KR101260655B1 - 살모넬라 콜레라수이스 또는 살모넬라 두블린 감염을 방지 및 처치하는 방법 - Google Patents

살모넬라 콜레라수이스 또는 살모넬라 두블린 감염을 방지 및 처치하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis) 균 및 살모넬라 두블린(Salmonella Dublin) 균의 감염을 방지하는데 이용될 수 있고, 또한 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염 질환을 처치할 수 있는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지(Bacteriophage), 서열번호 2 내지 서열번호 22의 부분 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지, 또는 상기 두 박테리오파지의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 이용하여 살모넬라 콜레라수이스 균이나 살모넬라 두블린 균의 감염을 방지하거나 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균의 감염 질환을 처치하는 방법에 관한 것이다.

Description

살모넬라 콜레라수이스 또는 살모넬라 두블린 감염을 방지 및 처치하는 방법{Method for prevention and treatment of infection of Salmonella Choleraesuis or Salmonella Dublin}
본 발명은 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균에 감염할 수 있는 박테리오파지들을 유효성분으로 한 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염 예방 및 감염 후 치료 목적으로 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
살모넬라(Salmonella)는 형태학적이나 생리학적으로 대장균과 유사하지만 의학상의 편의를 위해 K. Kauffmann 등의 제창에 의해 독립된 속(genus)으로 되었다. 살모넬라는 1885년 Salmon과 Smith가 돈콜레라로 죽은 돼지에서 살모넬라 콜레라수이스 균을 최초로 분리 보고한 이래, 장염과 위장염 환자 및 각종 질병을 가진 동물로부터 분리되었다. 또한 닭을 비롯한 소, 돼지, 염소, 개, 고양이 등의 건강한 동물과 환경물에서도 분리되었다. 살모넬라속 균은 2,000여종 이상의 혈청형이 현재까지 보고된 실정이며 동물에 따른 숙주 특이성이 있는 균종과 숙주 특이성이 없는 균종으로 크게 구분 지을 수 있다. 살모넬라는 그람음성 간균으로 포자는 형성하지 않는다. 살모넬라는 모두가 다양한 동물에서 기생균으로 발견되고 있다. 살모넬라 감염증은 몇 가지 형태로 발생하지만 일반적으로 장염 형태가 가장 일반적이다. 살모넬라는 식중독의 주요 원인균이기도 하다. 살모넬라 식중독은 국내에서도 매우 빈번하게 발생하고 있으며 단체 급식의 증가로 그 심각성이 계속 커지고 있다. 2000년도 식중독 환자의 원인균을 조사한 보고에 의하면, 2,500여 건 이상이 살모넬라에 의한 식중독으로 조사되었는데, 이는 포도상구균(약 1,000여건), 비브리오(약 200여건) 등 다른 주요 식중독 원인균에 비교하여서도 월등히 높은 비율을 차지하고 있는 것이다. 살모넬라에 감염되면 거친 피부, 식욕결핍, 결막염, 침울, 엷은 변, 비장 증대, 사망 등의 임상 증상을 보인다. 또 살모넬라는 사람이 음식으로 섭취하는 닭 등의 가금류 및 가축의 장내에 존재함으로 쉽게 사람에게 전달될 수 있다. 미국의 경우 식중독에 의해 발생하는 경제 피해 규모가 20-40억 불로 집계되고 있어 식중독 발생 예방은 경제적으로도 매우 중요하다고 할 수 있다.
살모넬라 균 중 살모넬라 콜레라수이스 균은 살모넬라 속의 돼지 콜레라균으로 잘 알려져 있는 균으로서, 사람과 동물 모두에게 감염되는 균이다. 돼지 콜레라의 잠복기는 평균 6~8일이며 40~41℃의 체열과 식욕부진, 결막염, 변비, 황회색 설사, 구토, 후구 마비 및 경련 등의 증상을 나타낸다.
살모넬라 두블린 균은 살모넬라 속의 균으로서, 일반적으로 살모넬라 균을 숙주에 대한 적응성에 따라 ‘숙주 특이성 그룹’과 ‘숙주 비특이성 그룹’으로 나눌 때 ‘소에 대하여 친화성을 나타내는 균종’으로 알려져 있다. 소 살모넬라 감염증의 주요 원인균이다. 살모넬라 두블린 균에 의한 살모넬라 감염증은 전 세계적으로 발생되며 계절적으로는 주로 여름에 가장 흔하며 오염된 사료나 물 또는 별 증상 없이 살모넬라 두블린 균을 보균하고 있는 보균우가 중요한 전염원이 될 수 있다. 살모넬라 두블린 균은 분변, 유즙, 질분비물 중에 포함되어 있고, 외계에 배설된 균은 1-6개월 간 생존할 수 있다고 알려져 있다. 소가 임신 중에 살모넬라 두블린 균에 감염되면 혈류를 타고 태자에 감염될 수 있으며, 이로 인하여 태자는 패혈증으로 폐사될 수 있어 조유산이 발생될 수 있다. 살모넬라 두블린 균에 의한 살모넬라 감염증은 생후 1개월 이내의 자우의 경우 치사율이 50-100%에 달하기 때문에 상당히 심각하게 여겨진다. 참고로, 드물기는 하지만 살모넬라 두블린 균은 젖소유방염의 많은 원인균 중 하나이기도 하다.
이들 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염에 의한 축산 산업의 피해는 상당히 크며, 이들의 감염을 방지할 수 있고 또한 이들의 감염을 효과적으로 처치할 수 있는 방법의 개발이 절실하다 할 수 있다.
이들 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염 치료에는 다양한 약물들이 사용되고 있으나 치료약제로는 통상적으로 완치가 어렵다. 따라서 치료보다는 감염되지 않도록 예방하는 노력이 보다 중요하다 할 수 있으며 이러한 목적에 맞는 천연 유래의 물질을 이용한 방법의 개발이 필요하다.
통상적으로, 박테리아에 의한 감염을 방지하고 더 나아가 감염 질환을 처치할 목적으로 다양한 약제가 사용될 수 있지만, 최근 자연친화적 방식이 보다 강조되면서 박테리오파지가 관심을 받고 있다.
박테리오파지는 세균을 감염시키는 바이러스의 일종으로 보통 파지라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 속에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 박테리아를 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이적이어서 특정 박테리아를 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 부류의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리아만을 사멸시킬 수 있다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스
Figure 112012012367118-pat00001
의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)
Figure 112012012367118-pat00002
을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다. 박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후 박테리아 감염에 대항하는 방안으로 기대를 모았으며 관련한 많은 연구가 있었다. 그러나 1950년 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 다시 부각되면서 다시 박테리오파지가 주목을 받고 있다.
이에, 본 발명자들은 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 이용하여 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지들을 확보하고 이들 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음 이 조성물이 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염 방지 및 처치에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 살모넬라 콜레라수이스 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 콜레라수이스 균의 감염 방지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 살모넬라 콜레라수이스 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 콜레라수이스 균의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 살모넬라 두블린 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 두블린 균의 감염 방지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 살모넬라 두블린 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 두블린 균의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 소독제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 음수 첨가제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지들을 유효성분으로 한 조성물, 및 이 조성물을 이용한 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염 방지 및 처치 방법을 제공한다.
본 발명의 박테리오파지는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖거나 서열번호 2 내지 서열번호 22의 부분 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는다. 이들 박테리오파지들은 본 발명자들에 의해 자연으로부터 분리되어 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 풀오룸(Salmonella pullorum) 및 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimuriun)에 대한 사멸능이 확인된 바 있다. 본 발명자들에 의해, 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 박테리오파지는 박테리오파지 SEP-1로 명명되었으며 2007년 8월 21일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11173BP)에 기탁되었다. 그리고 서열번호 2 내지 서열번호 22의 부분 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 박테리오파지는 박테리오파지 SGP-1로 명명되었으며 2007년 8월 21일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11174BP)에 기탁되었다.
또한, 본 발명은 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 소독제, 음수 첨가제, 및 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지는 상술한 바와 같이, 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균을 특이적으로 사멸시키므로, 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균에 의해 유발되는 다양한 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다.
따라서 본 발명의 조성물은 살모넬라 콜레라수이스 균에 의해 유발되는 대표 질환인 돼지 콜레라에 대한 예방 및 처치 목적으로 활용될 수 있으며, 또한 살모넬라 두블린 균에 의해 유발되는 살모넬라 감염증(salmonellosis)에 대한 예방 및 처치 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 ‘처치’ 또는 ‘치료’라는 용어는 (ⅰ) 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅱ) 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 SEP-1이나 박테리오파지 SGP-1이 단독으로 포함될 수 있으며, 또한 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1 둘 다가 모두 포함될 수도 있다. 이 때 포함되는 박테리오파지는 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1 × 1030 pfu/g의 박테리오파지를 포함하며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g의 박테리오파지를 포함한다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 소독제, 음수 첨가제, 및 사료 첨가제로 구현될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 효소 제제를 첨가할 수도 있다. 첨가되는 효소 제제는 건조 또는 액체 상태 모두 가능하며 효소 제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase), 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서의 사료 첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(J Animal Sci 43: 910-926, 1976) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(J Anim Sci 56: 735-739, 1983)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 본 발명에서의 사료 첨가제에는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 이 조성물을 이용한 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균의 감염 방지 및 처치 방법은 기존 항생제에 기반한 방식에 비하여 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 균에는 영향을 주지 않으면서도 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 감염의 방지 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미한다. 이에 따라 사용에 따른 부작용이 매우 작다. 통상적으로 항생제를 사용하면 여러 종류의 일반균도 피해를 함께 입게 되어 면역력 저하 등 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 이용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점도 제공한다. 그 밖에 본 발명의 박테리오파지들은 살모넬라 갈리나룸 균, 살모넬라 엔테리티디스 균, 살모넬라 풀오룸 균 및 살모넬라 티피무륨 균에도 사멸능을 갖고 있으므로, 본 발명의 조성물은 이들 균들과 함께 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균에 의한 감염을 동시에 방지하고자 하는 목적으로도 활용될 수 있으며, 또한 이들 균들과 함께 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균에 의한 감염이 복합적으로 일어났을 때도 본 발명의 조성물은 감염 처치 목적으로 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 박테리오파지 SEP-1과 박테리오파지 SGP-1의 살모넬라 콜레라수이스 균에 대한 사멸능 조사 실험인 용균반 분석 결과로서 전체 배양 접시 사진이다. 'SEP-1 spotting'은 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액을 떨어뜨린 경우의 결과이며, 'SGP-1 spotting'은 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액을 떨어뜨린 경우의 결과이다. 맑게 생긴 투명한 원은 배양 접시 위에 자란 박테리아가 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
도 2는 박테리오파지 SEP-1과 박테리오파지 SGP-1의 살모넬라 두블린 균에 대한 사멸능 조사 실험인 용균반 분석 결과로서 배양 접시의 일부 사진이다. 'SE'는 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액을 떨어뜨린 경우의 결과이며, 'SG'는 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액을 떨어뜨린 경우의 결과이다. 맑게 생긴 투명한 원은 배양 접시 위에 자란 박테리아가 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 박테리오파지 SEP-1 분리
본 발명의 박테리오파지 SEP-1은 살모넬라 엔테리티디스를 이용하여 분리되었다. 본 발명자들은 살모넬라 엔테리티디스에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하기 위해 살모넬라 엔테리티디스가 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집하였다. 이 시료를 살모넬라 엔테리티디스와 함께 배양한 후 이 배양액을 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상등액을 여과한 다음, 배양된 살모넬라 엔테리티디스를 박테리오파지 분리를 위한 미끼로 함께 다시 배양하여 살모넬라 엔테리티디스의 사멸 여부를 확인하였다. 사멸 여부 확인은 최종적으로 용균반 분석(plaque assay)을 통해 판별하였다.
이를 상세히 설명하면, 살모넬라 엔테리티디스를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 박테리오파지가 존재할 것이라 예상되는 서울 및 기타 지역의 생활하천으로부터 237개의 시료를 수집하여 살모넬라 엔테리티디스와 함께 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 해준 후, 이렇게 얻어진 여과액을 이용한 용균반 분석을 통해 살모넬라 엔테리티디스에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다. 이 분리된 박테리오파지를 SEP-1로 명명한 뒤, 2007년 8월 21일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(기탁번호 KCTC 11173BP)에 기탁하였다. 박테리오파지 SEP-1의 다량의 박테리오파지 액은 살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 SEP-1을 함께 증식한 다음 상기와 같이 원심분리하고 여과해 주는 방식을 반복함으로써 확보하였다. 최종 확보된 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액은 그대로 사용하기도 했으며 또는 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol) 침전 과정을 추가하여 보다 정제하여 사용하기도 하였다.
실시예 2: 박테리오파지 SGP-1 분리
본 발명의 박테리오파지 SGP-1은 살모넬라 갈리나룸을 이용하여 분리되었다. 본 발명자들은 살모넬라 갈리나룸에 특이적으로 감염하는 박테리오파지를 분리하기 위해 살모넬라 갈리나룸이 존재할 것으로 예상되는 곳을 기반으로 시료를 채집하였다. 이 시료를 살모넬라 갈리나룸과 함께 배양한 후 이 배양액을 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이렇게 얻어진 상등액을 여과한 다음, 배양된 살모넬라 갈리나룸을 박테리오파지 분리를 위한 미끼로 함께 다시 배양하여 살모넬라 갈리나룸의 사멸 여부를 확인하였다. 사멸 여부 확인은 최종적으로 용균반 분석을 통해 판별하였다.
이를 상세히 설명하면, 살모넬라 갈리나룸을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 박테리오파지가 존재할 것이라 예상되는 서울 및 기타 지역의 생활하천으로부터 시료를 수집하여 살모넬라 갈리나룸과 함께 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 해준 후, 이렇게 얻어진 여과액을 이용한 용균반 분석을 통해 살모넬라 갈리나룸에 특이적인 박테리오파지를 검출하였다. 이 분리된 박테리오파지를 SGP-1로 명명한 뒤, 2007년 8월 21일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(기탁번호 KCTC 11174BP)에 기탁하였다. 박테리오파지 SGP-1의 다량의 박테리오파지 액은 살모넬라 갈리나룸과 박테리오파지 SGP-1을 함께 증식한 다음 상기와 같이 원심분리하고 여과해 주는 방식을 반복함으로써 확보하였다. 최종 확보된 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액은 박테리오파지 SEP-1에서와 같이 그대로 사용하기도 했으며 또는 통상의 폴리에틸렌 글리콜 침전 과정을 추가하여 보다 정제하여 사용하기도 하였다.
실시예 3: 박테리오파지 SEP-1 유전체의 유전자 서열 분석
얻어진 박테리오파지 SEP-1 유전체의 유전자 서열분석을 실시하였다. 이를 위해 박테리오파지 SEP-1의 유전체를 통상의 방법으로 추출하였고 이를 유전자 서열 분석에 이용하였다. 구체적으로, 먼저 1 ℓ 플라스크에 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/ℓ; 소이빈 다이제스트, 3 g/ℓ; 덱스트로스, 2.5 g/ℓ; NaCl, 5 g/ℓ; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/ℓ) 200 ㎖에 600 nm에서 흡광도가 1인 살모넬라 엔테리티디스 부유액 50 ㎖ 및 1× 108 pfu/㎖ 수준으로 여과한 박테리오파지 용액 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 3-4시간 진탕배양 하였다. 배양 후, 살모넬라 엔테리티디스가 용균되었는지 여부를 확인한 다음, 용균이 일어났을 때 이 배양액을 0.45 ㎛의 필터로 여과해 주었다. 그 다음으로 이 여과한 배양액에 남아 있을 살모넬라 엔테리티디스의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 이 여과한 배양액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 ㎕를 첨가한 후 다시 10분간 정치시켰다. 그 다음 단계로 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K (20 ㎎/㎖) 100 ㎕와 10% 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 ㎕를 첨가한 다음 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 18,000 rpm에서 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층 중에서 위층을 취하고 여기에 2 부피비의 차가운 100% 알코올을 가하여 순수한 유전체만을 추출하였다. 추출한 박테리오파지의 유전체가 DNA인지, RNA 인지를 확인하기 위해, DNaseⅠ (10 U/㎕) 및 RNase A (10 ㎍/㎕)를 각각 첨가해 준 다음 37℃에서 1시간동안 처리하였고, 이와 더불어 DNA일 경우에 단일가닥 DNA인지, 이중가닥 DNA인지 구분하기 위해 녹두(Mung Bean) 뉴클레아제(45 U/㎕)를 첨가해 준 다음 상온에서 15분간 처리하였다. 이렇게 처리한 시료들을 0.8% 아가로즈(agarose) 젤을 이용한 전기영동을 실시하여 각 효소에 의한 절단 양상을 조사하였다. 그 결과, 얻어진 유전체는 DNaseⅠ에만 민감하였고 DNase I에 민감한 것은 유전체가 DNA임을 의미하고, 녹두 뉴클레아제에 민감하지 않은 것은 유전체가 DNA 이중가닥 형태임을 의미한다. 이 결과로부터 얻어진 박테리오파지의 유전체가 DNA형이면서 이중가닥임을 확인할 수 있었다.
위와 같이 분리된 박테리오파지의 유전체는 게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)이다. 이 gDNA의 유전자 서열을 분석하기 위해 먼저 다양한 제한효소(restriction enzyme)로 처리하여 제한효소 처리에 따른 절단 양상을 일차적으로 파악하였고, 제한효소 Hpa II로 처리하는 경우가 gDNA의 라이브러리(library) 구축에 가장 적합하다고 판단되어 Hpa II로 처리하여 준비된 유전자 단편(fragment)을 이용한 gDNA 라이브러리를 통상의 방법에 따라 구축하였다.
이를 상세히 설명하면, 먼저 통상의 방법대로 박테리오파지 SEP-1의 gDNA를 Hpa II로 처리하여 유전자 단편을 얻었고, 또한 추후 유전자 단편을 삽입할 때 사용할 벡터 부분의 준비를 위하여 pBluescript II SK(+) 파지미드 벡터(phagemid vector)(Stratagene사)를 Cla I로 처리하여 선형(linear)의 벡터 단편을 준비하였다. 이렇게 준비된 유전자 단편들과 벡터 단편을 T4 리가아제(ligase)를 이용해 통상의 방법대로 서로 결합시켰다. 이렇게 하여 준비된 박테리오파지 SEP-1의 유전자 단편이 도입된 재조합 벡터를 전기천공법(electroporation)이라는 전기적 형질전환 방법(electro-transformation)을 통해 대장균의 한 종인 Top10F' 종 (Invitrogen사)에 도입시켰다. 이렇게 하여 형질전환된 형질전환체를 엑스-갈(X-Gal; 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) 및 이소프로필 베타-디-1-티오갈락토피라노시드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)가 첨가된 암피실린(ampicillin) 함유 아가 평판배지 상에서 통상의 청백 콜로니 선별법(Blue-White colony selection)을 통해 선별하였다. 선별된 단일 콜로니(colony)를 암피실린이 포함된 배양배지에 접종한 후 하룻밤동안 진탕배양 하였고, 이 배양 세포로부터 플라스미드(plasmid) 정제 키트(iNtRON사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 이 추출된 플라스미드는 0.8% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동을 통하여 그 크기를 확인함으로써 재조합된 플라스미드를 선별하였다.
이렇게 선별된 플라스미드를 포함한 클론들을 다시 배양하여 배양 세포로부터 플라스미드를 상기 방법과 같이 다시 추출하였고, 이 추출된 플라스미드를 이용한 염기 서열 분석은 통상의 염기 서열 분석에서 널리 이용되는 프라이머(primer)인 M13 정방향(forward) 프라이머와 M13 역방향(reverse) 프라이머를 이용해 수행하였다. 각 프라이머의 서열은 다음과 같다.
Figure 112010036897929-pat00003
이렇게 하여 박테리오파지 SEP-1 유전체의 부분 유전자 서열을 확보하였으며, 이를 근거로 하여 통상의 전체 유전자 서열 분석을 실시하였다. 최종적으로 확인된 박테리오파지 SEP-1의 전체 유전자 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 SEP-1의 염기 서열을 기반으로 Web상의 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 기존 알려진 박테리오파지 유전자와의 상동성을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 분석된 박테리오파지 SEP-1의 염기 서열은 박테리오파지 KS7(bacteriophage KS7)의 서열 (GenBank Accession No. AY730274), 살모넬라 파지 SETP3(Salmonella phage SETP3)의 서열 (GenBank Accession No. EF177456) 및 박테리오파지 MB78(bacteriophage MB78)의 부분적으로 밝혀진 서열(GenBank Accession No. AY040866; AJ277754; AJ249347; Y19203; Y19202; AJ245858; AJ245537; Y18133; X87092; AF156970; AF349435; X86562)과 부분적으로 상동성을 가지긴 하지만 상당부분이 다른 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 박테리오파지 SEP-1의 유전체가 박테리오파지 KS7, 살모넬라 파지 SETP3 및 박테리오파지 MB78과 특징적으로 다름을 알 수 있었다. 따라서 박테리오파지 SEP-1은 신규한 박테리오파지라 할 수 있다.
실시예 4: 박테리오파지 SGP-1 유전체의 유전자 서열 분석
얻어진 박테리오파지 SGP-1의 유전자 서열분석을 실시하였다. 이를 위해 박테리오파지 SGP-1의 유전체를 실시예 3과 동일한 방법으로 추출하였고 이를 유전자 서열 분석에 이용하였다. 추출한 박테리오파지의 유전체가 DNA인지, RNA 인지의 확인도 실시예 3과 동일하게 실시하였으며, 그 결과 박테리오파지 SGP-1의 유전체가 DNA 이중가닥 형태임을 확인할 수 있었다.
이렇게 얻어진 박테리오파지 SGP-1의 유전체를 이용하여 실시예 3과 같은 방법으로 유전자 서열 분석을 실시하였다. 박테리오파지 SGP-1 유전체의 서열분석은 부분 서열까지만 확인되었으며, 확인된 부분 서열은 서열번호 2 내지 서열번호 22로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 SGP-1의 염기 서열을 기반으로 Web상의 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전자와의 상동성을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 분석된 박테리오파지 SGP-1 의 염기 서열은 박테리오파지 파이YeO3-12(bacteriophage phiYeO3-12) 및 박테리오파지 T3(bacteriophage T3)과 부분적으로 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 확보된 박테리오파지 SGP-1 유전체의 부분 서열을 박테리오파지 파이YeO3-12 유전체의 서열(GenBank Accession No. AJ251805) 및 박테리오파지 T3 유전체의 서열(GenBank Accession No. AJ318471)과 비교하여 이들 간의 상동성을 자세히 조사해 보았다.
Figure 112010036897929-pat00004
이 결과로부터 박테리오파지 SGP-1의 부분서열 중 많은 것이 박테리오파지 파이Ye03-12 및 박테리오파지 T3과 다름을 알 수 있었다. 이로부터 박테리오파지 SGP-1 유전체가 박테리오파지 파이Ye03-12 및 박테리오파지 T3과 특징적으로 다름을 알 수 있었다. 따라서 박테리오파지 SGP-1은 신규한 박테리오파지라 할 수 있다.
실시예 5: 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1의 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균에 대한 사멸능 조사
확보한 박테리오파지 SEP-1과 박테리오파지 SGP-1의 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 박테리오파지 SEP-1과 박테리오파지 SGP-1 모두 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균과 관계되지 않은 방식으로 분리된 박테리오파지이므로 이는 반드시 필요한 조사이었다. 조사방법은 600 ㎚에서 흡광도가 1 정도 되는 살모넬라 콜레라수이스 균(KCTC2932 strain)과 살모넬라 두블린 균(BA584; 임상분리주로 유전체 분석을 통하여 살모넬라 두블린 균으로 판명된 strain) 배양액 1 ml을 각각 다른 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말하여 말린 후, 실시예 1에서 준비한 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액 및 실시예 2에서 준비한 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액을 각각 떨어뜨렸다. 이를 37℃ 배양기에서 한밤 배양한 후 각 박테리아의 용균(lysis) 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 1과 도 2에 제시되어 있다. 본 조사에서 박테리오파지 SEP-1과 박테리오파지 SGP-1의 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균에 대한 용균(사멸) 활성을 확인할 수 있었으며, 이로부터 본 발명의 박테리오파지 SEP-1과 박테리오파지 SGP-1이 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균 모두에 항균 활성이 있다고 결론지을 수 있었다. 이로부터 본 발명의 박테리오파지 SEP-1과 박테리오파지 SGP-1은 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 얻어진 박테리오파지 SEP-1, 박테리오파지 SGP-1, 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1의 혼합물을 이용한 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균의 감염 예방에 대한 적용예
9 ㎖의 영양배지(Nutrient broth: 소고기 추출물 3 g/ℓ, 펩톤 5 g/ℓ) 두 개에는 각각 약 1× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액 100 ㎕를 넣어주고, 다른 두 개에는 각각 약 1× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액 100 ㎕를 넣어주고, 또 두 개에는 각각 약 0.5× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액 100 ㎕와 약 0.5× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액 100 ㎕를 넣어주고, 마지막 두 개에는 박테리오파지 액을 넣어주지 않은 시료를 각각 준비하였다. 각 두 개로 이루어진 군의 하나의 시료에는 최종적으로 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 살모넬라 콜레라수이스 균의 배양액을 넣어주고, 나머지 하나의 시료에는 최종적으로 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 살모넬라 두블린 균의 배양액을 넣어준 다음 박테리아의 성장 상태를 관찰해보았다. 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 박테리오파지 액을 첨가해 주지 않은 배지에서는 60분 후 600 nm에서의 흡광도가 1.3 정도가 될 정도로 박테리아가 매우 잘 성장하는 반면에 박테리오파지 액을 첨가해 준 영양배지에서는 박테리오파지 액의 종류에 관계없이 15분경과 후 600 nm에서의 흡광도가 0.1 정도 수준으로, 60분 후에는 0.05 수준으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
Figure 112010036897929-pat00005
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1이 살모넬라 콜레라수이스 균 및 살모넬라 두블린 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있어 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균의 감염을 막는데 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 얻어진 박테리오파지 SEP-1, 박테리오파지 SGP-1, 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1의 혼합물을 이용한 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균의 감염에 의해 유발되는 질환을 치료한 적용예
4 마리의 2일령 병아리에게 1× 107 cfu의 살모넬라 콜레라수이스 균을 먹여 인위적으로 감염상태를 만들었고 (동물 1-1, 1-2, 1-3, 1-4), 또 다른 4 마리의 2일령 병아리에게 1× 107 cfu의 살모넬라 두블린 균을 먹여 인위적으로 감염상태를 만들었다 (동물 2-1, 2-2, 2-3, 2-4). 그 다음 동물 1-1과 동물 2-1에는 박테리오파지 SEP-1을 사료 1 g당 1× 109 pfu가 되도록 섞어서 급이하였고, 동물 1-2와 동물 2-2에는 박테리오파지 SGP-1을 사료 1 g당 1× 109 pfu가 되도록 섞어서 급이하였고, 동물 1-3과 동물 2-3에는 박테리오파지 SEP-1은 사료 1 g당 0.5× 109 pfu가 되고 박테리오파지 SGP-1도 사료 1 g당 0.5× 109 pfu가도록 함께 섞어서 급이하였고, 동물 1-4와 동물 2-4에는 박테리오파지를 배제 시킨 동일한 조성의 사료만을 급이하였다. 급이 2일 후 분변 및 맹장 내용물에서의 살모넬라 균수를 측정하였다. 본 실시예에서는 타 오염 세균에 의한 간섭을 막기 위해 살모넬라 균 선택배지(Rambach agar plate; Merck)를 사용하였다. 실험 결과, 박테리오파지를 사료와 함께 급이한 경우, 박테리오파지 액의 종류에 상관없이 분변에서는 대조군 대비 1,000배 이상의 살모넬라 균의 감소가 확인되었으며, 맹장 내용물에 있어서도 200배 이상 살모넬라 균의 오염이 줄어듦을 확인할 수 있었다.
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1 모두가 살모넬라 콜레라수이스 균 또는 살모넬라 두블린 균을 원인으로 하는 감염질환의 처치에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 사료 첨가제 및 사료의 제조
실시예 1에서 준비된 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액을 이용하여 사료 첨가제 1 g당 1× 109 pfu의 박테리오파지 SEP-1이 포함되도록 제조하였다. 제조 방법은 중량비로 덱스트란 90%, 실리카 5%, 탄산칼슘 5%로 이루어진 가루 형태의 매질 위에 실시예 1에서 준비된 박테리오파지 액을 골고루 분사시킨 다음 이를 상온 건조시켰고 최종적으로 고운 가루 형태로 분쇄하는 방식으로 잘 혼합하여 제조하였다. 상기 과정 중의 건조 시에는 감압 건조, 가온 건조, 동결건조도 대체 가능하다.
사료 첨가제 1 g당 1× 109 pfu의 박테리오파지 SGP-1이 포함된 사료 첨가제도 실시예 2에서 준비된 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액을 이용하여 동일한 방식으로 제조하였다. 또한, 사료 첨가제 1 g당 0.5× 109 pfu의 박테리오파지 SEP-1과 함께 0.5× 109 pfu의 박테리오파지 SGP-1도 포함된 사료 첨가제도 실시예 1에서 준비된 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액과 실시예 2에서 준비된 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액의 동부피의 혼합액을 이용하여 동일한 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료 첨가제도 박테리오파지가 포함되지 않은 생리식염수를 분사해 주는 방식으로 제조하였다.
이렇게 제조된 4종의 사료 첨가제 각각을 중량비로 1,000배의 사료와 혼합하여 최종 4종의 사료를 제조하였다. 이렇게 제조된 사료는 추가의 사료 제조 공정을 통하여 추가 가공될 수도 있지만 본 실시예에서는 이는 적용하지 않고 그대로 사용하였다.
실시예 9: 음수 첨가제 및 소독제의 제조
음수 첨가제나 소독제는 그 활용에서만 차이가 나고 제형은 동일하므로 같은 방식으로 제조하였다. 실시예 1에서 준비된 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액을 이용하여 음수 첨가제 (또는 소독제) 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 SEP-1이 포함되도록 제조하였다. 제조 방법은 멸균된 통상 당분야에서 사용하는 완충액 (본 실시예에서는 생리식염수 사용)에 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 SEP-1이 포함되도록 실시예 1에서 준비된 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다.
음수 첨가제 (또는 소독제) 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 SGP-1이 포함된 음수 첨가제 (또는 소독제)도 실시예 2에서 준비된 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액을 이용하여 동일한 방식으로 제조하였다. 또한, 음수 첨가제 (또는 소독제) 1 ml당 0.5× 109 pfu의 박테리오파지 SEP-1과 함께 0.5× 109 pfu의 박테리오파지 SGP-1이 포함된 음수 첨가제 (또는 소독제)도 실시예 1에서 준비된 박테리오파지 SEP-1의 박테리오파지 액과 실시예 2에서 준비된 박테리오파지 SGP-1의 박테리오파지 액의 동부피의 혼합액을 이용하여 동일한 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 음수 첨가제 (또는 소독제)로 박테리오파지가 포함되지 않은 생리식염수 자체를 선택하였다.
이렇게 제조된 4종의 음수 첨가제 (또는 소독제)는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 음수 또는 소독제로 사용하였다.
실시예 10: 돼지 사육에서의 효과 확인
살모넬라 콜레라수이스 균은 돼지에서의 주요한 병원균이므로 돼지 사육에서의 본 발명의 효과를 조사해 보았다. 실시예 8 및 실시예 9에서 제조한 사료 및 음수와 소독제를 이용하여 이를 실제 동물 사육에 적용하여 동물 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 60 마리의 자돈을 20 마리씩 한 그룹으로 총 3개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 음수로 공급한 그룹-B; 소독 처리한 그룹-C)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 5마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 SEP-1이 적용된 소그룹 (소그룹-①), 박테리오파지 SGP-1이 적용된 소그룹 (소그룹-②), 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1이 함께 적용된 소그룹(소그룹-③), 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹 (소그룹 ④)으로 나누어진다. 본 시험에 대상이 된 자돈은 20일령의 이유 자돈이었으며, 각 시험 소그룹의 자돈은 한 분방에 5마리씩 나누어져 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 4와 같이 구분되고 지칭되었다.
Figure 112010036897929-pat00006
사료 급이의 경우에는 실시예 8에서 제조한 사료를 표 4의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이하였으며, 음수 급이의 경우에는 실시예 9에서 제조한 음수를 표 4의 구분에 따라 통상적인 음수 급이 방식에 따라 급이하였으며, 소독 처리의 경우에는 일주일에 3회씩 기존 소독과 번갈아 가면서 실시하였다. 본 발명의 소독제를 분무하는 날은 통상의 소독제를 이용한 소독은 실시하지 않았다. 시험 결과가 표 5에 제시되어 있다.
Figure 112010036897929-pat00007
이상의 결과로 본 발명에 따른 사료 및 음수의 급이와 소독 처리가 동물의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명이 동물의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
실시예 11: 소 사육에서의 효과 확인
살모넬라 두블린 균은 소에서의 주요한 병원균이므로 소 사육에서의 본 발명의 효과를 조사해 보았다. 실시예 8 및 실시예 9에서 제조한 사료 및 음수와 소독제를 이용하여 이를 실제 동물 사육에 적용하여 동물 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 설사변 (황색 수양성의 악취변) 및 점혈변의 발생 빈도 관점에서 1개월간 실시되었다. 본 시험에 대상이 된 자우는 1-3개월령이었다. 총 10 마리의 자우를 5 마리씩 한 그룹으로 총 2개 그룹으로 나누었으며, 하나의 그룹은 실시예 8에서 제조한 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1이 함께 포함된 사료와 실시예 9에서 제조한 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1이 함께 포함된 음수도 공급하면서, 이에 더하여 실시예 9에서 제조한 박테리오파지 SEP-1 및 박테리오파지 SGP-1이 함께 포함된 소독제를 이용한 소독도 실시하였다. 나머지 하나의 그룹은 대조 그룹으로서 박테리오파지와 관련된 어떠한 처치도 실시하지 않았다.
사료 급이와 음수 급이의 경우에는 통상적인 급이 방식에 따라 급이하였으며, 소독 처리의 경우에는 일주일에 3회씩 기존 소독과 번갈아 가면서 실시하였다. 본 발명에 따른 소독제를 이용한 소독은 축사 및 각 동물 개체 모두에 대하여 실시하였다. 본 발명의 소독제를 분무하는 날은 통상의 소독제를 이용한 소독은 실시하지 않았다. 시험 결과가 표 6에 제시되어 있다.
Figure 112010036897929-pat00008
이상의 결과로 본 발명에 따른 사료 및 음수의 급이와 소독 처리가 동물의 설사 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명이 동물의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
KCTC KCTC11173BP 20070821 KCTC KCTC11174BP 20070821
<110> iNtRON Biotechnology, Inc. <120> Method for prevention and treatment of infection of Salmonella Choleraesuis or Salmonella Dublin <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 43285 <212> DNA <213> SEP-1 Bateriophage gene <400> 1 aactcgaact gtgcggctgc gccgttgtcg ttagtaatgg tgaacgtgtc gataagttta 60 agtggcgcgg caccgtcata agcagataca tcaaccgatg caaacgggcg ggcactaaaa 120 ttagtcgtga agtcggaacc gctaggcggc gcctgtaaga tttcctgatt caagccgatg 180 aacgggaatg aaccggtcac cattgcgtta acagcctgtt cgatagtgaa cccggtaaac 240 tcgacaccac gggttacgat gtatgaatcc gggtttccgc atttaccttt caaccatgtg 300 aggattgaat aggtcttaca caagttaccg gtttccagtt tatctgcgat acgcaaatct 360 gcctggacgt cggattcggc ggtaagggta tgctggatgc ccgcaccggt tacgaccgta 420 gccgttactg cggtaacgag gaaagcttta tcgttattac cggacaaacc atcgaattgc 480 accaggtcgc ctacttcaac gccatcggtt acaaagctac cggaggcccg tgtgaaagtt 540 ttcgctaccg ggtcaaccgt aatgccgatt gccgatgcgg tggaacctgc tacccatgaa 600 ctggtcattg caccggctaa cagctcgtcc tggcttgtcg cgcttagttc gatagcgtat 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ggcggtcaac cagtagttga gattggtgcc ttcaaggatg 180 gttctgacca gcagacggca aacgtgccag ttaaagtagg cttgcgcctc gttcacgtgt 240 tctaaggagg acataatgtt atcacttgat ttcaacaacg a 281 <210> 20 <211> 186 <212> DNA <213> SGP-1 Bateriophage partial gene <400> 20 tttcaccaac ctctggaaac ggcgggcctt gggaacgtac tgtgtacact gcccagactg 60 acttcggtct caaccgctgg cgcacgctga gtggttcgtc atggggagaa gtagtcaact 120 tacttaatag ctccggcgta cttaaagggt atccgcaacg tcttgttgtt gacttcacgg 180 ttgagg 186 <210> 21 <211> 222 <212> DNA <213> SGP-1 Bateriophage partial gene <400> 21 gggcgtcgct cattctgcat ctccttaata gtacgctgga gcgccctttg gtgagcatca 60 gcagctcggg ttattccgat aatacgctta gcatctgact cgtgaagttc gcgtcgacca 120 ttaaactcgc atctaccgta atcttctgga agccggaaag ggtcttgatg cggactgaca 180 gccgcttata attactacgc aggacattaa gcatcctatc ag 222 <210> 22 <211> 358 <212> DNA <213> SGP-1 Bateriophage partial gene <400> 22 cttattacta cgcacgtcat taagcatcct atcagtgctg ccttcaatgg ctgcaatctc 60 ttcttggtac tcacgggata cccgactgac ctctgcctga gttgctgcgg ttgcttttgt 120 tttcgcaatg tattcatttt ggattacctc cttccagttt gctctctcat gggttgaccc 180 taagtgccag ccacccataa agagtgtccc ggcgagtacc caagggagtg cgctgcgtaa 240 aagttttacc ataacacctc ccatcaattt tcacatttta catacatgca ccaaataaca 300 tccataaagg ctccccgcgt ggagaacctt gagtatgtca cttactgtac cgtgattg 358

Claims (13)

  1. 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)균 또는 살모넬라 두블린(Salmonella Dublin)균 감염 방지 또는 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)균 또는 살모넬라 두블린(Salmonella Dublin)균 감염증의 증상 완화를 위한 용도로, 기탁번호 KCTC 11173BP의 박테리오파지의 증식액에 대한 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 침전 과정을 통하여 제조한 박테리오파지 액, 기탁번호 KCTC 11174BP의 박테리오파지의 증식액에 대한 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 침전 과정을 통하여 제조한 박테리오파지 액, 또는 기탁번호 KCTC 11173BP의 박테리오파지의 증식액 및 기탁번호 KCTC 11174BP의 박테리오파지의 증식액의 혼합액에 대한 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 침전 과정을 통하여 제조한 박테리오파지 액으로 구성되며, 각각의 박테리오파지 기준으로 1×104 pfu/g 내지 1×1015 pfu/g 함량으로 포함되는 사료조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기탁번호 KCTC 11173BP의 박테리오파지는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 사료조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기탁번호 KCTC 11174BP의 박테리오파지는 서열번호 2 내지 서열번호 22를 포함하는 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 사료조성물.
  4. 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)균 또는 살모넬라 두블린(Salmonella Dublin)균 감염 방지 또는 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)균 또는 살모넬라 두블린(Salmonella Dublin)균 감염증의 증상 완화를 위하여, 제1항에서 정의된 사료조성물을 이용하여 제조한 사료를 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)균 또는 살모넬라 두블린(Salmonella Dublin)균에 감염될 수 있거나 감염된 인간을 제외한 포유동물로 투여하는 단계를 포함하는, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)균 또는 살모넬라 두블린(Salmonella Dublin)균에 의한 감염을 방지하거나 또는 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)균 또는 살모넬라 두블린(Salmonella Dublin)균에 의한 감염증의 증상을 완화시키는 방법.
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