KR101823860B1 - 신규한 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지 Clo-PEP-2 및 이의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 증식 억제 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지 Clo-PEP-2 및 이의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 증식 억제 용도{Novel Clostridium perfringens bacteriophage Clo-PEP-2 and its use for preventing proliferation of Clostridium perfringens}

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 감염하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해서 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)는 편성 혐기성균(산소의 존재 하에서는 거의 생육할 수 없는 세균)이며, 사람 혹은 소, 돼지, 염소 등의 여러 동물들에서 심각한 질병을 유발할 수 있는 원인균으로, 특히 괴사성 장염(Necrotizing enterocolitis) 및 식중독의 주요 원인균이다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균이 생산하는 주요 외독소는 α, β, ε, i의 4가지가 존재하며, 이 독소들의 유무에 따라 클로스트리디움 퍼프린젠스 균은 A-F형의 6가지 타입으로 분류된다. 이 중 A형 균은 대표적인 식중독 원인균으로 α-독소만을 분비하며, 괴사성 장염의 원인균으로 알려져 있는 C형 균은 α-독소 및 β-독소를 분비한다.

최근 양계 산업에 있어 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염 발생이 증가하고 있으며, 이로 인한 농가 피해가 심각한 상황이다. 특히 육계군에서의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염에 따른 피해 발생이 매우 심각한 실정이다. 최근에는 양돈 산업에서도 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의한 감염 사례가 증가되고 있으며 이에 따른 피해 발생도 증가하고 있다. 따라서 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염에 효과적으로 대처할 수 있는 방안의 마련이 시급한 상황이다.

클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방이나 치료 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 이들 항생제들에 대한 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다.

최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성으로 인하여 박테리오파지는 대상으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 세균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.

세균을 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 세균 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 발생 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-세균제로 주목을 받고 있다.

앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 박테리오파지의 세균에 대한 높은 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.

이에, 본 발명자들은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고, 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정지을 수 있도록 유전체(Genome)의 서열 정보를 확보한 후에 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음에 이 조성물이 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP)를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 감염하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP)를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 감염하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP)를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용되는 소독제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용되는 음수첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

박테리오파지 Clo-PEP-2는 본 발명자들에 의해 분리된 후에 2017년 1월 11일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 13185BP).

또한, 본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Clo-PEP-2를 유효성분으로 포함하는 소독제, 음수첨가제 및 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Clo-PEP-2는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 효과적으로 사멸시키므로 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”라는 용어는 (ⅰ) 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지; 및 (ⅱ) 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅱ) 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 본 발명의 박테리오파지를 특정지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 본 발명의 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Clo-PEP-2가 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Clo-PEP-2는 1× 10¹ pfu/㎖ 내지 1× 10³⁰ pfu/㎖ 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1× 10³⁰ pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 10⁴ pfu/㎖ 내지 1× 10¹⁵ pfu/㎖ 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g로 포함된다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 소독제, 음수첨가제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다. 이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 Clo-PEP-2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 기존의 항생제 등의 기반을 둔 방식에 비하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래시켜 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[클로스트리디움 퍼프린젠스 균종에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.

도 1은 박테리오파지 Clo-PEP-2의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Clo-PEP-2의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 투명한 부분은 세균이 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주들은 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 클로스트리디움 퍼프린젠스로 동정(identification)된 것들이다.

박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 1/1000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음에 혐기 조건의 37℃에서 3-4시간동안 배양하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 1/1000 비율로 접종한 다음에 혐기 조건의 37℃에서 3-4시간 동안 또 다시 배양하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에는 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복 실시하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.

상기 점적 실험은 다음과 같이 실시하였다. TSB 배지에 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 1/1000 비율로 접종한 다음에 혐기 조건의 37℃에서 한밤동안 배양하였다. 이렇게 하여 준비된 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 배양액 3 ㎖(OD₆₀₀이 1.5)을 혐기배양장치에서 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판배지를 혐기배양장치에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 클로스트리디움 퍼프린젠스 균이 도말된 평판배지 위에 점적하였다. 이를 혐기배양장치에서 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후에 점적한 평판배지를 혐기 조건의 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음에 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.

클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 배양액에 첨가해 주어 4-5시간 동안 혐기 조건의 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 혐기 조건의 37℃에서 4-5시간 동안 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후에 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때, 신규 확보된 박테리오파지는 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.

이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5시간 동안 혐기 조건에서 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음에 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.

상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Clo-PEP-2로 명명한 뒤, 2017년 1월 11일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13185BP).

실시예 2: 박테리오파지 Clo - PEP -2의 유전체 분리 및 유전체 서열 분석

박테리오파지 Clo-PEP-2의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/㎖) 100 μl를 첨가한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음에 이를 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Clo-PEP-2의 유전체를 다량 확보하였다.

이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행하여 박테리오파지 Clo-PEP-2의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Clo-PEP-2 유전체는 39,456 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.

확보된 박테리오파지 Clo-PEP-2의 유전체 서열 정보를 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 박테리오파지 Clo-PEP-2의 유전체 서열은 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지 phi13O의 서열(Genbank Accession No. JF767208.1)과 상동성을 가지고 있다고 분석되었다. 그러나 그 정도(identity)는 69%로 낮은 수준이었다. 또한 박테리오파지 Clo-PEP-2는 환형의 유전체를 가짐에 반하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지 phi13O는 선형의 유전체를 가져 두 박테리오파지의 유전체 사이에는 서열 외에도 형태적으로도 큰 차이가 있음을 알 수 있었다. 또한, 박테리오파지 Clo-PEP-2 유전체 상의 개방형해독틀(Open Reading Frame, ORF)의 개수는 64개임에 반하여, 클로스트리디움 퍼프린젠스 박테리오파지 phi13O는 55개의 개방형해독틀을 가지고 있어 이 점에서도 두 박테리오파지는 차이가 있었다.

이러한 사실들에 근거하여 박테리오파지 Clo-PEP-2는 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 Clo-PEP-2는 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단할 수 있었다.

실시예 3: 박테리오파지 Clo - PEP -2의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능 조사

분리된 박테리오파지 Clo-PEP-2의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주들 본 발명자들에 의해 분리되어 클로스트리디움 퍼프린젠스로 동정된 것들로 총 10주이었다. 박테리오파지 Clo-PEP-2는 실험에 대상이 된 클로스트리디움 퍼프린젠스 10주 중에 총 9주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Clo-PEP-2의 보데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis) 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Clo-PEP-2는 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.

이상의 결과로 박테리오파지 Clo-PEP-2는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대하여 우수한 사멸능을 가지며, 다수의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주들에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Clo-PEP-2가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.

실시예 4: 박테리오파지 Clo - PEP -2의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염 예방에 대한 실험예

9 ㎖의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 10⁸ pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Clo-PEP-2 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 혐기 조건에서 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 배양액을 넣어 주었다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 첨가한 후 튜브들을 혐기 조건의 37℃ 에서 배양하면서 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Clo-PEP-2 액을 첨가해 준 튜브에서는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.

클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장 억제

구분	OD600 흡광도 값
	배양 0분	배양후 60분	배양후 120분
박테리오파지 액 미첨가	0.5	0.7	1.3
박테리오파지 액 첨가	0.5	0.3	0.2

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Clo-PEP-2가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Clo-PEP-2가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.

실시예 5: 박테리오파지 Clo - PEP -2를 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 동물시험

이유자돈을 이용하여 박테리오파지 Clo-PEP-2의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 효과를 조사하였다. 생후 25일령의 이유자돈 20마리를 총 2 그룹(그룹 당 10마리)으로 나눈 후 실험사육돈방(1.1m × 1.0m)에 분리 사육하면서 14일간 시험을 실시하였다. 보온시설 하에 주위환경을 통제하였고 돈방의 온도와 습도는 일정하게 유지시켰으며 돈방 바닥의 청소를 매일 실시하였다. 시험 개시일로부터 시험 종료일까지 시험군(박테리오파지 포함 사료 투여군)의 돼지들에게는 1× 10⁸ pfu/g의 박테리오파지 Clo-PEP-2를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 돼지들에게는 시험 개시일로부터 시험 종료일까지 박테리오파지 Clo-PEP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험개시일로부터 7일째가 되는 날부터 2일간에 걸쳐 실험군(박테리오파지 포함 사료 투여군) 및 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 돼지들 모두에게 1× 10⁸ cfu/g 수준으로 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 급이하는 사료에 추가 포함시켜 하루 2회씩 급이하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염을 유도하였다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 포함하고 있는 사료 급이 시행일(시험 개시일로부터 7일째가 되는 날)부터 매일 모든 시험동물들을 대상으로 분변에서의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 검출 정도를 조사하였고 돼지들의 설사 발생 정도도 조사하였다.

분변에서의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 검출 조사는 다음과 같이 수행하였다. 분변 시료를 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 선택배지(TSC agar plate; OXOID)에 도말한 후에 혐기 조건의 37℃에서 18-24시간 동안 배양한 다음에 형성된 콜로니(Colony) 중에 클로스트리디움 퍼프린젠스 균으로 추정되는 콜로니를 선별하였다. 이렇게 선별된 콜로니들을 각각 시료로 하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 특이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하여 최종적으로 해당 콜로니가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균인지를 확인하였다.

설사 발생 정도 조사는 설사지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 설사지수 측정은 통상 사용되는 Fecal Consistency(FC) score(정상: 0, 연변: 1, 묽은 설사: 2, 심한 설사: 3)를 측정하는 방식으로 실시하였다.

그 결과는 표 2 및 표 3과 같았다.

클로스트리디움 퍼프린젠스 균 검출 결과(평균치)

구분	평판배지 접시 당 검출된 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 콜로니 수
	D7	D8	D9	D10	D11	D12	D13	D14
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여)	20	18	15	14	16	15	14	13
시험군(박테리오파지 포함 사료 투여)	10	7	4	3	1	0	0	0

설사지수

구분	D7	D8	D9	D10	D11	D12	D13	D14
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여)	1.1	1.4	2.0	1.5	1.4	1.5	1.4	1.4
시험군(박테리오파지 포함 사료 투여)	0.5	0.3	0.2	0	0	0	0	0

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Clo-PEP-2가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 박테리오파지 Clo - PEP -2를 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료예

박테리오파지 Clo-PEP-2의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 효과를 조사해 보았다. 2일령 병아리 40마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후에 분리 사육하면서 14일간 시험을 실시하였다. 시험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 10⁷ cfu/g 수준으로 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 포함하고 있는 사료 급이 마지막 날부터 분변에서 클로스트리디움 퍼프린젠스 균이 두 그룹 모두에서 확인되었다. 3일간의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 포함하고 있는 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 시험군(박테리오파지 포함 사료 투여군)의 병아리들에게는 1× 10⁸ pfu/g의 박테리오파지 Clo-PEP-2를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 병아리들에게는 박테리오파지 Clo-PEP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험 개시일로부터 9일째가 되는 날부터는 시험동물들을 대상으로 분변에서의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균수를 측정하였다. 본 실시예의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균수 측정에서는 타 오염 세균에 의한 간섭을 막기 위해 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 선택배지(TSC agar plate)를 사용하였다. 혐기 조건에서 시료를 선택배지에 도말한 후에 혐기 조건의 37℃에서 18-24시간 동안 배양하였다. 배양한 선택배지로부터 클로스트리디움 퍼프린젠스 균으로 추정되는 콜로니를 선별하여 순수분리한 후에 중합효소연쇄반응을 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스 균인가를 확인하는 방식(중합효소연쇄반응을 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스 균으로 확인된 콜로니의 수가 10² cfu/ml 수준 이상일 경우: 2, 중합효소연쇄반응을 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스 균으로 확인된 콜로니의 수가 10¹~10² cfu/ml 수준인 경우: 1, 중합효소연쇄반응을 통해 클로스트리디움 퍼프린젠스 균으로 확인된 콜로니의 수가 10⁰~10¹ cfu/ml 수준인 경우:0)으로 실시하였다. 그 결과는 표 4와 같았다.

클로스트리디움 퍼프린젠스 균수 측정 결과(평균치)

날짜	D9	D10	D11	D12	D13	D14
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여)	1.0	1.1	1.0	1.1	1.1	1.2
실험군(박테리오파지 포함 사료 투여)	0.2	0.1	0	0	0	0

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Clo-PEP-2 가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 사료첨가제 및 사료의 제조

박테리오파지 Clo-PEP-2 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 10⁹ pfu의 박테리오파지 Clo-PEP-2가 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(50%, w/v)한 다음에 동결건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루형태로 분쇄하였다. 상기 제조과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.

이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 1,000배의 양계용 사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.

실시예 8: 음수첨가제 및 소독제의 제조

음수첨가제나 소독제는 그 활용에서만 차이가 나고 제형은 동일하므로 같은 방식으로 제조하였다. 박테리오파지 Clo-PEP-2 액을 이용하여 음수첨가제(또는 소독제) 1 ml당 1× 10⁹ pfu의 박테리오파지 Clo-PEP-2가 포함되도록 음수첨가제(또는 소독제)를 제조하였다. 음수첨가제(또는 소독제)의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ml당 1× 10⁹ pfu의 박테리오파지 Clo-PEP-2가 포함되도록 상기 박테리오파지 Clo-PEP-2 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 음수첨가제(또는 소독제)로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.

이렇게 제조된 2종의 음수첨가제(또는 소독제)는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 음수 또는 소독제로 사용하였다.

실시예 9: 닭 사육에서의 사양 효과 확인

실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 음수 및 소독제를 이용하여 닭 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 120 마리의 2일령 병아리를 한 군당 40 마리씩으로 총 3개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 음수로 공급한 그룹-B; 소독 처리한 그룹-C)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 20마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Clo-PEP-2가 적용된 소그룹(소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 병아리들은 각 시험 소그룹 별로 분리되어 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 5와 같이 구분되고 지칭되었다.

닭 사양 시험에서의 소그룹 구분 및 표시

적용	소그룹 구분 및 표시
	박테리오파지 Clo-PEP-2 적용	박테리오파지가 적용되지 않음
사료로 급이한 그룹	A-①	A-②
음수로 공급한 그룹	B-①	B-②
소독 처리한 그룹	C-①	C-②

사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 5의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이하였으며, 음수 급이의 경우에는 실시예 8에서 제조한 음수를 표 5의 구분에 따라 통상적인 음수 급이 방식에 따라 급이하였으며, 소독 처리의 경우에는 일주일에 3회씩 기존 소독과 번갈아 가면서 실시하였다. 본 발명의 소독제를 분무하는 날은 통상의 소독제를 이용한 소독은 실시하지 않았다. 시험 결과가 표 6에 제시되어 있다.

닭 사양 시험에서의 폐사율

그룹	폐사율(%)
A-①	0
A-②	40
B-①	5
B-②	40
C-①	0
C-②	40

이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료 및 음수의 급이와 본 발명에 따른 소독 처리가 닭 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 닭의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.

이상의 결과로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[수탁번호]

기탁기관명: KCTC

수탁번호: KCTC 13185BP

수탁일자: 20170111

SEQUENCE LISTING <110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Novel Clostridium perfringens bacteriophage Clo-PEP-2 and its use for preventing proliferation of Clostridium perfringens <130> KP090510 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 39456 <212> DNA <213> bacteriophage Clo-PEP-2 <400> 1 tatccttctc gctatctaaa aataaagttt caaagattat attaggcgcg tttatatttc 60 tcatttcata atatttatca ctatatttaa cacctctatt tttaaaccct aaactagaaa 120 agtttttgca cattctttca gcataaggct tagctcttga attgttagca atccaagctt 180 cacaaccttg tccaccacca atattaccat gccaagatat aaataaatcc aaaatttgtg 240 catttgcttt ccttgcacct tctgacaact ctccgttttg agtgttagcg ttggagcaac 300 aatcaattat agtatgtcca tattgttcca ttattttttt gaattcaaaa tgaagaggtt 360 tcatagcgtc cacttcatct cttaatcctt tagcccctct gcaattttca gaatgaccat 420 atctacttcc aattatcaca ttatcacctt cctttatcta tattttacca ctttaattac 480 aattattgca acgatataac tcccaaaatt cattaatcgg ctttttatgg ataatttctt 540 tctctctttt ttgtatcgat ggtgtttcag tttcttgaga aggtttttga actgtagctt 600 tttgcataaa attattttct ttattttcat gctcaaaccc 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tcgataattc ttttgtttgt cattgtaatt attgttgtaa acagcgtcgc accattctaa 29040 attacaaagt ctgttgtcat cttttatctc atttatatga ttaacttgtt ctttattttt 29100 aggcatatca acaaaactca ataaaaccac tctgtgaacc ctcgcttgtt tttttattcc 29160 atttttacac agagtaaaat acaaatatcc atccttatcc tttgtagttt taattatttt 29220 tcctttaact tttctaccta aagaatctat tctatctagt gattttattc ttcctaaatc 29280 acttgcctga tataaacctt cataattagg tatatctctc catttctctt taatcacttt 29340 ctattctcct ttaactcttt aattataatc gcagtagcaa ccccaccaac tgtaacacct 29400 attaaaatag gtttagctaa gatactgcta ttaggatagg ctattaatcc cattaaagct 29460 attcctacac ttgtaattaa acacgcttta ctatcactca ttcaattcaa cccccacatt 29520 aaaatttctt aaaagataat ttctaacttc ataatataaa gtgttgtata tctcgctccc 29580 catatattca cttggtattg cttctatagt agtgttgtat tcagcttcaa agccttttat 29640 cctagcgtgt aatgttttag gttcgtacct acttctatac ttcccttctc ttaaatgctt 29700 atgaaataat ttatcctcta taaacaatct aaccttagta ttattagctt ttaaaatagc 29760 aaactcttta cttattcttg gataatcaga actactaaaa ttacttgcta 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cacttctatt cataaaaata 30660 cctcctttta actgacaatt taattataca ccaacttaac taccttgtca atcatcttat 30720 ttttaaactt tcctcttgca ctaatttagc cccttctatt ttctcgccat ttttcaacgc 30780 ttctttaagc attttcttat ccacgctagg agtatttaca ataaattgtc tcggtatagc 30840 gtttaaatcc tctacaatcg ctttaggagg gtttttcttt acacttacag taaatatacc 30900 acctttgact tctctcttct ctaatccgtt tatagtatca aataaatacc cttgtaagtt 30960 ctcaatctta ttctctctta tctttcgttc tcttgctaat cttttttctt ccgcttttaa 31020 cgcttccgct tctgcttgta ggtttttaat taatctcacg atattttcta cctttgtaga 31080 taaatcgcac tctaatcctt tcatagagtt tataactaac tcttttaaat tttcatcttc 31140 tcccgcattt tctaaaactt gttgtaagtt tctaaagttt tgtgataatt catatagttt 31200 cattaaataa ctccctcctc tttaaactgt tttatataag gtcttaaaac cttaactgct 31260 tctgattctt taggacaacc aattataaaa gcgattcttt taataaatct agttgttaac 31320 tccggacttt tataagccgc catgttggtt ttgcaagtcc tttcttccat tcttctccaa 31380 tcttgaagag cttttctgat ttcacttttc ttaataacca tcataatacc tcctcgatgt 31440 tctctacaag tataattata gcgtacttaa ttatcttgtc aatacttttt tctaaaaaat 31500 aattatgggg tgatgaggtg aaaatatttt atttcattat tcgtctcgga gcatctttga 31560 accattataa gaaataaaaa ttaatcactt actacattta ctacaaaaac tacatcattt 31620 tctatatagc acatttttat ataaaatata tatattattt tattacttat aataaagtct 31680 tataattcaa tgtagtaaat gtagtaaata tatataaagc gttggtatca ctagcttaca 31740 aagggtttta aaaatgtagt aattatgtag taaaaaatgt agtaagctta aaaatgtagt 31800 aaatatttta attaattatg aattgattgg taacattttg tttataatta agtgtagtaa 31860 atgtagtaaa actacaaaaa tgtaacttaa aaatgtagta aatgtagtaa taaaaaaaga 31920 cacctattaa gtgcctttat aatggtttat ttatattgtt gtttgtagag catcatagta 31980 taattcttta aatacctagc atactcataa gcttcctttg tagtcttgca agtctttgtt 32040 tgtaataatt cgttagcgat tttatcaata ttcttcataa aaaatacctc ctaaagcttt 32100 atattttata tatatgctct aagaggtaaa aagattactc tttttcttca atttctttaa 32160 ctttatcatg aagcatttta tcaaccaact tgatataact tgcatcatat ccagtaaact 32220 caaagtcttg taaccatctg cgtatctttt ctatttcttt agaaactccg caaaggggtt 32280 ttaagacttt ttcagattct 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atcctccata ataaggattc 35640 atattattac ctcctgttct ttatacttta attttacatt aggttataat ggttcttaaa 35700 tagaaataaa tagtaagttt taggtaaatt aaacgtaaaa aaagcaccct ttcggatgct 35760 ttaatattat tcttccatat tccttatatt aaaattacta taactattta aaattgattt 35820 tatacacatc atagataatt gtaagttata atttataaat cttactcttt gtatactctc 35880 tctgtctgtc ttaggttgtc cgtgtttatt tagatattta cttacaaatg tttttacaaa 35940 atccattgga acatctatag cacctatttt tagactatct aaatcccagt taacttttac 36000 ccaagcaccg gttatctgtc tatcaaagaa tcttaaagct tgattttctt gagataataa 36060 ttgatttctt tctttgatta tctgtaattc tttttctaac ttttctatat ctgcattttt 36120 agttagataa taaccatctt ttcttatctg cttaagaatt ttcttaactt ccttcttaaa 36180 ttgttttgct ataggttttc tgctttgcat taatacttca tacaatccat cttctgttaa 36240 aaatgtcatt tctcttgatt gaatcatatc tggtgtcttt attgtagata ccagcttttc 36300 ttcttcatct acaaccgaaa ccatttggct tactttatat ttcccgtttg attttgaata 36360 atctatccat tcagctacat ctttagctaa aaataatggg ttttctatat ctccataaat 36420 tttaaattcc tttgataata cctcttgttg tttaaaaact tttaattctt tcattttatc 36480 cacctatctt tcttatatta aatttagatt ttattattaa cctatataaa tcaccttccg 36540 ggattaatgt cattgtttgc gtatttctcg cttcattatg tgcgttccca ttttgggaag 36600 ccacattaac tacttctttt attccatctc tccttctttt ctgttattct ctcttaattc 36660 atataacccc tccaatatat ctaaaggtgt taatatatca tgattaactt ctatataaga 36720 aattatcata tctagttgtt cgtctgtcat ttatctcacc tcctgtaatt ataataacat 36780 ctataaaggt tataaaaatg acaaaaatat tacaatttgt aatttgaata aaaaaagagt 36840 agatttctct actcttaatt gtttaatatt tctcttttta atttatttaa tttcatccca 36900 taataactta caatgggtat atttacaatt cctattataa tagcaaacgg ggaaaataag 36960 gttaaaaata aacttaatat aataattaaa gcagatatag aaaaacaatt gcctattctt 37020 ttatacttag catctaaatc attattccct tttatctttt cctctataac tccaagctct 37080 gcaactcttt gttgtgcttt attttgcttt aatatttttt cttgttgttt tcttttcttt 37140 ctatttcttc taaaatcatt tatttcacca gctacccaaa ttttggttat gaactctaac 37200 atttaaaaca ccttcctaaa ccctaaaaat ctcatttctc tttcaatctc ttctttagtt 37260 ccctcaaatg taacctcttt 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Claims (5)

1. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 시포비리대 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP).
   
2. 제1항의 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP)를 유효성분으로 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
   
4. 제2항 또는 제3항에 의한 박테리오파지 Clo-PEP-2(수탁번호 KCTC 13185BP)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 용도로 사람을 제외한 동물에 투여되는 것을 특징으로 하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.

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