KR101291052B1

KR101291052B1 - 살모넬라 티피무륨 감염을 방지 및 처치하는 방법

Info

Publication number: KR101291052B1
Application number: KR1020110091699A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 전수연; 백형록; 김동환; 강상현
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2013-08-01
Also published as: KR20130028275A; WO2013035906A1; US9402873B2; US20140363401A1

Abstract

본 발명은 살모넬라 티피무륨 균에 감염하여 살모넬라 티피무륨 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지인 박테리오파지 STP-1을 유효성분으로 포함한 조성물, 및 본 조성물을 이용한 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 박테리오파지 STP-1은 살모넬라 티피무륨 균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

살모넬라 티피무륨 감염을 방지 및 처치하는 방법{Method for prevention and treatment of Salmonella Typhimurium infection}

본 발명은 살모넬라 티피무륨 균에 감염하여 살모넬라 티피무륨 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함한 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 방지하거나 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 살모넬라 티피무륨 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 박테리오파지, 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 목적으로 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 방법에 관한 것이다.

살모넬라(Salmonella) 균은 형태학적이나 생리학적으로 대장균과 유사하지만 의학상의 편의를 위해 K. Kauffmann 등의 제창에 의해 독립된 속(genus)으로 되었다. 살모넬라 균은 1885년 Salmon과 Smith가 돈콜레라로 죽은 돼지에서 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis) 균을 최초로 분리 보고한 이래, 장염과 위장염 환자 및 각종 질병을 가진 동물들로부터 분리되었다. 또한 닭을 비롯한 소, 돼지, 염소, 개, 고양이 등의 건강한 동물과 환경에서도 분리되었다.

살모넬라 균은 2,000여종 이상의 혈청형이 현재까지 보고되고 있으며 동물에 따른 숙주 특이성이 있는 균종과 숙주 특이성이 없는 균종으로 크게 구분 지을 수 있다. 살모넬라 균은 그람음성 간균으로 포자는 형성하지 않으며 모두가 다양한 동물에서 기생균으로 발견되고 있다.

살모넬라 균의 감염증은 살모넬라증(salmonellosis)이라 지칭되는데, 거친 피부, 식욕결핍, 결막염, 침울, 엷은 변, 비장 증대, 사망 등의 임상 증상을 나타낸다.

살모넬라 균 중 양돈 산업에서 가장 흔하게 발견되는 것이 살모넬라 티피무륨(Salmonella Typhimurium) 균이다. 이 살모넬라 티피무륨 균의 감염에 의한 축산 산업, 특히 양돈 산업에서의 피해는 상당히 크며, 이의 감염을 방지할 수 있고 또한 이들의 감염을 효과적으로 처치할 수 있는 방법의 개발이 절실하다 할 수 있다.

최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지(bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 자연친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 박테리오파지는 세균을 감염시키는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아를 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 박테리아에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.

박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후 박테리아 감염에 대항하는 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구가 있었다. 그러나 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다.

이에, 본 발명자들은 살모넬라 티피무륨 균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 방지 또는 처치하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(genome)의 유전자 서열을 확보한 후 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음 이 조성물이 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지 및 처치에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 살모넬라 티피무륨 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가진 신규 분리된 박테리오파지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 티피무륨 균에 감염하여 살모넬라 티피무륨 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 티피무륨 균에 감염하여 살모넬라 티피무륨 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 티피무륨 균의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 티피무륨 균 감염 방지 및 처치 목적의 소독제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 티피무륨 균 감염 방지 및 처치 목적의 음수첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 티피무륨 균 감염 방지 및 처치 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명은 살모넬라 티피무륨 균에 감염하여 살모넬라 티피무륨 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지 및 처치 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물의 유효성분으로 포함되는 분리 박테리오파지는 서열번호 1로 표시되는 DNA 형태의 유전체를 가지는 박테리오파지 STP-1이다. 박테리오파지 STP-1은 본 발명자들에 의해 분리된 후 2011년 9월 5일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다 (기탁번호 KCTC 12012BP).

또한, 본 발명은 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 소독제, 음수첨가제, 및 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 STP-1은 살모넬라 티피무륨 균을 효과적 사멸시키므로 살모넬라 티피무륨 균에 의해 유발되는 살모넬라증의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 살모넬라 티피무륨 균에 의해 유발되는 살모넬라증에 대한 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다. 본 명세서에서의 살모넬라증이란 살모넬라 감염에 의해 발열, 두통, 설사, 구토 등을 수반하는 증상을 총칭한다.

본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 살모넬라 티피무륨 균에 의해 유발된 살모넬라증의 억제; 및 (ⅱ) 살모넬라 티피무륨 균에 의해 유발된 살모넬라증의 경감을 의미한다.

본 명세서의 “분리” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 박테리오파지를 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.

본 발명의 박테리오파지는 박테리오파지 STP-1과 이의 변형체들(variants)을 포함한다. 본 명세서의 “변형체”란 유전체 서열(genomic sequence)이나 유전정보가 코딩(coding)하고 있는 폴리펩타이드(polypeptide)에서의 작은 변이(minor variation)가 있지만 전반적 유전자형(genotypic) 및 표현형(phenotypic) 특징이 박테리오파지 STP-1과 같은 박테리오파지들을 의미한다. 상기 변형체에는 다변형성 변형체(polymorphic variants)도 당연히 포함된다. 이러한 변형체들은 박테리오파지 STP-1과 같은(same) 또는 동등한(equivalent) 생물학적 기능(biological function)을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에는 박테리오파지 STP-1 또는 이의 변형체들이 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 STP-1 또는 이의 변형체들은 1× 10¹ pfu/㎖ 내지 1× 10³⁰ pfu/㎖ 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1 × 10³⁰ pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 10⁴ pfu/㎖ 내지 1× 10¹⁵pfu/㎖ 또는 1× 10⁴pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g로 포함된다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만, 소독제, 음수첨가제, 및 사료첨가제로 구현될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지 및 처치 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 기반을 둔 방식에 비하여 살모넬라 티피무륨 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미한다. 이에 따라 사용에 따른 부작용이 매우 적다. 통상적으로 항생제 등의 화학물질을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래하여 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 분리하여 조성물의 유효성분으로 사용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점을 제공할 수 있다.

도 1은 박테리오파지 STP-1의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 STP-1의 살모넬라 티피무륨 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 살모넬라 티피무륨 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

살모넬라 티피무륨 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 선별에는 자연 환경이나 동물 검체로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 살모넬라 티피무륨 균은 살모넬라 티피무륨 ST2로서 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 살모넬라 티피무륨 균으로 동정(identification)된 것이다.

박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 수집된 시료를 살모넬라 티피무륨 균을 1/1000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 함께 첨가한 다음 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 살모넬라 티피무륨 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 37℃에서 3-4시간동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우 박테리오파지의 수(titer)가 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 5회 반복 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 해 주었다. 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(spot assay)을 통하여 살모넬라 티피무륨 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.

상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 살모넬라 티피무륨 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 살모넬라 티피무륨 균의 배양액 3 ml (OD600이 2.0)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 살모넬라 티피무륨 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 37℃에서 하루 정도 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 살모넬라 티피무륨 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 살모넬라 티피무륨 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.

살모넬라 티피무륨 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음 이를 살모넬라 티피무륨 균 배양액에 첨가해 주어 4-5 시간 동안 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 살모넬라 티피무륨 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회로 달성되지 않기 때문에 이 때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 조사에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 기술한 과정을 반복하였다. 전자현미경 조사는 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(copper grid)에 묻히고 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 촬영하였다.

이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 살모넬라 티피무륨 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 4-5 시간 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과한 다음 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음 상온에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.

이렇게 하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 STP-1로 명명한 뒤, 2011년 9월 5일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(기탁번호 KCTC 12012BP)에 기탁하였다. 박테리오파지 STP-1의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다.

실시예 2: 박테리오파지 STP -1의 유전체 분리 및 서열 분석

박테리오파지 STP-1의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 살모넬라 티피무륨 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 ㎕를 첨가한 다음 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K (20 ㎎/㎖) 100 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 ㎕를 첨가한 다음 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로판 알코올(isopropyl alcohol)을 첨가한 다음 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(ethanol)을 첨가한 다음 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음 100 ㎕의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 다량의 박테리오파지 STP-1의 유전체를 확보하였다.

이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 샷건 라이브러리 구축(shotgun library construction)방법을 통하여 박테리오파지 STP-1의 유전체 서열분석을 실시하였다. 이를 상세히 설명하면, 박테리오파지의 유전체를 네불라이저(Nebulizer)를 이용한 무작위 절단(random shearing) 기법을 통하여 얻은 DNA(1~6kbp)를 말단 수선(end-repairing) 과정을 거친 후 다시 한번 아가로즈 젤에서 전기영동을 실시한 후 크기에 기반하여 3-5kbp에 해당되는 유전자 조각(gDNA fragment; insert)을 확보하였다. 이렇게 얻어진 박테리오파지의 유전자 단편을 T4 리가아제(ligase)를 이용해 pC31 벡터(vector)에 삽입(ligation)하여 라이브러리를 구축하였다. 이렇게 하여 준비된 박테리오파지의 유전자 단편이 도입된 재조합 벡터를 통상 사용되는 열자극(heat-shock) 방법에 의한 형질전환법으로 대장균의 한 종인 DH10B' 종에 도입시켰다. 이 플라스미드(plasmid)가 도입된 형질전환체를 배양한 다음 이것으로부터 플라스미드 정제 키트(iNtRON사)를 사용하여 유전자 조각을 포함하고 있는 플라스미드를 추출하였다. 이후 전기영동을 통해 플라스미드에 포함된 유전자 조각의 크기를 확인하였으며 최종 유효 클론을 선별하였다. 이 선별된 클론들의 플라스미드를 통상의 방법에 따라 회수한 다음 회수된 유전자의 염기서열 분석을 실시하였다. 확보된 유전자 서열을 이용하여 일반적인 방법으로 콘티그 지도를 제작하였으며 프라이머 워킹(primer walking)을 통해 최종 157,662bp의 크기의 전체 유전자 서열을 분석할 수 있었다. 최종적으로 확인된 박테리오파지 STP-1의 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.

확보된 박테리오파지 STP-1의 유전체 서열을 기반으로 Web상의 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 기존 알려진 박테리오파지 유전자 서열과의 상동성(similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 박테리오파지 STP-1의 유전체 서열은 대장균 박테리오파지 vB_EcoM_CBA120(Escherichia phage vB_EcoM_CBA120)의 서열 (GenBank Accession No. JN593240.1)과 가장 높은 상동성을 가졌다 (93%). 대장균 박테리오파지 vB_EcoM_CBA120의 전체 유전체 서열은 157,340bp로 박테리오파지 STP-1과 그 크기가 유사하였다. 그러나 박테리오파지STP-1의 전체 유전자 서열에 대한 오픈 리딩 프레임 (open reading frame; ORF)을 ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)를 통하여 분석해 본 결과 총 207개의 ORF를 갖는 것으로 확인된 것과 달리 대장균 박테리오파지 vB_EcoM_CBA120은 총 203개의 ORF를 가지고 있었다. 박테리오파지 STP-1의 ORF 중에는 대장균 박테리오파지 vB_EcoM_CBA120의 서열 내에 존재하지 않는 것이 다수 확인되었다.

이러한 결과로부터 박테리오파지 STP-1은 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다.

실시예 3: 박테리오파지 STP -1의 살모넬라 티피무륨 균에 대한 사멸능 조사

분리된 박테리오파지 STP-1의 살모넬라 티피무륨 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 살모넬라 티피무륨 균들은 본 발명자들에 분리되어 살모넬라 티피무륨 균으로 동정된 것들로 총 50종이었다. 박테리오파지 STP-1은 실험에 사용된 모든 살모넬라 티피무륨 균들에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 STP-1의 액티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 보데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis), 대장균(Escherichia coli) 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 STP-1은 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.

이상의 결과로 박테리오파지 STP-1은 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지 및 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 박테리오파지 STP -1의 살모넬라 티피무륨 균의 감염 예방에 대한 실험예

9 ㎖의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 STP-1 액 100 ㎕를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 첨가하였다. 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 살모넬라 티피무륨 균의 배양액을 넣어 주었다. 살모넬라 티피무륨 균을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 배양기에 옮겨 진탕배양 하면서 살모넬라 티피무륨 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 STP-1 액을 첨가해 준 튜브에서는 살모넬라 티피무륨 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 살모넬라 티피무륨 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.

살모넬라 티피무륨 균의 성장 억제

구분	OD₆₀₀ 흡광도 값
구분	배양 0분	배양후 15분	배양후 60분
박테리오파지 액 미첨가	0.5	0.7	1.5
박테리오파지 약 첨가	0.5	0.1	0.05

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 STP-1이 살모넬라 티피무륨 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 STP-1이 살모넬라 티피무륨 균의 감염을 방지하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.

실시예 5: 박테리오파지 STP -1을 이용한 살모넬라 티피무륨 균의 감염 질환 처치예

박테리오파지 STP-1의 살모넬라 티피무륨 균에 의한 질환이 유발된 돼지에서의 처치 효과를 조사하였다. 생후 25일령의 이유자돈 5마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 실험사육돈방(1.1m × 1.0m)에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 보온시설 하에 주위환경을 통제하였고 돈방의 온도와 습도는 일정하게 유지시켰으며 돈방 바닥의 청소를 매일 실시하였다. 실험 개시일로부터 7일째 되는 날에 모든 돼지들에게 살모넬라 티피무륨 균액을 경구 주입관을 사용하여 경구투여 하였다. 투여한 살모넬라 티피무륨 균액은 다음과 같이 준비한 것이다. 살모넬라 티피무륨 균을 TSB 배지를 이용하여 37℃에서 18시간 배양한 후 균체만을 회수한 후 이를 생리식염수 (pH 7.2)로 1011 CFU/ml가 되게끔 조정하였다. 살모넬라 티피무륨 균 투여 다음날부터 실험군 (박테리오파지 액 투여군)의 돼지들에게는 매일 2회씩 109 PFU의 박테리오파지 STP-1을 살모넬라 티피무륨 균액 투여와 같은 방식으로 경구투여하였다. 대조군 (박테리오파지 액의 미 투여군)의 돼지들은 어떠한 처치도 하지 않았다. 사료와 음수는 대조군과 실험군 모두 동일하게 급이하였다. 살모넬라 티피무륨 균 투여 후부터 매일 모든 시험동물들을 대상으로 설사 발생 상태를 조사하였다. 설사 발생 상태 조사는 설사지수를 측정 방식으로 실시하였다. 설사지수 측정은 통상 사용되는 Fecal Consistency (FC) score (정상: 0, 연변: 1, 묽은 설사: 2, 심한 설사: 3)를 측정하는 방식으로 실시하였다. 대조군의 돼지들은 살모넬라 티피무륨 균을 투여한 날부터 4일 동안 지속적으로 설사지수가 증가하였으며 그 후는 점차 감소하였다. 이에 반하여 실험군의 돼지들은 살모넬라 티피무륨 균을 투여한 날의 다음날부터 설사지수의 지속적 감소가 관찰되었다 (표 2).

설사지수 측정 결과

살모넬라 티피무륨 균 투여 후 경과 일	0	1	2	3	4	5	6
대조군 (박테리오파지 액 미 투여)	0.4	0.8	1	0.6	0.6	0.4	0.3
실험군 (박테리오파지 액 투여)	0.4	0.3	0.3	0.2	0.2	0	0

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 STP-1이 살모넬라 티피무륨 균을 원인으로 하는 감염 질환의 처치에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 사료첨가제 및 사료의 제조

박테리오파지 STP-1 액을 이용하여 사료 첨가제 1 g당 1× 109 pfu의 박테리오파지 STP-1이 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 중량비로 말토덱스트란에 상기 박테리오파지 STP-1 액을 골고루 분사시킨 다음 이를 상온에서 진공 건조시켰고 최종적으로 고운 가루 형태로 분쇄하고 여기에 중량비로 5%가 되게 실리카를 첨가하여 잘 혼합하여 제조하였다. 상기 제조 과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 동결건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)만을 분사해 주는 방식으로 제조하였다.

이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 1,000배의 양돈용 사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.

실시예 8: 음수첨가제 및 소독제의 제조

음수첨가제나 소독제는 그 활용에서만 차이가 나고 제형은 동일하므로 같은 방식으로 제조하였다. 박테리오파지 STP-1 액을 이용하여 음수첨가제 (또는 소독제) 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 STP-1이 포함되도록 음수첨가제 (또는 소독제)를 제조하였다. 음수첨가제 (또는 소독제)의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 STP-1이 포함되도록 상기 박테리오파지 STP-1 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 음수첨가제 (또는 소독제)로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.

이렇게 제조된 2종의 음수첨가제 (또는 소독제)는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 음수 또는 소독제로 사용하였다.

실시예 9: 돼지 사육에서의 사양 효과 확인

실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 음수 및 소독제를 이용하여 돼지 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 30 마리의 자돈을 10 마리씩 한 그룹으로 총 3개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 음수로 공급한 그룹-B; 소독 처리한 그룹-C)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 5마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 STP-1이 적용된 소그룹 (소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹 (소그룹 ②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 자돈은 20일령의 이유 자돈이었으며, 각 시험 소그룹의 자돈은 일정 간격을 두고 위치한 격리된 각각의 분방에서 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 3과 같이 구분되고 지칭되었다.

돼지 사양 시험에서의 소그룹 구분 및 표시

적용	소그룹 구분 및 표시
적용	박테리오파지 STP-1 적용	박테리오파지가 적용되지 않음
사료로 급이한 그룹	A-①	A-②
음수로 급이한 그룹	B-①	B-②
소독 처리한 그룹	C-①	C-②

사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 3의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이하였으며, 음수 급이의 경우에는 실시예 8에서 제조한 음수를 표 3의 구분에 따라 통상적인 음수 급이 방식에 따라 급이하였으며, 소독 처리의 경우에는 일주일에 3회씩 기존 소독과 번갈아 가면서 실시하였다. 본 발명의 소독제를 분무하는 날은 통상의 소독제를 이용한 소독은 실시하지 않았다. 시험 결과가 표 4에 제시되어 있다.

그룹	폐사율(%)
A-①	0
A-②	20
B-①	0
B-②	40
C-①	0
C-②	40

이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료 및 음수의 급이와 본 발명에 따른 소독 처리가 돼지 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 돼지의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12012BP

20110905

서열목록 전자파일 첨부

Claims

자연으로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 유전체를 가진 박테리오파지 STP-1을 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지, 억제 및 경감용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 STP-1은 기탁번호 KCTC 12012BP인 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지, 억제 및 경감용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피무륨 균의 감염 방지, 억제 및 경감용 조성물.
제1항 또는 제2항에 의한 살모넬라 티피무륨 균의 감염, 억제 및 경감용 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 살모넬라 티피무륨 균에 의한 감염을 방지, 억제 또는 경감시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 용도로 동물에 투여되는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피무륨 균에 의한 감염을 방지, 억제 또는 경감시키는 방법.