KR102037398B1

KR102037398B1 - 신규한 살모넬라균 특이 박테리오파지 sg102 및 이를 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR102037398B1
Application number: KR1020170180597A
Authority: KR
Inventors: 김영주; 김선진; 연영은; 한범구; 김현일; 박철세
Original assignee: 주식회사 옵티팜
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-10-28
Also published as: KR20190078864A

Abstract

본 발명은 신규한 살모넬라균 특이 박테리오파지 SG102에 관한 것으로서, 더욱 상세하기는 상기 살모넬라균 특이 박테리오파지 SG102를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 박테리오파지 SG102는 살모넬라균에 대한 특이성이 매우 높고, 살모넬라균에 감염하여 살모넬라균 내에서 증식함으로써 용균 활성이 우수하며, 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 SG102는 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는바, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

신규한 살모넬라균 특이 박테리오파지 SG102 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel Salmonella specific bacteriophage SG102 and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 신규한 살모넬라균 특이 박테리오파지 SG102에 관한 것으로서, 더욱 상세하기는 상기 살모넬라균 특이 박테리오파지 SG102를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

살모넬라(Salmonella)는 장내세균과에 속하는 그람음성의 통성혐기성 세균으로 아포를 형성하지 않는 간균이다. 살모넬라균은 사람과 동물의 장관 내 급성 감염을 유발하는 균으로, 오염된 식품을 통하여 사람에 전염될 수 있는 인수공통전염병의 주요한 원인 중 하나이다. 대표적으로 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)는 사람뿐 아니라 동물에도 동시에 감염될 수 있는 혈청형으로 알려져 있다. 사람에게 있어서는 식중독을 일으키며, 닭, 돼지, 소 등에 있어서는 살모넬라증을 유발하여 급성 또는 만성의 감염증으로 발생한다. 감염 시 발열, 장염, 패혈증 등이 발생하고 폐렴, 관절염, 유산 등도 일으킬 수 있다. 이러한 살모넬라는 돼지의 경우 2~4개월의 어린 돼지에 다발하고, 6개월 이상이 지나면 발병이 감소한다고 알려져 있다. 또한 닭의 경우에는 다양한 계군과 일령에서 감염되어 질병을 일으킨다고 보고되고 있다. 보통 살모넬라는 건강한 돼지에도 존재하며 보유율의 경우 나라, 지역, 계절에 따라 차이가 있으나 10 내지 20% 정도이다. 동물에게 감염되는 경로는 경구이며, 감염원의 유입 경로는 오염된 사료, 물, 외부 요인 등을 들 수 있다. 또한 계사나 돈사 내에서는 오염된 개체들을 통해 수직 또는 수평 감염이 원인이 되어 질병을 계속해서 유발할 수 있다. 또한 가금 특이적인 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarum)과 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum)은 각각 양계에 있어서 가금티푸스와 추백리를 일으키며 발생 시 대량 폐사를 유발 할 수 있다. 또한 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)는 돼지에 감염되어 돼지 콜레라를 일으킬 수 있고 살모넬라에 의한 급성 패혈증을 발생시킬 수 있다.

살모넬라균은 다양한 혈청형을 가지며 현재 2,600여종 이상의 혈청형이 보고되고 있다. 살모넬라균은 혈청형이 다양한 만큼 혈청형에 따라 감염되는 동물이 다를 수 있는데, 가금티푸스를 일으키는 살모넬라 갈리나륨이나 추백리를 일으키는 살모넬라 플로럼은 닭에게만 감염되어 질병을 일으키기도 한다. 특히 살모넬라 갈리나륨은 가금에 있어서 경구나 호흡기관을 통해서 감염, 전염되어 가금티푸스(Fowl typhoid)를 유발하는 원인균으로 분류된다. 급성 또는 만성으로 질병을 초래할 수 있으며 감염 시 폐사율이 50% 이상이며 치사율이 거의 100%에 이를 수 있어 산란계 산업에 있어서 가장 심각한 질병이라고 할 수 있다. 폐사율이 높으며 산란 수가 현저히 감소하게 되므로 경제적으로도 막대한 영향을 미치고 있는 실정이다. 살모넬라 갈리나륨에 의한 질병은 양계산업에서 산란계에서 더 많은 수로 빈번하게 발병하며 오염원은 주로 감염된 사료나 물 또는 환경 등 여러 경로로 전염이 되고 있다. 이 원인균은 국내에서는 1992년 이래로 주로 갈색의 산란계 농장에 전국적으로 확산되어 있다. 가금티푸스를 예방 및 치료하기 위해 항생제를 주로 사용하고 있으나 최근 많은 분야에서 항생제 내성에 대한 문제가 발생되고 있어 이에 대한 원인을 항생제 오남용으로 규명하고 항생제를 충분히 사용하지 못하게 되었다. 이에 따라 산업동물의 배합 사료 내에 성장촉진제로 사용하는 항생제를 금지하기 시작하였고, 유럽연합에서는 2006년부터, 우리나라에서는 2011년 하반기부터 항생제 사용을 규제하기 시작하였다. 또한 항생제가 없는 안전한 먹거리에 대한 소비자의 요구가 증대되고 있어 점차 항생제 사용이 줄어들고 있다.

한편, 박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균을 감염시켜 감염된 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스를 의미한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다. 따라서 최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 자연 친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다.

이에 본 발명자들은 박테리오파지를 기존 항생제의 대체 물질로 활용하기 위하여, 살모넬라균 특이 박테리오파지를 분리하였고, 분리된 박테리오파지의 형태적 및 유전학적 특성 분석을 통해 살모넬라균을 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 살모넬라균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 SG102를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는 항생용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는 소독제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는 세척제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 SG102를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 살모넬라균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살모넬라균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 SG102를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는 항생용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는 소독제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는 세척제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 살모넬라균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 박테리오파지 SG102는 살모넬라균에 대한 특이성이 매우 높고, 살모넬라균에 감염하여 살모넬라균 내에서 증식함으로써 용균 활성이 우수하며, 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 SG102는 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는바, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 박테리오파지 SG102의 살모넬라 갈리나륨에 대한 용균반 형성 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 박테리오파지 SG102의 전체 유전자를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 박테리오파지 SG102의 형태학적 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 SDS-PAGE를 통해 본 발명에 따른 박테리오파지 SG102의 단백질 패턴을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 박테리오파지 SG102의 pH 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 박테리오파지 SG102의 열 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 살모넬라균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 SG102를 제공한다.

본 발명에서, 용어 박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.

본 발명에서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있으며, 바람직하게는 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)이다.

본 발명의 박테리오파지 SG102의 전체 유전자의 크기는 38,352 bp 이며, GC함량이 50.8%, 전체 ORFs의 수는 48개이다. 상기 박테리오파지 SG102는 살모넬라균, 특히 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)에 대해 용균활성이 탁월하다. 또한, 상기 박테리오파지 SG102는 150 내지 170 nm의 크기로, 정이십면체의 머리를 가지며 꼬리를 가지는 형태인 사이포비리대(Siphoviridae)에 속한다. 본 발명의 박테리오파지 SG102의 단백질 패턴 분석 결과 70, 60, 41, 34 및 16 kDa 크기의 단백질을 포함하는 것을 확인하였다. 또한 상기 박테리오파지 SG102는 열 및 pH에 대한 안정성이 우수한 특성을 가지고 있다.

본 발명의 박테리오파지 SG102는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 전체 유전자의 전체 또는 일부로서 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 박테리오파지 SG102는 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 및 상기 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란 염기서열의 변형, 치환의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다.

상기와 같은 살모넬라균 특이적 용균활성, 내산성, 내염기성 및 내열성은 본 발명의 박테리오파지 SG102을 살모넬라균에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 박테리오파지 SG102을 유효성분으로 포함하는 다양한 제품에 적용함에 있어, 다양한 온도 및 pH 범위의 적용이 가능하게 한다.

본 발명의 박테리오파지 SG102은 하수처리장으로부터 시료를 채취하여 분리한 박테리오파지로서, 본 발명자는 박테리오파지 SG102로 명명하고 2017년 11월 28일에 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울, 한국)에 기탁하여, 기탁번호 KFCC11753P를 부여받았다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는, 항생용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 항생용 조성물은 약제 형태로 개체에 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제, 항생제 및 항균제를 총칭하는 것이다.

본 발명의 박테리오파지 SG102는 기존 항생제에 비하여 살모넬라균에 대한 특이성이 매우 높으므로, 유익균은 죽이지 않고, 특정 병원균만 사멸시킬 수 있고, 약물 내성 내지 저항성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는, 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 질병의 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이고 가축에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있어서 문제이다. 항생제가 육류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 또한, 사료에 섞어 먹이는 항생제의 종류가 많고 이는 다제 내성균 발생 확률이 높아지는 문제점이 있기 때문에 좀 더 자연 친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결할 새로운 사료 첨가용 항생물질로서 본 발명의 상기 박테리오파지 SG102를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공할 수 있으며, 본 발명의 사료는 박테리오파지를 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파지는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 사료는 본 발명의 박테리오파지 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 동물의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 SG102를 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 포함될 수 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 포함될 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는, 소독제를 제공한다.

다양한 살모넬라균에 특이적 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지 SG102를 포함하는 소독제는 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 양계장, 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 포함하는, 세척제를 제공한다.

본 발명의 박테리오파지 SG102는 다양한 살모넬라균에 특이적 사멸능을 가지므로, 상기 살모넬라균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 가축의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 SG102를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 살모넬라균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 살모넬라균은 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있으며, 바람직하게는 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 또는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)이다.

본 발명의 방법은 살모넬라균에 의한 감염성 질병, 예컨대 유행성 또는 급성으로 발병하는 전염성 질환으로, 살모넬라증 외에 식중독, 위염, 장염, 폐렴, 패혈증, 장티푸스 및 가금티푸스가 발생한 개체 또는 발생 위험이 있는 개체에 박테리오파지 SG102를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, 용어 "개체"는 살모넬라균에 의한 감염성 질병이 발병될 수 있는 모든 개체를 의미하는 것으로 인간을 포함한 포유동물, 가축류 또는 가금류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지 SG102는 가금디티푸스의 원인인 살모넬라 갈리나륨에 특이적 사멸능을 가지는바, 바람직하게는 가금류에 투여될 수 있다.

상기 용어 "가축류"는 인간에 의하여 순화, 개량되어 사람과 함께 공동생활을 하는 유용한 동물을 지칭하는 개념으로, 예를 들어, 돼지, 소, 닭, 말, 오리 또는 개 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 "가금류"는, 가축 중 조류에 속하는 동물을 총칭하여 이르는 개념으로, 예를 들어, 닭, 오리, 꿩, 메추리, 타조, 거위 또는 칠면조 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서 상기 박테리오파지 SG102 또는 이를 포함하는 조성물은 약학적 제제의 형태로 개체에 투여되거나, 가축의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에서 상기 박테리오파지 SG102 또는 이를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 투여되는 상기 박테리오파지 SG102의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 신규한 박테리오파지의 분리 및 배양

1.1 박테리오파지의 스크리닝 및 단일 박테리오파지의 분리

살모넬라 갈리나륨에 특이적인 박테리오파지를 스크리닝 및 분리하기 위해서 용균반 분석을 수행하였다. 시료는 박테리오파지가 존재할 것으로 예상되는 하수처리장으로부터 채취하였으며, 박테리오파지 분리에 사용된 살모넬라 갈리나륨은 (주)옵티팜에서 채취한 야외 시료로부터 분리 동정된 것을 사용하였다.

구체적으로, 채취한 시료를 균질화 한 후 살모넬라 갈리나륨과 함께 35℃에서 24시간 동안 진탕배양 하였다. 상기 배양액을 4,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후, 상등액을 공극(pore) 크기가 0.2 μm인 필터를 이용하여 여과하여 시료 여과액을 얻었다.

전배양된 살모넬라 갈리나륨 150 μL를 취해서 멸균된 튜브에 넣고 3 mL의 LB 탑 아가(top agar) [LB 배지(트립톤 10 g/L, 효모 추출물(yeast extract) 5 g/L, NaCl 10 g/L) + 0.6% 아가]를 첨가하여 잘 혼합한 후 미리 만들어 둔 2% LB 아가 플레이트에 중층하였다. 이를 실온에서 30분간 방치한 후 상기 시료 여과액을 각각 10 μL씩 점적하고, 다시 실온에서 30분간 방치한 후 35℃에서 24시간 동안 배양하여 박테리오파지의 유무를 확인하였다.

박테리오파지의 존재를 확인한 시료로부터 박테리오파지를 순수 분리하기 위해서 소프트 아가 오버레이(soft agar overlay)법을 이용하였다. 박테리오파지가 존재하는 것으로 확인된 시료를 식염수로 적절히 희석하여 각 희석단의 시료 희석액 100 μL를 취하고, 대상 세균(살모넬라 갈리나륨) 배양액 150 μL에 혼합한 후 0.6% LB 탑 아가 3 mL을 첨가하여 잘 혼합한 뒤, 미리 만들어 둔 2% LB 아가 플레이트에 중층하여 방치한 후 35℃에서 24시간 배양하였다. 배양한 각 플레이트에서 형성된 용균반을 확인한 후, 이를 선택하여 400 μL의 SM 완충액 (NaCl 5.8 g/L; MgSO₄7H₂O 2 g/L; 1M Tris-HCl (pH7.5) 50 mL)에 현탁하고, 실온에서 4시간동안 방치하였다. 상기 박테리오파지액 100 μL를 0.6% LB 탑 아가와 세균 배양액 500 μL와 혼합한 뒤 150 mm 지름의 LB 플레이트에 분주하여 중층한 후 완전히 용균이 일어날 때까지 35℃에서 배양하였다. 배양이 종료된 후, LB 플레이트에 15 mL의 SM 완충액을 가하고 실온에서 4시간 동안 천천히 교반하면서 박테리오파지 용액을 회수한 후 4,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액만 취하고 이를 0.2 μm 필터로 여과하여 최종 박테리오파지 용액을 회수하였다. 이렇게 얻어진 최종 박테리오파지의 용균반을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 5 내지 7 mm의 크기를 가지는 용균반을 확인함으로써, 상기 박테리오파지가 살모넬라 갈리나륨에 특이적인 용균능을 갖는 박테리오파지임을 확인하였다.

1.2 박테리오파지의 대량 배양 및 정제

상기 실시예 1.1에서 확인한 살모넬라 갈리나륨 특이적 박테리오파지를 대량 배양하기 위하여, 1.1에서 회수한 최종 박테리오파지 배양액을 1.0x10⁷PFU/mL로 희석한 후 전배양된 살모넬라 갈리나륨 1.0x10⁹CFU/mL과 혼합하고 MOI(Multiplicity of infection)를 0.01이 되도록 하여 35℃에서 120 rpm으로 6시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후 배양액 전량을 6,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였고, 이를 0.2 μm 필터로 여과하여 최종 박테리오파지 배양액을 회수하였다.

분리된 박테리오파지를 "박테리오파지 SG102(Bacteriophage SG102)"로 명명하고, 2017년 11월 28일에 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울, 한국)에 기탁하고, 수탁번호 KFCC11753P를 부여받았다.

실시예 2. 박테리오파지 SG102의 전체 유전자 분석

박테리오파지 SG102의 전체 유전자를 분석하기 위해, 박테리오파지 SG102 배양액에 20 mM EDTA, 50 μg/mL의 프로테나아제 K, 0.5%(w/v) SDS를 가한 후, 50℃에서 1시간 동안 정치하였다. 동량의 페놀-클로로포름-이소프로필 알코올(25:24:1)과 혼합한 후 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액을 동일 부피의 페놀-클로로포름-이소프로필 알코올(25:24:1)과 혼합하여 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 회수하고, 상기 상등액에 3M 소듐 아세테이트를 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가한 후 혼합하였다. 여기에 2배 부피의 차가운 95% 에탄올을 가하여 혼합한 뒤 -20℃에서 1시간 동안 정치하였다. 반응이 끝난 후 0℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심분리하여 침전물을 획득하였고, 차가운 70% 에탄올로 2회 세척한 뒤 에탄올을 완전히 제거하여 DNA 펠렛을 회수하였다. 회수한 펠렛을 최종 부피가 50 μL가 되도록 TE 완충액(Tris-EDTA, pH8.0)에 용해시킨 후 DNA 농도를 측정하였다. 전체 유전자 분석을 위해 PacBio RSII를 이용하여 유전자 시퀀싱을 시행하였고(마크로젠, 한국), 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 유전자 시퀀싱 분석을 수행한 결과, 박테리오파지 SG102의 전체 유전자의 크기는 38,352 bp 이며, GC함량이 50.8 %, 전체 ORFs의 수는 48개임을 확인하였다. 상기 분석한 박테리오파지 SG102의 전체 유전자 서열을 서열번호 1로 나타내었다.

실시예 3. 박테리오파지 SG102의 형태학적 특성

박테리오파지 SG102의 형태학적 특성을 알아보기 위해, 배양액을 0.01% 젤라틴 용액에 희석하여 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 탄소 코팅 운모 플레이트(carbon-coated mica plate)(ca. 2.5 x 2.5 mm)에 적가한 후, 10분간 적응시켜 멸균증류수로 세척하였다. 이를 구리 격자(copper grid)에 끼워 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)에서 30 내지 60초간 염색하고 건조시킨 후, 투과전자현미경(Tecnai G² Spirit Twin, Bio-Transmission electron microscope, 120 kV, 120,000~400,000)으로 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 SG102는 150 내지 170 nm의 크기로, 정이십면체의 머리를 가지며 꼬리가 있는 형태인 사이포비리대(Sipoviridae)에 속함을 확인하였다.

실시예 4. 박테리오파지 SG102의 단백질 패턴 분석

박테리오파지 SG102의 단백질 패턴을 분석하기 위해, 1.0x10¹⁰PFU/mL로 준비된 박테리오파지 SG102 40 μL를 10 μL의 5X 로딩 완충액과 혼합하고, 10분간 끓인 다음 12.5% SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE 수행 후 단백질 전기영동 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 SG102는 70, 60, 41, 34 및 16 kDa 크기의 주요 단백질을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 5. 박테리오파지 SG102의 다양한 세균에 대한 감염성 조사

박테리오파지 SG102가 다양한 세균에 대하여 용균활성을 나타내는지 확인하기 위하여 ㈜옵티팜에서 분리하여 보유하고 있는 균주와 미생물 자원센터 등에서 분양받은 균주를 대상으로 소프트 아가 오버레이법을 통해서 감염성을 확인하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 살모넬라균 및 다른 미생물을 대상으로 감수성 조사를 수행한 결과, 박테리오파지 SG102는 살모넬라균, 특히 살모넬라 갈리나륨, 살모넬라 티피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스에 특이적인 용균활성을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 6. 박테리오파지 SG102의 pH 안정성 조사

박테리오파지 SG102의 pH에 대한 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 pH 범위(pH2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11)에서 박테리오파지의 수를 측정하였다. 소듐 아세테이트 완충액, 소듐 포스페이트 완충액, Tris-HCl을 이용하여 각각의 pH에 맞게 조제한 후 990 μL로 분주하여 준비하였다. 박테리오파지 SG102 배양액을 1.0x10⁸PFU/mL가 되도록 준비한 다음 배양액을 10 μL씩 취하여 pH에 맞게 조제한 각각의 완충액에 첨가하여 2시간 동안 상온에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이법에 의해 타이터(titer) 측정을 수행한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 박테리오파지 SG102는 pH3 내지11의 범위에서 안정한 것을 확인하였다. 이를 통해 박테리오파지 SG102는 pH 안정성이 우수한 박테리오파지임을 알 수 있다.

실시예 7. 박테리오파지 SG102의 열 안정성 조사

박테리오파지 SG102의 열 안정성을 확인하기 위하여, 40℃, 50℃, 60℃, 및 70℃ 등 다양한 온도 범위에서 일정 시간 방치 후 박테리오파지의 수를 측정하였다. 보다 구체적으로, 박테리오파지 SG102 배양액을 1.0x10⁷PFU/mL가 되도록 희석한 후 배양액 5 mL을 멸균된 튜브에 분주하고 30분, 1시간 및 2시간 동안 각 온도에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이법에 의한 타이터 측정을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 박테리오파지 SG102는 40 내지 60℃의 범위에서 안정한 것을 확인하였다. 이를 통해 박테리오파지 SG102는 내열성이 우수한 박테리오파지임을 알 수 있다.

종합적으로 본 발명자들은 박테리오파지 SG102가 살모넬라균, 특히 살모넬라 갈리나륨, 살모넬라 티피뮤리움 및 살모넬라 엔테리티디스에 대한 특이성이 매우 높고, 살모넬라균에 감염하여 살모넬라균 내에서 증식함으로써 용균 활성이 우수하며, 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 박테리오파지 SG102는 사람, 동물, 실물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 박테리오파지 SG102는 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이하, 제제예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 제제예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 제제예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.

제제예 1. 사료 첨가용 조성물

박테리오파지 SG102 1x10⁷ PFU/mL

비타민 믹스 100 mg

미네랄 믹스 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 사료 첨가제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

제제예 2. 소독제 조성물

박테리오파지 SG102 1x10⁷ PFU/mL

에탄올 적량

멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 소독제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

제제예 3. 세척제 조성물

박테리오파지 SG102 1x10⁷ PFU/mL

에탄올 적량

효소 복합물 적량

멸균 증류수 적량

통상의 세척제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터

KFCC11753P

20171128

<110> Optipharm.CO.,LTD <120> Novel Salmonella specific bacteriophage SG102 and antibacterial composition comprising the same <130> 1-69P <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 38352 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> bacteriophage SG102 <400> 1 cgctcggtca tcctcaaact gcatctcctt ggtcttctgt gcgcgggact tatcagcgtc 60 gataagaacc tgcgtgtcga taccttggtt atccaacatg tccatcgtca ggaacaactc 120 ggccttgtca ggatacagag aggcaatcag gtcagggtca gtgttgcgga tgcgacgaag 180 gttgtccata gctggtgtgc tctcaggcat cttaccgtta atcaccgcag cctgccactc 240 attacccgcg tccgtaatca tctcaccaaa cgccgccctg aacgcacctt ccttggcgtc 300 tgcccgtagg tagtccaatt tcagtttgtc tttctgttca ggcgttaagt ccatcgcttc 360 gatttccgct aacttctggt tcgcgtagtt gaccatatcg ctatgtgtaa actcaccagt 420 gttctcgttg gtcggcatgt ccttatagtt tgtcgagacg tattcaccgt tgaggcgctt 480 ctggaactgc ttgtcgatga ccaaagattt gttcagggtc ttctgttgct tgtccatcag 540 cttggctgtc tcagcctgtt cctgcttgaa gcgtgtgcgc atctgttcct gtgcggaaat 600 caaccactcg cgctcaggag tcatctcttc acccggctga 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cggcaccagc 1500 cttagcgaag cgaccaatgg agtccagaag actcgctctt ggttgctcag cctgaatggt 1560 tgctgcccga tagtccatac ctttgacgcc ccggagtcgt tccataccgg gagtcgccat 1620 gttgcctaaa acactattta gtttactagc cattattacc tcccggtctt ggttcctttg 1680 gcggcactga taggtgctgc ttggtttcca cctttcttgt caaatccacc agccgcatat 1740 tgacttgcag cttcctgacc cataattgac agagggtcta gtacacgcat cagaccagac 1800 ttacctttgg cctcgctctt gtacattgca tcgacttgac ttgctgtgga ctgagtgcgt 1860 cccaactgtt gcgcaaagat actcgcgtag tctcgacggt agttctcggt gacactattt 1920 gcctcccgga tgtagttacc ttcttcgata cgcttgatgc gcttcatgga ttcaccttct 1980 agcatactct cgccgatagc tgcacggatt gttcccatag cctgtacctt ctgcatgtta 2040 cgtgaagtca actcagagga tgcagcttca agggcgtccc gttgttcaag cgaggcgttg 2100 gcattctgga tattcatctc tttgaccatc tccattgcct gtctgcgtcc agcttcggtc 2160 tgtgccactc gcgccttgtc agcactgttc tggctactca gagcttgggc acccatcatg 2220 gcaataggaa tcgctgccat ccagcacata gttacctcct actgatagtg aataattgga 2280 attgaccacc agcggtaaac tcattatgga ataccgcacc tatggtcttt 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Claims

살모넬라균에 특이적인 사멸능을 갖는 수탁번호 KFCC11753P인 박테리오파지 SG102로,
상기 살모넬라균은 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이며,
상기 박테리오파지는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 전체 게놈 크기가 38,352 bp인 것을 특징으로 하는, 박테리오파지 SG102.
삭제
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제1항의 박테리오파지 SG102를 포함하는, 항생용 조성물.
제1항의 박테리오파지 SG102를 포함하는, 사료 첨가용 조성물.
제5항의 사료 첨가용 조성물을 포함하는, 사료.
제1항의 박테리오파지 SG102를 포함하는, 소독제.
제1항의 박테리오파지 SG102를 포함하는, 세척제.
제1항의 박테리오파지 SG102를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 살모넬라균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법으로,
상기 살모넬라균은 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.