CN105308179B - 噬菌体、包括其的组成物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)、包括其的组成物及其应用。另外，本发明涉及一种抗细菌组成物，例如为抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂，其包含所述噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分。此外，提供一种使用噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)或含有所述噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分的所述抗细菌组成物来预防和/或治疗鸟类的由禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli；APEC)导致的传染病的方法。根据本发明的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)具有针对禽病原性大肠杆菌(APEC)的特异性杀菌活性。

Description

噬菌体、包括其的组成物及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有针对禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichiacoli；APEC)的特异性杀菌活性的噬菌体以及包括所述噬菌体的抗细菌组成物。另外，本发明涉及一种使用所述噬菌体或所述抗细菌组成物来预防或治疗家禽疾病的方法。
背景技术
大肠杆菌(下文称为“大肠杆菌(E.coli)”)是一种属于埃希氏菌属(Escherichia)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性(Gram-negative)、短杆状细菌，并且是存在于各种动物(包含哺乳动物)的肠中的正常菌丛中的一者。已知大部分大肠杆菌的菌株是非病原性的并且可能导致机会性感染，但一些高度病原性菌株在动物(包含人类)中导致多种肠疾病和败血症。
已知在这些大肠杆菌菌株中，通过鸟类(例如，鸡、鸭、火鸡等等)的呼吸道感染的大肠杆菌禽病原性大肠杆菌(APEC)尤其通过呼吸道粘膜渗透到体内。APEC在鸟类中导致各种疾病，如败血症、肉芽肿、气囊炎、咽鼓管炎、关节炎等等。确切地说，APEC对家禽行业造成巨大经济损害，因为APEC主要在家禽等等中导致呼吸道疾病，以使得APEC成为问题。
同时，噬菌体是一种仅感染并且破坏细菌，并且可以仅在宿主细菌内自我复制的特定病毒类型。噬菌体与抗生素相比具有强宿主特异性，并且最近，针对使用抗生素的耐受性细菌的出现问题较为严重，以使得对噬菌体的实际使用的兴趣已经增加(非专利文献1和非专利文献2)。
因此，关于噬菌体的研究已经在全世界的许多国家中积极地进行，并且除了针对噬菌体的专利申请之外，获得对含有噬菌体的组成物的食品和药物管理局(Food and DrugAdministration；FDA)批准的尝试已经逐渐增多。
作为噬菌体的现有技术，专利文献1中已经公开7种用于控制大肠杆菌0157:H的噬菌体，并且专利文献2中已经公开一种具有针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的特异性杀菌活性的噬菌体。此外，专利文献3中已经公开衍生自特异性地破坏细菌细胞膜的肽聚糖结构的噬菌体的溶解蛋白，以及由所述溶解蛋白产生的细菌溶解物。
然而，尽管存在以下现有技术，但与噬菌体相关联的用于预防和/或治疗由APEC导致的传染病(其是饲养鸟类(包含家禽)中的重要问题)的技术仍然不充足，以使得应该开发噬菌体和与噬菌体相关联的技术。
[现有技术文献]
[专利文献]
(专利文献1)美国专利第6,485,902号
(专利文献2)韩国专利登记第10-0910961B1号
(专利文献3)韩国专利特许公开公开案第10-2009-0021475A号
[非专利文献]
(非专利文献1)西斯罗M(Cislo M)等人,免疫与治疗学实验文献(Arch.Immunol.Ther.Exp.)2:175-183,1987
(非专利文献2)金胜勋(Sung Hun Kim)等人,噬菌体，新颖替代抗生素(Bacteriophage,Novel Alternative Antibiotics),生物波(BioWave)第7卷第15期,2005,BRIC
发明内容
技术问题
本发明人进行了研究以便解决如在使用抗生素之后出现的耐受性细菌和残留在肉中的抗生素等等的问题，并且有效地预防和治疗鸟类的传染病。因此，本发明人从自然中分离出了具有针对APEC(其导致家禽的呼吸道疾病)的特异性杀菌活性的新型噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)。
另外，本发明人鉴别了噬菌体的形态、生物化学以及遗传特征，并且确认了所述噬菌体具有极好的耐酸性、耐热性等等，从而使用所述噬菌体开发抗生素、消毒剂、饲料添加剂以及其它组成物。此外，本发明人开发了用于预防或治疗在鸟类中产生的传染病的组成物，和使用所述组成物预防或治疗所述疾病的方法。
本发明提供一种具有针对APEC的特异性杀菌活性的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)。
另外，本发明提供一种预防和/或治疗由APEC导致的传染病的组成物，其含有噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分。
此外，本发明提供一种含有噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。
此外，本发明提供一种使用噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)或含有噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分的组成物来预防和/或治疗由APEC导致的传染病的方法。
问题的解决方案
本发明的一个示范性实施例提供一种具有针对禽病原性大肠杆菌(APEC)的特异性杀菌活性的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)。
本发明的另一个示范性实施例提供一种用于预防或治疗由APEC导致的传染病的组成物，其含有如上文所描述的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分。。
本发明的另一个示范性实施例提供一种含有如上文所描述的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。
本发明的另一个示范性实施例提供一种预防或治疗由APEC导致的传染病的方法，所述方法包含向鸟类施予如上文所描述的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)或含有噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物。
本发明的有利作用
根据本发明的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)具有针对禽病原性大肠杆菌(APEC)的特异性杀菌活性。
另外，因为本发明的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)具有极好的耐酸性、耐热性以及耐旱性，所以其不仅可以用作用于在各种温度或pH范围下预防或治疗由APEC导致的传染病的物质，并且可以用作抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂以及清洁剂等等。
此外，根据本发明，由APEC导致的传染病可以通过向鸟类施予噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)或含有噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分的组成物来预防或治疗。
附图说明
图1是噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P，下文称作'ΦCJ23')的电子显微镜照片。
图2示出噬菌体ΦCJ23的脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis；PFGE)的结果。
图3示出噬菌体ΦCJ23的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)结果。
图4是示出噬菌体ΦCJ23的耐酸性测试结果的曲线图。
图5是示出噬菌体ΦCJ23的耐热性测试结果的曲线图。
具体实施方式
在下文中，将对本发明进行详细描述。因为所属领域或类似领域的技术人员可以充分认识和推断出本说明书中未描述的内容，所以将省略其描述。
详细地说，本发明的一个实施例提供一种具有针对禽病原性大肠杆菌(APEC)的特异性杀菌活性的噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)。
通过鸟类(如，鸡、鸭、火鸡等等)的呼吸道感染的大肠杆菌APEC通过呼吸道粘膜渗透到鸟类体内以导致各种疾病，如败血症、肉芽肿、气囊炎、咽鼓管炎、关节炎等等。APEC是类似于一般大肠杆菌的革兰氏阴性、杆状细菌，并且由于周毛鞭毛而具有活动性，并且是分解乳糖或果糖以产生酸和气体的好氧或兼性厌氧细菌。
APEC在通用培养基中良好地生长并且可以在约7℃到48℃下生长，并且最佳生长温度是约35℃到37℃。确切地说，毒性因子在约42℃下有效地表达(express)，所述温度接近于鸟类的体温。另外，APEC可以在4.5到9.0的pH范围中生长。
噬菌体是感染特异性细菌以遏制并且抑制细菌生长的细菌特异性病毒，并且意指包含单股或双股脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)或核糖核酸(ribonucleicacid；RNA)作为遗传物质的病毒。
本发明的噬菌体ΦCJ23，其为选择性感染APEC的物种选择性噬菌体，具有等距衣壳的结构，但未观察到尾部(图1)，并且在形态上属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。通过比较噬菌体ΦCJ23的基因组序列与其它噬菌体的经解码基因组序列的同系物所获得的结果与表2示出的结果相同。噬菌体ΦCJ23的活性在pH3.5到pH11.0之间是稳定的(耐酸性，参照图4)。当暴露于60℃1小时，噬菌体ΦCJ23未减小高于1个对数(耐热性，参照图5)。
噬菌体ΦCJ23，其为由本发明人新分离的噬菌体，是在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，简称为KCCM)(韩国首尔市西大门区弘济洞361-221号(361-221,Hongjedong,Seodamun-gu,Seoul,Korea))以保藏编号KCCM11365P于2013年1月30日保藏。
在另一个实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗由APEC导致的传染病的组成物，其含有噬菌体ΦCJ23作为活性成分。
因为噬菌体ΦCJ23具有能够特异性地杀死APEC的抗细菌活性，所以其可以用于预防或治疗由APEC感染产生的疾病。由APEC导致的传染病的优选实例有禽大肠杆菌病(aviancolibacillosis)，但本发明不限于此。所述鸟类包含(但不受特定限制)由鸡、鸭以及火鸡构成的族群中选出的至少一者。
禽大肠杆菌病是在鸟类等等的呼吸道被病原性大肠杆菌感染时产生的疾病，禽大肠杆菌病导致各种病变，如气囊炎、肝周炎、腹膜炎、心包炎、咽鼓管炎、脐炎、骨髓炎或败血症等等，从而抑制经感染鸟类的生长并且导致其死亡。
如本文所用的术语“预防”是指向标靶提供噬菌体ΦCJ23和/或包括噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物以遏制对应疾病或延迟疾病出现的所有动作。
如本文所用的术语“治疗”是指向标靶提供噬菌体ΦCJ23和/或包括噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物从而使得由感染导致的对应疾病的症状好转或减轻的所有动作。
根据本发明的用于预防或治疗由APEC导致的传染病的组成物可以以优选地5×102pfu/ml(空斑形成单位/毫升)到5×1012pfu/ml、更优选地1×106pfu/ml到1×1010pfu/ml的量含有噬菌体ΦCJ23。
根据本发明的用于预防或治疗由APEC导致的传染病的组成物可以还含有药学上可接受的载剂并且与所述载剂一起配制来以食物、药物、饲料添加剂、饮用水添加剂等的形式提供。如本文所用的术语“药学上可接受的载剂”意指既不刺激活有机体也不抑制所施予的化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。
本发明中可用的载剂种类不受特定限制，并且可以使用任何载剂，只要其通常用于所属领域并且是药学上可接受的。作为载剂的非限制性实例，有盐水、无菌水、林格氏(Ringer’s)溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等等。这些载剂可以单独地或以这些载剂中的至少两者的混合物形式使用。
另外，必要时，可以进一步添加并且使用另一种通用添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂和/或抑菌剂等，并且组成物可以通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂等来配制成注射配制品(如水溶液、悬浮液、乳液等等)、丸剂、胶囊、粒剂、片剂等等，并且接着被使用。
用于预防或治疗由APEC导致的传染病的组成物的施予方法不受特定限制，但可以使用通常用于所属领域的任何方法。作为施予方法的非限制性实例，组成物可以经口或肠胃外施予。
作为用于经口施予的配制品的非限制性实例，有糖衣片、口含片、片剂、水性悬浮液、油状悬浮液、制备的粉剂、粒剂、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆、酏剂等。
为了将根据本发明的组成物配制成配制品，如片剂、胶囊等，配制品可以还含有粘合剂，如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，如磷酸二钙等等；崩解剂，如玉米淀粉或甘薯淀粉等等；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰反丁烯二酸钠、聚乙二醇蜡等等。在胶囊配制品的情况下，所述配制品可以还含有除了上文所提到的物质之外的液体载剂，如脂肪油。
作为本发明的肠胃外施予方法，可以使用静脉内施予方法、腹部施予方法、肌肉内施予方法、皮下施予方法或局部施予方法等。另外，还可以使用将组成物施加或喷涂到疾病部位上的方法，但本发明不限于此。
用于肠胃外施予的配制品的实例可以包含用于注射，如皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射等等的配制品；栓剂配制品；或喷雾配制品，如能够通过呼吸道系统被吸入的气雾剂配制品等等，但本发明不限于此。为了将组成物配制成注射配制品，根据本发明的组成物可以与稳定剂或缓冲剂在水中混合从而制备溶液或悬浮液，并且接着，所制备的溶液或悬浮液可以以用于安瓿或小瓶的单位剂量配制。在将组成物配制成喷雾配制品(如气雾剂配制品等等)的情况下，推进剂等等可以与添加剂混合以使得经水分散的凝结物或湿粉剂可以被分散。
用于预防或治疗由APEC导致的传染病的组成物的合适的施加、喷涂或施予剂量可以取决于如施予个体动物的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、摄取食物、排泄速率等等，以及配制所述组成物的方法、施予方法、施予时间和/或途径的因素来不同地确定。一般来说，在所属领域中具有一般技术的兽医可以容易地确定并且规定用于所需治疗的有效剂量。
在另一个实施例中，本发明提供一种包括噬菌体ΦCJ23作为活性成分的抗生素。
如本文所用的术语“抗生素”意指能够以药物形式向个体(包含人类)提供从而杀死细菌的药剂，并且对应于总体而言指示防腐剂、消毒剂以及抗菌剂的概念。
含有根据本发明的噬菌体ΦCJ23作为活性成分的抗生素可以有利地具有与常规抗生素相比对APEC的高特异性从而不杀死有益细菌但杀死特异性病原性细菌，并且不诱发抗药性，以使得根据本发明的抗生素可以作为具有与常规抗生素相比延长的生命期的抗生素提供。
在另一个实施例中，本发明提供一种含有噬菌体ΦCJ23(KCCM11365P)作为活性成分的用于鸟类，确切地说家禽的饲料添加剂和饮用水添加剂。
如本文所用的术语“家禽”是总体而言指示属于家畜中的鸟类的动物的概念。家禽不受特定限制，但可以包含优选地由鸡、鸭以及火鸡构成的族群中选出的至少一者。
根据本发明的用于鸟类的饲料添加剂或饮用水添加剂可以以其中噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23的组成物以饲料添加剂或饮用水添加剂形式单独地制备并且接着与饲料或饮用水混合的方式使用，或以其中噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23的组成物可以在制备饲料或饮用水时直接添加的方式使用。
用作根据本发明的饲料添加剂或饮用水添加剂的噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23的组成物可以处于液态或干燥状态，并且优选地呈干燥粉剂形式。
用于制备呈干燥粉剂形式的根据本发明的饲料添加剂和饮用水添加剂的干燥方法不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的方法。作为干燥方法的非限制性实例，有空气干燥方法、天然干燥方法、喷雾干燥方法、冷冻干燥方法等等。可以单独使用这些方法或至少两种方法可以彼此一起使用。
另一种非病原性微生物可以另外添加到本发明的饲料添加剂或饮用水添加剂中。能够添加的微生物的非限制性实例可以由以下各者所构成的族群中选出：能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖转化酶的芽孢杆菌属(bacillus sp.)，如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等等；在厌氧条件(如牛的胃)下具有针对有机物质的生理活性和降解活性的乳杆菌属(Lactobacillus sp.)；具有增加家畜体重、乳产量以及饲料消化率的作用的霉菌真菌，如米曲菌(Aspergillus oryzae)等等；以及酵母，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等等。这些微生物可以单独地或以这些微生物中的至少两者的混合物形式使用。
视需要，含有根据本发明的噬菌体ΦCJ23作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂可以还含有其它添加剂。作为可用添加剂的非限制性实例，有粘合剂、乳化剂、防腐剂等等，其经添加以便预防饲料或驱动水的质量退化；氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取剂或寡糖等等，其经添加以便增加饲料或饮用水的效用。另外，添加剂可以更包含饲料混合剂等等。这些添加剂可以单独地或以这些添加剂中的至少两者的混合物形式使用。
以饲料的100重量份计，可以以0.05重量份到10重量份、更优选地0.1重量份到2重量份的含量含有饲料添加剂。以饮用水的100重量份计，可以以0.0001重量份到0.01重量份、更优选地0.001重量份到0.005重量份的含量含有本发明的饮用水添加剂。在上文所提到的范围内，噬菌体ΦCJ23针对APEC的活性可以充分展现。
在另一个实施例中，本发明提供一种饲料或饮用水，其是通过添加含有噬菌体ΦCJ23作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂或直接添加噬菌体ΦCJ23而制备。
用于本发明的饲料不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的任何饲料。饲料的非限制性实例可以包含植物饲料，如谷物、根部以及果实、食物加工副产物、藻类、纤维、药学副产物、脂肪、淀粉、葫芦科或谷物副产物；以及动物饲料，如蛋白质、无机物质、脂肪、矿物质、单细胞蛋白质、动物浮游生物或食物。这些饲料可以单独地或以这些饲料中的至少两者的混合物形式使用。
用于本发明的饮用水不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的任何饮用水。
在另一个实施例中，本发明可以提供一种含有噬菌体ΦCJ23作为活性成分的消毒剂或清洁剂。消毒剂或清洁剂的配制品不受特定限制，其可以配制成所属领域中已知的任何配制品。
消毒剂可以经喷洒以便去除APEC，并且可以被喷洒到鸟类生活的区域、屠宰场、死亡区域、烹饪场所或烹饪设备等等，但本发明不限于此。
清洁剂可以用于洗涤鸟类身体暴露或将暴露于APEC的皮肤表面或部位中的每一者，但本发明不限于此。
在另一个实施例中，本发明提供一种通过使用噬菌体ΦCJ23或包括所述噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物来预防或治疗由APEC导致的传染病的方法。
详细地说，根据本发明的预防或治疗传染病的方法可以包含以药学上有效的剂量向感染APEC或处于感染APEC风险下的鸟类施予噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物。所属领域的技术人员将显而易见，当向患者施予药学组成物时，合适的总日剂量(total daily dose)可以由主治医生或兽医在合理的医学判断范围内确定。
对于特定鸟类，噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物的特定药学上有效剂量可以通过考虑噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23的组成物的施予时间和施予途径、组成物的分泌速率、治疗持续时间段等等，以及所需反应的种类和程度；对应个体的年龄、体重、大体健康状态、性别或饮食来确定。另外，药学上有效剂量可以根据各种因素不同地改变，如同时或独立地使用的药物或其它组成物的成分，以及在医学领域中熟知的类似因素。
根据本发明的噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物可以以药学形式(经鼻喷雾)向鸟类施予，或以直接添加到鸟类的饲料或饮用水中并且接着饲喂所述饲料或饮用水的方法施予。另外，噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23的组成物可以以饲料添加剂或饮用水添加剂的形式混合在饲料或饮用水中并且接着施予。
根据本发明的噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物的施予途径和施予方法不受特定限制，而可以使用任何施予途径和施予方法，只要噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23的组成物可以到达对应的标靶组织。即，噬菌体ΦCJ23或含有所述噬菌体ΦCJ23作为活性成分的组成物可以通过各种经口或肠胃外途径施予。作为施予途径的非限制性实例，可以进行经口、经直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、皮下以及经鼻施予、吸入等等。
在下文中，将通过实例详细描述本发明。然而，这些实例仅为了说明本发明，并且本发明的范围不限于这些实例。
[实例1]经APEC感染的噬菌体的分离
<实例1-1>
噬菌体的筛分和单个噬菌体的分离
在将从来自清忠南道保宁(Boryeng,South Chungchong Province)的鸭农场区域的粪便和环境样品获得的50毫升样品在4,000转/分钟下离心10分钟之后，用0.45微米过滤器过滤上澄液以制备样品溶液，并且接着使用所制备的样品溶液进行软琼脂覆盖方法。软琼脂覆盖方法是使用生长在顶部琼脂中的宿主细胞(使用0.7％琼脂附着到固体培养基上)观察噬菌体溶解作用的方法。
详细地说，将18微升样品滤液与从建国大学(Kunkuk University)的兽医学院(College of Veterinary Medicine)获得的APEC(E10-4)的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)和2毫升10×LB培养基(胰蛋白胨10克/升；酵母提取物5克/升；以及NaCl 10克/升)混合，并且在37℃下培养18小时。接着，在4,000转/分钟下离心培养物溶液10分钟，并且使用0.45微米过滤器过滤上澄液。接着，在将3毫升0.7％(w/v)琼脂与APEC(E10-4)的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)的混合溶液倾倒并且硬化到LB平板培养基上之后，将10微升样品溶液滴落到其上，接着在37℃下培养18小时。接着，确认形成空斑。
因为已知一种噬菌体存在于单个空斑中，所以打算从所形成的空斑分离单一噬菌体。详细地说，将空斑添加到400微升SM溶液(NaCl(5.8克/升)；MgSO47H2O(2克/升)；1MTris-Cl(pH 7.5)50毫升)中并且保持在室温下4小时，从而获得噬菌体溶液。
在其之后，将100微升噬菌体溶液与12毫升0.7％(w/v)琼脂和APEC(E10-4)的500微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)混合，接着使用直径为150毫米的LB平板培养基进行软琼脂覆盖方法。进行培养直到APEC完全溶解。在培养终止之后，将15毫升SM溶液添加到LB平板培养基上并且保持在室温下4小时，从而获得噬菌体溶液。
在回收溶液并且向其中添加1％(v/v)氯仿之后，混合混合物10分钟，接着在4,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上澄液。用0.45微米过滤器过滤所获得的上澄液，从而获得最终样品。
<实例1-2>
噬菌体的大规模培养和纯化
使用APEC(E10-4)大规模培养在实例1-1中获得的噬菌体，并且接着自其纯化噬菌体。
详细地说，在摇晃培养APEC(E10-4)之后，在4000转/分钟下离心1.5×1010cfu的等分试样10分钟并且接着使其再悬浮于4毫升SM溶液中。向其接种1.5×106pfu的噬菌体(感染复数(multiplicity of infection；MOI)＝0.0001)，并且保持在室温下20分钟。
在其之后，将溶液接种到150毫升LB培养基中并且在37℃下培养6小时。在培养终止之后，以最终体积的1％(v/v)的量添加氯仿并且搅拌20分钟。接着，添加限制酶DNase I和RNase A以便分别具有1微克/毫升的最终浓度，并且溶液保持在30℃下30分钟。接着，添加NaCl和聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)以便分别具有1M和10％(w/v)的最终浓度，并且进一步保持在4℃下3小时，接着在4℃和12,000转/分钟下离心20分钟，从而获得沉淀物。
使所获得的沉淀物悬浮于5毫升SM溶液中并且保持在室温下20分钟。接着，向其添加4毫升氯仿并且搅拌，接着在4℃和4,000转/分钟下离心20分钟，从而获得上澄液。在其之后，用0.45微米过滤器过滤上澄液，并且进行使用甘油密度梯度方法(密度：40％，5％甘油)的超速离心法(35,000转/分钟，1小时，4℃)，从而纯化噬菌体。
本发明人将通过从所述农场的粪便提取样品而获得的具有针对APEC的特异性杀菌活性的噬菌体指定为“噬菌体ΦCJ23”，并且于2013年1月30日以保藏编号KCCM11365P将所述噬菌体保藏在韩国微生物保藏中心(韩国首尔市西大门区弘济洞361-221号)。
<实例2>
检查APEC的ΦCJ23感染
为了确认在实例1中纯化的噬菌体ΦCJ23是否对除APEC(E10-4)以外的大肠杆菌菌株具有溶解活性，进行与其它大肠杆菌物种的交叉感染。
详细地说，在从建国大学的兽医学院获得的野生型大肠杆菌菌株中，分别培养两种APEC菌株(E10-4和E09-35)以及六种非病原性大肠杆菌菌株(E09-1、E09-10、E09-13、E09-14、E09-15以及E09-16)，从而获得培养物溶液。培养物溶液中的每一者和纯化ΦCJ23都用于进行软琼脂覆盖方法，并且确认是否形成空斑。
结果在下表1中示出。
表1
[表1]
菌株名称 空斑形成
APEC(E10-4) O
APEC(E09-35) O
大肠杆菌(E09-1) X
大肠杆菌(E09-10) X
大肠杆菌(E09-13) X
大肠杆菌(E09-14) X
大肠杆菌(E09-15) X
大肠杆菌(E09-16) X
如表1中示出，可以了解，在实例1中纯化的噬菌体ΦCJ23对非病原性大肠杆菌菌株不具有溶解活性。
<实例3>
ΦCJ23的形态观察
将在实例1中纯化的噬菌体ΦCJ23稀释于0.01％明胶溶液中，并且接着固定在2.5％戊二醛溶液中。将固定的噬菌体滴落到碳涂布云母培养板(约2.5毫米×2.5毫米)上，对其进行适应10分钟，并且用无菌蒸馏水洗涤。
将碳膜安放在铜栅格上，用4％乙酸铀酰染色30到60秒，将其干燥，并且使用透射电子显微镜(JEM-1011，80千伏，放大率×120,000到×200,000)研究(图1)。
图1是噬菌体ΦCJ23的电子显微镜照片。经判断，噬菌体ΦCJ23具有含大小约40纳米的二十面体头部的不具有尾部的形态型，以使得其在形态上属于短尾噬菌体科。
<实例4>
ΦCJ23的基因组DNA大小分析
从实例1中所纯化的噬菌体ΦCJ23提取基因组DNA。
详细地说，向纯化噬菌体ΦCJ23的培养物溶液添加20mM乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)、50微克/毫升蛋白酶K以及0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate；SDS)，并且保持在50℃下1小时。接着，添加等体积的苯酚(pH 8.0)并且搅拌，接着在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上澄液。
将所述上澄液与等体积的PC(苯酚:氯仿＝1:1)混合并且在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上澄液。将所述上澄液与等体积的氯仿混合并且在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上澄液。以上澄液总体积计，将所获得的上澄液依次与10％(v/v)的3M乙酸钠和双倍体积的冷95％乙醇混合，并且保持在-20℃下1小时。
接着，在0℃和12,000转/分钟下进行离心10分钟，并且通过去除上澄液来获得沉淀物。接着，向其添加50微升Tris-EDTA(Tris-EDTA；TE)缓冲液(pH 8.0)从而使所获得的沉淀物溶解。将所提取的DNA稀释10次，并且通过测量在OD260下的吸光度来测量浓度。
接着，将1微克DNA装载到1％脉冲场凝胶电泳(PFGE)琼脂糖凝胶上，并且使用伯乐(BIORAD)PFGE系统程序7(大小范围：25kb到100kb；切换时间斜坡：0.4到2.0秒，线性形状；正向电压：180伏；反向电压：120伏)持续20小时(图2)。
图2是噬菌体ΦCJ23的基因组DNA的脉冲场凝胶电泳(PFGE)照片，并且可以确认噬菌体ΦCJ23的基因组DNA具有约71kbp的大小。
<实例5>
ΦCJ23的蛋白质图谱分析
将在1010pfu/ml效价下的15微升纯化噬菌体ΦCJ23溶液与3微升5X SDS样品溶液混合，并且加热5分钟。接着，进行15％SDS-PAGE(图3)。
图3是示出对噬菌体ΦCJ23进行的SDS-PAGE的结果的电泳照片，并且观察到具有约40kDa(千道尔顿)、43kDa以及53kDa大小的主要蛋白质。
<实例6>
ΦCJ23的遗传特征分析
为了确认实例1中所纯化的噬菌体ΦCJ23的遗传特征，使用基因分析设备FLX钛定序器(罗氏(Roche))分析噬菌体ΦCJ23的DNA。基因是在千年基因公司(Macrogen Inc.)使用GS和重新装配软件(罗氏)装配。开放阅读框的序列分析是使用GeneMArk.hmm、Glimmerv3.02以及FGENESB软件来进行。开放阅读框的鉴别是使用BLASTP和InterProScan程序来进行。
噬菌体的基因组序列与现存经报告的噬菌体的基因组序列具有各种类似性，但确认了不存在其中所有碎片都完全(100％)相同的噬菌体。因此，可以确认所述噬菌体是新分离的噬菌体。
下表2示出通过比较噬菌体ΦCJ23的基因组序列与其它噬菌体的经解码基因组序列的同系物所获得的结果。
表2
[表2]
<实例7>
取决于pH的ΦCJ23的稳定性测试
为了确认噬菌体ΦCJ23是否可以在胃中的低pH环境中具有稳定性，在宽pH范围(pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、7.5、8.3、9.2以及11.0)内进行稳定性测试。
为了测试，分别以0.2M的浓度制备各种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH 2.1、pH 4.0、pH5.5以及pH 6.4)、柠檬酸钠缓冲液(pH 2.5、pH 3.0以及pH 3.5)、磷酸钠缓冲液(pH 6.9和pH 7.4)以及Tris-HCl溶液(pH 8.2、pH 9.0、pH 9.8以及pH 11.0))。
在将90微升所述pH溶液中的每一者与效价为2.0×1010pfu/ml的10微升噬菌体溶液混合以使得pH溶液中的每一者的浓度都变为1M之后，将所述pH溶液中的每一者都保持在室温下2小时。在对照组中，将20微升噬菌体溶液(2.0×1010pfu/ml)与180微升SM溶液混合并且接着保持在室温下2小时。接着，逐步稀释反应溶液，并且滴落10微升经稀释溶液中的每一者并且通过软琼脂覆盖方法在37℃下培养18小时，并且在存在或不存在溶解的情况下测量效价。
图4示出噬菌体ΦCJ23的耐酸性测试的结果。如图4中示出，可以确认，与对照组相比，噬菌体ΦCJ23在3.5到11.0的pH范围中未失去其活性并且是稳定的。
<实例8>
取决于温度的ΦCJ23的稳定性测试
进行测试，其用于确认在使用噬菌体作为所述噬菌体的配制品中的饲料添加剂配制品的情况下，针对在所述噬菌体的配制过程期间产生的热的稳定性。
详细地说，将浓度为6.5×109pfu/ml的100微升噬菌体ΦCJ23溶液保持在60℃下30分钟，并且接着逐步稀释以上溶液。滴落10微升每一步骤的经稀释溶液并且通过软琼脂覆盖方法在37℃下培养18小时，并且在存在或不存在溶解的情况下测量效价(图5)。
图5示出噬菌体ΦCJ23的耐热性测试的结果。如图5中示出，当暴露于60℃1小时，噬菌体ΦCJ23的效价未减小约1个对数或高于1个对数。
<实例9>
对APEC野生型菌株的ΦCJ23的感染谱测试
除用于实验的APEC(E10-4)以外，对由建国大学兽医学院分离的6个APEC野生型菌株测试了噬菌体ΦCJ23是否具有溶解活性。
详细地说，滴落效价为108pfu/ml并且与所述菌株中的每一者的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)混合的10微升噬菌体ΦCJ23溶液，并且通过软琼脂覆盖方法在37℃下培养18小时。接着，观察是否形成空斑。
结果在下表3中示出。
表3
[表3]
菌株名称 空斑形成
APEC(E09-6) O
APEC(E09-11) O
APEC(E09-35) O
APEC(E10-03) O
APEC(E10-04) O
APEC(E10-05) O
如表3中示出，可以确认，噬菌体ΦCJ23对APEC(包含O-78血清型)具有有效感染性，所述APEC是在一般家禽农场中导致禽大肠杆菌病的细菌。同时，已知O-78血清型APEC是最频繁地发现于在一般家禽农场中分离的APEC菌株中的菌株。
申请人或代理人的文件参考号P13-5113 国际申请编号
涉及保藏微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)。

Claims (9)

1.一种噬菌体ΦCJ23，其保藏编号为KCCM11365P，且具有针对禽病原性大肠杆菌的特异性杀菌活性。
2.一种组成物，用于预防或治疗由禽病原性大肠杆菌导致的传染病，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ23作为活性成分。
3.根据权利要求2所述的组成物，其中所述传染病是禽大肠杆菌病。
4.一种用于鸟类的饲料添加剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ23作为活性成分。
5.一种用于鸟类的饮用水添加剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ23作为活性成分。
6.一种消毒剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ23作为活性成分。
7.一种清洁剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ23作为活性成分。
8.一种根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ23或根据权利要求2所述的组成物作为制备预防或治疗由禽病原性大肠杆菌导致的鸟类传染病药物的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述传染病是禽大肠杆菌病。
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