の前記鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物の好適な塗布、噴霧又は投与量は、前記組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間及び／又は投与経路は勿論、投与対象となる動物の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食事内容、排泄速度などの要因に応じて様々であり、通常、熟練した獣医であれば、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定し、処方することができる。

本発明のさらに他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む抗生剤を提供する。

本発明に使用される用語「抗生剤」とは、薬剤形態でヒトを含む対象体に提供されて菌を死滅させることができる効能を有する製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤及び抗菌剤を総称する概念に該当する。

本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む抗生剤は、従来の抗生剤に比べて鳥類病原性大腸菌に対する特異性が非常に高いので、有益バクテリアを殺すことなく特定の病源菌のみを死滅させることができ、薬物耐性を誘導せず、従来の抗生剤に比べて製品の寿命を延長させた新規抗生剤として提供されるという利点がある。

本発明のさらに他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む鳥類用、特に家禽類用飼料添加剤又は飲用水添加剤を提供する。

本発明で使用される用語「家禽類」とは、家畜のうち鳥類に属する動物を網羅する概念である。前記家禽類は、特に制限されないが、好ましくは、ニワトリ、カモ及びシチメンチョウからなる群から選択される１種以上を含んでもよい。

本発明の前記鳥類用飼料添加剤又は飲用水添加剤は、前記バクテリオファージΦＣＪ２３又はこれを含む組成物を飼料添加剤又は飲用水添加剤の形態に個別に製造して飼料又は飲用水に混合する方式で使用されるか、前記バクテリオファージΦＣＪ２３又はこれを含む組成物を飼料又は飲用水を製造する際に直接添加する方式で使用することができる。

本発明の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤として使用される前記バクテリオファージΦＣＪ２３及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を含む組成物は、液状又は乾燥状であってもよく、好ましくは、乾燥した粉末状であってもよい。

本発明の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤を乾燥した粉末状に製造するための乾燥方法は、特に制限されず、当該技術分野において通常使用する方法に従うことができる。前記乾燥方法の非制限的な例としては、気送乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。これらは、単独で使用されるか、２種以上の方法をともに利用する方式で行われてもよい。

本発明の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤には、非病原性の他の微生物がさらに添加されてもよい。添加可能な前記微生物の非制限的な例としては、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素及び／又は糖転移酵素を生産できるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの枯草菌；ウシの胃のような嫌気的条件で生理的活性及び有機物分解能を有するラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株；家畜の体重を増加させ、牛乳の乳量を増加させ、飼料の消化吸収率を高める効果を奏するアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などの糸状菌；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母からなる群から選択されてもよい。これらは単独で使用されるか、２種以上を混合して使用されてもよい。

本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤は、必要に応じて、その他の添加剤をさらに含んでもよい。使用可能な前記添加剤の非制限的な例としては、飼料又は飲用水の品質低下を防止するために添加する結着剤、乳化剤、保存剤など；飼料又は飲用水の効用増大のために添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤又はオリゴ糖などがあり、その他に、飼料混合剤などをさらに含んでもよい。これらは、単独で使用されるか、２種以上がともに添加されてもよい。

本発明の前記飼料添加剤は、飼料１００重量部に対して、好ましくは０．０５〜１０重量部含有されてもよく、より好ましくは、０．１〜２重量部含有されてもよい。本発明の前記飲用水添加剤は、飲用水１００重量部に対して、好ましくは０．０００１〜０．０１重量部含有されてもよく、より好ましくは、０．００１〜０．００５重量部含有されてもよい。前記範囲内で鳥類病原性大腸菌に対するバクテリオファージΦＣＪ２３の活性が十分に発揮されるという利点がある。

本発明のさらに他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤を添加するか、前記バクテリオファージΦＣＪ２３を直接添加して製造された飼料又は飲用水を提供する。

本発明で使用される飼料は、特に制限されず、当該技術分野において通常使用される飼料を使用することができる。前記飼料の非制限的な例としては、穀物類、根菜類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、デンプン類、ウリ類又は穀物副産物類などの植物性飼料；タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性油、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類又は飲食物などの動物性飼料が挙げられる。これらは、単独で使用されるか、２種以上を混合して使用されてもよい。

本発明で使用される飲用水は、特に制限されず、当該技術分野において通常使用される飲用水を使用することができる。

本発明のさらに他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む消毒剤又は洗浄剤を提供する。前記消毒剤又は洗浄剤の剤形は、特に制限されず、当該技術分野における周知の剤形に製造されて使用することができる。

前記消毒剤は、鳥類病原性大腸菌を除去するために撒布することができ、鳥類の活動領域、屠殺場、斃死地域、調理場所又は調理設備などに撒布することができるが、これらに制限されない。

前記洗浄剤は、鳥類病原性大腸菌に暴露しているか暴露する可能性のある鳥類の皮膚の表面又は身体の各部位などを洗浄するために使用することができるが、これに制限されない。

本発明のさらに他の一態様によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２３又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む組成物を用いて、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法を提供する。

本発明の前記予防又は治療方法は、具体的には、鳥類病原性大腸菌に感染しているか、感染する可能性のある鳥類に、前記バクテリオファージΦＣＪ２３又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む組成物を薬学的に有効な量で投与する段階を含む。前記バクテリオファージΦＣＪ２３又はこれを含む組成物の好適な１日総使用量は、正しい医学的判断範囲内で獣医によって決定することができ、これは、当該技術分野における通常の知識を有する者にとって自明な事項である。

特定の鳥類に対する前記バクテリオファージΦＣＪ２３又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む組成物の具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、当該個体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別又は食餌は勿論、前記バクテリオファージΦＣＪ２３又はこれを含む組成物の投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間などを考慮して決定することができ、同時又は異時にともに使用される薬物のその他の組成物の成分などをはじめとした様々な因子及び医薬分野において周知の類似因子に応じて様々である。

本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２３又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む組成物は、薬学的製剤の形態で鳥類に噴霧式に経鼻投与されるか、鳥類の飼料又は飲用水に直接添加して、これを摂食させる方式で投与してもよく、飼料添加剤又は飲用水添加剤の形態で飼料又は飲用水に混合して投与してもよい。

本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２３又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む組成物の投与経路及び投与方式は、特に制限されず、目的とする当該組織に前記バクテリオファージΦＣＪ２３又はこれを含む組成物が到達し得る限り、任意の投与経路及び投与方式に従ってもよい。すなわち、前記バクテリオファージΦＣＪ２３又は前記バクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む組成物は、経口又は非経口の様々な経路を介して投与されてもよく、その投与経路の非制限的な例としては、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻噴投与又は吸入などが挙げられる。

以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
鳥類病原性大腸菌に感染するバクテリオファージの分離

＜実施例１−１＞
バクテリオファージのスクリーニング及び単一バクテリオファージの分離
韓国忠清南道保寧市所在のカモ農場の農場地域の糞便及び環境サンプルから取得した試料５０ｍｌを４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上澄み液を０．４５μｍのフィルターで濾過して試料液を準備し、これを用いてソフトアガーオーバーレイ（ｓｏｆｔ ａｇａｒ ｏｖｅｒｌａｙ）方法を行った。前記ソフトアガーオーバーレイ方法とは、トップアガー（ｔｏｐ ａｇａｒ、０．７％の寒天を用いて固体培地上に付着させること）で成長する宿主細胞を用いてバクテリオファージが溶菌することを観察する方法を意味する。

具体的には、韓国の建国大学の獣医科大学で入手した鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）振とう培養液（ＯＤ₆₀₀＝２）１５０μｌと１０×ＬＢ培地（トリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎｅ）１０ｇ／ｌ；酵母抽出物５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）２ｍｌに前記試料濾過液１８ｍｌを混合し、これを３７℃で１８時間培養した後、前記培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してその上澄み液を０．４５μｍのフィルターで濾過した。次に、ＬＢ平板培地上に０．７％（ｗ／ｖ）の寒天３ｍｌと鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）振とう培養液（ＯＤ₆₀₀＝２）１５０μｌの混合液を注液して固めた後、その上に前記試料液１０μｌを滴下し、３７℃で１８時間培養して、溶菌斑が形成されることを確認した。

一つの溶菌斑には一種のバクテリオファージが存在することが知られているため、上記のようにして形成された溶菌斑から単一バクテリオファージを分離した。具体的には、前記溶菌斑を４００μｌのＳＭ溶液（ＮａＣｌ ５．８ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ ２ｇ／ｌ；１Ｍ Ｔｒｉｓ‐Ｃｌ（ｐＨ７．５） ５０ｍｌ）に加え、室温で４時間放置してバクテリオファージ溶液を取得した。

次に、前記バクテリオファージ溶液１００μｌを０．７％（ｗ／ｖ）の寒天１２ｍｌ及び鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）振とう培養液（ＯＤ₆₀₀＝２）５００μｌと混合し、１５０ｍｍ直径のＬＢ平板培地を用いたソフトアガーオーバーレイ方法を行い、完全に溶菌されるまで培養した。培養が終了した後、前記ＬＢ平板培地に１５ｍｌのＳＭ溶液を加え、室温で４時間放置してバクテリオファージ溶液を取得した。

前記溶液を回収し、１％（ｖ／ｖ）のクロロホルムを加えた後、１０分間混合し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を取得し、前記上澄み液を０．４５μｍのフィルターで濾過して最終の試料を取得した。

＜実施例１−２＞
バクテリオファージの大量培養及び精製
前記実施例１−１で取得したバクテリオファージを鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）を用いて大量培養し、これによりバクテリオファージを精製した。

具体的には、鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）を振とう培養して１．５×１０¹⁰ｃｆｕになるように分注し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、これを４ｍｌのＳＭ溶液に再懸濁した。これに前記バクテリオファージを１．５×１０⁶ｐｆｕで接種し、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．０００１に滴定した後、常温で２０分間静置した。

次に、これを１５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で６時間培養した。培養が終了した後、最終体積の１％（ｖ／ｖ）になるようにクロロホルムを添加して２０分間撹拌し、制限酵素であるＤＮａｓｅ ＩとＲＮａｓｅ Ａをそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加し、３０℃で３０分間静置した。次に、最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）になるようにＮａＣｌとポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）を加えて４℃で３時間さらに静置した後、４℃で１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して沈殿物を取得した。

上記のようにして取得した沈殿物を５ｍｌのＳＭ溶液に懸濁し、２０分間室温で静置した後、４ｍｌのクロロホルムを加えて撹拌し、４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してその上澄み液を取得した。前記上澄み液を０．４５μｍのフィルターで濾過した後、グリセロール密度勾配法（密度：４０％、５％グリセロール）を用いた超遠心分離（３５０００ｒｐｍ、１時間、４℃）を行い、バクテリオファージを精製した。

本発明者らは、農場の糞便サンプルから試料を採取し、ＡＰＥＣに対して特異的な死滅効果を奏する前記バクテリオファージを「ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅΦＣＪ２３」と称し、２０１３年１月３０日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１３６５Ｐ号で寄託した。

＜実施例２＞
ΦＣＪ２３の鳥類病原性大腸菌感染性の比較
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２３が鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）以外の他の大腸菌に対しても溶菌活性を示すかを確認するために交差感染を行った。

具体的には、韓国の建国大学の獣医科大学で入手した野生分離株のうち、鳥類病原性大腸菌の２種（Ｅ１０−４及びＥ０９−３５）と非病原性大腸菌の６種（Ｅ０９−１、Ｅ０９−１０、Ｅ０９−１３、Ｅ０９−１４、Ｅ０９−１５、Ｅ０９−１６）をそれぞれ培養してその培養液を取得した後、これらの培養液のそれぞれと、上記のようにして精製したΦＣＪ２３を用いたソフトアガーオーバーレイ方法を行い、溶菌斑が形成されるか否かを確認した。

その結果を下記表１に示す。

前記表１に示されたように、実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２３は、非病原性大腸菌に対しては溶菌活性を示さないことを確認することができた。

＜実施例３＞
ΦＣＪ２３の形態観察
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２３を０．０１％のゼラチン溶液に希釈し、２．５％のグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液で固定した。これを炭素コーティングされた雲母板（ｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃａ ｐｌａｔｅ（およそ２．５ｍｍ×２．５ｍｍ））に滴下して１０分間適応させた後、滅菌蒸留水で洗浄した。

次に、炭素被膜（ｃａｒｂｏｎ ｆｉｌｍ）を銅グリッド（ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄ）で挟んで４％の酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で３０秒〜６０秒間染色し、乾燥した後、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１０１１、８０ｋＶ、倍率；１２００００〜２０００００倍）で検鏡した（図１）。

図１は、バクテリオファージΦＣＪ２３の電子顕微鏡写真を示す図であり、約４０ｎｍサイズの正２０面体のカプシドを有し、尾のない形態型を示すことから見て、形態学的にポドウイルス科に属するものと判断された。

＜実施例４＞
ΦＣＪ２３の全体ゲノムＤＮＡのサイズ分析
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２３からゲノムＤＮＡを抽出した。

具体的には、精製されたバクテリオファージΦＣＪ２３培養液に２０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、５０μｇ／ｍｌのタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）及び０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）を加えて５０℃で１時間静置し、同一体積のフェノール（ｐＨ８．０）を加えて撹拌した後、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を取得した。

前記上澄み液を同一体積のＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）と混合し、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を取得した。前記上澄み液を同一体積のクロロホルムと混合し、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄み液を取得した。前記上澄み液に３Ｍの酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）を全体体積の１０％（ｖ／ｖ）になるように加えて混合し、２倍の体積の冷たい９５％エタノールを加えて混合した後、−２０℃で１時間静置した。

次に、０℃で１０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を除去して沈殿物を取得した後、これに５０μｌのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて溶解した。上記の抽出したＤＮＡを１０倍希釈してＯＤ₂₆₀で吸光度を測定し、濃度を測定した。

次に、１μｇのＤＮＡを１％ＰＦＧＥ（ｐｕｌｓｅ−ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）アガロースゲルにロードし、バイオ・ラッド（ＢＩＯＲＡＤ）ＰＦＧＥシステムの７番プログラム（サイズ範囲２５ｋｂ〜１００ｋｂ；スイッチタイムランプ（ｓｗｉｔｃｈ ｔｉｍｅ ｒａｍｐ）０．４秒〜２．０秒、線形（ｌｉｎｅａｒ ｓｈａｐｅ）；順方向電圧（ｆｏｒｗａｒｄ ｖｏｌｔａｇｅ）１８０Ｖ；逆方向電圧（ｒｅｖｅｒｓｅ ｖｏｌｔａｇｅ）１２０Ｖ）を用いて、常温で２０時間展開した（図２）。

図２はバクテリオファージΦＣＪ２３のゲノムＤＮＡの電気泳動写真であって、バクテリオファージΦＣＪ２３のゲノムＤＮＡは、約７１ｋｂｐのサイズを示すことを確認することができた。

＜実施例５＞
ΦＣＪ２３のタンパク質パターンの分析
１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌタイター（ｔｉｔｅｒ）の精製されたバクテリオファージΦＣＪ２３溶液１５μｌと５×ＳＤＳ試料溶液３μｌを混合して５分間沸騰した後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３）。

図３はバクテリオファージΦＣＪ２３を対象として行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動写真であって、約４０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び５３ｋＤａサイズの主要タンパク質を確認することができた。

＜実施例６＞
ΦＣＪ２３の遺伝子的特性の分析
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２３の遺伝子的特性を分析するために、バクテリオファージΦＣＪ２３のＤＮＡを遺伝子分析機器ＦＬＸチタンシーケンサー（ｔｉｔａｎｉｕｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）(Ｒｏｃｈｅ)を使用して分析した。（株）マクロジェン(Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．)でＧＳとデ・ノボアセンブリーソフトウェア（ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ）(Ｒｏｃｈｅ）を使用して遺伝子を組み合わせた。転写解読枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）は、ＧｅｎｅＭＡｒｋ．ｈｍｍ、Ｇｌｉｍｍｅｒ ｖ３．０２及びＦＧＥＮＥＳＢソフトウェアを使用して行われた。ＢＬＡＳＴＰとインタープロスキャン（ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ）プログラムを使用して転写解読枠の名称を注釈付け（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）した。

前記バクテリオファージの塩基配列は、既に報告されているバクテリオファージの塩基配列と様々な類似性を示したが、すべての断片が１００％一致するバクテリオファージはないことが確認された。従って、前記バクテリオファージは、新規分離したバクテリオファージであることを確認することができた。

下記表２は、バクテリオファージΦＣＪ２３の塩基配列と他のバクテリオファージの塩基配列解読の相同性を比較した結果を示すものである。

＜実施例７＞
ｐＨによるΦＣＪ２３の安定性の調査
バクテリオファージΦＣＪ２３が胃内の低いｐＨで安定性を有することができるかを確認するために、様々なｐＨ範囲（ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、７．５、８．３、９．２及び１１．０）で安定性調査の実験を実施した。

実験のために様々なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ２．１、ｐＨ４．０、ｐＨ５．５及びｐＨ６．４）、酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ２．５、ｐＨ３．０及びｐＨ３．５）、リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．９及びｐＨ７．４）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．２、ｐＨ９．０、ｐＨ９．８及びｐＨ１１．０））をそれぞれ０．２Ｍで作製した。

前記各ｐＨ溶液９０μｌと２．０×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌタイターのバクテリオファージ溶液１０μｌを混合して各ｐＨ溶液の濃度を１Ｍとした後、２時間常温で静置した。対照群は、同一の方法で２．０×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌのバクテリオファージ溶液２０μｌをＳＭ溶液１８０μｌに混合した後、２時間常温で静置した。次に、これらを段階希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液を１０μｌずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して、溶菌したか否かに応じてタイターを測定した（図４）。

図４はバクテリオファージΦＣＪ２３の耐酸性実験の結果を示す図である。図４に示すように、対照群と比較してバクテリオファージΦＣＪ２３はｐＨ３．５からｐＨ１１．０まで活性を失わず、安定していることを確認することができた。

＜実施例８＞
温度によるΦＣＪ２３の安定性の調査
バクテリオファージの製品剤形のうち飼料添加剤として利用する場合、バクテリオファージの剤形の製剤過程で発生する熱に対する安定性を確認するための実験を行った。具体的には、６．５×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌ濃度のバクテリオファージΦＣＪ２３の溶液１００μｌを６０℃で３０分間静置した後、前記実験培養液を段階希釈してソフトアガーオーバーレイ方法で各段階の希釈液１０μｌずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌されるか否かに応じてタイターを測定した（図５）。

図５はバクテリオファージΦＣＪ２３の耐熱性実験結果を示す図である。図５に示すように、バクテリオファージΦＣＪ２３は、６０℃で１時間暴露する際に１ログ（ｌｏｇ）以上減少しなかった。

＜実施例９＞
野生分離株鳥類病原性大腸菌に対するΦＣＪ２３の感染範囲の調査
実験に使用された鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）以外に韓国の建国大学の獣医科大学で分離した野生分離株鳥類病原性大腸菌の６株に対してバクテリオファージΦＣＪ２３が溶菌活性を有するか否かを確認した。具体的には、各菌株の振とう培養液（ＯＤ₆₀₀＝２）１５０μｌを混合してソフトアガーオーバーレイ方法を行い、１０⁸ｐｆｕ／ｍｌタイターのバクテリオファージΦＣＪ２３の溶液１０μｌずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌斑が形成されるか否かを観察した（表３）。

その結果を下記表３に示す。

前記表３に示すように、バクテリオファージΦＣＪ２３は、一般の養鶏農家で鳥類大腸菌症の原因菌である鳥類病原性大腸菌（Ｏ−７８血清型を含む）に対して効果的な感染能を示すことを確認することができた。一方、前記Ｏ−７８血清型は、一般的に養鶏農場で分離される鳥類病原性大腸菌のうち、最も頻繁に現れる菌株として知られている。

Claims (8)

1. 鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的な死滅効果を奏する、受託番号がＫＣＣＭ１１３６５Ｐである新規のバクテリオファージΦＣＪ２３。
2. 請求項１に記載の受託番号がＫＣＣＭ１１３６５ＰであるバクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物。
3. 前記感染性疾病は鳥類大腸菌症である、請求項２に記載の鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物。
4. 請求項１に記載の受託番号がＫＣＣＭ１１３６５ＰであるバクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む、抗生剤。
5. 請求項１に記載の受託番号がＫＣＣＭ１１３６５ＰであるバクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む、鳥類用飼料添加剤又は飲用水添加剤。
6. 請求項１に記載の受託番号がＫＣＣＭ１１３６５ＰであるバクテリオファージΦＣＪ２３を有効成分として含む、消毒剤又は洗浄剤。
7. 請求項１に記載の受託番号がＫＣＣＭ１１３６５ＰであるバクテリオファージΦＣＪ２３又は請求項２に記載の組成物を鳥類に投与する段階を含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法。
8. 前記感染性疾病は鳥類大腸菌症である、請求項７に記載の鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法。

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