KR102193499B1 - 신규한 바실러스 세레우스 균 특이 박테리오파지 bc13 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 세레우스 균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 BC13, 상기 박테리오파지를 포함하는 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 박테리오파지 BC13을 이용한 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 비해 바실러스 세레우스 균에 대한 특이성이 매우 높고, 상기 박테리오파지 BC13은 바실러스 세레우스 균에 감염하여 탁월한 용균 활성을 나타내고 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 BC13은 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지 BC13은 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제, 또는 세척제 분야에서 다양하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 바실러스 세레우스 균 특이 박테리오파지 BC13 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel Bacillus cereus bacteria specific bacteriophage BC13 and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 바실러스 세레우스 균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 BC13, 상기 박테리오파지를 포함하는 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

바실러스(Bacillus)는 그람 양성의 간균으로 아포를 형성하고 편모를 갖는 세균이다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 산소 조건에서 잘 증식하는 호기성 세균으로 7~49℃에서 발육하며, 최적온도는 28~35℃이다. 다른 바실러스 속과 구별되는 특징으로는 β-용혈 현상을 가지고 있고, 레시틴 분해효소(lecithinase)를 생성하여 난황반응(egg-yolk reaction)에서 집락 주변이 유백색을 띄는 양상을 나타낸다. 바실러스 세레우스 균은 토양이나 물 등 자연계에 널리 분포하고, 열에 강한 포자를 형성하여 식품 등을 오염시킨다. 특히 쌀, 유제품, 육류, 향신료 등의 식품 원료나, 이를 가공한 식품에서 검출이 빈번하다. 1955년, 노르웨이에서 식중독 원인균으로 처음 보고가 되었으며 이후 영국 등 유럽에서의 발병사례가 많아 주목을 받아왔다. 최근 우리나라에서도 각종 식품에서 검출되어 주요 식중독 원인 균주로 규제 대상이 되고 있다. 바실러스 세레우스에 의한 식중독은 두 가지로 나뉠 수 있는 데, 장 독소(enterotoxin)를 원인 독소로 하는 설사형과 구토 독소(emetic toxin)를 원인 독소로 하는 구토형으로 두 가지 형태가 있다. 설사형인 경우 바실러스 세레우스가 인체 장관 내에서 증식하면서 enterotoxin을 생산하여 발생되며, 독소 활성은 내열성이 높아서 120℃, 20분 가열하여도 파괴되지 않는다. 육류, 소시지, 푸딩 등 기타 여러 가지 식품에서 발생한다. 구토형인 경우 오염된 식품 섭취 후 균이 증식하면서 구토형 독소인 emetic toxin에 의해 발생하며 구토, 오심, 복통을 유발한다. 독소는 126℃, 90분간 가열하여도 파괴되지 않으며 산, 알칼리 및 단백질 가수분해 효소에도 저항성을 갖는다. 바실러스 세레우스에 의한 식중독은 대부분의 경우 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스 생장세포나 포자가 10⁵~10⁸/g 존재할 경우 발생한다. 바실러스 세레우스의 포자는 강한 접착성을 지녔으며 어느 표면이든 잘 부착하여 세척과 소독에 어려움이 있다. 그리고 물체 표면에 부착 후 바이오필름을 형성하여 농업, 축산업, 식품산업 등에서 제어하기 어려운 문제가 되고 있다. 바실러스 세레우스의 포자가 강한 접착성을 지니는 것은 1) 포자가 상대적으로 높은 소수성을 지녔고 2) 포자의 표면이 낮은 전하를 띄고 3) 긴 부속사(appendage)가 포자를 싸고 있는 형태 때문이다. 이렇듯 바실러스 세레우스는 자연에 널리 분포되어 있고 그 특성으로 인하여 식품 중 오염을 방지하기는 어려우므로 가열, 염화나트륨, 유기산, 에탄올, 전자선 조사(electron beam irradiation) 등의 물리적, 화학적 제어법을 이용하여 사멸시키거나 증식을 억제한다. 하지만, 소비자들은 식품 내에 상기 물질의 함유 및 최소한의 가공 처리를 원하기 때문에 인체 유익한 미생물에는 무해하며 유해 미생물만을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 새로운 방법의 식품 보존 및 살균제가 요구되는 상황이다.

박테리오파지(bacteriophage)는 세균을 뜻하는 “bacteria”와 먹는다 라는 뜻의 “phage”의 합성어로 세균을 잡아먹는 바이러스를 말하며, 각각의 숙주 세균에만 특이적으로 감염되어 감염 세균의 성장을 억제하고 사멸시킨다. 1900년대 초, Twort와 d'Herelle에 의해 발견되어 세균성 질병의 치료에 사용되었지만 페니실린과 같은 항생제의 등장으로 점차 관심에서 멀어졌다. 이후, 항생제 남용으로 인한 부작용과 내성 균주의 출현으로 박테리오파지 치료법이 항생제 대체제로서 다시 주목 받고 있다. 박테리오파지의 세균 사멸 기작은 기존 합성 항생제와 달리 전혀 다른 기작으로 세균에 감염(infection)한 후 세균 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 내성 문제도 없다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균만을 사멸시키며 다른 세균에는 영향을 주지 않는다. 또한, 자연 친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있으며 미국 FDA에서 식품에 대장균(E. coli)과 살모넬라 (Salmonella) 제어용 파지 제품이 승인되어 활용 중에 있다. 따라서 최근 세균성 질환에 대한 기존 항생제의 대체 물질 개발이 요구되고 있는데, 다시금 새롭게 주목 받고 있는 항박테리아제로서의 박테리오파지가 그 하나의 대안이 될 수 있다.

이에 본 발명자들은 바실러스 세레우스 균에 특이적인 용균활성을 갖는 박테리오파지를 분리하고 분리된 박테리오파지의 형태적 및 유전적 특성을 분석하여 상기 박테리오파지가 바실러스 세레우스 균을 선택적으로 사멸할 수 있음을 확인하였으며, 상기 박테리오파지의 pH 안정성과 온도 안정성을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바실러스 세레우스 균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 BC13을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 BC13을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 세레우스 균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 BC13을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 항생용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는, 사료를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 소독제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 세척제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 박테리오파지 BC13을 이용한 바실러스 세레우스 균의 사멸 또는 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 비해 바실러스 세레우스 균에 대한 특이성이 매우 높고, 상기 박테리오파지 BC13은 바실러스 세레우스 균에 감염하여 탁월한 용균 활성을 나타내고 pH 안정성과 온도 안정성이 우수함을 입증한 바, 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 BC13은 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지 BC13은 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제, 또는 세척제 분야에서 다양하게 사용될 수 있다.

도 1은 박테리오파지 BC13의 바실러스 세레우스 균에 대한 용균반 형성 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 전자 현미경을 통해 박테리오파지 BC13의 형태학적 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 박테리오파지 BC13의 단백질 패턴을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 박테리오파지 BC13의 pH 안정성 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 박테리오파지 BC13의 온도 안정성 실험 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 바실러스 세레우스 균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 BC13을 제공한다.

본 발명에서, 용어 박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.

본 발명의 박테리오파지 BC13은 바실러스 세레우스 균에 대해 용균활성이 탁월하다. 상기 박테리오파지 BC13은 정이십면체의 머리와 비수축성의 긴 꼬리를 갖는 형태인 사이포비리대(Siphoviridae)에 속한다. 본 발명의 박테리오파지 BC13은 단백질 패턴 분석 결과 63 kDa, 52 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 24 kDa 그리고 19 kDa 크기의 주요 단백질을 포함함을 확인하였다. 그 전체 염기서열을 서열번호 1로 표시하였다.

박테리오파지 BC13은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 전체 유전자의 전체 또는 일부로서 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 박테리오파지 BC13은 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 및 상기 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란 염기서열의 변형, 치환의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다.

상기와 같은 바실러스 세레우스 균 특이적 용균활성 또는 바실러스 세레우스 균에 특이적인 사멸능은 본 발명의 박테리오파지 BC13을 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 박테리오파지 BC13을 유효 성분으로 포함하는 다양한 제품에 적용을 가능하게 한다.

본 발명의 박테리오파지 BC13은 상기 박테리오파지가 존재할 것으로 예상되는 하천으로부터 시료를 채취하여 분리한 박테리오파지로서, 본 발명자는 이를 박테리오파지 BC13으로 명명하고 2018년 08월 14일에 한국미생물보존센터에 수탁번호 KFCC11782P로 기탁하였다.

본 발명에서 pH 안정성은 다양한 pH 범위에서 박테리오파지 BC13의 역가가 안정적으로 유지되는 것을 의미하며, 본 발명의 박테리오파지 BC13은 산성 내지 염기성의 넓은 pH범위에서 장기간 동안 안정한 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 pH 3 내지 11범위에서 안정한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 온도 안정성은 다양한 온도 범위에서 박테리오파지 BC13의 역가가 안정적으로 유지되는 것을 의미하며, 본 발명의 박테리오파지 BC13은 넓은 온도 범위에서 역가가 장기간 동안 안정한 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 40~60℃ 범위에서 안정한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 바실러스 세레우스 균 특이적 사멸능은 박테리오파지 BC13이 바실러스 세레우스 균 이외의 다른 균을 사멸시키지 않으면서, 특이적으로 바실러스 세레우스 균만 사멸시키는 박테리오파지 BC13의 능력을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 항생용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 항생용 조성물은 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제, 항생제 및 항균제를 총칭하는 것이다.

본 발명의 박테리오파지 BC13은 기존 항생제에 비하여 바실러스 세레우스 균에 대한 특이성이 매우 높고, 유익균은 죽이지 않으면서 바실러스 세레우스 균만 사멸시킬 수 있다. 아울러, 약물 내성 내지 저항성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다는 이점이 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 질병의 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이고 가축에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있어서 문제이다. 항생제가 육류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 또한, 사료에 섞어 먹이는 항생제의 종류가 많고 이는 다제 내성균 발생 확률이 높아지는 문제점이 있기 때문에 좀 더 자연 친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결할 새로운 사료 첨가용 항생물질로서 본 발명의 상기 박테리오파지 BC13을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공할 수 있으며, 본 발명의 사료는 박테리오파지를 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파지는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 사료는 본 발명의 박테리오파지 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 BC13을 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근괴류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 포함될 수 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 박테리오파지 BC13을 포함하는, 음용수 첨가제를 제공한다.

본 발명의 음용수 첨가제는 상기 박테리오파지 BC13 또는 이를 포함하는 조성물을 음용수 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료 또는 음용수에 혼합하는 방식으로 사용되거나, 음용수 제조 시 직접 첨가하는 방식으로 사용할 수 있다. 상기와 같이 음용수에 혼합하여 공급함으로써 지속적으로 바실러스 세레우스 균의 숫자를 감소시킬 수 있는 효과가 있다.

본 발명에서 음용수는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 음용수를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 소독제를 제공한다.

바실러스 세레우스 균에 특이적 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지 BC13을 포함하는 소독제는 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 양계장, 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 포함하는, 세척제를 제공한다.

본 발명의 박테리오파지 BC13은 바실러스 세레우스 균에 특이적 사멸능을 가지므로, 바실러스 세레우스 균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 개체의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 BC13을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병은, 바실러스 세레우스 균에 의한 식중독을 포함하며, 바실러스 세레우스 균에 의한 식중독은 장 독소 또는 구토 독소에 의한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 식중독은 음식물을 섭취함으로써 소화기가 감염되어 설사, 복통 등의 증상이 급성 또는 만성으로 발현되는 질환을 통칭하는 것으로, 식품매개질환을 의미한다. 원인 물질에 따라 식품 안에 들어 있는 미생물이 생산하는 독소에 의한 식중독 및 복어, 모시조개 등에 들어 있는 동물성 독소나 버섯, 감자, 피마자씨 등에 들어 있는 식물성 독소에 의한 자연독 식중독 및 화학 물질에 의한 화학성 식중독 및 세균에 의한 세균성 식중독으로 분류할 수 있다.

본 발명에서 바실러스 세레우스에 의한 식중독은, 바실러스 세레우스 균이 잘 자랄 수 있는 환경이 만들어지게 되어 10⁶CFU/g 이상이 되면 장 독소(enterotoxin)을 원인 독소로 하여 설사를 일으키는 설사형 식중독 또는 구토 독소(emetic toxin)을 원인 독소로 하여 구토를 유발하는 구토형 식중독을 유발하게 된다. 설사형 식중독이 나타나게 되는 잠복기는 10~12 시간 정도이고 구토형 식중독이 나타나게 되는 잠복기는 1~5 시간이다. 두 가지 형태의 식중독 모두 바실러스 세레우스 균을 사멸시키는 것을 통해 예방 또는 치료가 가능하다.

본 발명의 용어 장 독소(enterotoxin)는 분자량이 50~60 kDa의 고분자단백질로 약 17종의 아미노산으로 구성되어 있으며, 장관 내에서 증식하여 생성된다. 이 독소는 60℃, 20분간의 가열로 파괴되며 pH 변화에도 민감하다. 장 독소에 의한 설사형 식중독은 Clostridium perfringens 식중독 증상과 유사하며 음식 섭취 후 6~16시간 이내에 수인성 설사 및 어지러움과 복통 등이 나타난다. 또한 메스꺼움이 설사와 동반되기도 하지만 대부분 구토증상은 없으며 이 증상들은 24시간 정도 지속되다가 회복된다.

본 발명의 용어 구토 독소(emetic toxin)는 4개의 아미노산 또는 oxyacid의 삼반복 고리 구조로 이루어져 있다. [D-O-Leu-D-Ala- L-O-Val-L-Val]3의 고리구조는 한외 여과막을 통과하는 1.2 kDa의 저분자 펩타이드이며, 화학적으로 potassium ionophore valinomycin과 매우 유사하다. 구토 독소는 126℃로 90분간 가열하여도 파괴되지 않는 열 저항성과 산, 알칼리 및 단백질 가수분해효소에도 저항성을 나타내며, 항체를 형성하지 않는다. 하지만 여전히 구토 독소의 생합성 경로와 작용기작은 아직 정확하게 밝혀지지 않았다.

본 발명에서, 용어 "개체"는 바실러스 세레우스 균에 의한 감염성 질병이 발병될 수 있는 모든 개체를 의미하는 것으로 인간을 포함한 포유동물, 가축류 또는 가금류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 "가축류"는 인간에 의하여 순화, 개량되어 사람과 함께 공동생활을 하는 유용한 동물을 지칭하는 개념으로, 예를 들어, 돼지, 소, 닭, 말, 오리 또는 개 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 "가금류"는, 가축 중 조류에 속하는 동물을 총칭하여 이르는 개념으로, 예를 들어, 닭, 오리, 꿩, 메추리, 타조, 거위 또는 칠면조 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서 상기 박테리오파지 BC13 또는 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에서 상기 박테리오파지 BC13 또는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 투여되는 상기 박테리오파지 BC13의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예, 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제제예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신규한 박테리오파지의 분리 및 배양

1.1 박테리오 파지의 스크리닝 및 분리

대상세균인 바실러스 세레우스는 한국 미생물 보존센터에서 분양 받은 것을 사용하였다(Bacillus cereus KCCM 11204). 바실러스 세레우스를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 박테리오파지가 존재할 것으로 예상되는 하수처리장의 시료를 채취하여 대상세균인 바실러스 세레우스와 함께 35℃에서 하룻밤 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 4,000 rpm으로 20분간 원심분리 한 후, 상등액을 공극의 크기가 0.2 μm인 필터를 이용하여 여과하였다. 이렇게 얻어진 여과액을 이용하여 용균반 분석을 통해 바실러스 세레우스에 특이적인 박테리오파지를 선별하였다.

박테리오파지를 스크리닝 하기 위해서 구체적으로 전 배양된 대상세균(Bacillus cereus KCCM 11204) 150 μL를 취해 멸균된 tube에 넣고 3 mL의 LB 탑 아가 [LB배지 (Tryptone 10 g/L; yeast extract 5 g/L; NaCl 10 g/L) + 0.6% agar]를 첨가하여 잘 혼합한 후 미리 만들어 둔 2% LB 아가 플레이트에 중층 하였다. 실온에서 30분간 방치한 후 준비된 샘플 여과액을 각각 10 μL씩 점적 하고 실온에서 30분간 방치한 후 35℃에서 24시간 배양하여 박테리오파지의 유무를 확인하였다. 박테리오파지의 존재를 확인한 샘플로부터 박테리오파지를 순수 분리하기 위해서 소프트 아가 오버레이법을 이용하였다. 박테리오파지가 있다고 확인된 샘플을 SM buffer [NaCl 5.8 g/L; MgSO₄7H₂O 2 g/L; 1M Tris-Cl (pH7.5) 50 mL]로 적절히 희석하여 각 희석단의 샘플 희석액 100 μL를 취하여 대상 세균 배양액 150 μL에 혼합한 후 0.6% LB 탑 아가를 3 mL 첨가하여 잘 혼합한 뒤, 미리 만들어 둔 2% LB 아가 플레이트에 중층하여 방치한 후 35℃에서 24시간 배양하였다. 배양한 각 플레이트에서 형성된 용균반을 확인한 후 선택하여 400 μL의 SM buffer [NaCl 5.8 g/L; MgSO₄7H₂O 2 g/L; 1M Tris-Cl (pH7.5) 50 mL]에 현탁하고, 실온에서 4시간동안 방치하였다. 이 박테리오파지 액을 100 μL를 0.6% LB 탑 아가와 세균배양액 500 μL와 혼합한 뒤 150 mm 지름의 LB 플레이트에 분주하여 중층한 후 완전히 용균이 일어날 때까지 35℃에서 배양하였다. 배양이 종료된 후, LB 플레이트에 15 mL의 SM buffer를 가하고 실온에서 4시간 동안 천천히 교반하면서 박테리오파지 용액을 회수한 후 4,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액만 취하고 이를 0.2 μm 필터로 여과하여 최종 박테리오파지 용액을 회수하였다. 이렇게 얻어진 최종 박테리오파지의 용균반을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 3-4 mm의 크기의 용균반을 형성하는 박테리오파지를 확인하였고, 상기 박테리오파지는 바실러스 세레우스 균에 특이적인 용균능을 갖는 박테리오파지임을 확인하였다.

1.2 박테리오파지의 대량 배양 및 정제

박테리오파지를 대량 배양하기 위하여, 1.1에서 회수한 최종 박테리오파지 배양액을 1.0x10⁸ PFU/mL로 희석한 후 전 배양된 Bacillus cereus KCCM 11204(1.0x10⁹ CFU/mL)과 혼합하여 MOI(Multiplicity of infection)를 0.1이 되도록 하여 35℃에서 100 rpm으로 18시간 배양하였다. 배양이 종료된 후 배양액 전량을 6,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였고, 이를 0.2 μm 필터로 여과하여 최종 박테리오파지 배양액을 회수하였다. 분리된 박테리오파지를 박테리오파지 BC13으로 명명하고, 2018년 8월 14일 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울, 한국)에 기탁하여 기탁번호 KFCC11782P를 부여받았다.

실시예 2. 박테리오파지 BC13의 형태학적 특성

분리된 박테리오파지의 형태학적 특성을 알아보기 위해, 박테리오파지 BC13을 0.01% 젤라틴 용액에 희석하여 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 carbon-coated mica plate(ca. 2.5 x 2.5 mm)에 적가한 후, 10분간 적응시켜 멸균증류수로 세척하였다. 이를 구리 격자(copper grid)에 끼워 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)에서 30-60초간 염색하고 건조시킨 후, 투과전자현미경(Tecnai G² Spirit Twin, Bio-Transmission electron microscope, 120 kV, 120,000~400,000)으로 검경한 사진을 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이 박테리오파지 BC13은 정이십면체의 머리와 비수축성의 긴 꼬리를 갖는 형태인 사이포비리대(Siphoviridae)에 속함을 확인할 수 있었다. 박테리오파지 BC13의 머리 크기는 80 ± 10 nm이며, 꼬리의 크기는 180 ± 20 nm이다.

실시예 3. 박테리오파지 BC13의 단백질 패턴 분석

1.0x10¹⁰ PFU/mL로 준비된 박테리오파지 BC13을 24 μL와 6 μL의 5X loading buffer에 혼합하고, 10분간 끓인 다음 12.5% SDS-PAGE를 수행한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 박테리오파지 BC13의 단백질 전기영동 결과를 나타낸 것으로, 63 kDa, 52 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 24 kDa 그리고 19 kDa 크기의 주요 단백질을 확인하였다(M; Precision Plus Protein™ unstained Standards, BIO-RAD).

실시예 4. 박테리오파지 BC13의 전체 유전자 분석

파지 배양액에 20 mM EDTA, 50 μg/mL의 Proteinase K, 0.5%(w/v) SDS 가한 후, 50℃에서 1시간 동안 정치하였다. 동량의 Phenol-Chloroform-Isopropyl alcohol25:24:1)과 혼합한 후 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하고, 상기 상등액에 3M sodium acetate를 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가한 후 혼합하였다. 여기에 2배 부피의 차가운 95% 에탄올을 가하여 혼합한 뒤 -20℃에서 1시간 동안 정치하였고, 반응이 끝난 후 0℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심분리하여 침전물을 획득하였다. 이후 차가운 70% 에탄올로 2회 세척한 뒤 에탄올을 완전히 제거하여 DNA pellet을 회수하였고 이를 최종 50 μL TE buffer(Tris-EDTA, pH 8.0)에 용해시킨 후 DNA 농도를 측정하였다. 전체 유전자 분석을 위해 마크로젠사의 PacBio RSII를 이용하여 유전자 시퀀싱을 시행한 결과를 서열번호 1에 나타내었다.

시퀀싱 결과 박테리오파지 BC13의 전체 유전자의 크기는 42,999 bp를 가지며, GC함량이 42.39%, 전체 ORFs의 수는 55개로 확인하였다.

실시예 5. 박테리오파지 BC13의 바실러스 세레우스 균에 대한 특이적 사멸능 확인

분리된 박테리오파지 BC13이 다양한 세균에 대해서 용균 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 ㈜옵티팜에서 분리하여 보유하고 있는 균주와 한국생명공학연구원 미생물 자원센터 등에서 분양 받은 균주를 대상으로 소프트 아가 오버레이법을 이용하여 바실러스 속의 세균 및 기타 다른 종의 세균을 대상으로 감수성을 확인한 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

표 1에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 BC13은 바실러스 세레우스에만 용균 활성을 보였으며 생균제로 많이 사용되는 Bacillus subtilis를 포함한 다른 바실러스 종에는 감염하지 않으며, 그람 양성세균인 Staphylococcus 종, Listeria 종 등 다른 세균에 대해서도 용균 활성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 박테리오파지 BC13은 바실러스 세레우스 균에 선택적으로 특이적 용균활성을 나타내는 효과가 있음을 확인하여 박테리오파지 BC13의 바실러스 세레우스 균 특이적 사멸능을 확인하였다.

실시예 6. 박테리오파지 BC13의 pH 안정성 조사

박테리오파지 BC13의 pH 안정성을 확인하기 위하여 다양한 pH 범위(pH2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11)에서 시험을 진행하였다. Sodium acetate buffer, Sodium phosphate buffer, Tris-HCl을 이용하여 각각의 pH에 맞게 조제한 후 990 μL로 분주하여 준비한 후, 5.0x10⁸ PFU/mL로 준비한 박테리오파지 BC13 배양액 10 μL을 첨가하여 2시간 동안 상온에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이법에 의한 역가 측정을 시행한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 BC13은 pH3-11의 범위에서 2시간 동안 안정한 것을 확인하였다. 따라서 박테리오파지 BC13은 산성 내지 염기성 범위에서 장기간 안정성을 유지하는 것을 확인하였다.

실시예 7. 박테리오파지 BC13의 온도 안정성 조사

박테리오파지 BC13의 온도 안정성을 확인하기 위하여 다양한 온도 범위 (40℃, 50℃, 60℃, 및 70℃)에서 박테리오파지 BC13의 안정성을 시험하였다. 박테리오파지 BC13 배양액(2.4x10⁸ PFU/mL) 1 mL를 멸균된 튜브에 분주한 후 10분, 30분, 60분 그리고, 120분 동안 각 온도에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이법으로 역가 측정을 시행한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 BC13은 40-60℃의 범위에서 2시간 동안 안정한 것을 확인하였다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

이하 본 발명의 박테리오파지 BC13을 포함하는 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아니고 단지 이를 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 사료 첨가용 조성물

박테리오파지 BC13 1x10⁹ PFU/mL

비타민 믹스 100 mg

미네랄 믹스 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 사료 첨가제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

제제예 2. 소독제 조성물

박테리오파지 BC13 1x10⁹ PFU/mL

에탄올 적량

멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 소독제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

제제예 3. 세척제 조성물

박테리오파지 BC13 1x10⁹ PFU/mL

에탄올 적량

효소 복합물 적량

멸균 증류수 적량

통상의 세척제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11782P 20180814

<110> Optipharm.CO.,LTD <120> Novel Bacillus cereus bacteria specific bacteriophage BC13 and antibacterial composition comprising the same <130> optipharm1-77p <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 42999 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bacteriophageBC13 <400> 1 cacacgaagc gctccgtgca gtatcatcac agtgggcaga acggggcgtt cccactatcc 60 gtgacaagaa aggtagagtg tggagtaccg aagcatatgt gcctatggtt gtccgttcta 120 cagtgaaaaa ggtttcgact gattcacaga tcagtagaat ggatgaccat gatatagatt 180 taatcgaagt aagttctcat atgggagcta gaccgaaatg cgagccttat caaggccgta 240 tattcagtaa aagcgggaaa agtaaaaagt atcctgcgtg gtctactact tcatacggag 300 agcctgatgg actactgggg attaattgcc atcatgtcat ctatccctac gtagagggta 360 agtccactaa gcgatacaac ccatatccga aagaacagaa tgacaaagca tatgaacagt 420 cgcagcagca acgtaagatt gagcgagaca tccgtaagaa gaagaaacgc ttagtcatgg 480 cgaaggccac aggtgatgaa gtagcaatca agcaagcaaa ccaaatggta agacagcaac 540 aagaacgcat gagaaacttc ttaaaagaaa ctggtagacg acgcaagcca aatagggagc 600 agattgtata 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gctttctacg taaaaacttc tgatctgcca gtcgttgtag 1500 gtactgctta caacaaagat gctaacgtag gtttcggaac tggaacgggt aactctactc 1560 gcttcggtga gcgtaaagaa atcatctata ctgacatgtc ggttccttac acttgggaat 1620 acacatggca cgaaggcatc gaccgttgga ctgtaaacaa caacatggat gctgctatgg 1680 ctgaccgtat tgatttacag gcacaagcga aagctcacac gttcgataac aagtacggtg 1740 cgttcattgc ttctgtagca ggtaaaactg aagcgttaac tgcttatgat gaagcagctg 1800 tattgaaatt attcaatgct ttatcagctt actacatcaa catcgaagct atcggacgta 1860 aagtagctaa agttggccct gaactttata acattatcgt tgaccaccga ttaactacag 1920 atgcgaaagg ctctgcagca aacgtggacg gcaacgtaat taaaatgttc aaaggatttg 1980 aaatccatga agtgccacag gctaaactag gcgcaaacgc tgcattagtt tacatccctg 2040 gtatcggtaa atcatttaca ggtatcacga ctgctcgtac tatcgagtct gaagacttcg 2100 acggcgtagc attccagggt gcaggtaaag caggtgagtt catcttagat gacaacaaac 2160 ctgctgtagt aaaagtaact gctccagtag ttactcctta ataaaataca aacttaaaaa 2220 gcctactatt tctagtaggc ttttcttaaa tagaaagggt ggataagatg gctaagtata 2280 aagtattacg aaactttcat 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cgaccgatga cgggacaggt cgttacacat atgtagaggg 34800 aagtacagca ggcggactcg taatctatga tgaagatacg ttctgtcact cgcatcactc 34860 caccgaccca attagtggtg aaatggttaa cgcatatgac ctggtacgct tgcataagta 34920 tggacacctg gattacggca tggacgacaa aggtaagatg ggtaagatgc catctgacaa 34980 gatgatgagc gtgttaatgg ataaggacaa gctctgtaag aaaacgagaa tagaagaaaa 35040 acgaaatggt attgcaactg acttcgctga tgaagagttt gaaatagata tgacgtcaga 35100 ccacgatgag cctgcacctg aagaagttga ggactgggaa gctgatctgg atatggaggg 35160 tgacgagttc tcgctcacgg ctaagaacct tatgctcatc ctaacgaaag gccctatgga 35220 aggtgtactt gcttataacg agattacgaa tagacaagta ctacttaagc ctgctccgtg 35280 gatgaaagat aaagagatag aacagttcga aaagaaagat gaagttccgt ggacgaacaa 35340 tgacatgcat cgtatgcagc actggttatt cgataagtat caatttagaa gtgagaagca 35400 gttaatcaat gcattcgtta cagtatgcct ggagcgctct tacaatccaa tcaagacgta 35460 tatagaagcg caagagtggg atggcatcga aagagctgaa acagtcttta tcgacatggt 35520 aggcgcagag gacagcccat atgtaagaca ggtgacacgt aagacgttgc ttggtgctgt 35580 tatgcgtttg tacgacccag ggtgtaagtt cgactatatg cctgtcctag ttggtggcca 35640 gggcgtcggt aagtctacta ttattgaaaa gttagcagta aaacaagctt ggtataatgg 35700 tagcttgaca gactttaaag ggaaagaagc aggagaacaa ttgcaagcag ggtggatatt 35760 cgagattggt gagcttgctg caatgagtaa aagcggtata gaagaagtga aaaacttcat 35820 taccaatcca tcggacaagt ttagaccgcc gtacggtgcg atggtggagg agtatccacg 35880 taagaacgta ttcttcggta caacaaataa aatggacttc ctggtcgata agacaggtaa 35940 tagacgcttt ttccctatta ctacaaaacg tatgcctaca ggtgaagaac attggaacac 36000 aatacctatg aataagaaag gtgacgcagg ttttgagtat atcggtcaga tatgggctga 36060 agtgtatcag tggtacatgg ccggggaatc tcaattcctg gataacgaaa ttattgatat 36120 cgctgttcag attcaaaagg cgcatactgt tgttgatgat ctggaagaac gattacttga 36180 atggttagaa gagcctgaag aagcggacga gtttgaaatt ggtgaagcta ttgtccgcga 36240 taaagtaaca actcgccaaa tctataaaga agtaatgaat ggacaggaag caatcgttcc 36300 tcgccaaatt tctaaccaaa tcaaactcat catgaacaat ttagatgggt gggaacataa 36360 aaagtcactc cgtattatag aagatggaaa agaaaaagta atggccggat acgtaaaatt 36420 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Claims (11)

1. 바실러스 세레우스 균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 BC13 (수탁번호 KFCC11782P).
   
2. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 BC13은 정이십면체의 머리와 비수축성의 긴 꼬리를 갖는 형태인, 박테리오파지 BC13.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 BC13은 pH3 내지 pH11의 범위에서 안정한 것을 특징으로 하는 박테리오파지 BC13.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 BC13은 40℃ 내지 60℃의 범위에서 안정한 것을 특징으로 하는 박테리오파지 BC13.
   
5. 제1항의 박테리오파지 BC13을 포함하는, 항생용 조성물.
   
6. 제1항의 박테리오파지 BC13을 포함하는, 사료 첨가용 조성물.
   
7. 제6항의 사료 첨가용 조성물을 포함하는, 사료.
   
8. 제1항의 박테리오파지 BC13을 포함하는, 소독제.
   
9. 제1항의 박테리오파지 BC13을 포함하는, 세척제.
   
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