KR101151532B1 - 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 박테리오파지(bacteriophage)에 관한 것으로, 더욱상세하게는 가금에서 가금티푸스를 일으키는 살모넬라 갈리나룸과 추백리를 일으키는 살모넬라 플로럼, 및 가금파라티푸스와 가금 유래 식중독을 일으키는 인수공통 감염종인 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움, 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 항생제 및 가축용 사료에 관한 것이다.

박테리오파지, 가금티푸스, 추백리, 가금파라티푸스, 식중독, 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 엔테리티디스

Description

신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel bacteriophage and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 신규한 박테리오파지(bacteriophage)에 관한 것으로, 더욱 세하게는 가금에서 가금티푸스를 일으키는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, SG)과 추백리를 일으키는 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum, SP), 및 가금파라티푸스와 가금 유래 식중독을 일으키는 인수공통 감염균인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium, ST)과 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis, SE)를 모두 사멸시킬 수 있는 박테리오파지, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 항생제 및 가축용 사료에 관한 것이다.

살모넬라균은 장내균과의 그람 음성의 보통 혐기성 세균 1속(조건 무산소균임)으로 아포를 형성하지 않는 간균이며, 보통 주모성 편모에 의한 운동성을 갖는 다. 살모넬라균의 유전자 염기 구성 성분을 보면 GC 포함 정도가 50-52%로 대장균(Escherichia coli)과 쉬겔라(Shigella)와 유사하다. 살모넬라균 속은 사람에게뿐만 아니라 여러 가축에 감염하여 다양한 질병을 일으키는 병원성 미생물이다. 살모넬라종인 살모넬라 엔테리카(Salmoneall enterica)는 혈청학적 구별에 의한 구분을 통해 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis), 살모넬라 더비(Salmonella derby)등을 포함한 많은 혈청종(serovar)를 가진다. 이들 중 가금에 특이한 갈리나룸과 플러럼, 대상 동물이 다양한 인수공통 혈청종인 살모넬라 타이피뮤리움과 살모넬라 엔테리티디스, 사람에 특이한 타이피, 돼지 특이의 살모넬라 콜레라수이스와 더비 등이 질병을 일으켜 농가와 소비자에게 막대한 피해를 주기도 한다.

가금에서 살모넬라균이 일으키는 질병의 예로써 가금티푸스(Fowl typhoid, FT)가 있다. 이 질병은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum 이하 SG로 명명함)이 원인체로 닭 및 칠면조 등의 조류에서 발생하는 급?만성의 전염병으로 모든 일령에 나타나는 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징이다. 최근에 유럽, 남미, 아프리카 및 동남아시아 등지에서는 발생빈도가 높은 것으로 보고 되어 그 피해가 증가되고 있다. 국내에서는 1992년 이래로 주로 갈색 산란계 농장에 전국적으로 확산되어 왔다.

추백리(Pullorum Disease) 또한 살모넬라균이 원인이 되는 질병으로써 살모 넬라 플로럼(Salmonella Pullorum 이하 SP로 명명함)에 의하여 발병된다. 추백리는 일령, 계절에 관계없이 발병하지만, 초생추 시기에 가장 감수성이 높은 것이 특징이다. 지난 1 세기 동안 국내는 물론 전세계적으로 모계로부터 난계대 전염에 의한 1-2 주령 미만의 일령 병아리에서 발생 및 피해가 심각하였던 질병으로 지난 ‘80년대 이후에 그 발생이 매우 감소하였으나 근년 90년대 중반 이후 다시 증가하는 추세에 있다.

우리 나라에서는 '90년대 이후 가금티푸스와 추백리의 발병이 증가하고 있는 추세로 농가에 큰 경제적 손실을 주고 있다. 이 때문에 2004년부터 약독화된 SG 생균 백신을 육계(broiler)에 사용해 가금티푸스에 대하여 예방하려 하였지만, 백신의 효과에 대한 사용자의 의구심이 제기고 있으며, 산란계 (Layer)에서는 난계대 전염 우려로 생균 백신의 사용이 불허되고 있다. 가금티푸스와는 달리 추백리의 경우에는 현재 상업화된 예방책은 없다. 따라서 가금티푸스와 추백리를 예방할 수 있는 방법 모색이 시급한 상황이다.

가금파라티푸스 또한 살모넬라로 인하여 유발되는 질병으로 이를 일으키는 대표적인 살모넬라 균은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium, 이하 ST로 명명함) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis, 이하 SE로 명명함)가 있다. 4주령 이하의 어린 병아리는 추백리와 유사한 증상을 보인다. 4주령이 넘으면 폐사율은 감소되지만 발육이 지연되고, 성계는 불현성으로 경과하면서 산란율이 저하되어 경제적인 손실을 가져온다.

살모넬라 타이피뮤리움과 살모넬라 엔테리티디스는 가금에서뿐만 아니라, 사 람에게 감염하여 식중독을 일으킬 수 있는 인수공통 감염종이다. 미국의 질병관리센터(CDC)통계에 따르면 1973년에서 1984년 사이에 발생된 사람의 살모넬라 감염증 중에서 닭이 중간매개체로 작용한 경우가 5%였다고 보고한 바 있다. 1988년 이후로 미국, 캐나다, 유럽에서는 살모넬라 엔테리티디스에 의한 식중독 사례가 급격히 증가해 왔음을 볼 수 있는데, 미국에서의 역학적인 추적결과 A등급 계란이나 계란을 함유하는 요리가 원인임을 밝혀낸바 있다. 따라서 가금파라티푸스뿐만 아니라 가금 유래 살모넬라로 사람에게 감염하여 식중독을 일으킬 수 있는 살모넬라 타이피뮤리움과 살모넬라 엔테리티디스의 통제 방법 모색 또한 시급한 상황이다.

한편, 박테리오파지는 특정 세균에만 감염하여 세균의 성장을 통제하는 세균특이적 바이러스로 세균 숙주 없이는 자가 증식이 불가능하다. 박테리오파지는 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA가 유전물질로써 핵산을 구성하고 있으며, 이 핵산을 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조로 20면체의 머리에 꼬리가 있는 형태, 20면체 머리에 꼬리가 없는 형태, 그리고 필라멘트형의 3가지 기본형 구조로 나뉜다. 세균을 감염시킬 때 박테리오파지는 세균의 표면에 달라붙어 자신의 유전물질을 세포 내로 주입한 후 용균성(lytic) 또는 용원성(lysogenic)을 띠게 된다. 용균성인 경우 박테리오파지가 세포 기구들을 이용하여 자신의 구조물들을 만든 후 새로운 박테리오파지 입자들을 방출시킴으로써 세포를 파괴하거나 용해한다. 용원성인 경우 자신의 핵산을 세균 숙주세포의 염색체에 편입시켜 세균을 파괴하지 않고 세포와 함께 복제되지만 일정 조건이 되면 용균성으로 전환된다.

박테리오파지의 발견 이후 이를 감염질병 치료제로 이용하기 위한 연구가 진행되었지만 광범위한 숙주범위(broad target spectrum)를 갖는 항생제의 특성에 비해 숙주특이성(specific target spectrum)을 갖는 박테리오파지가 경쟁에서 밀려나 관심을 받지 못했다. 하지만 항생제의 오?남용으로 항생제 내성균의 문제가 심각해 지고, 식품내의 항생제 잔류에 의한 인체에 미칠 영향에 대한 우려가 더해지고 있다. 특히 동물의 성장촉진을 위해 사료에 첨가하는 항생제(antimicrobial growth promoter, AGP)가 항생제 내성유발의 주요원인임이 밝혀짐에 따라 AGP의 사용을 금지하는 정책들이 입안되어 유럽연합은 2006년부터 모든 AGP의 사용이 금지되었고 한국은 일부 AGP의 사용금지가 시행되고 있으며 향후 전면금지가 예상되고 있다.

이러한 흐름을 바탕으로 항생제 대체를 위한 박테리오파지의 연구가 다시 관심을 모으고 있다. 박테리오파지를 이용하여 E.coli O157:H 균을 통제하기 위한 박테리오파지 7개가 2002년도에 미국 특허등록(미국 등록특허 제6,485,902호)되었으며, Nymox 사에서는 다양한 종의 미생물을 통제하는 박테리오파지 2종에 대하여 2005년도에 미국 특허등록(미국 등록특허 제6,942,858호)를 받았다. 박테리오파지에 관한 연구가 활발히 진행됨에 따라 산업계에서 또한 박테리오파지를 이용한 다양한 상품을 개발하고 있다. 유럽의 EBI food system 사는 박테리오파지를 이용하여 리스테리아균에 의한 식중독을 방지하는 식품첨가제 제품인 Listerix-P100을 개발하여 최초로 미국 FDA의 승인을 받았고 동일한 개념의 리스테리아균 통제 식품첨가형 박테리오파지 제품 LMP-102를 개발하여 GRAS(Generally regarded as safe)의 인증을 받았다. 또한 2007년에는 OmniLytics 사에서 도축과정 중에 E.coli O157이 소고기 제품으로 오염되는 것을 막기 위한 세척액으로 박테리오파지를 이용한 제품이 개발되어 USDA's Food Safety and Inspection Service(FSIS)로부터 승인되었다. Clostridium sporogenes phage NCIMB 30008과 Clostridium tyrobutiricum phage NCIMB 30008는 각각 2003년과 2005년에 유럽에서 사료보존제로써 등록되어 사료 내 오염된 Clostridium 균의 통제를 목적하는 제품으로 개발되었다. 이러한 연구는 박테리오파지는 항생제 치료가 어려운 세균의 통제나 축산물 등에 오염된 인수공통 전염균 등을 식품단계에서 통제할 수 있는 연구가 지속적으로 이루어지고 있음을 보여준다.

본 발명자들은 과거 항생제와 같이 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결하기 위해, 가축의 주요질병을 일으키는 살모넬라 병원균에 감염하는 박테리오파지를 자연계에서 신규 분리하고, 이들의 형태적, 생화학적 및 유전적 특성을 확인한 결과, 상기 박테리오파지가 이들의 익균에는 영향을 주지 않고 살모넬라 갈리나룸(SG), 살모넬라 플로럼(SP), 살모넬라 타이피뮤리움(ST) 및 살모넬라 엔테리티디스(SE)를 선택적으로 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어남을 확인하였다. 이를 바탕으로 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼에 의해 유발되는 질환, 특히 가금티푸스 및 추백리, 그리고 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리카에 의해 유발되는 가금파라티푸스 또는 가금 유래 식중독 질병 예방 및 치료 목적으로 이용할 수 있고, 동물 사료로도 적용이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스에 대하여 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 함유하는 항생제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 함유하는 가축용 사료를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 가금에서 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병인 가금티푸스, 추백리, 또는 가금파라티푸스를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스로 인한 가금 유래 식중독을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지에 관한 것이다.

본 발명의 박테리오파지는 형태학상 형태형(morphotype) A1, 마이오비리데(Myoviridae)에 속하고, 전체 게놈 크기가 158 kb이며, 45 kDa, 62 kDa, 그리고 80 kDa 크기의 단백질을 주요 구조단백질로 갖는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 본 발명의 박테리오파지는 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움, 그리고 살모넬라 엔테리카를 감염시키는 특성을 갖는 다.

또한, 본 발명의 박테리오파지는 전게 게놈 크기가 158 kb이며, 서열번호 1 내지 4로 기재되는 핵산 분자를 전체 게놈의 일부로서 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)를 포함하는 개념이다.

또한, 본 발명의 박테리오파지는 내산성 및 내열성의 생화학적 특징을 가지는데, pH 3.5 내지 pH 9.0 의 넓은 pH 범위에서 안정하게 생존하는 내산성을 가지며, 37℃ 내지 60℃ 범위의 온도, 즉, 높은 온도에서도 안정하게 생존할 수 있는 내열성을 가진다. 또한 고온 건조한 후에도 안정하게 생존하는 내건성을 가진다. 이러한 내산성, 내열성 및 내건성은 본 발명의 박테리오파지를 가축 질병 또는 가축 유래 사람에게 유발될 수 있는 질병 예방 및 치료용으로 사용함에 있어, 다양한 온도 및 pH 범위의 적용이 가능하게 한다.

본 발명자는 도계장 근처의 하수로부터 시료를 채취하여, SG, SP, ST 그리고 SE에 대한 사멸능을 갖고 상기와 같은 특징을 같은 본 발명의 박테리오파지를 동정 하고, 이를 ΦCJ3로 명명하고, 2008년 12월 17일 한국미생물보존센터에 기탁번호 제 KCCM10977P호로 기탁하였다.

본원의 구체적 실시예에 따르면, 도계장 근처의 하수로부터 시료를 채취하여 시료에서 ST를 숙주세포로 ST를 용균하는 박테리오파지를 분리하고, 이들이 SG, SP 그리고 SE를 용균시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 이들 박테리오파지(ΦCJ3)를 전자현미경을 통해 형태학적으로 관찰한 결과, 형태형(morphotype) A1, 마이오비리데(Myoviridae)에 속하는 것을 확인하였다(도 1).

또한, ΦCJ3의 단백질 패턴을 분석한 결과, 박테리오파지의 주요 구조단백질로서 45 kDa, 62 kDa, 그리고 80 kDa의 단백질을 포함하는 것으로 나타났다.

또한, ΦCJ3의 전체 게놈 크기를 분석한 결과, 158 kb 크기를 갖는 것을 확인하였다. 이들의 유전적 특성을 분석한 결과, 서열번호 1 내지 4의 핵산 분자를 전체게놈의 일부로서 포함하는 것을 확인하였으며, 이들을 바탕으로 타종간 유사성을 비교한 결과, 현재까지 알려진 박테리오파지와 유사성이 매우 낮아, 신규한 박테리오파지임을 확인하였다. 유전적 특성을 좀 더 구체적으로 분석한 결과, ΦCJ3에 특이적인 프라이머 세트(primer set), 즉 서열번호 5번과 6번, 서열번호 7번과 8번, 서열번호 9번과 10번, 및 서열번호 11번과 12번 프라이머 세트로 PCR을 진행하였을 때, 특정 크기의 PCR 산출물, 각각 1kb 정도의 산출물이 얻어지는 것을 확인하였다.

또한, ΦCJ3을 SG, SP, ST 및 SE에 감염시켰을 때, 용균반(phage plaque로 soft agar에서 하나의 박테리오파지에 의해 숙주세포가 용균되어 형성되는 clear zone)의 크기와 탁도 등이 동일한 것을 확인하였다.

또한, ΦCJ3를 다양한 pH 범위 및 온도에서 안정성을 조사한 결과, pH 3.5 내지 9.0 및 37℃ 내지 60℃ 범위의 넓은 범위에서 안정하게 생존하는 할 뿐만 아니라, 고온 건조 시에도 안정성을 유지하는 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 박테리오파지 ΦCJ3를 사료첨가제로의 적용이 용이하다는 것을 의미하는 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병인 가금티스 또는 추백리의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스에 의한 가금파라티푸스 및 가금 유래 식중독 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 박테리오파지는 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리카를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 항균 활성을 가지므로, 이들 균들에 의해 유발되는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

본 발명의 상기 조성물을 적용할 수 있는 살모넬라 갈리나룸 감염성 질병의 예로는 가금티푸스, 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예로는 추백리, 그리고 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스에 의한 감염성 질병의 예로는 가금파라티푸스 및 가금 유래 식중독이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품 및 사료첨가제로 제공될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀 젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리카 감염성 질병인 가금티푸스, 추백리, 가금파라티푸스 또는 가금 유래 식중독의 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 항생제에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "항생제"는 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 것이다. 상기 동물은 인간을 포함한 포유동물이며, 바람직하게는 가금류이다. 본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 살모넬라에 대한 특이성이 매우 높으므로, 익균은 죽이지 않고, 특정 병원균만 사멸시킬 수 있고, 약물 내성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병인 가금티푸스, 추백리, 가금파라티푸스 또는 가금 유래 식중독의 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 가축용 사료에 관한 것이다.

본 발명의 가축용 사료는 박테리오 파지를 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파지는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 가축용 사료는 본 발명의 박테리오파지 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움, 또는 살모넬라 엔테리카 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 이용하여 가금에서 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병인 가금티푸스, 추백리, 가금파라티푸스 또는 가금 유래 식중독을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 사료첨가제의 형태로 사료에 혼합되어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 신규 분리된 박테리오파지는 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스에 특이적 사멸능을 가지며, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어난 장점을 가져, 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병인 가금티푸스, 추백리, 가금파라티푸스 또는 가금 유래 식중독의 예방 및 치료 용도로 이용이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 살모넬라균에 감염하는 박테리오파지의 분리

도계장 및 근처 하수 종말 처리장 시료 50 ml를 원심분리관으로 옮겨 4000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후, 상등액을 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. ST 진탕 배양액 (OD₆₀₀=2) 150 μl 와 10 X Luria-Bertani 배지(이하 LB 배지라고 명명함, tryptone 10 g; yeast extract 5 g; NaCl 10 g; 최종부피가 1 L 되도록) 2 ml 에 시료 여과액 18 ml 을 섞어주었다. 이를 37℃에서 18 시간 동안 배양한 후, 배양액을 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하고, 그 상등액을 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. LB plate에 0.7% 한천(agar) (w/v) 3 ml, ST 진탕 배양액 (OD₆₀₀=2) 150 μl를 섞어 부어 굳힌 후, 그 위에 시료 배양 여과액 10 μl를 떨어뜨려 37℃에서 18 시간 동안 배양하였다(0.7% 한천을 이용해 고체 배지 위에 붙는 것을 탑-아가(top-agar)라고 하고, 탑-아가에서 성장하는 숙주세포를 이용해 박테리오파지가 용균하는 것을 관찰하는 방법을 소프트 아가 오버레이(soft agar overlay) 방법이라고 정의한다).

용균이 일어난 시료 배양 여과액을 적당히 희석하여 ST 진탕 배양액 (OD₆₀₀=2) 150 μl 섞은 후 소프트 아가 오버레이를 진행하여 단일 용균반을 획득하였다. 하나의 용균반에는 하나의 박테리오파지로 이루어 졌다고 보기 때문에, 단일 박테리오파지를 순수분리 하기 위해 하나의 용균반을 취해서 400 ul SM 용액 (NaCl, 5.8 g; MgSO₄7H₂O, 2 g; 1 M Tris-Cl (pH7.5), 50 ml; H₂O, 최종부피가 1 L 되도록)에 넣고 4 시간 동안 실온에 정치하여 단일 박테리오파지를 순수분리하였다. 분리된 박테리오파지를 대량확보하기 위해 단일 박테리오파지 용액의 상등액 100 ul를 취한 후, 0.7% 한천 12 ml, ST 진탕 배양액 500 ul와 혼합하여, 150 mm 지름의 LB 배지에서 소프트 아가 오버레이를 실시하였다. 완전히 용균이 일어난 plate에 15 ml SM 용액을 부운 후, 4 시간 동안 실온에서 살며시 흔들어 주어 탑-아가 속의 박테리오파지를 유출시켰다. 박테리오파지가 유출된 SM 용액을 회수한 뒤 최종부피의 1%가 되도록 클로로포름(chloroform)을 첨가해서 10 분간 잘 섞어준 후, 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 여기서 얻어진 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 냉장 보관하였다.

선별된 박테리오파지를 ST를 이용하여 대량배양을 실시하였다. ST를 진탕 배양하여 1.5 X 10¹⁰ cfu(colony forming unit)가 되도록 분주하여 4000 rpm 에서 10 분간 원심분리한 후 이를 4 ml SM 용액에 재부유시켰다. 여기에 박테리오파지를 7.5 X 10⁷ pfu (plaque forming unit)로 접종해 MOI(multiplicity of infection)=0.005로 만든 후 37℃에서 20 분간 정치하였다. 이를 150 ml LB 배지가 들어있는 플라스크에 접종한 후 5 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 최종 부피의 1%가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20 분간 흔들어 주었다. DNase I과 RNase A를 각각 최종농도 1 ㎍/ml 되도록 첨가하고 30 분간 37℃에 정치시켰다. 최종 농도가 각각 1 M과 10% (w/v)이 되도록 NaCl과 PEG(polyethylene glycol)를 넣어 준 뒤 4℃에서 3 시간 추가 정치시켰다. 4℃, 12000 rpm 에서 20분간 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 5 ml SM용액으로 침전물을 재부유시킨 후 20 분간 실온에 정치시켰다. 여기에 4 ml 클로로포름을 첨가한 후 잘 섞어주고 4℃, 4000 rpm에서 20 분간 원심분리하였다. 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 글리세롤(glycerol) 밀도 구배법(밀도:40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심분리(35,000rpm, 1시간, 4℃)를 통하여 ΦCJ3을 정제하였다. 정제한 ΦCJ3은 300 μl의 SM 용액으로 재부유 한 후 타이터를 측정하였다.

실시예 2 : ΦCJ3의 살모넬라균 감염 여부 조사

선별된 박테리오파지가 ST 외에 다른 종의 살모넬라균에 대하여 용균 활성을 하기 위해 다른 종의 살모넬라균에 교차감염을 시도하였다. 그 결과 ΦCJ3은 SC(Salmonella enterica Serotype Choleraesuis), SD(Salmonella enterica Serotype Derby), SA(Salmonella enterica subsp. Arizonae), SB(Salmonella enterica subsp. Bongori)에는 감염하지 않고 SG, SP, ST, 그리고 SE에 감염하였다 (실시예 12 참조). 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다. SG를 숙주로 이용하여 생산한 ΦCJ3은 ST에서 생산된 것과 동일한 용균반 모양, 형성된 용균의 투명성 정도, 단백질 패턴 및 게놈 크기를 보였다.

< ΦCJ3의 살모넬라균 감염여부 >

Sero type	Strain name	용균반형성 유무	Sero type	Strain name	용균반형성 유무
SG	SGSC 2293	O	SC	ATCC 13312	X
SP	SGSC 2295	O	SD	SCSG 2467	X
ST	ATCC 14028	O	SA	ATCC 13314	X
SE	SGSC 2282	O	SB	ATCC 43975	X

* ATCC : The Global Bioresource Center

* SGSC : salmonella genetic stock center

실시예 3 : ΦCJ3의 형태관찰

정제된 ΦCJ3을 0.01% 젤라틴 용액에 희석한 후, 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 carbon-coated mica plate(ca.2.5 X 2.5 mm)에 떨어뜨려 10 분간 적응시킨 후, 멸균증류수로 세척하였다. 카본 필름(Carbon film)을 copper grid에 끼워 4% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)에서 30-60 초간 염색하고, 건조를 수행한 후, 투과전자현미경(JEM-1011 transmission electron microscope, 80kV, 배율 X 120,000 ~ X 200,000)으로 검경하였다. 그 결과 분리된 ΦCJ3의 형태는 도 1과 같으며, 형태형(morphotype) A1, 마이오비리데(Myoviridae)에 속하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4 : ΦCJ3의 단백질 패턴 분석

10¹¹ pfu/ml 타이터(titer)의 정제된 ΦCJ3 용액 15 μl와 5X SDS 시료 용액 3 μl을 섞은 후 5분간 끓였다. 이를 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen 사) 젤에서 ΦCJ3의 전체 단백질을 전개하였다. 쿠마시블루(coomassie blue) 염색 용액을 이용하여 젤을 1 시간 동안 상온에서 염색하였다. 그 결과 단백질 패턴은 도 2와 같이 45 kDa, 62 kDa, 그리고 80 kDa 의 주 단백질로 관찰되었고, 그 외에도 17 kDa, 28 kDa, 110 kDa, 및 170 kDa 의 단백질이 관찰되었다.

실시예 5 : ΦCJ3의 전체 게놈 DAN 크기 분석

초원심분리를 통해 정제된 ΦCJ3의 게놈 DNA를 추출하였다. 구체적으로 정제된 ΦCJ3 배양액에 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid(pH8.0)), 프로테네이즈 케이(proteinase K), 그리고 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 각각 최종 농도가 20 mM, 50 ug/ml, 및 0.5% (w/v) 되도록 첨가한 후 50℃에서 1 시간 동안 정치하였다. 동일 양의 페놀(phenol (pH8.0))을 첨가한 후 잘 섞어준 다음, 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 상등액을 취해서 동일 양의 PC(phenol:chloroform=1:1)를 첨가하고 잘 섞어준 후 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 상등액을 취해서 동일양의 클로로포름을 잘 섞어준 후 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 상등액을 취한 후 3 M 초산나트륨(sodium acetate)을 전체 부피의 1/10로 섞고 2배 양의 차가운 95% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후 -20℃에서 1 시간 정치시켰다. 0℃에서 10 분간 12,000 rpm으로 원심분리 후 상등액을 완전히 제거한 후 바닥의 DNA를 50 ul TE(Tris-EDTA (pH 8.0)) 용액에 녹였다. 추출한 DNA를 10배 희석하여 OD₂₆₀에서 흡광도를 측정해 농도를 측정하였다. 1 μg 전체 게놈 DNA를 1% PFGE (pulse-field gel electrophoresis) 아가로즈 젤에 로딩한 후 BIORAD PFGE system 7번 프로그램(size range 25-100 kb; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape; forward voltage 180 V; reverse voltage 120 V)을 이용하여 상온에서 20 시간 동안 전개하였다. ΦCJ3의 게놈 DNA의 크기는 도 3에서 보는 것과 같이 약 158 kb 정도이었다.

실시예 6 : ΦCJ3의 유전적 특성 분석

분리한 ΦCJ3의 유전자적 특성을 알아보기 위해서 ΦCJ3의 게놈 DNA 5 μg을 EcoR V와 Sca I 제한효소로 동시에 처리하였다. 벡터로는 pBluescript SK+ (Promega 사)를 EcoR V 제한효소로 자른 후 CIP(calf intestinal alkaline phosphatase) 처리한 것을 사용하였다. 절편된 게놈 DNA와 벡터의 양이 3:1이 되도록 반응조건을 맞추어 섞은 후, 16℃에서 5 간 동안 라이게이션(ligation)을 진행하였다. 이를 대장균의 한 종인 DH5 세포에 도입시켰다. 이렇게 형질전환 된 전환체를 엠피실린(ampicillin)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)이 포함된 LB plate에서 통상의 청백 콜로니 선별법을 통해 4개 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 엠피실린이 포함된 배양배지에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 여기서 플라스미드 정제키트 (Promega 사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다.

상기 플라스미드들을 M13 forward와 M13 reverse 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 클로닝 여부를 확인하였으며, 삽입조각 크기가 1 kb 이상 되는 것을 골라 M13 forward 와 M13 reverse 프라이머 세트를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 이렇게 수득한 유전자 염기서열이 서열번호 1 내지 4에 나타내었고, 각각의 크기는 모두 1 kb 정도였다. 이를 NCBI blastx 프로그램을 이용하여 해독염기서열의 유사성을 분석한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

하기 표 2에서 보는 바와 같이, ΦCJ3은 서열번호 1의 해독 염기서열의 앞부분은 유사성을 보이는 단백질은 없었으며, 중간부분부터 뒤쪽 부분의 경우에는 역방향으로 synechococcus phage의 single-stranded DNA binding protein과 약 40% 유사성을 보였다. 서열번호 2의 해독 염기서열의 앞부분은 역방향으로 synechococcus phage의 sliding clamp protein과 약 32% 유사성을 보였다. 뒷부분 또한 역방향으로 ecterobacteria phage Phi1의 UvsW RNA-DNA and DNA-DNA helicase ATPase와 32% 유사성을 보였다. 서열번호 3의 해독염기서열의 경우에는 박테리오파아지의 단백질과 상동성을 보이지 않았다. 서열번호 3의 해독염기서열의 뒷부분은 psychroflexus torquis의 ATP-dependent DNA hlicase RecG와 약 29% 유사성을 보이며 앞부분은 leishmania major의 conserved protein과 약 38% 유사성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 서열번호 4의 해독 염기서열의 앞부분은 역방향으로 enterobacteria phage의 UvsX RecA-like recombination protein과 약 46% 유사성을 보였다.

또한 ΦCJ3의 서열번호 2와 서열번호 3의 경우에는 e-value가 매우 높을 뿐 아니라 서열번호 3의 경우 검색 결과 박테리오파아지의 단백질로 분석되지 않았다. 더욱이 서열번호 1 내지 4를 NCBI blastn 프로그램을 이용하여 DNA 염기서열을 분석한 결과 염기서열의 상동성은 보이지 않았다. 따라서 ΦCJ3은 신규 박테리오파지로 판단되었다.

< ΦCJ3의 염기서열과 다른 박테리오파지의 해독염기 서열 상동성 비교 >

	organism	protein	Accession number	Subject location	Query location	identities	E value
1	Synechococcus phage syn9	single-stranded DNA binding protein	NC_008296.2	68-247	995-429	77/192 (40%)	2e-30
	Synechococcus phage S-PM2	ssDNA binding protein gp32	NC_006820.1	63-242	995-423	79/202 (39%)	3e-29
2	Enterobacteria phage Phi1	UvsW RNA-DNA and DNA-DNA helicase ATPase	NC_009821.1	443-500	998-855	19/58 (32%)	1.9
	Synechococcus phage syn9	sliding clamp	NC_008296.2	4-45	126-1	19/58 (32%)	4.5
3	Psychroflexus torquis ATCC 700755	ATP-dependent DNA helicase RecG	NZ_AAPR01000001.1	12-136	541-873	38/129 (29%)	0.045
	Leishmania major	hypothetical protein, conserved	XM_001681761.1	58-115	121-297	23/59 (38%)	0.22
4	Enterobacteria phage RB69	UvsX RecA-like recombination protein	NC_004928.1	34-225	578-3	89/192 (46%)	2e-41
	Enterobacteria phage JS98	UvsX RecA-like recombination protein	NC_010105.1	34-225	578-3	87/192 (45%)	3e-41

실시예 7 : ΦCJ3 특이적 프라이머 염기서열 제작

ΦCJ3을 동정하기 위하여 ΦCJ3 특이적인 프라이머를 서열번호 1 내지 4를 바탕으로 제작하였다. 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 그리고 서열번호 11과 12을 각각 프라이세트로 하여 PCR을 진행하였다. 0.1 ug의 박테리오파지 전체 게놈 DAN와 0.5 pmol이 되도록 프라이머를 pre-mix (Bioneer 사)에 첨가하고 최종부피가 20 ul이 되도록 맞추었다. 이를 denaturation; 94℃ 30 초, annealing; 60℃ 30 초, polymerization; 72℃ 1 분 의 조건으로 30 cycles PCR을 진행하였다. 그 결과 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 그리고 서열번호 11과 12를 프라이머 세트로 이용했을 경우 전부 약 1 kb 정도의 PCR 산물을 수득하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실시예 8 : 박테리오파지의 감염능력 확인

ΦCJ3의 감염 능력을 확인하기 위하여 one-step growth 실험을 진행하였다.

SG 배양액(OD₆₀₀=0.5) 50 ml을 4000 rpm에서 10 분간 원심분리 한 후 새로운 LB 배지 25 ml에 재부유했다. 여기에 분리한 박테리오파지를 MOI=0.0005로 접종한 후 5 분간 정치시켰다. 반응액을 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 균체를 분리한 다음 이를 다시 새로운 LB로 재부유 시켰다. 이후 37℃에서 배양하며 10 분 간격으로 2개씩 배양액을 수집하여 12000 rpm에서 3 분간 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이방법으로 각 단계의 희석액을 10 ul씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 이와 같은 실험을 SP, ST, 그리고 SE에 대해서도 똑같이 진행하였다. SG, SP, ST, SE를 숙주세포로 이용하였을 때 one-step growth 결과를 보면 방출크기(burst size)는 모두 2 X 10² 이상임을 알 수 있었다. 그 결과를 도 5 내지 도 8에 나타내었다.

실시예 9 : 박테리오파지의 pH에 따른 안정성 조사

ΦCJ3이 닭 위장 내 낮은 pH에서 안정성을 알아보기 위하여 다양한 pH 범위(pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.2, 9.0)에서 안정성 조사 실험을 하였다. 다양한 pH 용액(소디움아세테이트 용액(Sodium acetate buffer (pH 2.1, pH 4.0, pH 5.5, pH 6.4)), 소디움시트레이트 용액(Sodium citrate buffer (pH 2.5, pH 3.0, pH 3.5)), 소디움포스페이트 용액(Sodium phosphate buffer (pH 6.9, pH 7.4)), 트리스 용액(Tris-HCl (pH 8.2, pH 9.0))을 각각 2 M로 제작하였다. pH 용액 100 ul와 동량의 1.0 X 10¹¹ pfu/ml 타이터의 박테리오파지용액을 섞어 각 pH 용액의 농도가 1 M이 되게 한 후, 1 시간 동안 상온에서 정치하였다. 이들을 단계 희석하고, 소프트 아가 오버플레이(soft agar overlay) 방법을 이용하여 각 단계의 희석액을 10 ul 씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 원래의 ΦCJ3의 타이터와 비교하여 pH 변화에 따른 타이터 변화를 통하여 상대적 안정성을 확인하였는데, 실험 결과 pH 3.5까지는 활성을 잃지 않고 매우 안정적임을 알 수 있었다. 하지만 pH 3.0 이하의 pH에서는 활성을 잃었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

실시예 10 : 박테리오파지의 온도에 따른 안정성 조사

박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 발생하는 열에 대한 안정성을 확인하기 위한 실험을 하였다. 1.0 X 10¹¹ pfu/ml 타이터의 ΦCJ3의 용액 200 μl 를 37℃, 45℃, 53℃, 60℃, 70℃, 그리고 80℃의 온도 조건 하에서 각각 0 분, 10 분, 30 분, 60 분, 120 분 동안 정치시켰다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액 10 ul씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 원래 타이터와 온도 및 노출 시간 변화에 따른 상대적 안정성을 확인하였는데 60℃에서 2 시간까지 노출이 되어도 활성을 많이 잃지 않는 것을 알 수 있었다. 하지만 70℃이상에서는 활성을 잃어버리는 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

실시예11 : 박테리오파지의 건조에 대한 안정성 조사

박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 발생하는 건조 조건에 대한 안정성을 확인하였다. 내열성 확인 실험을 통해 도출한 결과를 바탕으로, spray-dryer (Lab Plant 사)를 이용하여 건조 실험을 진행하였다. 1.0 X 10¹¹ pfu/ml 타이터의 ΦCJ3의 용액 50 ml에 안정화제형으로 덱스트린(dextrin)과 설탕(sugar)를 각각 w/v 으로 20%와 2%가 되게 첨가하였다. 이를 inlet 온도 95℃, 3 ml/min 속도의 조건으로 spray-dryer 내부로 분사시켰다. 그 후 만들어진 분말 0.3 g을 2 ml의 SM 용액에 재부유 시킨 후 타이터를 측정하였다. 건조 후 원래 타이터와의 상대적인 안정성을 비교하였을 때 활성이 약 5 x 10³ 정도 감소하는 것을 알 수 있었다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

실시예12 : 박테리오파지의 야생 분리주에 대한 감염범위 조사

ΦCJ3이 실험에 사용된 SG(SG SGSC2293), SP(SP SGSC2295), ST(ST ATCC14028) 그리고 SE(SE SCSG 2282) 이외 서울대학교 수의과대학 조류질병학실에서 분리한 우리 나라의 야생 분리주 SG 27주, SP 16, ST 13주, 그리고 SE 2주에 대하여 용균 활성이 있는지 여부를 확인하였다. 각 균주의 진탕 배양액 (OD₆₀₀=2) 150 μl을 섞어 소프트 아가 오버레이 방법을 진행하여 10¹⁰ pfu/ml 타이터의 ΦCJ3의 용액 10 ul씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균반 형성 유무를 관찰하였다. 야생 분리주 모두에 대하여 100% 용균율을 보이는 것을 확인할 수 있었고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

< 야생 분리주 SG, SP, ST, SE에 대한 용균 형성 여부 조사 >

Sero type	Strain name	ΦCJ2 용균반형성 유무	Sero type	Strain name	ΦCJ2 용균반형성 유무
SG	SNU SG1	O	SP	SNU SP1	O
	SNU SG2	O		SNU SP 4	O
	SNU SG3	O		SNU SP 5	O
	SNU SG4	O		SNU SP 8	O
	SNU SG5	O		SNU SP 11	O
	SNU SG6	O		SCSG 2294	O
	SNU SG7	O		SCSG 2295	O
	SNU SG8	O		SCSG 2742	O
	SNU SG9	O		SCSG 2743	O
	SNU SG10	O		SCSG 2745	O
	SNU SG11	O		SCSG 2751	O
	SNU SG12	O		SCSG 4663	O
	SNU SG13	O		SCSG 4664	O
	SNU SG14	O		SCSG 4665	O
	SNU SG15	O		SCSG 4666	O
	SNU SG16	O		SCSG SA1684	O
	SNU SG17	O	ST	SNU ST2	O
	SNU SG18	O		SNU ST3	O
	SNU SG19	O		SNU ST4	O
	SNU SG20	O		SNU ST7	O
	SNU SG21	O		SNU ST8	O
	SNU SG24	O		SNU ST11	O
	SCSG 9184	O		SNU ST12	O
	SCSG 2292	O		SNU ST17	O
	SCSG 2293	O		SNU ST37	O
	SCSG 2744	O		SNU ST38	O
	SCSG 2296	O		SNU ST41	O
SE	SCSG 2282	O		SNU ST42	O
	SCSG 2377	O		UK1	O

* SNU : 서울대학교 수의과대학 조류질병학실

* SGSC : salmonella genetic stock center

본 발명의 박테리오파지는 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스 특이적 사멸능을 가져 익균을 사멸시키지 않으며, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어나므로, 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병, 특히 가금 티푸스, 추백리, 가금파라티푸스 또는 가금 유래 식중독 예방 및 치료 목적의 치료제, 항생제, 가축용 사료 등에 광범위하게 이용될 수 있다.

도 1은 ΦCJ3 의 전자 현미경 사진이다. 형태학상 형태형(morphotype) A1, 마이오비리데(Myoviridae)에 속한다

도 2는 분리된 박테리오파지 ΦCJ3의 SDS-PAGE 결과이다. 박테리오파지의 단백질 패턴을 나타낸 것으로 45 kDa, 62 kDa, 그리고 80 kDa 의 주 단백질로 관찰되었고, 그 외에 17 kDa, 28 kDa, 110 kDa, 및 170 kDa 의 단백질이 관찰되었다. 인비트로젠(Invitrogen) 사의 See-blue plus 2 prestained-standard를 마커로 사용하였다.

도 3은 분리된 박테리오파지 ΦCJ3의 PFGE 결과이다. ΦCJ3의 전체 게놈의 크기는 약 158 kb 정도이다. 바이오라드(Bio-rad)사의 5 kb DNA size standard를 크기 마커(size marker)로 사용하였다.

도 4는 ΦCJ3의 게놈 DNA의 각 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다. A; 서열번호 5와 6번 프라이머 세트로 PCR 증폭, B; 서열번호 7과 8번 프라이머 세트로 PCR 증폭, C; 서열번호 9와 10번 프라이머 세트로 PCR 증폭, D; 서열번호 11과 12번 프라이머 세트로 PCR 증폭. A, B, C 그리고 D lane 모두 1.0 kb 정도의 PCR 산출물을 가진다.

도 5 내지 도 8은 박테리오파지 ΦCJ3의 one-step growth 실험 결과이다. 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 및 살모넬라 엔테리 티디스(Salmonella enteritidis)에서 모두 방출 크기가 2 X 10² 이상이다.

도 9는 박테리오파지 ΦCJ3의 내산성 실험 결과로서, pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.0 및 9.0에서의 생존 박테리오파지 수를 나타낸다. Control과 비교하여 pH 3.5 까지는 박테리오파지 ΦCJ3의 활성을 잃지 않으나 pH 3.0 이하에서는 활성을 완전히 잃는다.

도 10은 박테리오파지 ΦCJ3의 내열성 실험 결과로서, 37, 45, 53, 60, 70 및 80℃에서 0, 10, 30, 60 및 120 분마다 시간별로 장치해 두었을 때 생존 박테리오파지 수를 나타낸다. 60℃에서 2 시간까지 노출이 되어도 활성을 잃지 않으나, 70℃ 이상에서는 10 분 노출 후 활성을 완전히 잃는다.

도 11은 박테리오파지 ΦCJ3의 내건성 실험결과이다. 스프레이드라이어를 이용하여 덱스트린과 설탕을 안정화제로 넣어서 건조 처리한 결과로서, 건조 후 원래 타이터와 상대적인 안정성을 비교하였을 때 활성이 약 5 X 10³ 정도 감소하는 것을 알 수 있었다.

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Novel bacteriophage and antibacterial composition comprising the same <130> PA080580/KR <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1000 <212> DNA <213> Bacteriophage KCCM 10977P <400> 1 ccctgctggc ttataagcaa ctcgatcagc ttgtaaacaa tctggctggt atcagcttgg 60 ctgatttcga aaggatctct atcggcatcc agagggatat attaggcaat gataacctga 120 cggcgtctga gaagagtagt ctgttgggat tgttacagga tgttgtcaaa aactaaaaag 180 cccccgaagg ggctttagtg aaattagtct tgcttcagga actgctcgaa ctcatcaatg 240 gaagccgtct gtttcgcatc ggcaccacca ttattggctg gaacagattg ctgtgcatta 300 gaaggctgag attgttgttg gtttagactt tcctgcgctg ttgggcgctg gggttcctga 360 gactgggtag gcgcatgtgc catagtagaa gcaccacctt caaccagagg ctgattatca 420 gggatggcca gaactttgcg caaacgtttt tccagatctt cgtacgattt gaagttggcc 480 ggattaaaga actcaaacag actgtgttct ttttcccaga tctcttcaat gtattcgtct 540 gtccccaaag gtgccggagt atcccacttc acattggtga agttggccac cagacctttc 600 cagttgccga actctttctc ttcgccaaag aggttcagaa tcaggttcgc gccttcccac 660 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900 tcatttgttc agttgtaaca tcctttggaa tagcatgaac ataatatatc gcatcttcaa 960 aatagatatg ctgcaatgac tctggaattt cttccccgcc 1000 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccctgctggc ttataagcaa c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgtgtgccat gatcatgaaa c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aatgtcggca atagcgataa c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cctctaagga tgttgcgcga a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aattatgcaa atggccagca g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 taccacctaa ttccggacat g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtgatgaacc acaattggtt a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggcggggaag aaattccaga g 21

Claims (12)

1. 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium)과 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)에 특이적 사멸능을 갖는 기탁번호 KCCM10977P인 박테리오파지.
2. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 형태학상 형태형(morphotype) A1, 마이오비리데 (Myoviridae)에 속하고, 전체 게놈 크기가 158 kb이며, 45 kDa, 62 kDa, 및 80 kDa 크기의 단백질을 주요 구조단백질로 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 서열번호 1 내지 4로 기재되는 핵산 분자를 전체 게놈의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
5. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 pH 3.5 내지 pH 9.0 범위에서 내산성을 가지는 박테리오파지.
6. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 37℃ 내지 60℃ 범위에서 내열성을 가지는 박테리오파지.
7. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 건조하였을 때 내건성을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
8. 제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상 선택된 살모넬라균 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 살모넬라 갈리나룸 감염성 질병은 가금티푸스이고, 살모넬라 플로럼 감염성 질병은 추백리이며, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스 감염성 질병은 가금파라티푸스 또는 가금 유래 식중독인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제8항의 조성물을 함유하는 항생제.
11. 제8항의 조성물을 함유하는 가금용 사료.
12. 제8항의 조성물을 이용하여 인간을 제외한 동물의 살모넬라 갈리나룸, 살모넬라 플로럼, 살모넬라 타이피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상 선택된 살모넬라균 감염성 질병을 치료하는 방법.

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