ES2724298T3 - Nuevo bacteriófago y composición antibacteriana que lo comprende - Google Patents

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Abstract

Un bacteriófago ΦCJ21 (KCCM11363P) que tiene una actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens, donde la secuencia de ácido nucleico de dicho bacteriófago Φ CJ21 es SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevo bacteriófago y composición antibacteriana que lo comprende
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo bacteriófago que tiene una actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens patógena y a una composición antibacteriana que comprende el mismo. Además, la presente invención se refiere a la composición antibacteriana o al nuevo bacteriófago para su uso en la prevención o en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por Clostridium perfringens.
Técnica anterior
Clostridium perfringens (CP), que es un bacilo anaerobio obligatorio gram-positivo de gran tamaño, se conoce como una bacteria que carece de flagelo y forma una espora. Clostridium perfringens, que es una bacteria causante de diarrea o similar, en particular, en animales domésticos tales como los pollos, cerdos, etc. y similares, ha sido reconocida como una de las bacterias patógenas importantes y letales en la industria ganadera, al igual que la Salmonella causante de la fiebre tifoidea aviar.
Actualmente, una de las enfermedades generadas con frecuencia en las industrias aviar y porcina es la enteritis necrótica producida por Clostridium perfringens. Se sabe que la enteritis necrótica se genera con frecuencia por la infección simultánea de Clostridium perfringens y Coccidium, y como síntoma principal de la enteritis necrótica, se encuentra la diarrea con sangre debida a lesiones necróticas graves en la parte inferior del intestino delgado de los pollos, cerdos o similares.
Esta enteritis necrótica genera síntomas de deshidratación, diarrea periódica y similares, en un animal infectado según la gravedad de la enfermedad, debilita gradualmente el cuerpo del animal, y causa retraso del crecimiento y similares, de manera que la enteritis necrótica se ha convertido en un problema importante para la industria ganadera. Además, dado que Clostridium perfringens se propaga fácilmente a través de las heces de los animales, puede generarse fácilmente la transmisión entre animales en un espacio de reproducción común por infección oral a través del suelo o el pienso contaminados, o similares. De forma particular, la incidencia en animales jóvenes es alta, por lo que Clostridium perfringens se ha convertido en un problema.
Al mismo tiempo, el bacteriófago es un tipo de virus especializado que infecta y destruye únicamente bacterias, y puede autorreplicarse únicamente dentro de las bacterias hospedadoras. El bacteriófago tiene una fuerte especificidad hospedadora en comparación con los antibióticos, y recientemente, el problema de la aparición de cepas resistentes a los antibióticos se ha vuelto grave, de manera que se ha aumentado el interés en el uso práctico del bacteriófago (Documentos de no patente 1 y 2).
Por lo tanto, en diversos países del mundo, se ha realizado activamente una investigación con respecto al bacteriófago, y, además de una solicitud de patente para el bacteriófago, han aumentado gradualmente los intentos por obtener la aprobación de la Administración de Medicamentos y Alimentos (FDA) para una composición que contenga el bacteriófago.
Como los documentos de la técnica anterior relativos al bacteriófago, un bacteriófago que tiene una actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens se ha divulgado en el Documento de patente 1, y un bacteriófago que tiene una actividad bactericida específica contra Staphylococcus aureus se ha divulgado en el Documento de Patente 2. Además, en el Documento de patente 3, se ha divulgado la proteína lítica derivada de un bacteriófago que destruye específicamente la estructura de peptidoglicano de la membrana celular bacteriana, y lisados bacterianos por la proteína lítica.
Sin embargo, a pesar de la presencia de las siguientes técnicas anteriores, sigue siendo insuficiente la tecnología asociada con el bacteriófago para prevenir y/o tratar enfermedades infecciosas, en particular, la enteritis necrótica producida por Clostridium perfringens, que es un problema todavía importante en la industria ganadera, incluyendo las industrias aviar y porcina, por lo que se debe desarrollar un bacteriófago y una tecnología asociada con el bacteriófago.
Documentos de la técnica anterior:
Documento de patente:
(Documento de patente 1) Publicación de patente de Corea abierta a inspección pública n.° 10-2012-0076710 A (Documento de patente 2) Patente de Corea con n.° de registro 10-0910961 B1
(Documento de patente 3) Publicación de patente de Corea abierta a inspección pública n.° 10-2009-0021475 A Documento de no patente
(Documento de no patente 1) Cislo M, et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. 2:175-183, 1987
(Documento de no patente 2) Sung Hoon Kim et al, “Bacteriophage, novel alternative antibiotics”, BioWave Vol. 7 n.° 15, 2005, BRIC.
Problema técnico
Los presentes inventores realizaron estudios con el fin de resolver problemas tales como las bacterias resistentes que aparecen tras el uso de antibióticos, restos de antibióticos de la carne y similares, y prevenir y tratar eficazmente enfermedades infecciosas producidas por Clostridium perfringens, y como resultado de ello, los presentes inventores aislaron de la naturaleza un nuevo bacteriófago ÓCJ21 (KCCM11363P), que tiene una actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens.
Además, los presentes inventores identificaron características morfológicas, bioquímicas y genéticas del nuevo bacteriófago, y confirmaron que el bacteriófago tenía excelente resistencia al ácido, resistencia al calor, resistencia a la sequía y similares, desarrollando así un antibiótico, un desinfectante, un aditivo para pienso y otras composiciones usando el nuevo bacteriófago. Además, los presentes inventores desarrollaron una composición para prevenir o tratar enfermedades infecciosas producidas por Clostridium perfringens, y un método para prevenir o tratar la enfermedad usando la composición.
La presente invención pretende proporcionar un bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) que tiene una actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens, donde la secuencia de ácido nucleico de dicho bacteriófago OCJ21 es SEQ ID NO: 1.
Además, la presente invención pretende proporcionar una composición que comprenda el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la invención como principio activo.
Además, la presente invención pretende proporcionar un aditivo para piensos, un aditivo para agua potable, un desinfectante o un limpiador que contengan el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la invención como principio activo.
Además, la presente invención pretende proporcionar la composición de la invención o el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la invención para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades infecciosas producidas por Clostridium perfringens en los animales, excepto para los seres humanos.
Solución técnica
De acuerdo con una realización ilustrativa de la presente invención, se proporciona un bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) que tiene una actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens, donde la secuencia de ácido nucleico de dicho bacteriófago OCJ21 es SEQ iD NO: 1.
De acuerdo con otra realización ilustrativa de la presente invención, se proporciona una composición que comprende el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) como se ha descrito anteriormente como principio activo.
De acuerdo con otra realización ilustrativa de la presente invención, se proporciona un aditivo para piensos, un aditivo para agua potable, un desinfectante o un limpiador que contienen el bacteriófago OCJ21 (KCCM1 1363P) como se ha descrito anteriormente como principio activo.
De acuerdo con otra realización ilustrativa de la presente invención, se proporciona la composición de la invención o el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad infecciosa causada por Clostridium perfringens.
Efectos ventajosos
El bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de acuerdo con la presente invención tiene el efecto de destruir específicamente a Clostridium perfringens.
Además, el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de acuerdo con la presente invención tiene excelentes resistencia a los ácidos, resistencia al calor y resistencia a la sequía, de manera que el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) se puede usar como un material para prevenir o tratar enfermedades infecciosas producidas por Clostridium perfringens en varios intervalos de temperatura o de pH, condiciones de humedad y similares, y se utiliza como un antibiótico, un aditivo para pienso, un aditivo para agua potable, un desinfectante, un limpiador o similares.
Además, de acuerdo con la presente invención, el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) o una composición que contiene el mismo (KCCM11363P) como principio activo pueden usarse en la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por Clostridium perfringens.
Descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una fotografía de microscopio electrónico de un nuevo bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P, que en lo sucesivo, en el presente documento, se denominará “OCJ21”).
La FIG. 2 muestra el resultado de una electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) del nuevo bacteriófago OCJ21.
La FIG. 3 muestra el resultado de una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) del nuevo bacteriófago OCJ21.
La FIG. 4 es un gráfico que muestra el resultado de un ensayo de resistencia al ácido del nuevo bacteriófago OCJ21.
La FIG. 5 es un gráfico que muestra el resultado de un ensayo de resistencia al calor del nuevo bacteriófago OCJ21.
La FIG. 6 es un gráfico que muestra el resultado de un ensayo de resistencia a la sequía del nuevo bacteriófago OCJ21.
Mejor forma de realización
En lo sucesivo, en el presente documento, se describirá detalladamente la presente invención. Dado que los contenidos que no se describen en la presente memoria descriptiva pueden ser suficientemente reconocidos o inferidos por los expertos en la materia o en una materia similar, se omitirá una descripción de los mismos.
En una realización, la presente invención proporciona un bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) que tiene una actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens (CP), donde la secuencia de ácido nucleico de dicho bacteriófago OCJ21 es SEQ ID NO: 1.
Se sabe que Clostridium perfringens, que es un bacilo anaerobio obligatorio gram-positivo de gran tamaño, carece de flagelo y forma una espora. Clostridium perfringens, que es una bacteria causante de diarrea o similar, en animales, en particular, en animales domésticos tales como aves de corral, cerdos y similares, ha sido reconocida como una de las bacterias patógenas peligrosas y letales en la industria ganadera tal como la Salmonella causante de la fiebre tifoidea aviar.
Un bacteriófago es un virus específico de bacterias que infecta bacterias específicas para suprimir e inhibir el crecimiento de las bacterias, y significa un virus que incluye ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), monocatenario o bicatenario, como material genético.
Un bacteriófago OCJ21 de la presente invención, que es un bacteriófago que tiene especificidad de especie para infectar selectivamente Clostridium perfringens, tiene una cápside isométrica y una cola no contráctil, y pertenece morfológicamente a Siphoviridae (FIG. 1). Los datos del análisis de homología de las secuencias de ácido nucleico entre el bacteriófago ÓCJ21 y otros bacteriófagos se muestran en la Tabla 1. La actividad del bacteriófago OCJ21 fue estable en el intervalo de pH 4 a pH 9,8 (resistencia a los ácidos, véase la FIG. 4). OCJ21 mantuvo su actividad durante 2 horas al exponerse a 60 °C (resistencia al calor, véase la FIG. 5), y su título se redujo aproximadamente 1/10 tras el secado (véase la FIG. 6). La secuencia de ácido nucleico del bacteriófago OCJ21 es la misma que la SEQ ID NO: 1.
El bacteriófago OCJ21, que era un bacteriófago recién aislado por los presentes inventores, se depositó en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos (361-221, Hongjedong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea) con el número de depósito KCCM11363P el 30 de enero de 2013.
En otra realización, la presente invención proporciona una composición que contiene el bacteriófago OCJ21 como principio activo. Como ejemplo de la composición, la presente descripción proporciona un antibiótico.
Dado que el bacteriófago OCJ21 tiene una actividad antibacteriana capaz de matar específicamente a Clostridium perfringens, el bacteriófago OCJ21 se puede usar para prevenir o tratar enfermedades generadas por la infección de Clostridium perfringens. Como un ejemplo adecuado de la enfermedad infecciosa causada por Clostridium perfringens que puede tratarse usando el bacteriófago OCJ21, está la enteritis necrótica, pero la presente invención no se limita a la misma.
La enteritis necrótica, que es una de las principales enfermedades infecciosas causadas por Clostridium perfringens, corresponde a una enfermedad bacteriana que se genera con mayor frecuencia en los animales domésticos, en particular, en las aves de corral, y causa un daño significativo. La enfermedad se puede generar en aves de corral, especialmente en pollos, esencialmente en todas las edades, pero se genera principalmente en pollos (de 2 a 5 semanas de vida) criados en el suelo, y también se genera con frecuencia en pollos (de 12 a 16 semanas de vida) criados en una jaula.
Como Clostridium perfringens prolifera excesivamente en el intestino delgado, se generan los síntomas de la enteritis necrótica, y se produce la necrosis de la mucosa gastrointestinal, diarrea repentina, y similares. Por ejemplo, en los cerdos, en el caso de la enteritis necrótica muy aguda, después de 1 a 2 días de su aparición, se genera la mortalidad de los cerdos, y en el caso de la enteritis necrótica aguda, después de 2 a 3 días de diarrea con sangre, se genera la mortalidad del cerdo. Además, en el caso de la enteritis necrótica subaguda, se desarrolla diarrea (no hay heces con sangre) durante 5 a 7 días, y luego se producen la debilidad y la deshidratación, y en el caso de la enteritis necrótica crónica, se produce diarrea intermitente, y se puede generar trastorno de crecimiento.
El término "prevención", como se usa en el presente documento, se refiere a todas las acciones para proporcionar el bacteriófago OCJ21 y/o la composición que contiene el mismo como principio activo a animales, excepto a seres humanos, para suprimir la enfermedad correspondiente o retrasar la aparición de la enfermedad.
El término "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a todas las acciones para proporcionar el bacteriófago OCJ21 y/o la composición que contiene el mismo como principio activo a animales, excepto a seres humanos, para permitir de esta manera que se mejore o alivie el síntoma de la enfermedad correspondiente provocada por la infección.
Como un ejemplo de la enfermedad infecciosa causada por Clostridium perfringens en la que el bacteriófago OCJ21 y/o la composición que contiene el mismo como principio activo se puede aplicar, está la enteritis necrótica, pero la presente invención no se limita a la misma.
La composición de acuerdo con la presente invención puede contener el bacteriófago OCJ21 en una cantidad preferentemente de 5 x 106 a 5 x 1012 ufp/ml, más preferentemente, de 1 x 106 a 1 x 101°ufp/mt.
La composición de acuerdo con la presente invención puede contener además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y se formula junto con el vehículo para proporcionarse de esta manera como un alimento, un fármaco, un aditivo para pienso, un aditivo para agua potable y similares. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento significa un vehículo o un diluyente que no estimula al organismo vivo ni inhibe la actividad biológica ni las propiedades de un compuesto que se administre.
Un tipo de vehículo que se puede usar en la presente invención no se limita a uno en particular, y se puede usar cualquier vehículo siempre y cuando se use en general en la técnica y que sea farmacéuticamente aceptable. Un ejemplo no restrictivo de vehículo, es solución salina, agua estéril, solución de Ringer, solución salina tamponada, solución de inyección de albúmina, solución de dextrosa, solución de maltodextrina, glicerol, etanol y similares. Estos se pueden usar solos o en una mezcla de al menos dos de ellos.
Además, si fuera necesario, otro aditivo general, tal como un antioxidante, un tampón y/o un agente bacteriostático, etc., se puede añadir y usar adicionalmente, y la composición se puede formular en una formulación para inyección tal como una solución acuosa, suspensión, emulsión, o similar, píldoras, cápsulas, gránulos, comprimidos, o similares, añadiendo de forma adicional un diluyente, un dispersante, un tensioactivo, un aglutinante y/o un lubricante, etc., y después usarse.
El método de administración de la composición no se limita a uno en particular, sino que se puede usar cualquier método usado en la técnica en general. Como ejemplo no restrictivo del método de administración, la composición se puede administrar por vía oral o parenteral.
Un ejemplo no restrictivo de la formulación para la administración oral, son trociscos, pastillas para chupar, comprimidos, suspensiones acuosas, suspensiones oleaginosas, polvos preparados, gránulos, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas blandas, jarabes, elixires o similares.
Para formular la composición de acuerdo con la presente invención en una formulación tal como un comprimido, una cápsula o similar, la formulación puede contener además un aglutinante tal como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, amilopectina, celulosa, gelatina; un excipiente, tal como fosfato dicálcico, o similar; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de batata, o similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio, estearilfumarato de sodio, cera de polietilenglicol, o similar. En el caso de la formulación en cápsulas, la formulación puede contener además un vehículo líquido, tal como aceite graso, además de los materiales anteriormente mencionados.
Como método de administración parenteral, se puede usar un método de administración intravenosa, un método de administración intraperitoneal, un método de administración intramuscular, un método de administración subcutánea o un método de administración local, etc. Además, también se puede usar un método de aplicación o pulverización de la composición sobre un lugar enfermo, pero la presente invención no se limita al mismo.
Un ejemplo de la formulación para la administración parenteral puede incluir las formulaciones para inyección por inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intramuscular o similares; formulaciones para supositorios; formulaciones de pulverización tales como formulaciones en aerosol que pueden inhalarse a través del sistema respiratorio o similares, pero la presente invención no se limita a las mismas. Para formular la composición en la formulación para inyección, la composición de acuerdo con la presente invención puede mezclarse en agua con un estabilizador o un tampón para preparar de este modo una solución o suspensión, y después, la solución o suspensión preparada se puede formular en una dosis unitaria en forma de ampolla o vial. En el caso de formular la composición en la formulación de pulverización, tal como la formulación en aerosol, o similar, se puede mezclar un propulsor, o similar, junto con un aditivo para que se disperse un condensado dispersado en agua o polvo húmedo. Una aplicación adecuada, pulverización o dosis de administración de la composición se pueden determinar de diferentes maneras dependiendo de factores tales como la edad, el peso, el sexo, el grado de síntoma de la enfermedad, el tipo de alimento, la velocidad de excreción de los animales que reciben la administración, o similares, así como del método de formulación de la composición, del método de administración, del tiempo y/o de la vía de administración. En general, un veterinario con experiencia normal en la técnica puede determinar y recetar fácilmente una dosis eficaz para el tratamiento deseado.
La presente descripción puede proporcionar un antibiótico que contenga el bacteriófago OCJ21 como principio activo.
El término "antibiótico", como se usa en el presente documento, significa un agente capaz de proporcionarse a animales, incluyendo seres humanos, en forma de fármaco para destruir bacterias de esta manera, y se corresponde con un concepto que indica colectivamente un conservante, un desinfectante y un agente antibacteriano.
El antibiótico que contiene el bacteriófago OCJ21 de acuerdo con la presente invención como principio activo puede tener una alta especificidad hacia la Clostridium perfringens en comparación con un antibiótico de acuerdo con la técnica anterior para que, de esta manera, no destruya bacterias beneficiosas, sino que destruya bacterias patógenas específicas, y no induzca resistencia farmacológica, de manera que el antibiótico de acuerdo con la presente invención puede proporcionarse como un nuevo antibiótico que tiene un mayor período de vida en comparación con el antibiótico de acuerdo con la técnica anterior.
En otra realización, la presente invención puede proporcionar un aditivo para pienso o un aditivo para el agua potable que contenga el bacteriófago OCJ21 como principio activo.
El aditivo para pienso y el aditivo para agua potable de acuerdo con la presente invención pueden usarse de una manera en la que el bacteriófago ÓCJ21 o la composición que lo contiene se preparen individualmente en forma de un aditivo para pienso o aditivo para agua potable, y después se mezclen con un pienso o con agua potable, o de una manera en la que el bacteriófago OCJ21 o la composición que lo contiene se añadan directamente durante la preparación del pienso o del agua potable.
El bacteriófago OCJ21 o la composición que contiene el mismo usados como el aditivo para pienso o el aditivo para agua potable de acuerdo con la presente invención pueden estar en estado líquido o en estado seco, y preferentemente, en forma de polvo seco.
El método de secado para la preparación del aditivo para pienso y del aditivo para agua potable de acuerdo con la presente invención en forma de polvo seco no se limita a uno en particular, sino que se puede usar un método usado de forma general en la técnica. Como ejemplo no restrictivo del método de secado, se encuentra un método de secado al aire, un método de secado natural, un método de secado por pulverización, un método de liofilización o métodos similares. Se pueden usar uno solo de estos métodos o al menos dos métodos juntos.
Se puede añadir otro microbio no patógeno además al aditivo para pienso o aditivo para el agua potable. Los ejemplos no restrictivos del microbio capaz de añadirse se puede seleccionar de entre un grupo que consiste en Bacillus sp. capaz de producir proteasa, lipasa y/o enzima conversora del azúcar, tal como Bacillus subtilis, o similar; Lactobacillus sp.,que tienen actividad fisiológica y actividad de degradación de un material orgánico en condiciones anaeróbicas talles como las del estómago de las vacas; hongos del moho que tienen los efectos de aumentar el peso del animal doméstico, la producción de leche y la digestibilidad del pienso, tal como Aspergillus oryzae, o similares; y levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, o similares. Estos se pueden usar solos o en una mezcla de al menos dos de ellos.
El aditivo para pienso o el aditivo para agua potable que, como principio activo, contiene el bacteriófago OCJ21 de acuerdo con la presente invención, puede contener además otros aditivos, según se necesite. Son ejemplos no restrictivos de aditivos utilizables, un aglutinante, un emulsionante, un conservante y similares, que se añaden para evitar que la calidad del pienso o del agua potable se deteriore; aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, compuestos nitrogenados no proteicos, silicatos, tampones, agentes colorantes, extractantes, oligosacáridos y similares, que se añaden para aumentar la utilidad del pienso o del agua potable. Por otra parte, el aditivo puede incluir además un agente de mezcla de pienso o similares. Estos se pueden usar solos o en una mezcla de al menos dos de ellos.
El aditivo para pienso puede estar contenido en una cantidad de 0,05 a 10, más preferentemente, de 0,1 a 2 partes en peso basado en 100 partes en peso de pienso. El aditivo para agua potable puede estar contenido en una cantidad de 0,0001 a 0,01, más preferentemente de 0,001 a 0,005 partes en peso basado en 100 partes en peso de agua potable. La actividad del bacteriófago OCJ21 contra Clostridium perfringens puede presentarse suficientemente en el intervalo mencionado anteriormente.
En otra realización, la presente invención proporciona un pienso o agua potable que se preparan añadiendo un aditivo para pienso o un aditivo para el agua potable que contiene el mismo como principio activo o se añade directamente el bacteriófago OCJ21.
El pienso usado en la presente invención no se limita a uno en particular, sino que se puede usar cualquier pienso usado en la técnica en general. Un ejemplo no restrictivo del pienso puede incluir piensos vegetales tales como granos, raíces y frutos, subproductos de procesamiento de productos alimentarios, algas, fibra, subproductos farmacéuticos, grasas, almidones, cucurbitáceas o subproductos del grano; y piensos para animales tales como proteínas, materiales inorgánicos, grasas, minerales, proteínas unicelulares, plancton animal o productos alimentarios. Estos se pueden usar solos o en una mezcla de al menos dos de ellos.
El agua potable usada en la presente invención no se limita a una en particular, sino que se puede usar cualquier agua potable usada en general en la presente invención.
En otra realización, la presente invención puede proporcionar un desinfectante o un limpiador que contenga como principio activo el bacteriófago OCJ21. La formulación del desinfectante o limpiador no se limita a una en particular, sino que el desinfectante o limpiador se puede formular en cualquier formulación conocida en la técnica.
El desinfectante puede pulverizarse para eliminar la Clostridium perfringens en una región donde vivan los animales, en un matadero, un área de generación de mortalidad, en un lugar donde se cocine o en los utensilios para cocinar, o en lugares similares, pero la presente invención no se limita a los mismos.
El limpiador se puede usar para lavar superficies cutáneas o cada uno de los sitios del cuerpo de los animales, en particular, aves de corral o cerdos, expuestos o que se vayan a exponer a Clostridium perfringens, pero la presente invención no se limita a los mismos.
En otra realización, la presente invención proporciona la composición de la invención o el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad infecciosa causada por Clostridium perfringens. La enfermedad infecciosa puede ser preferentemente enteritis necrótica, pero la presente invención no se limita a la misma. La diana de prevención o tratamiento de la enfermedad infecciosa causada por Clostridium perfringens puede ser un ave de corral o un cerdo, pero la presente invención no se limita a los mismos.
De forma detallada, la composición de la invención o el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la invención para su uso en la prevención o en el tratamiento de una enfermedad infecciosa de acuerdo con la presente invención se puede administrar a dianas infectadas por Clostridium perfringens o que están en riesgo de infección por Clostridium perfringens, excepto en seres humanos, a una dosis farmacéuticamente eficaz. Será obvio para los expertos en la materia, que cuando la composición farmacéutica se administra a un paciente, la dosis diaria total adecuada puede determinarla un médico o un veterinario tratante, dentro del alcance de su buen criterio médico.
Se puede determinar una dosis específica farmacéuticamente eficaz del bacteriófago OCJ21 o de la composición que contiene el mismo como principio activo para un animal específico considerando un momento de administración y una vía de administración del bacteriófago OCJ21 o de la composición que contiene el mismo, una velocidad de secreción de la composición, un período de duración de la terapia o similares, además de un tipo y grado de la respuesta deseada, de la edad, del peso, de un estado de salud general, del sexo o de la dieta del individuo correspondiente. Además, la dosis farmacéuticamente eficaz puede cambiarse de diversas maneras según varios factores, tales como los ingredientes de los fármacos u otras composiciones usados simultáneamente o por separado, y factores similares bien conocidos en un campo médico.
El bacteriófago OCJ21 de acuerdo con la presente invención, o la composición que contiene el mismo, como principio activo, puede administrarse a los animales como una forma farmacéutica (pulverizado nasal) o puede administrarse en un método directamente añadido a un pienso o al agua potable de los animales y después suministrarse el pienso o el agua potable. Además, el bacteriófago OCJ21 o la composición que contiene el mismo pueden mezclarse en un pienso o agua potable en forma de aditivo para pienso o aditivo para agua potable y después administrarse.
La vía de administración y el método de administración del bacteriófago OCJ21 de acuerdo con la presente invención, o la composición que contiene el mismo, como principio activo, no están limitados de forma particular, sino que se puede usar cualquier vía de administración y método de administración siempre que el bacteriófago OCJ21 o la composición que contiene el mismo puedan llegar al tejido diana correspondiente. Es decir, el bacteriófago OCJ21 o la composición que contiene el mismo como principio activo pueden administrarse a través de varias vías orales o parenterales. Como ejemplo no restrictivo de la vía de administración, se pueden realizar la vía oral, rectal, local, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, subcutánea y nasal, por inhalación, o similares, etc.
En lo sucesivo, en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle mediante los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos tienen como fin ilustrar únicamente la presente invención, y un alcance de la presente invención no está limitado en estos ejemplos.
Ejemplo 1: Aislamiento del bacteriófago que infecta a Clostridium perfringens
Ejemplos 1-1. Detección del bacteriófago y aislamiento de un solo bacteriófago
Tras aislar 50 mi de una muestra de heces de Samwhaw Gps. Breeding Agri. Inc., que es una granja de pollos y cerdos de la provincia meridional de Chungchong, se movieron a un bote de centrifugación y se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se filtró con un filtro de 0,45 mm para preparar una solución de muestra, y después se realizó un método de recubrimiento con agar blando usando la solución de la muestra preparada. El método de recubrimiento con agar blando es un método de observación de una acción lítica de bacteriófago en el que se usan células hospedadoras que crecen en la parte superior del agar (unido a un medio sólido usando agar al 0,7 %).
De forma detallada, se mezclaron 18 mi de filtrados de la muestra con 150 n i de una solución de cultivo agitada (DO600 = 2) de Clostridium perfringens, (CP, BCCP 17-1) aislada del Organismo de cuarentena de animales y plantas, y 2 mi de infusión de cerebro y corazón x10 (de aquí en adelante, medio "BHI") (compuesto para tener un volumen final de 1 l) y se cultivaron a 370C durante 18 horas. Después, se centrifugó la solución de cultivo a 4.000 rpm durante 10 minutos, y se filtró el sobrenadante usando el filtro de 0,45 pm. Posteriormente, se vertió una mezcla de 5 mi de agar al 0,7 % (p/v) y 150 pl de la solución de cultivo de agitación (DO600 = 2) de Clostridium perfringens (BCCP 17-1) y se endureció en una placa de BHI (BHI sangre de oveja al 0,2%), se depositaron encima 10 pl de la solución de filtrado del cultivo de muestra, seguido del cultivo a 30 °C durante 18 horas. Después, se confirmó que se había formado una placa.
Luego, se diluyó apropiadamente la solución de filtrado de cultivo de muestra donde se generó la lisis, y se mezcló con 150 pl de la solución de cultivo de agitación (DO600 = 2) de Clostridium perfringens (BCCP 17-1), se realizó el método de recubrimiento con agar blando, obteniendo así una sola placa. Dado que se considera que una sola placa está formada por un solo bacteriófago, para purificar y aislar el único bacteriófago, se seleccionó una sola placa, se dispuso en 400 pl de una solución de SM (NaCl a 5,8 g/l; MgSO47H2O a 2 g/l; Tris-Cl 1 M (pH 7,5), 50 mi; H2O, compuesta para tener un volumen final de 1 l), y se dejó a temperatura ambiente durante 4 horas, purificando y aislando así el bacteriófago individual.
Para garantizar una gran cantidad del bacteriófago aislado, se seleccionaron 100 pl de un sobrenadante de una solución de bacteriófago individual, y se mezclaron con 12 mi de agar al 0,7 % y 500 pl de la solución de cultivo agitada de Clostridium perfringens (BCCP 17-1), seguido de la realización del método de recubrimiento con agar blando en un medio LB con un diámetro de 150 mm. Tras verter 15 mi de la solución de SM en una placa donde se generó completamente la lisis, la placa se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 4 horas, descargando así el bacteriófago en el agar superior. Se recuperó la solución de SM donde se descargó el bacteriófago y se le añadió cloroformo en una cantidad del 1 % del volumen final y se mezcló adecuadamente durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante obtenido como se ha descrito anteriormente se filtró con un filtro de 0,45 pm y se almacenó a una temperatura fría.
Ejemplos 1-2. Cultivo a gran escala y purificación del bacteriófago
El bacteriófago seleccionado se cultivó a gran escala usando Clostridium perfringens (BCCP 17-1), y luego se purificó el bacteriófago del mismo.
De forma detallada, se inoculó el 1 % de la solución de cultivo agitada de Clostridium perfringens (BCCP 17-1) en un medio de cultivo líquido para la producción en masa, y al mismo tiempo, se introdujo el bacteriófago en su interior a una multiplicidad de infección (Mdl) de 0,1, simultáneamente a la inoculación de Clostridium perfringens (BCCP 17­ 1), realizándose así una infección conjunta. Después, se realizó un cultivo estático a 30 °C en condiciones anaeróbicas.
Posteriormente, se realizó la centrifugación a 4 °C y 12.000 rpm durante 20 minutos, y luego se filtró el sobrenadante con un filtro de 0,45 pm. Luego, se añadieron NaCl y polietilenglicol (PEG) al sobrenadante filtrado para obtener unas concentraciones finales de 1 M y 10 % (p/v), respectivamente, y se mezclaron entre sí, la mezcla se dejó a 4 °C durante 8 horas o más.
A continuación, luego se realizó la centrifugación a 4 °C y 12.000 rpm durante 20 minutos, después, se eliminó el sobrenadante y se obtuvieron los precipitados.
Se volvió a suspender el precipitado obtenido usando 5 mi de la solución de SM y se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Posteriormente, se filtró el sobrenadante con un filtro de 0,45 |jm y se realizó una ultracentrifugación (35.000 rpm, 1 hora, 4 °C) usando un método de gradiente de densidad de glicerol (densidad: 40 %, glicerol al 5 %), purificando así el bacteriófago OCJ21. Tras volverse a suspender el OCJ21 purificado usando 500 j l de la solución de SM, se midió un título.
El presente inventor llamó al bacteriófago obtenido mediante la extracción de la muestra de las heces y que tenía la actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens "bacteriófago OCJ21" y depositó el bacteriófago en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (361-221, Hongjedong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea) con el número de depósito KCCM11363P el 30 de enero de 2013.
Ejemplo 2: Observación de la morfología de 0CJ21
*99 Se diluyó el bacteriófago purificado OCJ21 en solución de gelatina al 0,01 % y luego se fijó con solución de glutaraldehído al 2,5 %. Se vertió el bacteriófago fijado en una placa de mica recubierta con carbono (aprox. 2,5 mm x 2,5 mm), adaptada al mismo durante 10 minutos, y se lavó con agua destilada estéril. En una rejilla de cobre, se montó una película de carbono, teñida con acetato de uranilo al 4 % durante 30 a 60 segundos, se secó y se estudió usando un microscopio electrónico de transmisión (JEM-1011, 80 kV, aumento: x120.000 a x200.000) (FIG. 1). La FIG. 1 muestra una fotografía de microscopio electrónico del bacteriófago OCJ21, y se puede apreciar que, dado que el bacteriófago carece de cápside isométrica y de cola contráctil, el bacteriófago pertenece morfológicamente a Siphoviridae.
Ejemplo 3: Análisis del tamaño del ADN genómico de 0CJ21
Se extrajo ADN genómico del bacteriófago OCJ21 purificada mediante la ultracentrifugación. De forma detallada, se añadieron ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, pH 8,0), proteinasa K y dodecilsulfato de sodio (SDS) a una solución de cultivo del bacteriófago OCJ21 purificado para tener concentraciones finales de 20 mM, 50 jg /m l y 0,5 % (p/v), respectivamente, y luego, permanecieron en un estado estacionario a 50 °C durante 1 hora. Posteriormente, se añadió y se agitó un volumen equivalente de fenol (pH 8,0), seguido de centrifugación a temperatura ambiente y a 12.000 rpm durante 10 minutos, obteniéndose de esta manera un sobrenadante.
El sobrenadante se mezcló con un volumen equivalente de PC (fenol:cloroformo = 1:1) y se centrifugó a temperatura ambiente y a 12.000 rpm durante 10 minutos, obteniéndose de esta manera un sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con un volumen equivalente de cloroformo y se centrifugó a temperatura ambiente y a 12.000 rpm durante 10 minutos, obteniéndose de esta manera un sobrenadante. El sobrenadante obtenido se mezcló secuencialmente con 10 % (v/v) de acetato de sodio 3 M y un volumen doble de etanol al 95 % frío, basado en el volumen total, y se dejó a -20 °C durante 1 hora. Posteriormente, se realizó la centrifugación a 0 °C y a 12.000 rpm durante 10 minutos, y se obtuvo el precipitado eliminando el sobrenadante. Después, se añadieron 50 j l de tampón Tris-EDTA (TE) (pH 8,0) para disolver así el precipitado obtenido. El ADN extraído se diluyó 10 veces, y se midió una concentración midiendo la absorbancia a DO260.
A continuación, se cargó 1 yg de ADN en gel de agarosa al 1 % para electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) y se realizó la electroforesis a temperatura ambiente durante 20 horas usando un programa de sistema BIORAD PFGE 7 (intervalo de tamaño: 25-100 kb; rampa de tiempo de conmutación: 0,4-2,0 segundos, forma lineal; voltaje directo: 180 V; voltaje inverso: 120 V) (FIG. 2).
La FIG. 2 es una fotografía de una electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) del ADN genómico del bacteriófago OCJ21, y se puede confirmar que el ADN genómico del bacteriófago OCJ21 tiene un tamaño de aproximadamente 56 kb.
Ejemplo 4: Análisis del patrón de proteínas de 0CJ21
Se mezclaron 15 j l de solución purificada de bacteriófago OCJ21 (título de 1010 ufp/ml con 3 j l de una solución de muestra de SDS x5, y se calentó durante 5 minutos. Posteriormente, se expandió la proteína total del bacteriófago OCJ21 en gel de SDS-PAGE al 15 %, y luego se tiñó el gel a temperatura ambiente durante 1 hora usando una solución de colorante azul de Coomassie (FIG. 3).
La FIG. 3 es una fotografía de una electroforesis que muestra un resultado de SDS-PAGE realizado en el bacteriófago OCJ21, y se observaron proteínas principales que tenían un tamaño de aproximadamente 40 kDa, 51 kDa, 53 kDa y 70 kDa. En la FIG. 3, M es una proteína que se convierte en un patrón para medir un peso molecular.
Ejemplo 5: Análisis de secuencia génica de QCJ21
Con el fin de confirmar las características genéticas del bacteriófago OCJ21 purificado, se analizó el ADN del bacteriófago OCJ21 usando un secuenciador de titanio FLX (Roche), que es un aparato de análisis genético. Los genes se ensamblaron en Macrogen INC, usando GS y el programa informático ensamblador de novo (Roche). El análisis de secuencias de un marco abierto de lectura se realizó usando los programas informáticos GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02 y FGENESB. La identificación del marco abierto de lectura se realizó usando BLASTP y el programa InterProScan.
La secuencia del genoma del bacteriófago tuvo varias similitudes con la del bacteriófago existente descrito, pero se confirmó que no existía un bacteriófago en el que todas las fracciones eran completamente (100 %) iguales a las del bacteriófago de la presente invención. Por lo tanto, se puede confirmar que el bacteriófago era un bacteriófago recién aislado.
Los datos del análisis de homología de la secuencia de ácido nucleico entre el bacteriófago OCJ21 y otros bacteriófagos se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
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Una secuencia parcial del genoma del bacteriófago OCJ21 preparado en lo anterior es igual a SEQ ID NO: 1. La secuencia del genoma se determinó mediante el analizador genético.
Ejemplo 6: Ensayo de estabilidad de QCJ21 dependiendo del pH
Con el fin de confirmar la estabilidad del bacteriófago OCJ21 en un ambiente a pH bajo, se realizó un ensayo de estabilidad en un amplio intervalo de pH (pH 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,2, 9,0, y 9,8).
Para el ensayo, se prepararon varias soluciones de pH (tampón de acetato de sodio (pH 4,0, pH 5,5 y pH 6,4), tampón de fosfato de sodio (pH 6,9 y pH 7,4) y solución de Tris-HCl (pH 8,2, pH 9,0 y pH 9.8)) a una concentración de 0,2 M, respectivamente.
Después, se mezclaron 90 pl de cada una de las soluciones de pH con 10 pl de solución de bacteriófago que tenía un título de 1,0 x 109 ufp/ml para que una concentración de cada una de las soluciones de pH se volviera 1 M, se dejó cada una de las soluciones de pH a temperatura ambiente durante 30 minutos, 1 hora y 2 horas. Después, se diluyó la solución de reacción etapa a etapa, se vertieron 10 pl de la solución diluida en cada etapa y se cultivaron a 30 °C durante 18 horas por un método de recubrimiento con agar blando, y se midió el título a través de la presencia o ausencia de lisis (FIG. 4).
La FIG. 4 muestra un resultado del ensayo de la resistencia al ácido del bacteriófago OCJ21. Tal como se muestra en la FIG. 4, se puede confirmar que el bacteriófago OCJ21 no perdió su actividad y se mantuvo significativamente estable en un intervalo de pH de 4,0 a 9,8 durante hasta 2 horas.
Ejemplo 7: Ensayo de estabilidad de QCJ21 dependiendo de la temperatura
Se realizó un ensayo para confirmar la estabilidad frente al calor generado durante un proceso de formulación del bacteriófago en el caso de usar el bacteriófago como una formulación de aditivo para pienso entre las formulaciones del bacteriófago.
De forma detallada, se dejaron 200 pl de la solución de bacteriófago OCJ21 que tenía un título de 1,0 x 108 ufp/ml a 60 °C durante 0, 10, 30, 60 y 120 minutos. Después, se diluyeron las soluciones anteriores etapa a etapa, se vertieron 10 pl de cada una de las soluciones diluidas, y se cultivaron a 30 °C durante 18 horas mediante un método de recubrimiento con agar blando, y se midió el título a través de la presencia o ausencia de lisis (FIG. 5).
La FIG. 5 muestra un resultado del ensayo de resistencia al calor del bacteriófago OCJ21. Tal como se muestra en la FIG. 5, se puede apreciar que la actividad no disminuyó significativamente hasta que el bacteriófago OCJ21 se expuso a 60 °C durante 2 horas.
Ejemplo 8: Ensayo de estabilidad de QCJ21 contra el secado
Se realizó un ensayo para confirmar la estabilidad frente a condiciones de secado generadas durante un proceso de formulación del bacteriófago en el caso de usar el bacteriófago como una formulación de aditivo para pienso entre las formulaciones del bacteriófago.
De forma detallada, se secaron 100 pl de solución del bacteriófago OCJ21 que tenía un título de 1,0 x 108 ufp/ml a 60 °C durante 120 minutos usando un vacío de velocidad (Concentrador de vacío de velocidad 5301, Eppendorf). Se dispuso y se volvió a suspender el sedimento obtenido después del secado en una solución de SM en una cantidad igual a la de una solución inicial a 4 °C durante un día.
Después, se diluyeron las soluciones anteriores etapa a etapa, se vertieron 10 pl de la solución diluida en cada etapa y se cultivaron a 30 °C durante 18 horas por un método de recubrimiento con agar blando, y se midió el título a través de la presencia o ausencia de lisis (FIG. 6).
La FIG. 6 muestra un resultado de un ensayo de resistencia a la sequía del bacteriófago OCJ21. Tal como se muestra en la FIG. 6, se puede apreciar que el título del bacteriófago OCJ21 después del secado se redujo a aproximadamente 1/10 del título antes del secado.
Ejemplo 9: Ensayo del espectro de infección de QCJ21 con respecto a cepas de tipo silvestre de Clostridium perfringens
Se ensayó si el bacteriófago OCJ21 tenía o no una actividad lítica en 45 cepas de tipo silvestre de Clostridium perfringens aisladas por el Organismo de cuarentena de animales y plantas, y la Universidad de Kunkuk distintas de Clostridium perfringens (BCCP 17-1) usadas en el experimento.
De forma detallada, se vertieron 10 j l de solución de bacteriófago OCJ21 que tenía un título de 1,0 x 1010 ufp/ml y se mezclaron con 150^1 de una solución de cultivo agitada (DO6oo=2) de cada una de las cepas y se cultivaron a 30 °C durante 18 horas mediante un método de recubrimiento con agar blando. Después, se observó si se formaba o no una placa.
Como resultado del experimento, de entre 45 cepas de tipo silvestre de Clostridium perfringens, se infectaron 44 cepas, de manera que una proporción de la infección fue del aproximadamente 97,7 % y una proporción de la lisis fue del aproximadamente 97,7 %. Los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3.
Tabla 2
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Tabla 3
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) que tiene una actividad bactericida específica contra Clostridium perfringens, donde la secuencia de ácido nucleico de dicho bacteriófago OCJ21 es SEQ ID NO: 1.
2. Una composición que comprende el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la reivindicación 1 como principio activo.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad infecciosa causada por Clostridium perfringens.
4. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde la enfermedad infecciosa es enteritis necrótica.
5. El bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la reivindicación 1 como principio activo para su uso como antibiótico.
6. Un aditivo para pienso o aditivo para agua potable que comprende el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la reivindicación 1 como principio activo.
7. Un desinfectante o limpiador que comprende, como principio activo, el bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de la reivindicación 1.
8. El bacteriófago OCJ21 (KCCM11363P) de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad infecciosa causada por Clostridium perfringens.
9. El bacteriófago para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde la enfermedad infecciosa es enteritis necrótica.
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