CN105008525B - 噬菌体、包括其的组合物及其用途、抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂及清洁剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种噬菌体、包括其的组合物及其用途、抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂以及清洁剂。本发明提供一种新颖噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)。此外，本发明涉及一种包含噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)作为活性成分的抗细菌组合物。另外，提供一种使用噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)或含有噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)作为活性成分的抗细菌组合物来预防和/或治疗除人类以外的动物由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的方法。本发明的噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)具有特异性地杀死产气荚膜梭菌的作用，并且具有极好的耐酸性、耐热性和耐旱性。

Description

噬菌体、包括其的组合物及其用途、抗生素、饲料添加剂、饮用 水添加剂、消毒剂及清洁剂
技术领域
本发明涉及一种具有针对病原性产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的特异性杀细菌活性的新颖噬菌体和包括其的抗细菌组合物。此外，本发明涉及使用所述新颖噬菌体或抗细菌组合物预防或治疗动物疾病的方法。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，CP)是革兰氏阳性大型专性厌氧芽孢杆菌，已被认为是不具有鞭毛并且形成孢子的细菌。产气荚膜梭菌是一种特别是在如鸡、猪等家畜中造成腹泻等等的细菌，和造成禽伤寒的沙门氏菌一样，已被公认为畜牧业中重要的致死性病原细菌之一。
目前，在家禽和猪肉行业中频繁产生的疾病之一是由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎。已知坏死性肠炎是因产气荚膜梭菌和球虫的协同感染而频繁产生，并且作为坏死性肠炎的主要症状，在鸡类、猪类等等的小肠下部由于严重坏死性病斑而存在出血性腹泻。
此坏死性肠炎根据疾病严重程度而导致感染动物的脱水症状、周期性腹泻等等，逐渐使动物身体衰弱，并且造成生长迟缓等，此使得坏死性肠炎已变成畜牧业的显著问题。另外，因为产气荚膜梭菌易于经由动物粪便传播，所以共同繁殖空间中动物之间的传染可易于经由土壤或污染的饲料等的经口感染而导致。特别是，仔畜中的发病率高，使得产气荚膜梭菌已变成问题。
同时，噬菌体是仅感染和破坏细菌并且仅可在宿主细菌内部自体复制的专门类型的病毒。噬菌体与抗生素相比具有强大的宿主特异性，并且近来，抗生素抗性菌株出现的问题已变得严重，使得对噬菌体实际用途的关注已增加(非专利文件1和2)。
因此，已在全世界多个国家积极进行与噬菌体有关的研究，并且除关于噬菌体的专利申请以外，含有噬菌体的组合物获得食品及药品管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批准的尝试已逐渐增加。
作为与噬菌体有关的现有技术文件，具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀细菌活性的噬菌体已公开在专利文件1中，并且具有针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的特异性杀细菌活性的噬菌体已公开在专利文件2中。另外，来源于噬菌体的特异性破坏细菌细胞膜的肽聚糖结构的溶解蛋白质、和溶解蛋白质的细菌溶解物已公开在专利文件3中。
然而，尽管存在以下现有技术，但是与噬菌体相关联的用于预防和/或治疗感染性疾病(特别是在包含家禽和猪肉行业的畜牧业中仍是重要问题的由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎)的技术仍不充分，因此应开发噬菌体和与噬菌体相关联的技术。
[现有技术文件]
[专利文件]
(专利文件1)韩国专利公开第10-2012-0076710 A号
(专利文件2)韩国专利登记号10-0910961 B1
(专利文件3)韩国专利公开第10-2009-0021475 A号
[非专利文件]
(非专利文件1)希斯罗(Cislo M)等人，免疫学治疗实验档案(Arch.Immunol.Ther.Exp.)2：175-183，1987
(非专利文件2)金成勋(Sung Hoon Kim)等人，噬菌体，新颖替代性抗生素(Bacteriophage，novel alternative antibiotics)，生物波(BioWave)第7卷第15期，2005，BRIC
发明内容
技术问题
本发明人进行研究以便解决如在使用抗生素后出现抗性细菌、抗生素残留于肉类中等的问题，并且有效预防和治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病，因此，本发明人从自然界分离出具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀细菌活性的新噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)。
此外，本发明人辨明了所述新颖噬菌体的形态学、生物化学和遗传特征并且证实所述噬菌体具有极好的耐酸性、耐热性、耐旱性等，从而使用新颖噬菌体开发抗生素、消毒剂、饲料添加剂和其它组合物。另外，本发明人开发出一种用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的组合物和一种使用所述组合物预防或治疗所述疾病的方法。
本发明打算提供一种具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀细菌活性的新颖噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)。
此外，本发明打算提供一种含有噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)作为活性成分的用于预防和/或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的组合物。
另外，本发明打算提供含有噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。
此外，本发明打算提供一种使用噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)或含有其(KCCM11363P)作为活性成分的组合物来预防和/或治疗除人类以外的动物由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的方法。
问题解决方案
根据本发明的一个示例性实施例，提供一种具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀细菌活性的新颖噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)。
根据本发明的另一个示例性实施例，提供一种用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的组合物，所述组合物含有如上所述的噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)作为活性成分。
根据本发明的另一个示例性实施例，提供含有如上所述的噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。
根据本发明的另一个示例性实施例，提供一种预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的方法，包括向除人类以外的动物投予如上所述的噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)或含有其的组合物。
本发明的有利作用
根据本发明的噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)具有特异性地杀死产气荚膜梭菌的作用。
此外，根据本发明的噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)具有极好的耐酸性、耐热性和耐旱性，使得噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)可以用作在各种温度或pH范围、湿度等条件下用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的材料，并且用作抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂、清洁剂等。
另外，根据本发明，由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病可以通过向除人类以外的动物投予噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)或含有其(KCCM11363P)作为活性成分的组合物来预防或治疗。
附图说明
图1是新颖噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P，在下文中称为“ΦCJ21”)的电子显微照片。
图2示出了新颖噬菌体ΦCJ21的脉冲场凝胶电泳(pulsed field gelelectrophoresis，PFGE)结果。
图3示出了新颖噬菌体ΦCJ21的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)结果。
图4是示出新颖噬菌体ΦCJ21的耐酸性试验结果的图形。
图5是示出新颖噬菌体ΦCJ21的耐热性试验结果的图形。
图6是示出新颖噬菌体ΦCJ21的耐旱性试验结果的图形。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。因为本说明书中未描述的内容可被所属领域或类似领域的技术人员充分认可及推断出，故不再对其予以赘述。
在一个实施例中，本发明提供一种具有针对产气荚膜梭菌(CP)的特异性杀细菌活性的新颖噬菌体ΦCJ21(KCCM11363P)。
已知产气荚膜梭菌是革兰氏阳性大型专性厌氧芽孢杆菌，其不具有鞭毛并且形成孢子。产气荚膜梭菌是一种在动物中(特别是在如家禽、猪类等家畜中)造成腹泻等的细菌，已被公认为畜牧业中危险且致死的病原细菌之一，如造成禽伤寒的沙门氏菌。
噬菌体是感染特定细菌以抑止和抑制所述细菌生长的细菌特异性病毒，并且意指包含单股或双股脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)作为遗传物质的病毒。
本发明的噬菌体ΦCJ21是具有选择性地感染产气荚膜梭菌的物种特异性的噬菌体，具有等距衣壳和不可收缩尾部，并且形态上属于长尾噬菌体科(Siphoviridae)(图1)。噬菌体ΦCJ21与其它噬菌体之间核酸序列的同源性分析数据在表1中示出。噬菌体ΦCJ21的活性在pH 4到pH 9.8的范围下是稳定的(耐酸性，参见图4)。ΦCJ21当其暴露在60℃下时保留其活性2小时(耐热性，参见图5)，并且其效价在干燥后降低约1/10(参见图6)。噬菌体ΦCJ21的核酸序列与SEQ ID NO：1相同。
噬菌体ΦCJ21是由本发明人最新分离的噬菌体，在2013年1月30日以保藏编号KCCM11363P保藏于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，简称KCCM)(韩国首尔市西大门区弘济一洞361-221(361-221，Hongjedong，Seodaemun-gu，Seoul，Korea))。
在另一个实施例中，本发明提供一种含有噬菌体ΦCJ21作为活性成分的用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的组合物。作为所述组合物的一个优选实例，本发明提供一种抗生素。
因为噬菌体ΦCJ21具有能够特异性地杀死产气荚膜梭菌的抗细菌活性，所以噬菌体ΦCJ21可以用于预防或治疗由产气荚膜梭菌感染产生的疾病。坏死性肠炎是能够使用噬菌体ΦCJ21治疗的由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的一个合适实例，但本发明并不限于此。
坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌引起的主要感染性疾病之一，相当于家畜(特别是家禽)中最频繁产生并且造成显著损害的细菌疾病。所述疾病可能在家禽(尤其实质上所有年龄的鸡)中产生，但是主要在地面上繁殖的鸡(2周龄到5周龄)中产生并且也频繁地在笼中繁殖的鸡(12周龄到16周龄)中产生。
随着产气荚膜梭菌在小肠中过度增殖，会产生坏死性肠炎症状并且导致胃肠粘膜坏死、暴泻等。举例来说，在猪类中，在非常急性的坏死性肠炎情况下，在出现1到2天后，产生猪类死亡，而在急性坏死性肠炎情况下，在出血性腹泻2到3天后，产生猪类死亡。另外，在亚急性坏死性肠炎情况下，腹泻(不存在有血粪便)继续进行5到7天，并且随后导致虚弱和脱水，而在慢性坏死性肠炎情况下，导致间歇性腹泻并且可能产生生长障碍。
本文中所用的术语“预防”是指向除人类以外的动物提供噬菌体ΦCJ21和/或含有其作为活性成分的组合物以抑止对应疾病或延缓疾病发生的全部作用。
本文中所用的术语“治疗”是指向除人类以外的动物提供噬菌体ΦCJ21和/或含有其作为活性成分的组合物、从而使由感染引起的对应疾病的症状好转或减轻的全部作用。
坏死性肠炎是可以应用噬菌体ΦCJ21和/或含有其作为活性成分的组合物的由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的一个实例，但本发明并不限于此。
根据本发明用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的组合物可以含有含量优选是5×106pfu/ml到5×1012pfu/ml、更优选是1×106pfu/ml到1×1010pfu/ml的噬菌体ΦCJ21。
根据本发明用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的组合物可以还含有医药学上可接受的载剂，并且与所述载剂一起配制，从而以食物、药物、饲料添加剂、饮用水添加剂等形式提供。本文中所用的术语“医药学上可接受的载剂”意指既不刺激活有机体也不抑制所投予化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。
在本发明中可用的载剂种类并无特别限制，并且任何载剂只要其是所属领域中一般使用的并且是医药学上可接受的即可以使用。作为载剂的非限制性实例，存在生理盐水、无菌水、林葛尔氏溶液(Ringer′s solution)、缓冲生理盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等。这些可以单独或以其至少两者的混合物形式使用。
此外，必要时，可以另外添加并且使用另一普通添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂和/或细菌抑制剂，并且所述组合物可以通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂等配制成注射配制品(如水溶液、悬浮液、乳液等)、丸剂、胶囊、颗粒、锭剂等，并随后使用。
用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的组合物的投药方法并无特别限制，但是可以使用所属领域中一般使用的任何方法。作为投药方法的一个非限制性实例，所述组合物可以口服或非经肠方式投予。
作为口服配制品的非限制性实例，存在糖衣锭、口含锭、锭剂、水性悬浮液、油性悬浮液、制备的散剂、颗粒、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆、酏剂等。
为了将根据本发明的组合物配制成如锭剂、胶囊等的配制品，配制品可以还含有粘合剂，如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支链淀粉、纤维素、明胶；赋形剂，如磷酸氢钙等；崩解剂，如玉米淀粉、甘薯淀粉等；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂基反丁烯二酸钠、聚乙二醇蜡等。在胶囊配制品的情况下，配制品可以另外含有除上述材料以外的液体载剂，如脂肪油。
作为非经肠投药方法，可以使用静脉内投药方法、腹膜内投药方法、肌肉内投药方法、皮下投药方法或局部投药方法等。此外，也可以使用将组合物施用或喷雾到疾病部位上的方法，但本发明并不限于此。
用于非经肠投药的配制品的实例可以包含用于皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射等的注射配制品；栓剂配制品；喷雾配制品，例如能够通过呼吸系统吸入的气雾剂配制品等，但本发明并不限于此。为了将组合物配制成注射配制品，根据本发明的组合物可以与稳定剂或缓冲剂一起于水中混合，由此制备溶液或悬浮液，并且随后可以将制备的溶液或悬浮液以单位剂量配制用于安瓿或小瓶。在将组合物配制成如气雾剂配制品等的喷雾配制品的情况下，可以将推进剂等与添加剂混合在一起，以便分散水分散性缩合物或湿润散剂。
适合用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的组合物的施用、喷雾或投药剂量可以取决于以下因素而可变地确定：如年龄、体重、性别、病征程度、食物种类、投药个体动物的排泄率等以及配制组合物的方法、投药方法、投药时间和/或途径。一般，具有所属领域普通技术的兽医可以易于确定用于所需治疗的有效剂量并对此开出处方。
在另一个实施例中，本发明可以提供含有噬菌体ΦCJ21作为活性成分的抗生素。
本文中所用的术语“抗生素”意指能够以药物形式提供给动物(包含人类)从而杀死细菌的药剂，并且相当于笼统地表示防腐剂、消毒剂以及抗细菌剂的概念。
含有根据本发明的噬菌体ΦCJ21作为活性成分的抗生素与根据现有技术的抗生素相比，可以具有针对产气荚膜梭菌的高特异性，从而不杀死有益细菌，而是杀死特定病原细菌，并且不诱发耐药性，使得根据本发明的抗生素可以作为与根据现有技术的抗生素相比具有延长使用期限的新颖抗生素而加以提供。
在另一个实施例中，本发明可以提供含有噬菌体ΦCJ21作为活性成分的饲料添加剂和饮用水添加剂。
根据本发明的饲料添加剂和饮用水添加剂可采用噬菌体ΦCJ21或含有其的组合物以饲料添加剂或饮用水添加剂形式单独制备并且随后与饲料或饮用水混合的方式、或采用在准备饲料或饮用水时直接添加噬菌体ΦCJ21或含有其的组合物的方式使用。
用作根据本发明的饲料添加剂或饮用水添加剂的噬菌体ΦCJ21或含有其的组合物可以呈液态或干燥状态，并且优选地呈干燥粉末形式。
用于以干燥粉末形式制备根据本发明的饲料添加剂和饮用水添加剂的干燥法不受特别限制，而是一般用于所属领域的方法均可以使用。作为干燥法的非限制性实例，存在风干法、自然干燥法、喷雾干燥法、冰冻干燥法等。可以单独使用这些方法中的一种方法或可以将至少两种方法彼此共同使用。
可将另一非病原微生物另外添加到饲料添加剂或饮用水添加剂。能够添加的微生物的非限制性实例可以从由以下组成的群组中选出：能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖转化酶的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，如枯草芽孢杆菌等；在厌氧条件下(如牛胃)具有生理活性和有机物质降解活性的乳杆菌属(Lactobacillus sp.)；具有增加家畜重量、产奶量和饲料可消化性的作用的霉菌，如米曲霉菌(Aspergillus oryzae)等；以及酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。这些可以单独使用或以其至少两者的混合物形式使用。
含有根据本发明的噬菌体ΦCJ21作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂可以视需要还含有其它添加剂。作为可用添加剂的非限制性实例，存在粘合剂、乳化剂、防腐剂等，其是为了防止饲料或饮用水的质量劣化而添加；氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提炼物、寡醣等，其是为了增加饲料或饮用水的效用而添加。另外，添加剂可以还包含饲料混合剂等。这些可以单独使用或以其至少两者的混合物形式使用。
以饲料的100重量份计，可以含有含量为0.05到10重量份、更优选0.1到2重量份的饲料添加剂。以饮用水的100重量份计，可以含有含量为0.0001到0.01重量份、更优选0.001到0.005重量份的饮用水添加剂。针对产气荚膜梭菌的噬菌体ΦCJ21的活性可以在上述范围得以充分展现。
在另一个实施例中，本发明通过添加含有噬菌体ΦCJ21作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂或直接添加噬菌体ΦCJ21来制备饲料或饮用水。
用于本发明的饲料不受特别限制，而是一般用于所属领域的任何饲料均可以使用。饲料的非限制性实例可以包含植物饲料，如谷物、根以及果实、食品加工副产品、藻类、纤维、药物副产品、脂肪、淀粉、葫芦科植物或谷物副产品；和动物饲料，如蛋白质、无机物质、脂肪、矿物质、单细胞蛋白、浮游生物或粮食。这些可以单独使用或以其至少两者的混合物形式使用。
用于本发明的饮用水不受特别限制，而是一般用于本发明的任何饮用水均可以使用。
在另一个实施例中，本发明可以提供含有噬菌体ΦCJ21作为活性成分的消毒剂或清洁剂。消毒剂或清洁剂的配制品不受特别限制，而是消毒剂或清洁剂可以配制成所属领域中已知的任何配制品。
为了去除产气荚膜梭菌，可以将消毒剂喷雾于动物生活区、屠宰场、死亡区域、烹饪场所或烹饪设备等，但本发明并不限于此。
清洁剂可以用于清洗暴露或将暴露于产气荚膜梭菌的动物(特别是家禽或猪类)的皮肤表面或身体每一个部位，但本发明并不限于此。
在另一个实施例中，本发明提供一种通过使用噬菌体ΦCJ21或含有其作为活性成分的组合物来预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的方法。感染性疾病可以优选地是坏死性肠炎，但本发明并不限于此。预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的目标可以是家禽或猪类，但本发明并不限于此。
具体来说，根据本发明的预防或治疗感染性疾病的方法可以包含向除人类以外受产气荚膜梭菌感染或处于产气荚膜梭菌感染风险中的目标投予医药学有效剂量的噬菌体ΦCJ21或含有其作为活性成分的组合物。对所属领域的技术人员将显而易见的是，当向患者投予医药组合物时，适合的总日剂量可以由主治医师或兽医在合理医学判断的范围内确定。
对于特定动物来说，除所需反应的种类和程度、对应个体的年龄、体重、一般健康状况、性别或饮食以外，噬菌体ΦCJ21或含有其作为活性成分的组合物的特定医药学有效剂量可以通过考虑噬菌体ΦCJ21或含有其的组合物的投药时间和投药途径、组合物的分泌速率、疗法持续时间等来确定。此外，医药学有效剂量可以根据多种因素而发生不同变化，如同时或单独使用的药物或其它组合物的成分和医学领域中熟知的类似因素。
根据本发明的噬菌体ΦCJ21或含有其作为活性成分的组合物可以医药形式(鼻喷雾)投予动物或以直接添加到动物的饲料或饮用水并且随后喂所述饲料或饮用水的方法投予。此外，噬菌体ΦCJ21或含有其的组合物可以饲料添加剂或饮用水添加剂形式混合于饲料或饮用水中并且随后投予。
根据本发明的噬菌体ΦCJ21或含有其作为活性成分的组合物的投药途径和投药方法不受特别限制，而是可以使用任何投药途径和投药方法，只要噬菌体ΦCJ21或含有其的组合物可以达到对应目标组织即可。即，噬菌体ΦCJ21或含有其作为活性成分的组合物可以通过各种口服或非经肠途径投予。作为投药途径的非限制性实例，可以进行经口、经直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、皮下以及经鼻投药或吸入等。
在下文中，将通过实例详细描述本发明。然而，这些实例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不限于这些实例。
[实例1]分离感染产气荚膜梭菌的噬菌体
<实例1-1>
噬菌体的筛选和单一噬菌体的分离
在从三和集团育种农业公司(Samwhaw Gps.Breeding Agri.Inc.)(其是忠清南道(South Chungchong Province)的养鸡和养猪场)的粪便样品分离的50ml样品移到离心瓶并在4,000rpm下离心10分钟后，用0.45μm过滤器过滤上清液以制备样品溶液，并且随后使用所制备的样品溶液进行软琼脂覆盖法。软琼脂覆盖法是使用在顶部琼脂(使用0.7％琼脂附着到固体培养基上)中生长的宿主细胞观察噬菌体溶解作用的方法。
具体来说，将18ml样品滤液与150μl在动植物检疫机关(Animal and PlantQuarantine Agency)分离的产气荚膜梭菌(CP，BCCP 17-1)振荡培养溶液(OD600＝2)和2ml10X脑心浸液(10XBrain-heart infusion，下文称为‘BHI’培养基)混合(被组成为具有1L的最终体积)且在37℃下培养18小时。接着，将培养液在4,000rpm下离心10分钟并且使用0.45μm过滤器过滤上清液。此后，在将5ml 0.7％琼脂(w/v)和150μl产气荚膜梭菌(BCCP17-1)振荡培养溶液(OD600＝2)的混合物倾倒于BHI平板(BHI+0.2％羊血)中并硬化后，将10μl样品培养物滤液滴在上面，接着在30℃下培养18小时。接着，证实噬菌斑形成。
在将产生溶解的样品培养滤液适当稀释并与150μl产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)振荡培养溶液(OD600＝2)混合后，进行软琼脂覆盖法，从而获得单一噬菌斑。由于人们认为单一噬菌斑是由单一噬菌体形成，所以为了纯化并分离单一噬菌体，选择单一噬菌斑，置于400μl SM溶液(NaCl 5.8g/l；MgSO47H2O 2g/l；1M Tris-Cl(pH 7.5)，50ml；H2O，被组成为具有1L的最终体积)中并且在室温下放置4小时，由此纯化并分离单一噬菌体。
为了获得大量经分离的噬菌体，选择100μl单一噬菌体溶液的上清液并与12ml0.7％琼脂和500μl产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)振荡培养溶液混合，接着在直径为150mm的LB培养基中进行软琼脂覆盖法。在将15ml SM溶液倾倒于完全产生溶解的平板中后，将平板在室温下轻柔地振荡4小时，由此排出软琼脂中的噬菌体。回收已排出噬菌体的SM溶液，并向其中添加量为最终体积的1％的氯仿，适当混合10分钟，接着在4,000rpm下离心10分钟。将如上所述获得的上清液用0.45μm过滤器过滤并且储存在低温下。
<实例1-2>
噬菌体的大规模培养和纯化
使用产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)大规模培养所选噬菌体，并且随后从其中纯化噬菌体。
具体来说，将1％的产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)振荡培养溶液接种于液体培养基中以便大量生产，并且同时以0.1的感染复数(multiplicity of infection，MOI)向其中放置噬菌体，同时接种产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)，由此进行协同感染。接着，在30℃厌氧条件下进行静置培养。
此后，在4℃和12,000rpm下进行离心20分钟，并且随后用0.45μm过滤器过滤上清液。在将NaCl和聚乙二醇(PEG)添加到经过滤的上清液以便最终浓度分别为1M和10％(w/v)并彼此混合后，将混合物另外在4℃下放置8小时或大于8小时。接着，在4℃和12,000rpm下进行离心20分钟后，接着去除上清液并获得沉淀。
使用5ml SM溶液再悬浮获得的沉淀并且在室温下放置20分钟。此后，用0.45μm过滤器过滤上清液并使用甘油密度梯度法(密度：40％，5％甘油)进行超速离心(35,000rpm，1小时，4℃)，由此纯化噬菌体ΦCJ21。在使用500μl SM溶液再悬浮经纯化的ΦCJ21后，测量效价。
本发明人将通过从粪便提取样品获得的并且具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀细菌活性的噬菌体称为“噬菌体ΦCJ21”并且在2013年1月30日将所述噬菌体以保藏编号KCCM11363P保藏在韩国微生物保藏中心(韩国首尔市西大门区弘济一洞361-221361-221)。
<实例2>
ΦCJ21的形态学观察
将经纯化的噬菌体ΦCJ21稀释在0.01％明胶溶液中并且随后由2.5％戊二醛溶液固定。将经固定的噬菌体滴在经碳涂覆的云母板(约2.5mm×2.5mm)上，使其适应10分钟并用无菌蒸馏水洗涤。将碳膜安放在铜网上，用4％乙酸双氧铀染色30秒到60秒、干燥并使用透射电子显微镜(JEM-1011，80kV，放大倍率：×120,000到×200,000)进行研究(图1)。
图1示出了噬菌体ΦCJ21的电子显微照片，并且可以了解到，由于所述噬菌体不具有等距衣壳和可收缩尾部，所以所述噬菌体在形态学上属于长尾噬菌体科。
<实例3>
ΦCJ21的基因组DNA尺寸分析
基因组DNA是从通过超速离心纯化的噬菌体ΦCJ21提取。
具体来说，将乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA，pH 8.0)、蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)添加到经纯化的噬菌体ΦCJ21的培养液中，以便最终浓度分别为20mM、50μg/ml以及0.5％(w/v)，并且随后在50℃下处于静止状态1小时。此后，向其中添加相等体积的苯酚(pH 8.0)，接着在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。
将上清液与相等体积的PC(苯酚∶氯仿＝1∶1)混合并且在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。将上清液与相等体积的氯仿混合并且在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。所获得的上清液依次与10％(v/v)3M乙酸钠和以总体积计两倍体积的95％冷乙醇混合，并且在-20℃下放置1小时。随后，在0℃和12,000rpm下进行离心10分钟，并且通过去除上清液获得沉淀。接着，向其中添加50μl Tris-EDTA(TE)缓冲剂(pH8.0)，由此溶解所获得的沉淀。将所提取的DNA稀释10倍，并且通过测量在OD260下的吸光度来测量浓度。
接着，将1μg DNA装载于1％脉冲场凝胶电泳(pulse-field gelelectrophoresis，PFGE)琼脂糖凝胶上，并且使用BIORAD PFGE系统程序7(尺寸范围：25-100kb；切换时间斜坡：0.4-2.0秒，线性形状；正向电压；180V；反向电压：120V)在室温下进行电泳20小时(图2)。
图2是噬菌体ΦCJ21的基因组DNA的脉冲场凝胶电泳(PFGE)照片，并且可以证实噬菌体ΦCJ21的基因组DNA的尺寸约为56kb。
<实例4>
ΦCJ21的蛋白质图谱分析
将15μl经纯化的噬菌体ΦCJ21溶液(1010pfu/ml效价)与3μl 5×SDS样品溶液混合并加热5分钟。此后，使噬菌体ΦCJ21的总蛋白质在15％SDS-PAGE凝胶中展开，并且随后使用考马斯亮蓝(coomassie blue)染料溶液在室温下使凝胶染色1小时(图3)。
图3是示出对噬菌体ΦCJ21进行SDS-PAGE的结果的电泳照片，并且观察到尺寸为约40kDa、51kDa、53kDa以及70kDa的主要蛋白质。在图3中，M是成为用于测量分子量的标准品的蛋白质。
<实例5>
ΦCJ21的基因序列分析
为了确认经纯化的噬菌体ΦCJ21的遗传特征，使用基因分析装置FLX titanium测序器(罗氏公司(Roche))分析噬菌体ΦCJ21的DNA。基因是在千年基因公司(MacrogenINC.)使用GS和从头组装软件(de novo assembler software)(罗氏公司)组装。使用GeneMArk.hmm，Glimmer 3.02版和FGENESB软件进行开放阅读框的测序分析。使用BLASTP和InterProScan程序进行开放阅读框的鉴定。
噬菌体的基因组序列与现有报导的噬菌体具有各种相似性，但是经证实并不存在所有部分均与本发明的噬菌体完全(100％)相等的噬菌体。因此，可以证实所述噬菌体是新分离的噬菌体。
噬菌体ΦCJ21与其它噬菌体之间的核酸序列同源性分析数据在表1中示出。
[表1]
上文制备的噬菌体ΦCJ21的部分基因组序列与SEQ ID No：1相同。基因组序列是通过基因分析仪来测定。
<实例6>
取决于pH的ΦCJ21的稳定性试验
为了确认噬菌体ΦCJ21在低pH环境中的稳定性，在宽pH范围(pH 4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0以及9.8)上进行稳定性试验。
关于试验，分别制备0.2M浓度的各种pH溶液(乙酸钠缓冲剂(pH 4.0、pH 5.5以及pH 6.4)、磷酸钠缓冲剂(pH 6.9和pH 7.4)以及Tris-HCl溶液(pH 8.2、pH 9.0以及pH9.8))。
在90μl的每一种pH溶液与10μl的具有1.0×109pfu/ml效价的噬菌体溶液混合使得每一pH溶液的浓度变为1M后，将每一pH溶液在室温下放置30分钟、1小时以及2小时。接着，逐步稀释反应溶液，滴加10μl每一步骤的稀释溶液并且通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，并通过是否存在溶解来测量效价(图4)。
图4示出了噬菌体ΦCJ21的耐酸试验的结果。如图4中所示，可以证实噬菌体ΦCJ21在4.0到9.8的pH范围中并不损失其活性并且相当稳定多达2小时。
<实例7>
取决于温度的ΦCJ21的稳定性试验
在使用噬菌体作为噬菌体配制品当中的饲料添加剂配制品的情况下，进行试验来确认抵抗在噬菌体配制过程期间产生的热量的稳定性。
具体来说，将200μl具有1.0×108pfu/ml效价的噬菌体ΦCJ21溶液在60℃下放置0分钟、10分钟、30分钟、60分钟以及120分钟。接着，逐步稀释上述溶液，滴加10μl每一稀释溶液并且通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，并通过是否存在溶解来测量效价(图5)。
图5示出了噬菌体ΦCJ21的耐热性试验的结果。如图5中所示，可以了解到活性并未显著降低直到噬菌体ΦCJ21暴露在60℃下2小时。
<实例8>
ΦCJ21抗干燥的稳定性试验
在使用噬菌体作为噬菌体配制品当中的饲料添加剂配制品的情况下，进行试验来确认抵抗在噬菌体配制过程期间产生的干燥条件的稳定性。
具体来说，使用快速真空机(快速真空浓缩机5301，艾本德公司(Eppendorf))将100μl具有1.0×108pfu/ml效价的噬菌体ΦCJ21溶液在60℃下干燥120分钟。将在干燥后获得的丸粒以等于起始溶液的量放置在4℃下SM溶液中并再悬浮一天。
接着，逐步稀释上述溶液，滴加10μl每一步骤的稀释溶液并且通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，并通过是否存在溶解来测量效价(图6)。
图6示出了噬菌体ΦCJ21的耐旱性实验的结果。如图6中所示，可以了解到噬菌体ΦCJ21在干燥后的效价减少到干燥前效价的约1/10。
<实例9>
关于产气荚膜梭菌野生型菌株的ΦCJ21的感染谱试验
除用于实验的产气荚膜梭菌(BCCP 17-1)以外，对由动植物检疫机关和建国大学(Kunkuk University)分离的45种产气荚膜梭菌野生型菌株试验了噬菌体ΦCJ21是否具有溶解活性。
具体来说，滴加10μl具有1.0×1010pfu/ml效价的噬菌体ΦCJ21溶液与每一种菌株的150μl振荡培养溶液(OD600＝2)混合并且通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时。接着，观察是否形成噬菌斑。
作为实验结果，在45种产气荚膜梭菌野生型菌株当中，44种菌株感染，使得感染比率为约97.7％并且溶解比率为约97.7％。结果在表2和表3中示出。
表2
[表2]
表3
[表3]
申请人或代理人的文件编号P13-5114 国际申请编号
关于所保藏微生物或其它生物材料的说明
(PCT规则13bis)
表格PCT/RO/134(1998年7月；2004年1月再版)

Claims (10)

1.一种噬菌体ΦCJ21，其保藏编号为KCCM11363P，所述噬菌体ΦCJ21具有针对产气荚膜梭菌的特异性杀细菌活性，其中所述噬菌体ΦCJ21具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
2.一种组合物，用于预防或治疗由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病，所述组合物包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ21作为活性成分，所述噬菌体ΦCJ21的保藏编号为KCCM11363P。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述感染性疾病是坏死性肠炎。
4.一种抗生素，包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ21作为活性成分，所述噬菌体ΦCJ21的保藏编号为KCCM11363P。
5.一种饲料添加剂，包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ21作为活性成分，所述噬菌体ΦCJ21的保藏编号为KCCM11363P。
6.一种饮用水添加剂，包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ21作为活性成分，所述噬菌体ΦCJ21的保藏编号为KCCM11363P。
7.一种消毒剂，包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ21作为活性成分，所述噬菌体ΦCJ21的保藏编号为KCCM11363P。
8.一种清洁剂，包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ21作为活性成分，所述噬菌体ΦCJ21的保藏编号为KCCM11363P。
9.一种噬菌体ΦCJ21或组合物在制备预防或治疗除人类以外的动物的由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的药物的用途，所述噬菌体ΦCJ21如权利要求1所述且其保藏编号为KCCM11363P，所述组合物权如利要求2所述。
10.根据权利要求9所述的噬菌体ΦCJ21或组合物在制备预防或治疗除人类以外的动物的由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病的药物的用途，其中所述感染性疾病是坏死性肠炎。
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