KR101275263B1

KR101275263B1 - 조류 병원성 대장균 특이 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR101275263B1
Application number: KR1020110030062A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 김태은; 조선희
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2013-06-14
Also published as: KR20120111535A

Abstract

조류 병원성 대장균(avian pathogenic Escherichia coli) 특이적인 신규한 박테리오파지에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 가금에서 봉와직염, 패혈증, 관절염, 다발성장막염 등을 일으키는 조류 병원성 대장균(avian pathogenic Escherichia coli), 특히 O78 항원형의 조류 병원성 대장균을 특이적으로 살균하는 박테리오파지, 이를 유효성분으로 하는 조류 병원성 대장균증 예방 및/또는 치료용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 항생제, 소독제 및/또는 사료가 제공된다.

Description

조류 병원성 대장균 특이 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물{Avian pathogenic Escherichia coli-specific bacteriophage and antibacterial compositions containing the same}

본 발명은 조류 병원성 대장균(avian pathogenic Escherichia coli) 특이적인 신규한 박테리오파지에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 가금에서 봉와직염, 패혈증, 관절염, 다발성장막염 등을 일으키는 조류 병원성 대장균(avian pathogenic Escherichia coli), 특히 O78 항원형의 조류 병원성 대장균을 특이적으로 살균하는 박테리오파지, 이를 유효성분으로 하는 조류 병원성 대장균증 예방 및/또는 치료용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 항생제, 소독제 및/또는 사료가 제공된다.

가금의 대장균증은 조류 병원성 대장균 (Avian Pathogenic Escherichia coli, 이하 APEC)에 의해 발생하는 중요 세균성 질병으로 난각 오염에 의한 중지란, 어린 병아리 제대염, 기낭염, 두부 종창증 (swollen head syndrome), 봉와직염, 수란관염, 다발성 장막염, 간 포막염, 척추염, 급성 패혈증 등 다양한 병증을 초래하여 양계산업에서 항생제 사용의 주된 원인이며, 도계육 품질저하 및 폐기로 추가적인 경제 손실을 주고 있다.

대장균의 항원형은 O 항원형 173개, K 항원형 74개, H 항원형 53개, F 항원형 17개로 다양하나 전세계적으로 중요한 조류 병원성 대장균의 O 항원형은 O1, O2, O78이며, K 항원형은 K1, K80 이다 (Gross, 1994). 조류 병원성 대장균은 건강한 닭의 공생 세균 (commensal)으로 10-15%에서 분리되며, 뉴캐슬병바이러스, 전염성 기관지염바이러스, 전염성낭병바이러스 등의 일차 감염 후 이차 감염원으로서 병증을 초래하는 것으로 알려져 있다. 국외의 경우 육계 폐사의 주 원인은 대장균성 패혈증으로 57일령까지 평균 4.0%의 폐사를 초래하고, 도계장 검사에서 질병에 의해 불합격 판정을 받는 빈도는 평균 약 1.6% (3,365만수 중)로 이 중 대장균증의 전형적인 병변인 간포막염과 기낭염을 동반한 심외막염은 42.8%인 것으로 보고된 바 있다. 특정 혈청형의 APEC (O1:K1, O78:K80) 감염에 의한 봉와직염은 도계 시 품질저하 및 불합격 판정에 의해 경제적인 피해를 초래하는데 미국의 경우 매년 봉와직염에 의해 1,800-2,000만 달러의 피해를 입는 것으로 보고되었다 (Morris, 1991). 정상적인 산란계가 산란한 계란의 0.5-6%에서 대장균이 분리되나, 실험적으로 감염시키는 경우 그 빈도는 26%까지 증가하며, 발육계태아 및 초생추 폐사의 주 원인이 대장균인 점을 감안하면 그 경제적 피해는 매우 크다고 할 수 있다.

축산분야에서는 생산성 향상을 위해 사료에 다양한 항생물질을 첨가하여 왔으나 1988년 반코마이신 내성 장구균이 인체에서 분리되고, 이 장구균이 닭, 돼지 사료에 첨가하고 있는 아보파신 때문이라는 사실이 알려지면서, 1995년 덴마크를 시작으로 각 나라에서 아보파신의 사료 첨가가 금지되었고, 1998년 7월 EU는 사람의 치료약과 동일한 계통에 있는 버지니아마이신을 포함하여 4종 항생제와 모넨신을 포함하여 4종의 사료첨가를 금지하였다. 1986년 스웨덴에서는 성장촉진 목적의 항생제 투약을 전면 금지 하였으나, 발육 및 사료 요구율 악화로 생산비가 약 10% 상승하였으며, 치료용 항생제 사용 급증에 따라 사용금지 전보다 항생제 사용은 오히려 증가하였다.

국내 경제동물 유래 세균의 항생제 내성 수준은 심각한 수준이며, 항생제 내성 획득 기간 또한 매우 짧은 상황이다. 일례로 동물 제2종 법정전염병으로 분류되는 가금티푸스의 원인균인 Salmonella Gallinarum biotype Gallinarum은 1992년 국내에서 최초로 보고 된 후 1996년 class I integron에 의한 설파제 및 스트렙토마이신 내성 획득, 1999년 tetA에 의한 테트라사이클린 내성 획득, 2000년 gyrA 돌연변이에 의한 엔로플록사신 (퀴놀론계열 항생제) 내성 획득 및 앰피실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 설파멕톡사진, 테트라사이클린 (ACSSuT) 모두에 내성을 갖는 다약제 내성을 획득하였다. 국내 가금티푸스균이 내성을 획득한지 4년 만에 다약제 내성을 획득한 사실은 빈번한 항생제 사용에 의한 내성주 선택과 내성유전자의 수평전파가 야외에서 빈번하게 일어나고 있음을 의미하며, 이러한 항생제 내성은 조류 병원성 대장균의 경우도 마찬가지여서, 신종 다약제 내성 병원성세균에 대한 대책 수립이 시급한 실정이다 (Kwon 등, 2002, 2007). 따라서 축산분야의 생산성 향상을 위해서는 새로운 차원의 항생제 개발이 절실하다.

한편, 박테리오파지는 세균에 특이적으로 감염되는 바이러스로 Twort (1915)와 d'Herelle (1917)이 발견하였고, d'Herrelle은 박테리오파지를 세균성 질병 치료에 처음으로 적용하였다 (d'Herrelle, 1926). 박테리오파지를 이용한 치료법은 항균제 개발 이후 동유럽과 구 소련에서만 지속적으로 연구되어 왔으나, 최근 다약제 내성 세균 및 슈퍼박테리아 출현으로 항균제의 대안으로써 각광받고 있으며, 항균제 대비 개발비용이 낮고, 특이적이어서 부작용이 없고, 내성균 출현율이 낮으나 극복할 수 있는 변이주 개발이 용이하므로 기존 항균제 대체제로 각광을 받고 있다.

박테리오파지는 최근 송아지의 대장균성 설사증 (Smith et al , 1987), 어류의 다양한 질병 (Park et al., 2000), 반코마이신 내성 장구균 패혈증 (Biswas et al, 2002), 결핵균 (Broxmeyer et al, 2002), 닭의 파라티푸스 (Berchieri et al, 1991) 및 E. coli O157:H7 (Kudva et al, 1991)등 다양한 질병에 대해 성공적인 예방 및 치료사례가 보고 되고 있다. 또한, 박테리오파지를 직접 사용하는 방법뿐 아니라 박테리오파지가 숙주세균의 세포벽을 특이적으로 파괴하는데 작용하는 리신 (lysin)을 이용하여 탄저 (Schuch et al , 2002), 폐렴구균 (Loeffler et al , 2003)등에 특이적인 항생제 개발도 이루어지고 있으며, 그 효과는 그람 음성세균 보다는 그람 양성세균에서 좋으며, 동물용 예방 및 치료제로는 고가의 리신 보다는 박테리오파지가 실용적일 것으로 기대된다.

이러한 다양한 학문적 연구 이외에도 2002년 E. coli O157:H7 균을 살균하는 박테리오파지에 대한 미국특허등록(6,485,902) 이외 다수의 특허등록이 이루어지고 있고, 2007년 OmniLytics 사는 도축과정 중에 E. coli O157:H7 균의 도체 오염을 줄이기 위한 박테리오파지 제품을 개발하여 미국 농무성 FSIS(Food Safety and Inspection Service)의 승인을 받아 상업화 하였으며, 현재 다양한 용도의 제품들이 승인 심사중에 있고, 박테리오파지를 이용한 항균제 및 소독제 연구와 산업화 노력이 지속적으로 이루어지고 있다.

그러나, 조류 병원성 대장균에 대하여 항균 활성을 갖는 박테리오파지에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 조류 대장균증의 주요 원인균인 O78 항원형 조류 병원성 대장균을 살균하는 새로운 박테리오파지(φWAO78-1)를 하수종말처리장의 배출수로부터 분리하고, 이 박테리오파지가 국내분리균주 및 표준 O78 대장균을 특이적으로 살균하는 것을 확인하였으며, O78 조류 병원성 대장균 감염된 시험계에 상기 박테리오파지를 주사하면 폐사와 병변을 감소시킬 뿐 아니라, 상기 박테리오파지만을 주사한 경우 임상증상, 병변 및 폐사가 관찰되지 않아 안전성도 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일례는 조류 병원성 대장균에 대하여 항균 활성을 갖는 신규한 박테리오파지를 제공한다.

또 다른 예는 상기 박테리오파지를 유효성분으로 함유하는 항균제를 제공한다.

또 다른 예는 상기 박테리오파지를 유효성분으로 함유하는 소독제를 제공한다.

또 다른 예는 상기 박테리오파지를 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

또 다른 예는 상기 박테리오파지를 포함하는 사료를 제공한다.

또 다른 예는 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조류 병원성 대장균증 예방 및/또는 치료용 조성물, 및 이를 이용한 조류 병원성 대장균증의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 신규한 박테리오파지는 조류 병원성 대장균, 특히, 조류 병원성 대장균증의 주요 원인균인 O78 항원형 조류 병원성 대장균에 대하여 특이적인 숙주 감수성을 나타내어, 조류 병원성 대장균에 특이적인 항균활성을 가지면서 특히 O78 조류 병원성 대장균에 특이적인 항균활성을 갖는 것을 특징으로 한다 (실시예 3 및 표 1 참조). 상기 박테리오파지는 서열번호 1의 게놈 서열을 가지며, 서열분석 결과, 기존의 박테리오파지와 다른 신규한 균주임이 확인되었다 (실시예 4 및 표 2 참조). 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCCM10995P인 균주일 수 있다.

본 발명에 사용된 바로서, 조류 병원성 대장균은 조류에 감염되어 병원성을 나타내는 모든 대장균을 의미하는 것으로, 항원형에 따라서, O 항원형 (173개), K 항원형 (74개), H 항원형 (53개), F 항원형 (17개)로 다양하고, 중요한 조류 병원성 대장균으로 O 항원형의 O1, O2, O78, K 항원형의 K1, K80 등이 있다.

이러한 상기 박테리오파지의 항균 활성에 기초하여, 본 발명의 다른 예는 상기 박테리오파지의 조류 병원성 대장균에 대한 항균 용도를 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 함유하는 항균제가 제공된다. 상기 항균제는 조류 병원성 대장균에 대하여 특이적인 항균활성을 보이는 것일 수 있으며, 특히, O78 항원형 조류 병원성 대장균에 대하여 특이적인 항균활성을 보이는 것을 특징으로 한다. 상기 항균제 내의 박테리오파지의 함량은 소망하는 항균활성 및 적용 대상에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 10³pfu/ml 이상, 바람직하게는 10³pfu/ml 내지 10¹⁰pfu/ml, 더욱 바람직하게는 10⁶pfu/ml 내지 10¹⁰pfu/ml 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 'pfu (plaque forming unit)'는 박테리오파지가 플라그를 형성하는 것을 수치화한 단위로서, 박테리아의 경우의 cfu (colony forming unit)와 유사한 개념이다.

상기 항균제는 다양한 양태로 적용 가능하다.

구체적으로, 상기 박테리오파지는 상기와 같은 조류 병원성 대장균에 대한 항균 활성에 의하여 소독제로 적용될 수 있으며, 양계장, 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔집, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 예는 박테리오파지를 유효성분으로 함유하는 소독제를 제공한다. 상기 소독제 내의 박테리오파지의 함량은 소망하는 소독 효능 및 적용 대상에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 10³pfu/ml 이상, 바람직하게는 10³pfu/ml 내지 10¹⁰pfu/ml, 더욱 바람직하게는 10⁶pfu/ml 내지 10¹⁰pfu/ml 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 박테리오파지는 조류의 사료에 첨가됨으로써, 조류의 조류 병원성 대장균에 대한 저항성 및 감염증에 대한 치료 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 예는 상기 박테리오파지를 포함하는 사료 첨가용 조성물, 및 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공한다.

상기 사료 첨가용 조성물은 상기 박테리오파지의 사료 제조에 사용될 수 있는 용도를 기재하기 위한 것으로, 상기 조성물 내의 박테리오파지의 함량은 아무런 제한이 없으며, 예컨대, 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 100 중량%일 수 있다. 상기 사료 내의 박테리오파지 함량은 소망하는 효과와 적용 대상의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 사료 전체 중량 기준으로 0.1 내지 1 중량%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 사료 첨가용 조성물 및 사료의 적용 대상 동물은 사육 가능한 모든 종류의 조류를 포함하며, 예컨대, 닭, 오리, 꿩, 칠면조, 메추리, 타조, 거위 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

또한, 상기 박테리오파지를 조류 병원성 대장균, 특히 O78 항원형 조류 병원성 대장균 감염된 개체에 접종시 폐사율이 현저하게 낮아지고 생존 개체에서의 세균 분리율도 현저하게 낮아지는 것이 확인되었으며, 시험 개체의 피하에 접종하여도 특이적인 임상증상이나 병변을 보이지 않아 생체 적용시 안전성도 매우 우수함이 확인되었다 (실시예 5 및 표 3 참조). 보다 구체적으로, 상기 방법은 O78 조류 병원성 대장균을 단독으로 시험계의 피하에 접종한 경우 50%의 폐사율을 초래하고 생존계 50%의 심장에서 접종균이 분리되나 세균과 φWAO78-1을 혼합하여 접종한 경우 폐사율과 심장에서 세균 분리율이 0% 였고, 서로 다른 부위에 세균과 φWAO78-1을 접종한 경우 심장에서의 세균 분리율이 62.5% 였으나 폐사는 전혀 일어나지 않아 치료 효과가 탁월하였다.

이와 같은 상기 박테리오파지의 조류 병원성 대장균 감염에 대한 효과에 기초하여, 본 발명의 또 다른 예는 상기 박테리오파지를 유효성분으로 함유하는 조류 병원성 대장균증의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 예방 및/또는 치료를 위한 유효량으로 조류에 투여하는 단계를 포함하는 조류 병원성 대장균증의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

본 명세서에 사용된 바로서, 조류 병원성 대장균증은 조류 병원성 대장균 감염에 의하여 나타나는 모든 병리학적 증상 및 질병, 및 이들 증상 및 질병에 의하여 파생되는 질병을 모두 의미하는 것으로, 제대염, 기낭염, 두부 종창증, 봉와직염, 수란관염, 관절염, 다발성 장막염, 간 포막염, 척추염, 패혈증 등을 모두 포함하는 의미이다.

상기 적용 대상 조류는 상기 조류 병원성 대장균의 감염에 의하여 병리학적 증상이 초래될 수 있는 모든 동물일 수 있으며, 예컨대, 닭, 오리, 꿩, 칠면조, 메추리, 타조, 거위 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 투여 방법은 모든 통상적인 방법에 의할 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 투여 등의 모든 경구 또는 비경구 투여에 의할 수 있다. 상기 예방 및/또는 치료를 위한 유효량은 투여 대상의 증상, 상태 및 목적하는 효과에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 박테리오파지 함량 기준으로, 10³pfu/200㎕/수 이상, 바람직하게는 10⁶pfu/200㎕/수 이상, 예컨대, 10³pfu/200㎕/수 내지 10¹²pfu/200㎕/수, 또는 10⁶pfu/200㎕/수 내지 10¹²pfu/200㎕/수 일 수 있다.

상기 항균제, 소독제, 및 조류 병원성 대장균증의 예방 및/또는 치료용 조성물 등의 제제는 필요에 따라 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 상기 담체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 모든 담체일 수 있고, 예컨대, 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리오파지용 배지(예컨대, Luria-Bertani 배지 등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 제제는 액상, 반 고체상 또는 고체상으로 제제 형태는 분말제, 과립제, 정제 등의 고체상 제제, 현탁제 또는 주사액제 등의 액상 제제 및 크림, 로션, 젤, 페이스트 등의 반 고체상 제제 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규 박테리오파지는 O78 조류 병원성 대장균을 특이적으로 살균하며 시험계의 피하 접종 시 병원성이 없고 병원성대장균과 함께 접종하는 경우 폐사를 막아 예방 및 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 KCCM10995P의 전자현미경 사진이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 박테리오파지 분리

하수종말처리장 배수구의 배출수를 0.45㎛ 여과지로 여과하여 수집한 9ml에 10x Luria-Bertani 배지(이하 LB, DIFCO Co.) 1ml을 첨가하고, O78 조류 병원성 대장균(이하 E123, 서울대학교 수의과대학 조류질병학실) 10⁵ CFU를 접종하여 5시간 이상 배양하였다. 얻어진 배양물을 5,000rpm에서 5분간 원심하여 상층액을 채취하였다. 숙주세균(E123) 108을 LB 한천배지(DIFCO Co.) 표면에 도포한 후 상기 채취한 상층액 10㎕를 점적하였다. 37℃에서 6시간 배양하여 용균이 일어나는 경우 10진 희석하여 역가를 측정하고, 플라크 모양(직경, 살균대의 투명도, 살균대 주변의 억제대)을 관찰하여 차이를 보이는 플라크를 yellow tip으로 채취하여 10⁵ CFU의 E123을 함유한 5ml LB broth에 부유하여 종야 배양하였다. 상기와 같이 플라크를 분리하여 배양하는 방식으로 총 5회 반복하여 순수한 플라크를 분리 하였으며, 이를 φWAO78-1로 명명하고, 2009년 3월 26일자로 서울 서대문구 홍제동에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM10995P를 부여받았다. φWAO78-1의 플라크는 직경 1.5mm로 투명한 플라크를 보였다. 순수배양액은 동결건조 후 -70℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

실시예 2: φ WAO78 - 1 의 전자현미경 구조 관찰

상기 배양된 φWAO78-1 100ml (4.4x10¹⁰pfu/ml)을 18,000 x g로 1시간 원심분리 한 후 100,000 x g에서 1시간 원심분리 하여 박테리오파지를 정제하였고, hydration된 grid에 시료를 묻혀주고 증류수로 2번에 걸쳐 씻어준 후 2%(w/v) uranyl acetate로 5초간 염색하여 투과전자현미경으로 관찰하였다. 이와 같이 관찰된 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, φWAO78-1는 구조상 Order Caudovirales의 Family Siphoviridae 혹은 Podoviridae에 속하는 것으로 판단되며, Head의 직경은 약 50nm이고 길이는 100nm 였다.

실시예 3: φ WAO78 -1의 숙주범위

표준균주 ATCC11775(serotype O1:K1:H7), ATCC23525(serotype O35:K.:H10), ATCC43886 (KCCM40404; serotype O25:K98:NM; LT+), ATCC43896 (KCCM40405; 078:K80:H12; ST+)와 국내 분리 O78 조류 병원성 대장균(E123) 19주, O1 2주, O18 3주, O20 1주, O115 2주 (이상, 서울대학교 수의과대학 조류질병학교실 분리주) 2x10⁸ cfu/ml 500ul를 각각 LB 한천배지에 점적 하여 도말 한 후, 4.4x10¹⁰pfu/ml의 φWAO78-1을 LB 육즙 배지에 10배 희석한 희석액 10ul를 상기 각각의 세균을 도말한 배지에 각각 점적하고 건조시켜 살균 능력(용균 여부)을 확인하여, 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

φWAO78-1의 숙주 범위

Strain	Serotype	Lysis	Strain	Serotype	Lysis
ATCC11775	O1:K1:H7	-	E106	078	+
ATCC43886	O25:K98	-	E107	078	+
ATCC23525	O35:K.:H10	-	E108	078	+
ATCC43896	078:K80:H12	+	E114	078	+
E28	078	+	E115	078	+
E30	078	+	E123	078	+
E31	078	+	E125	078	+
E36	078	+	E129	01	-
E43	078	+	E144	01	-
E49	078	+	E22	018	-
E61	078	+	E35	018	-
E75	078	+	E127	018	-
E102	078	+	E79	020	-
E103	078	+	E26	O115	-
E104	078	+	E146	O115	-
E105	078	+

상기 표 1에서 확인된 바와 같이, O78 표준주와 O78 국내 분리주들의 경우 세균의 증식이 일어나지 않아 투명한 원형대가 형성되었으나, 나머지 대장균들에서는 증식이 일어나는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 φWAO78-1이 O78 조류 병원성 대장균을 특이적으로 살균하는 능력을 가짐을 보이는 것이다.

실시예 4: 박테리오파아지 게놈 염기서열 결정

정제한 φWAO78-1 1ml에 proteinase K 완충용액(30mM Tris-HCl) 4ml를 첨가하고, proteinase K (1mg/ml NEB Inc. EC 3.4.21.14) 50㎍/ml을 첨가하여 50℃에서 1시간 진탕배양하였다. 상기 얻어진 배양물에 동량의 페놀-클로로포름(5:5, pH8.0)을 첨가한 후, 12,000rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리 한 후 상층액을 채취하고, 동량의 페놀-클로로포름(5:5, pH8.0)을 첨가하여 12,000xg에서 원심분리한 후, 상층액 부피와 동량의 이소프로판올(100% isopropanol)을 첨가하여 실온에 10분간 정치한 후 15,000rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 그 후 침전물을 제외한 용액을 제거하고, 냉장한 70% 에탄올을 10ml 첨가한 후 15,000rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리 한 후, 용액을 제거하고 침전물을 건조시키고, 0.5ml의 멸균 3차증류수에 부유하였다.

φWAO78-1 게놈을 ApoI(NEB Inc.)으로 pCR-TOPO 2.1은 EcoRI(NEB Inc.)으로 소화한 후 ligation 하였고, insert를 가지고 있는 클론들을 집락-PCR 법으로 확인한 후 그 amplicon을 정제하여 염기서열 결정에 사용하였다(M13F, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'(서열번호 2), 10pmol 0.5ul; M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(서열번호 3) 10pmol, 0.5ul; 10x PCR buffer 3ul, dNTPs 10mM 0.5ul, Taq polymerase 5U/ul 0.5ul Bioneer Co., 세균 집락 부유액 1ul, 멸균3차증류수 24ul). 또한 AluI(NEB Inc.)으로 파아지 게놈을 처리하고, EcoRV(NEB Inc.)로 클로닝 벡터(pBlueScript SK+, Stratagen Co.)를 처리하고, 클로닝하여 염기서열을 결정하였다(M13F, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'(서열번호 2), 10pmol 0.5ul; M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(서열번호 3) 10pmol, 0.5ul; 10x PCR buffer 3ul, dNTPs 10mM 0.5ul, Taq polymerase 5U/ul 0.5ul Bioneer Co., 세균 집락 부유액 1ul, 멸균3차증류수 24ul). 결정된 염기서열들의 겹치는 부분을 연결하여 게놈서열(서열번호 1)을 얻었다.

결정된 φWAO78-1 게놈 염기서열을 BLAST 검색한 결과 대장균 파지인 φK1ind2 (GenBank accession no. GU196280)과 가장 유사하였고, 부위별 상동성을 아래의 표 2에 나타내었다

φWAO78-1과 φK1ind2의 게놈 염기서열 상동성 비교

φWAO78-1	φK1ind2	Identity
53-3664	18396-22007	91.2% (3294/3613)
6201-7628	24349-25768	83.9% (1202/1432)
8306-8965	26692-27351	92.4% (610/660)
9149-12317	27344-30508	91.1% (2889/3170)
12485-14002	30506-32023	89.1% (1352/1518)
14239-15224	32021-32954	85.2% (840/986)
15486-17475	33243-35232	89.7% (1786/1992)
24478-24970	41341-41832	89.5% (441/493)
25133-25794	41970-42651	89.1% (608/682)
26490-28615	604-2729	82.0% (1749/2134)
29507-31032	2814-4339	89.1% (1360/1526)
31364-34113	4257-7106	94.2% (2595/2754)
34279-42746	7155-15635	87.9% (7463/8488)
42939-44545	15827-17434	90.5% (1455/1608)

표 2에서 확인되는 바와 같이, φWAO78-1의 게놈 염기서열은 φK1ind2와 부위 별로 82.0% 내지 92.4%의 상동성을 보였다.

실시예 5: φ WAO78 -1의 조류 병원성 대장균증 치료 효과

병원성이 높은 E123 주를 6.4 x 10⁹cfu/200㎕/수를 42일령 육계 각 10수에 피하 접종 한 E123 군, 2 x 10⁹pfu/200㎕/수의 φWAO78-1만을 피하 접종한 φWAO78-1 군, φWAO78-1과 E123을 함께 섞어 피하 접종한 E123+φWAO78-1 군, 및 동일한 접종량으로 E123을 등과 φWAO78-1을 다리에 각각 접종한 E123/φWAO78-1 군을 7일간 관찰하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.

φWAO78-1의 예방 및 치료 효과

시험군	폐사율	세균분리율	비고
E123	40%	50%(2/4)	2수 사고사
φWAO78-1	0%	0%	1수 사고사
E123+ φWAO78-1	0%	0%	1수 사고사
E123/ φWAO78-1	0%	62.5%	2수 사고사

표 3에 나타난 바와 같이, E123 군에서는 40% (4/10)의 폐사율을 보이고, 생존계 50% (2/4)에서 E123이 순수 배양된 반면, E123+φWAO78-1 군은 폐사와 병변이 없었고, E123 세균 또한 분리되지 않았다. E123/φWAO78-1 군은 0%의 폐사를 보였으나, 62.5% (5/8)에서 E123 세균이 분리되었고, 병변이 관찰되었으나 침울이나 운동실조 등의 임상증상은 관찰되지 않아 회복 중에 있었던 것으로 판단되었다. 또한, φWAO78-1만을 접종한 시험계는 침울이나 운동장애 등의 임상증상을 보이지 않았고, 폐사도 없었으며 부검결과 육안적인 병변이 관찰되지 않아 박테리오파지 자체로는 병원성이 전혀 없는 것으로 확인되었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM10995

20090326

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 게놈 서열을 갖는 박테리오파지.
제1항에 있어서, 기탁번호 KCCM10995P인 박테리오파지.
제1항 또는 제2항의 박테리오파지를 유효성분으로 함유하며,
O78 항원형의 조류 병원성 대장균 감염에 의해 발생되며,
제대염, 기낭염, 두부 종창증, 봉와직염, 수란관염, 관절염, 다발성 장막염, 간 포막염, 척추염, 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택된 조류 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
삭제
제1항 또는 제2항의 박테리오파지를 유효성분으로 함유하며, O78 항원형의 조류 병원성 대장균에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균제.
삭제
제1항 또는 제2항의 박테리오파지를 유효성분으로 함유하며, O78 항원형의 조류 병원성 대장균에 대하여 특이적인 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 소독제.
제1항 또는 제2항의 박테리오파지를 포함하는 사료 첨가용 조성물.
제9항의 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료.
제1항 또는 제2항의 박테리오파지의 유효량을 조류에 투여하는 단계를 포함하며,
O78 항원형의 조류 병원성 대장균 감염에 의해 발생되며,
제대염, 기낭염, 두부 종창증, 봉와직염, 수란관염, 관절염, 다발성 장막염, 간 포막염, 척추염, 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택된 조류 병원성 대장균증의 예방 또는 치료 방법.