CN108179135B - 大肠杆菌噬菌体Esc-COP-7及其致病性大肠杆菌增殖抑制用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从自然中分离的肌病毒科噬菌体Esc‑COP‑7(受托编号：KCTC 13130BP)，其特征在于，携带具有特异性杀灭大肠杆菌能力、并用序列号1标记的基因组，且本发明还涉及利用以所述噬菌体为有效成分包含在内的组合物防止及治疗致病性大肠杆菌感染的方法。

Description

大肠杆菌噬菌体Esc-COP-7及其致病性大肠杆菌增殖抑制 用途

技术领域

本发明涉及一种从自然环境中分离能够感染大肠杆菌后可杀灭大肠杆菌的噬菌体及利用以该噬菌体为有效成分包含的组合物防止及处置致病性大肠杆菌感染的方法。具体讲，就是涉及一种以携带具有特异性杀灭大肠杆菌能力、用序列号1标记的基因组为特征的从自然中分离的肌病毒科噬菌体E sc-COP-7(受托编号：KCTC 13130BP)及利用以所述噬菌体为有效成分包含在内的组合物防止致病性大肠杆菌的感染及感染后处置的方法。

背景技术

大肠杆菌属于肠内细菌科，作为革兰氏阴性杆菌、过氧化氢酶(Catala se)阳性、氧化酶(Oxidase)阴性、兼性厌氧细菌，大部分都分解乳糖。大肠杆菌从血清学的角度区分为细胞体(O)、鞭毛(H)、荚膜(K)抗原，且公知为这些抗原与大肠杆菌的致病性相关。致病性大肠杆菌是指大肠杆菌中少数获得病毒性的大肠杆菌，根据发病特征、毒素的种类等通常大致分为肠出血型大肠杆菌、肠产毒型大肠杆菌、肠侵袭型大肠杆菌、肠致病型大肠杆菌、肠集聚型大肠杆菌这5种类型。致病性大肠杆菌会感染多种年龄的家畜使之发病，主要症状为腹泻，因极其严重的脱水而导致的病死率也是非常高的。这种致病性大肠杆菌引起的腹泻病是在我国几乎所有的养殖户中蔓延的主要疾病，由此给畜牧产业带来的损失是相当大的。

通常情况下，为了对致病性大肠杆菌的感染疾病进行预防及治疗而采取的方法有利用疫苗及抗生素的方法。然而利用抗生素的治疗因耐药菌的增加而导致其效果持续下降。同时，由于加强了对动物使用抗生素的规制，因此迫切需要研发出一种除抗生素之外的其它有效方法。

最近，作为细菌性疾病的应对方案，噬菌体(Bacteriophage)的利用受到了极大关注。特别是，由于人们倾向于亲环境方式，使得大家对噬菌体的关注程度比以往任何时候都高。噬菌体作为感染细菌的极小微生物，通常也简称其为抗菌素(Phage)。噬菌体在感染(Infection)细菌后，在细菌的细胞内增殖，增殖后，当子代噬菌体向细菌外游离时，就通过破坏宿主即细菌的细胞壁的方式而杀灭细菌。噬菌体的细菌感染方式具有很高的特异性，因此能够感染特定细菌的噬菌体种类仅限定在一部分。即，特定噬菌体只能感染特定范畴内的细菌。因此，特定噬菌体只能杀灭特定细菌，而不会对其它细菌产生影响。这种噬菌体的细菌特异性只会对目标细菌产生抗菌效果，而不会对环境中或者动物体内的正常菌群产生影响。通常情况下，广泛用于细菌处置的现有抗生素会同时对多种细菌产生影响。因此，造成了环境污染或者干扰动物的正常细菌丛等问题。与此相反，由于噬菌体只对特定细菌有效，因此使用噬菌体不会产生干扰体内正常菌丛等问题。由此，使用噬菌体与使用抗生素相比，不仅更加安全，且使用中带来副作用的可能性也是相对很低的。

噬菌体是1915年英国的细菌学者Twort在对葡萄球菌(Micrococcus)菌落由某种物质溶解后呈透明状这一现象的原因进行研究时发现的。另外，1917年法国的细菌学者d'Herelle发现痢疾患者大便滤液中存在溶解痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)的某种物质，并通过对此进行的研究，独立发现了噬菌体，且从它能够吞噬细菌这一涵义出发将其命名为”噬菌体”。此后，陆续发现了痢疾菌、伤寒沙门氏菌、霍乱病菌等多种针对致病性细菌的噬菌体。

由于噬菌体具有杀灭细菌的特殊能力，因此噬菌体被发现后，研发人员都期待能够研发出一种应对细菌感染的有效方案，并开展了大量相关研究。但是，Fleming发现青霉素之后，随着抗生素的广泛普及，对噬菌体的研究仅在一部分东欧国家和前苏联开展，维持了一线生机。不过，2000年以后，由于抗生素耐药菌的增加，发现了现有抗生素的局限性。随着作为现有抗生素替代物质的研发可能性不断加大，噬菌体作为抗菌剂再次受到了关注。特别是，最近随着全球范围内从政府层面加强了对抗生素使用的规制，人们对噬菌体的关注度进一步升高，将其用于产业方面的事例也在逐渐增加。

如前所述，噬菌体对细菌的特异性非常高。正是由于存在这种特异性，所以即使对属于同一种(Species)的细菌，噬菌体往往也只会对其一部分株(Strain)发挥抗菌效果。另外，随着对象菌株的不同，由此发挥的噬菌体的抗菌力强度本身也会不一样。因此，要想获得针对特定种类的细菌进行有效控制的方法，就需要确保具有多种有用的噬菌体。为了开发出针对致病性大肠杆菌的有效噬菌体利用方法，当然也需要确保可针对大肠杆菌提供抗菌效果的多种多样的噬菌体。进一步地，在确保的多种有用噬菌体中，也需要从抗菌力强度或者抗菌范围的层面筛选具有比较优势的噬菌体加以利用。

发明内容

发明所要解决的课题

因此，本发明人致力于研发一种可用于防止或处置致病性大肠杆菌感染的组合物，其利用能够选择性杀灭大肠杆菌的从自然环境中分离的噬菌体，并利用该组合物研发出防止或处置致病性大肠杆菌感染的方法，经过不懈努力，终于从自然环境中分离出了符合上述条件的噬菌体。同时，为了能够区分所述分离的噬菌体与其它噬菌体并特定其性质而确保了其基因组(Genome)的基因序列后，开发出了以所述噬菌体作为有效成分的组合物，并确认该组合物能够有效用于防止和处置致病性大肠杆菌感染，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供一种从自然环境中分离的肌病毒科(Myoviridae)噬菌体Esc-COP-7(受托编号：KCTC 13130BP)，其特征在于，携带用序列号1标记的基因组，具有特异性杀灭大肠杆菌的能力。

本发明的另一个目的在于，提供一种组合物及利用该组合物的致病性大肠杆菌的感染防止方法，所述组合物以感染大肠杆菌后能够将大肠杆菌杀灭的噬菌体Esc-COP-7作为有效成分包含在内，并且该组合物可用于防止致病性大肠杆菌的感染。

本发明的又一个目的在于，提供一种组合物及利用该组合物的致病性大肠杆菌的感染处置方法，所述组合物以感染大肠杆菌后能够将大肠杆菌杀灭的噬菌体Esc-COP-7为有效成分包含在内，并且该组合物可用于处置致病性大肠杆菌的感染。

本发明的又一个目的在于，提供一种利用所述组合物的以防止和处置致病性大肠杆菌感染为目的的消毒剂。

本发明的又一个目的在于，提供一种利用所述组合物的以防止和处置致病性大肠杆菌感染为目的的非人类动物的饮用水添加剂。

本发明的又一个目的在于，提供一种利用所述组合物的通过防止和处置致病性大肠杆菌的感染以提高饲养效率为目的的饲料添加剂。

课题解决的方法

本发明提供了一种从自然环境中分离的肌病毒科噬菌体Esc-COP-7(受托编号：KCTC 13130BP)，其特征在于，携带具有特异性杀灭大肠杆菌的能力、用序列号1标记的基因组。同时，本发明还提供了一种利用以所述噬菌体作为有效成分包含的组合物的防止及处置致病性大肠杆菌感染的方法。

噬菌体Esc-COP-7在由本发明人分离后，于2016年10月17日寄存在韩国生物科学与生物工艺学研究院(受托编号：KCTC 13130BP)。

另外，本发明提供了一种消毒剂、非人类动物的饮用水添加剂及饲料添加剂，其以可用于防止和处置致病性大肠杆菌的感染的噬菌体Esc-COP-7作为有效成分包含。

本发明的组合物中所包含的噬菌体Esc-COP-7能够有效杀灭大肠杆菌，因此对由致病性大肠杆菌诱发的疾病的预防(防止感染)或者治疗(处置感染)显示出效果。因此，本发明的组合物可用于由致病性大肠杆菌诱发的疾病的预防及治疗。

本说明书中使用的“防止”或“预防”等术语的含义：(ⅰ)防止致病性大肠杆菌感染；(ⅱ)抑制致病性大肠杆菌的感染发展成疾病。

本说明书中使用的“处置”或“治疗”等术语的含义：(ⅰ)对由致病性大肠杆菌诱发的疾病进行抑制；(ⅱ)使由致病性大肠杆菌诱发疾病的病情减轻的一切行为。

本说明书中的“分离”、“分离的”或“被分离的”是指，从自然状态中利用多种实验方法分离出噬菌体；并确保能与其它噬菌体区分而特定所述噬菌体的特征的事情。同时，还包括，利用生物工程技术将噬菌体增殖以便用于产业领域。

本发明的组合物中包含的药剂学上允许使用的载体为生产制剂时通常使用的物质，包括但不限于：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、洋槐胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。本发明的组合物除了上述成分外，还可包括：润滑剂、润湿剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。

本发明的组合物中作为有效成分包含噬菌体Esc-COP-7。其中噬菌体Esc-COP-7包含

或1×10¹pfu/g～1×10³⁰pfu/g。优选地，包含

或1×10⁴pfu/g～1×10¹⁵pfu/g。

本发明的组合物根据具有本发明所属技术领域常规知识的技术人员容易实施的方法利用药学上允许使用的载体及/或赋形剂制成制剂，可以按单位容量形式制造，或者可以装入大容量的容器内而制造。其剂型既可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可以包含分散剂或稳定剂。

本发明的组合物根据使用方式的不同可实现为消毒剂、非人类动物的饮用水添加剂及饲料添加剂，但并非仅限于此。

为了提高这种利用目的中的效率，还可以向本发明的组合物中添加针对其它菌种提供抗菌活性的噬菌体。另外，也可以添加对大肠杆菌具有抗菌活性的其它种类的噬菌体。即使是对大肠杆菌具有抗菌活性的噬菌体，在抗菌力的强度，或者抗菌范围的层面，彼此之间都存在差异。因此，将其进行适当组合可最大限度地发挥其功效。

发明效果

利用以本发明噬菌体Esc-COP-7为有效成分包含的组合物的致病性大肠杆菌的感染防止及处置方法，与现有基于抗生素等化学物质的方式相比，优点在于其对大肠杆菌的特异性非常高。这意味着，它不会对其它有用的正常菌群产生影响，同时还能够用于致病性大肠杆菌的感染防止或处置，而由其产生的副作用却又非常小。通常情况下，如果使用抗生素等化学物质，对普通的正常菌群也会造成损害，最终会导致动物的免疫力降低，从而显示出随使用的多种副作用。另外，由于本发明是分离自然界中已经存在的噬菌体作为组合物的有效成分，因此它还具有非常亲自然、环保的优点。另外，即使噬菌体中能够发挥抗菌活性的菌种相同，就抗菌效果的发挥而言，在抗菌力的强度，或抗菌范围【在从属于大肠杆菌的多种细菌菌株(Strain)的侧面，噬菌体对个别细菌菌株发挥抗菌活性的范围。通常情况下，噬菌体只能够对属于同一菌种(Species)的一部分细菌菌株(Strain)发挥抗菌活性。即，即使属于同一菌种，个别不同的细菌菌株对噬菌体的敏感性会存在差异】的层面存在差异。因此，与对大肠杆菌具有抗菌力的其它噬菌体相比，本发明可以提供具有差异性的抗菌效果。这意味着，在实际的产业应用中可以使所产生的效果存在很大的差异。

附图说明

图1是噬菌体Esc-COP-7的电子显微镜照片。

图2是显示噬菌体Esc-COP-7杀灭大肠杆菌能力的实验结果，透明部分是试验对象细菌被溶菌后最终形成的溶菌斑。

具体实施方式

下面，将依据实施例对本发明进行更加具体的说明。但是，所列举的实施例只是本发明的示例，本发明的范围并非仅限定于这些实施例。

实施例1:分离可杀灭大肠杆菌的噬菌体

分离可杀灭大肠杆菌的噬菌体时，利用了从自然环境中确保的样品。另外，用于噬菌体分离的大肠杆菌已由本发明人事先分离出来，并经过鉴定(identification)是致病性大肠杆菌。

下面，详细说明噬菌体的分离过程。在按照1/1000的比例接种大肠杆菌的TSB(Tryptic Soy Broth)培养基(酪蛋白消化物，17g/L；大豆消化物，3g/L；葡萄糖，2.5g/L；NaCl，5g/L；磷酸氢二钾，2.5g/L)中一起添加收集的样品(sample)，然后在37℃的条件下振荡培养3-4小时。培养之后，以8,000rpm离心分离20分钟，回收上清液。将大肠杆菌按照1/1000的比例接种到回收的上清液中，然后在37℃的条件下再次振荡培养3-4小时。在噬菌体已包含在样品中的情况下，为确保噬菌体的数量(Titer)能够充分增加，将上述过程总共重复实施了5次。将上述过程重复实施5次后，再将培养液以8,000rpm离心分离20分钟。离心分离后，将回收的上清液用0.45μm的过滤器进行了过滤。通过使用由此获得的滤液的常规的斑点试验(Spot assay)调查是否存在能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。

所述斑点试验按照以下方法实施。将大肠杆菌按照1/1000的比例接种到TSB培养基中后，在37℃的条件下振荡培养一夜。将由此准备的大肠杆菌培养液

(OD₆₀₀为1.5)涂抹(Spreading)到TSA(Tryptic Soy Agar)平板培养基(酪蛋白消化物，15g/L；大豆消化物，5g/L；NaCl，5g/L；琼脂，15g/L)上。将涂抹后的平板培养基在洁净工作台(Clean bench)上放置大约30分钟左右，使涂抹液干燥。干燥之后，将前面准备的滤液10μl点滴到涂抹有大肠杆菌的平板培养基上，并将其放置30分钟左右使其干燥。干燥之后，将经过上述点滴操作的平板培养基在37℃条件下静置培养一天。然后，调查在滴有滤液的位置是否生成透明环(Clear zone)。生成有透明环的滤液，就可以判断为其含有能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。通过这种调查，可以确保包含噬菌体的滤液，而该噬菌体具有针对大肠杆菌的杀灭能力。

利用确认含有能够杀灭大肠杆菌的噬菌体的滤液实施了纯噬菌体的分离。纯噬菌体的分离采用了常规的溶菌斑分析(Plaque assay)技术。具体讲，将溶菌斑分析过程中形成的一个溶菌斑用经过灭菌处理的尖端(tip)回收，然后将其添加到大肠杆菌培养液中，在37℃的条件下一起培养4-5小时。培养后，以8,000rpm离心分离20分钟，获得上清液。在获得的上清液中按照1/50的体积将大肠杆菌培养液添加后，再在37℃的条件下培养4-5小时。为了增加噬菌体的数量，将上述过程至少实施了5次以上，最后以8,000rpm离心分离20分钟，获得上清液。利用获得的上清液再次实施溶菌斑分析。通常情况下，由于纯噬菌体的分离不能仅通过上述1次过程完成，因此利用所述形成的溶菌斑再次重复整个前述步骤。这种过程至少重复实施了5次以上，确保了含有纯噬菌体的溶液。按照惯例，纯噬菌体的分离进行了重复执行，直到形成的溶菌斑的大小及形状全都相似为止。最后通过电子显微镜分析确认是否纯粹地分离了噬菌体。在电子显微镜分析过程中，也重复了前述过程，直至确认了纯粹分离为止。电子显微镜分析采用常规方法实施，下面对此进行简单说明。将含有纯噬菌体的溶液沾到铜网(Copper grid)上，再用2％的乙酸双氧铀(Uranyl acetate)进行负染法(Negative staining)和干燥后，通过透射电子显微镜观察其形态。分离的纯噬菌体电子显微镜照片如图1所示，如果通过形态特征进行判断，可以确认获得的新型噬菌体属于肌病毒科(Myoviridae)噬菌体。

含有通过这种方式确认的纯噬菌体溶液经过了以下提纯的过程。按照占溶液总体积1/50的体积向含有纯噬菌体的溶液中添加大肠杆菌培养液，然后再培养4-5小时。培养后，在8,000rpm离心分离20分钟，从而获得上清液。为了获得含有充足数量噬菌体的溶液，对这一过程总共重复实施了5次。将最后通过离心分离获得的上清液利用0.45μm的过滤器进行过滤后，实施了常规的聚乙二醇(Polyethylene Glycol；PEG)沉淀过程。具体讲，向

滤液中添加PEG和NaCl使其达到10％PEG 8000/0.5M NaCl，然后在4℃的条件下静置2-3小时，接着在8,000rpm离心分离30分钟，从而获得噬菌体沉淀物。将由此获得的噬菌体沉淀物用缓冲液(Buffer；10mM Tris-HCl，10mM MgSO₄，0.1％明胶，pH 8.0)

使其悬浮，将其称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。

通过上述过程，获得了经过提纯的纯噬菌体。将该噬菌体命名为噬菌体Esc-COP-7。此后，于2016年10月17日寄托在韩国生物科学与生物工艺学研(受托编号：KCTC13130BP)。

实施例2:噬菌体Esc-COP-7的基因组分离及序列分析

将噬菌体Esc-COP-7的基因组按如下方式进行了分离。基因组的分离利用了以与实施例1相同的方法获得的噬菌体悬浮液。首先，为了去除悬浮液中可能含有的大肠杆菌的DNA和RNA，向

噬菌体悬浮液中分别添加了200U的DNase I和RNase A，然后在37℃的条件下放置了30分钟。放置30分钟后，为了消除DNase I和RNase A的活性，添加0.5M乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)500μl后，再静置10分钟。然后，将其再在65℃的条件下静置10分钟。接着，为了瓦解噬菌体的外壁，添加蛋白酶

100μl后，使其在37℃的条件下反应了20分钟。然后，添加10％十二烷基硫酸钠(Sodium dodecylsulfate；SDS)500μl，接着让其再在65℃的条件下反应了1小时。反应1小时后，向该反应液中添加

按照25：24：1的构成比由苯酚(Phenol)：三氯甲烷(Chloroform)：异戊醇(Isoamylalcoh ol)组成的混合液并充分搅拌均匀。然后，将其以13,000rpm离心分离15分钟使其分层，接着从分离的层中取上层，向其中添加1.5体积比的异丙醇(Isopr opylalcohol)后，以13,000rpm离心分离10分钟，使基因组沉淀。将沉淀物回收后，向沉淀物中添加70％乙醇(Ethanol)，然后再以13,000rpm离心分离10分钟，对沉淀物进行了洗涤。将已洗涤的沉淀物回收，对其实施真空干燥后，再将其溶解于100μl的水中。重复执行上述过程，获得了大量噬菌体Esc-COP-7的基因组。

在首尔大学农业与生命科学仪器中心(National Instrumentation Center forEnvironmental Management)利用由此获得的基因组使用illumina Mi-Seq仪器进行了下一代碱基序列分析(Next generation sequencing analysis)，获得了噬菌体Esc-COP-7的基因组序列信息。最终，分析的噬菌体Esc-COP-7基因组具有的大小为54,200bp，全部基因序列用序列号1标记。

以获得的噬菌体Esc-COP-7基因组序列为基础，利用网上的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对其与现在已知噬菌体基因组序列之间的相似性(Similarity)进行了调查。BLAST调查结果表明，噬菌体Esc-COP-7的基因组序列与大肠杆菌噬菌体phiEcoM-GJ1的序列(基因库登记号.EF460875.1)有比较高的相似性(同一性：89％)。但是，与噬菌体Esc-COP-7基因组上的开放型解读框架(Open Reading Frame，ORF)的个数为77个，与此相反，大肠杆菌噬菌体phiEcoM-GJ1为75个，它具有与噬菌体Esc-COP-7不同的开放型解读框架个数。

根据这一事实可以得出的结论是，噬菌体Esc-COP-7为与现有已报告的噬菌体不同的新型噬菌体。与此同时，通常情况下，如果噬菌体的种类不同，则其能提供的抗菌力的强度及抗菌范围也不同，通过这一事实可以判断，噬菌体Esc-COP-7能够提供与现有已报告的其它噬菌体不同的抗菌效果。

实施例3:噬菌体Esc-COP-7杀灭致病性大肠杆菌的能力调查

对分离噬菌体Esc-COP-7杀灭致病性大肠杆菌的能力进行了调查。杀灭能力调查是按照通过实施例1中提出的斑点试验调查是否生成透明环的方式实施的。用于杀灭能力调查的致病性大肠杆菌是由本发明人分离并鉴定为致病性大肠杆菌，总共用了10株。噬菌体Esc-COP-7针对成为实验对象的10株致病性大肠杆菌中的总共9株具有杀灭能力，具有代表性的实验结果如图2所示。另外，还调查了噬菌体Esc-COP-7对支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)及绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的杀灭能力，结果表明，噬菌体Esc-COP-7对这些菌种不具有杀灭能力。

从以上结果可知，噬菌体Esc-COP-7对致病性大肠杆菌具有优秀的杀灭能力，对多数的致病性大肠杆菌都能够发挥抗菌效果。这意味着，噬菌体Esc-COP-7可作为以防止及处置致病性大肠杆菌的感染为目的的组合物的有效成分而使用。

实施例4:噬菌体Esc-COP-7预防致病性大肠杆菌的感染的实验例

向装有

的TSB培养基的一个软管内加入100μl的

标准的噬菌体Esc-COP-7溶液，向另一个装有

的TSB培养基的软管内仅再添加了等量的TSB培养基。然后，向各个软管内加入致病性大肠杆菌的培养液，使其在600nm处的吸光度约为0.5左右。添加致病性大肠杆菌后，将软管移至37℃的培养器中进行振荡培养，并观察了致病性大肠杆菌的生长状态。如表1所示，在添加有噬菌体Esc-COP-7溶液的软管中，观察到致病性大肠杆菌的生长被抑制。相反，在未添加噬菌体溶液的软管中，未观察到致病性大肠杆菌的生长被抑制的现象。

【表1】

致病性大肠杆菌的生长抑制

通过这一结果可以确认，本发明的噬菌体Esc-COP-7不仅能够阻碍致病性大肠杆菌的生长，而且具有将其杀灭的能力。由此可以得出的结论是，噬菌体Esc-COP-7可作为以防止致病性大肠杆菌感染为目的的组合物的有效成分而使用。

实施例5:利用噬菌体Esc-COP-7治疗致病性大肠杆菌感染疾病的示例

对噬菌体Esc-COP-7的针对猪的治疗效果进行了调查，该猪诱发了由致病性大肠杆菌引起的疾病。将出生后25天的断奶仔猪4头分为一组，总共分为两组，然后将其分开饲养在实验用饲养猪舍(1.1m×1.0m)中，实验进行了14天。在保温设施下对周围环境进行控制，使猪舍的温度与湿度保持恒定，每天都对猪舍地面进行了清扫。从实验开始日起的第7天，对所有的猪都使用口腔灌输管使猪口服了致病性大肠杆菌溶液。口服的致病性大肠杆菌溶液按如下方法准备。将致病性大肠杆菌利用TSB培养基在37℃的条件下培养18小时后，只回收菌体。然后，将其用生理盐水(pH 7.2)调整到10⁹CFU/ml。从口服致病性大肠杆菌的次日开始按照与注入致病性大肠杆菌溶液相同的方式每日使实验组(注入噬菌体溶液的组)的猪口服2次10⁹PFU的噬菌体Esc-COP-7，而对照组(未注入噬菌体溶液的组)的猪未做任何处理。为对照组和实验组提供的饲料和非人类动物的饮用水都是相同的，从注入致病性大肠杆菌后开始每日以所有的试验动物为对象调查了腹泻发生状况。腹泻发生状况调查是按照测定腹泻指数的方式实施的，腹泻指数测定按照测定常规排泄物稠度(FC)分数(正常：0，软便：1，拉稀：2，严重腹泻：3)的方式实施，其结果如表2所示。

【表2】

腹泻指数测定结果

通过这一结果可以确认，本发明的噬菌体Esc-COP-7对于治疗因致病性大肠杆菌诱发的感染疾病也非常有效。

实施例6:饲料添加剂及饲料的制造

利用噬菌体Esc-COP-7溶液制造饲料添加剂，确保每1g饲料添加剂中含有1×10⁹pfu的噬菌体Esc-COP-7。饲料添加剂的制造方法如下，向噬菌体溶液中添加麦芽糖糊精(50％，w/v)后进行冷冻干燥即可。最后，将其粉碎成细粉状。在所述制造过程中的干燥过程可以采用减压干燥、加温干燥、常温干燥。为了进行对比实验，不含噬菌体的饲料添加剂按照以下方式制造，即使用制造噬菌体溶液时使用的缓冲液(buffer；10mM Tris-HCl，10mMMg SO₄，0.1％明胶，pH 8.0)代替噬菌体溶液。

将通过上述方法制造的2种饲料添加剂分别按照重量比与1,000倍的养猪用饲料混合最终制成了2种饲料。

实施例7:非人类动物的饮用水添加剂及消毒剂的制造

非人类动物的饮用水添加剂或者消毒剂只是使用方式有差异，其剂型都是相同的，因此，两者都是采用相同的方式制造的。利用噬菌体Esc-COP-7溶液制造非人类动物的饮用水添加剂(或消毒剂)，确保每1ml非人类动物的饮用水添加剂(或消毒剂)含有1×10⁹pfu的噬菌体Esc-COP-7。非人类动物的饮用水添加剂(或消毒剂)的制造方法如下，按照添加所述噬菌体Esc-COP-7溶液并充分混合的方式制造，确保制造噬菌体溶液时使用的每1ml缓冲液中含有1×10⁹pfu的噬菌体Esc-COP-7。为了进行对比实验，不含噬菌体的非人类动物的饮用水添加剂(或消毒剂)按照以下方式制造，即直接使用制造噬菌体溶液时使用的缓冲液本身。

将通过上述方法制造的2种非人类动物的饮用水添加剂(或消毒剂)按照体积比用1,000倍的水稀释后用作最终的非人类动物的饮用水或消毒剂。

实施例8:确认养猪的饲养效果

对利用实施例6及实施例7中制造的饲料、非人类动物的饮用水及消毒剂养猪的饲养效果是否有改善进行了调查。特别是，本调查是从病死率的角度出发实施的。将总共30头仔猪每10头分为一组，总共分为3组(用饲料喂养的组-A；用非人类动物的饮用水供给的组-B；消毒处理的组-C)，试验实施了4周。将每组再分为由5头组成的小组，各小组再分为使用噬菌体Esc-COP-7的小组(小组-①)及不使用噬菌体的小组(小组②)。作为本试验对象的仔猪是出生后20天的断奶仔猪，将各试验小组的仔猪饲养在按一定间隔隔开的不同独立猪舍中，各小组按表3所示情况进行区分及指示。

【表3】

猪饲养试验中的小组区分及表示

如果用饲料喂养，就用实施例6中制造的饲料根据表3中的区分按照常规饲料喂养方式进行喂养。如果用非人类动物的饮用水喂养，就用实施例7中制造的非人类动物的饮用水根据表3中的区分按照常规非人类动物的饮用水喂养方式进行喂养。如果是消毒处理，就一周3次与现有消毒方式轮流消毒。喷洒本发明消毒剂的日子就不用普通的消毒剂进行消毒，试验结果如表4所示。

【表4】

通过以上结果可以确认，用依据本发明制造的饲料及非人类动物的饮用水喂养和依据本发明进行消毒处理在饲养猪的过程中可以有效降低病死率，由此可以得出的结论是，使用本发明的组合物可以有效改善养猪效果。

在上述说明中，对本发明的特定部分进行了详细阐述。具有本行业常规知识的技术人员都会明白，以上详细说明仅是本发明的优选实施例，本发明的范围并非仅限定于此。因此，本发明的实际范围应当根据权利要求项及其等同物确定。

【受托编号】

寄托机构名称：KCTC

受托编号：KCTC 13130BP

受托日期：20161017

<110> 因特伦生物技术株式会社

<120> 大肠杆菌噬菌体Esc-COP-7及其致病性大肠杆菌增殖抑制用途

<130> DFP16KR2907

<160> 1

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 54200

<212> DNA

<213> Bacteriophage Esc-COP-7

<400> 1

gtcttgcgaa tgatggttgc ataaccgact ctcgtggtaa tcaaattaag tgtgctcgta 60

caccaatggt tatcattatg cagagagtgc atgaccaaga tttagttgga tacatacttc 120

gtggtggctc gtctgataag taccactacc tcaacatccc agccattatt gagaaggggg 180

ttgggagtgc tcagtggtat gacaagttaa ttaagaagca gaactacact catgctatcc 240

cgattcttta tgatttgaat aggaaggaag agaagtctgc attgtggcct tcacgtaaga 300

gtttagattc tctggaggca atgaaagagt ccaacccata cacatacaat tcacagtatg 360

ctggcgaccc atctgcacaa ggccacggcc ttatcaaaga agattggtgg caagagtatg 420

aaccggatgc tttcgacaga agtcgcatag tcagaagttt tattacagcg gatacggcat 480

caactgccaa atcttattct gattattcgg tccttaagca ttggggcgtg actaaagagc 540

gtgatgttta ttgtttagat attatgcttg gtaagtttga aactccagaa ctcaagactg 600

ctattatcga cttctggaac aaatgcaaca agttggactt gaagtgtgta ggttgtattc 660

ctcgtgcact gtatatggaa gataaatctg ctggacaatt cttgaaccaa caatttatta 720

gagatgggag tgtccgagtt ttaccgttgc ctcgtgatgg gattaatggt aatgacaagg 780

taactcgatt ccttaacgca atcccatatt tctcacaaaa gagaatattc ttccctgctg 840

gtcatgaaca cattgaccac gttagacgtg aaatacttgg attcacttct ttgggtagtg 900

gtactggaca cgacgattgt gtcgataacg tttcagatat ggttgcaatc gaattctcag 960

gcccaagtgc caactactcc gcatggatgt aaatatggcg gttatcactc gtttagatgc 1020

ccgctcacgc aagaacaact ccttccagat tcaagatttg gaaggaaaca ttttgtgtgt 1080

gattgaggca gtttctacta cagagagcga ctgtgttaag ttaaagcacg agtcaaatct 1140

gcgactccac acctccgaca acattcaaat tgttaagggt aatggaacta ttctaaggaa 1200

gaaataatga cttccaagaa gaaaaataat ctctctgtta aagttgcaga tgggttagaa 1260

aaccttgtaa caggattggg cggtcaggca gataagtcca cttttaacca gtggaccttc 1320

tcaaacaaga acgcgaacta tcgcgaactt atgaaccgct tccgtgagga ttgggtggca 1380

cagaaagtgt gcacagttat tcctcaagac atgacgcgta agtggcggca tattgattcc 1440

gaagagggac gcaaagcgga taagaaactt cgtatccgta aactgttccg tgaggcgtat 1500

caatgggcca gattgtatgg gacttcattt gttctgctcg acctaaaagg tacgggcaaa 1560

cttgacacac cattgcgact ggataacttg aagactggat gtattaaatc catgagagtt 1620

attgaccgct cacgcttatt tgccgcaggg actatggttc tggacccttt gagtcctcac 1680

tatggtttgc cagagtatta cactttggct gggtatcccg gctatatcca ctacactcgc 1740

tttcttcggt tcgagggtac tgaacttccg ctgttcgaat tccaacgaaa catgtggtat 1800

tctgattcgg tacttattcc actgttgaaa acgattgacc aattctacac aactgccgct 1860

gctgctgcca gccttgctca agaagccaca attgatgtgg taactgttga aggcttacaa 1920

tctctgctta catcgccgga aggtgaagct gctgtgatga agcgcttcaa acttatgaag 1980

ctggcaaaga gtatttataa cgtcttaatt ctcgacaata ctgagaagta tgacaccaag 2040

tcaattgcac tatctggtgt gaaagatttg atttgggaat acttgaagat tgtagctgcc 2100

gcagttggta ttccggctac acgtttcctt tctgcatctc cagacggtat gaatgctacg 2160

ggcgaatctg acctcgtaaa ctatatcgac ttgttgactg gcttgcagac ttctgtgttc 2220

gaccctcgtt tagatgtggt agacaagatt gtccaagcgc actttggcat tgaagaatat 2280

aactacgaat ggttagacat cttccctgaa tccaatgttg agaaagcgaa gcgagctaaa 2340

gatttggcat tcgctgttga cctgctggtt aacaacggca ccattaccac ggaagttgca 2400

aacgaagtca tgttccattc aggcgtgttc ggaacttgtg accttggcaa gccaaatcct 2460

aatcctccta acatccaaaa gggtaacgca agtgaagcaa aaccaaaacc tggttcagct 2520

taacgacgaa gataccgtga atgaagtagt tttgttgaac gacaaggcta ctttaacgac 2580

ccgtcgttta cgtgactctg gcgagatgat tgcagaatgc accatcgctc gtactggcat 2640

catgctgtac aaagcgaaag aacttggtga aattgcaaaa catctggacc cagaatctat 2700

ttgccgtgtt cgtaccaagc cggaagtatt atttgacgaa gcaaccatcg aaggctgtcg 2760

ttcaattccg gtaactatcg gccatccgaa aaatgatgtt aacatcaaga acaacaaaga 2820

actccagaaa gggttcatcg aagggcgtcc agttgcagac ggttctttct tggctgcatc 2880

aatcgttttg aatgacgagc aagctattcg attagttgat tctggtgttg accaaatctc 2940

cttgggccat aatgccgaac tggctgtatc agaagatgat gaagccgact tcgataaagt 3000

tcgcattatc cctaaccatg ctgcaattgt tgttcgtggt cgtgctcaga ctactcgcat 3060

tggtgactct ggtgaagaga ttgccattgt tgataaggca acctttgatg ttgttgaagc 3120

agagcgtgat gcagcgcttg acaagattag tgtccttgaa cagaaacttg ctgatgcaga 3180

aactgcacga ctatccgatg aagctattca ggctgaggta gacaaacgtg tagttgctcg 3240

tacagcactg cttgttgatg tggcccgtct tggcgacgag ttctccaacc tcgatttctc 3300

cggcaagact gatgcagaaa ttaagttggc tgtagttaat aaattgcatg acaaggattt 3360

cagcgataag agcgaagact atatctccgc ccgtttcgat gcagctcttg aagattgcga 3420

ttccattact ttaggagatg ccctgaatca gtctatgcaa ttcgctgcta agaaagattc 3480

agaagctcgt aaacctaaag tttctatttc cgaagaagct aacaaacgtc gtttagaacg 3540

cttcaactct ttataaggta agacaatgcc aaagcaagat tggtctatta atactggtga 3600

agcatatgca ggtgaacaat acggcctggc taccaccaac tcccagcgcc tgacctacgt 3660

tgccgaagaa gaaatggcaa actttggtct ggctgttgtt caaggcacgg cttctaatca 3720

ggttaaacct ggtattgaat ctgatggtac tgttctgggc attaccatgc gccagattaa 3780

catcgaatct gctactcgtc ctggcgacgg tactgttgca atcaaagttg gctggcctct 3840

gggcgttatg ctgtctggcc caatcatggt caaactggta actgcaatca ccgataaaga 3900

cattggcgta tctgccactg gtcaatttgg tggcgttggt gctggctata ctaaagcaac 3960

caacctgact gccctgcgtt atccggctgc tgctggtgat gttgttccgg tcatgattaa 4020

cgtagtccca aagccgtaac gccacctcca gctcctgcgg tatctgctgt agcaggcact 4080

gtaactgcgg acgcatctgc atctgatgcc actgtaactg tagataaact gtttaagttt 4140

gagaactcta cggcaacaga ttacaacttc gccgttactc ctgctgtagc tggtgtttct 4200

gtggcggcaa acggcactgt gactgtactc agtgcaacga ctacagccac ttctgcgaca 4260

atcaaggcaa ctaataaaac agaatctggt gtaactgcat ctaaagtgat tacgattaag 4320

cctaaacctc ctgcacctac agtatctgct gtagctggag ttgtgaccgc tgatgcgtct 4380

tctgctgatg ccactgtaac tgtagacaag ctgttcaagt ttggtaattc tacagcaaca 4440

gattatgcct acactgttac gcctcctgtg actggcgttt ctgtggctgc aaatggtact 4500

gtaactgttc tgaatgaaac gactactgat acctctgcca cgattaaggc aacaaacaaa 4560

acaacctcca gcgtgactgc aactaaagaa attgctatta cgccgaagtc ttaagttgtg 4620

atggcgcaat taatagttgc gcctcaccaa acaaaacgga ttaatttaca tgcctaagat 4680

gattaaactg gcggacggtt ctgaattcga actgaacgac gctatcaccc gtattcagga 4740

ttctggcact gttgtcctga atgacgacga tgcagtattc tttcaacgcc agcttgagtt 4800

cattgaagct caaacttacg acactctgta tccagaactg gaagctcgtg ctgctttcgg 4860

tgtggacact actggtggcg ctggcgtaaa cactctgacc taccgttctt acaaccatgt 4920

tggtaaagcc caggtaatta acgcccgtgc aaccgacctg ccgaagtcca gcatttctgg 4980

taaagaatac agcatccctg ttaaatcagt tggtactgca ttcgactacg atattgatga 5040

agtagcgtct gctgctgtta ctggcctacc gctggaaacc cgtaaagcaa atgctgctat 5100

tcgtggttac gaacagtatg ttaactctgc tgcatggtac ggcgataaag ctaacggctt 5160

tgttggcttc ttcgaaaacc cagacattac caaagcaact gttgctgctg gtgctggtgg 5220

ttctaccaag tgggctgaga agactccgac cgaagttatt gccgacctga ccactgctgt 5280

gtctgcaatg tatgcctcta ctctgaaaat catgcgcccg gatgaaatct ggatgcctgt 5340

tgagcatgag cagtacatct tcaacactgc acgttctgag cagtctgata agacgattgg 5400

tcagttcttc attgataaca accagttcat caactcccgc gataaaatca agggtctgaa 5460

cgcaatcaaa ggtcacggcg acgctggttc cgattgcttc gttgttgttt gccgcaatgc 5520

aatgggcaac cgcactttcc gtctgcgtga acctctgccg ctgacctggc aaccggtaca 5580

gcttcatggc ctggtttatg aagttcctgg tcgtggtcgt ttcgctggct tccaagcgat 5640

gtatccggca gcaatctcca tcaactccgg catctgataa atagggcggg actgttctcg 5700

cccataactt aagagaaata gtaatgcaga ttaagaacaa cgaatcacgc aaccttcaat 5760

tcttcttctc taagaaggga aagtctggca aatctgaact ggactttgtt cacattcctg 5820

gcggcgcaac tgtagaaatc gatgatgaaa tctacaaatc tcttacggca tctctgacgg 5880

aagttgaaga actgcgcgaa gaagtggttc cgcttgatga cgagaatatc ggtgcttctg 5940

ttaagaccgg taaagaagct cttgtcatta aagagtatta cagcactggc aaaactcgca 6000

aagtcaacct ggttaaagaa gcaatcaaag ctggctctct taccattgtt gaacgtgtga 6060

aagttggtat gcctgacatt gatgccatcc tgactaagaa tggtattgat attaagggca 6120

tgccggaaga cgttaaactg gcactctacg ataagttggc gtaaatgata acactaaccg 6180

atttggttaa acgttatccg gcaatggctg acatgacccc agagcgtttt gatattctag 6240

ttgaagatgc aaaacttatc atggggacaa tcgaatcgcg ttggtgtggg ttttatgacc 6300

cagctatggc atcacttgta gcgcattggt ctgcaacaat tgacgaccta atgcctggtg 6360

atgccgcaat gccagctatg cctgttagtc gtaccgatgt ggacgatgtt caggtagagt 6420

ttagcgaccg aatcatttca acaattccat atgttgaagc tgatttcatg tctactgtgt 6480

acggtcaacg ttacttgcaa tggcggcgaa tggcatttgc tgggccgagg gttagccctg 6540

ggtcacagtt ttgattaacc agcgtcgagc attcaaccgc tacacaacca ctcgtatgta 6600

tcttgaggta tatcaagaag gttactacga tgacaaaaat aattgggttg gtgattcata 6660

tgctccaaag aaacccatcc gatgtactcc cataccttat ggtgacaggg attctggcgt 6720

aagcggtcaa tcgcttaaag ctacagaagt cggagagcgc caacctgcat tcatgcaagt 6780

acattcccga actgaaatgc cgatgaagtc tatcctaact atctacggcc ttcgttataa 6840

agttatttct gtttctgact acaaggcagc tggattcttt gaagtcattg ctgcaaagga 6900

gttagagaaa tgatttatga tgaagatatt caggcgatga aggatattgt ggacgtctgt 6960

gttggcgtcc cacgcttctc ttatgagatg cagataaacg cacctcgacc atctgataac 7020

tatgccgcaa taaaatgtgt gtcgtcagtt aatccaggct ttgatgaaac tcgaatcgaa 7080

gtacgcgatg gtgaggaggt atttgttacg agagggattc gaatcttaac cttctatatt 7140

ctcttctcac gtcgtgggag tgagtatgtt aagtttgata attccttctt ccgtccagat 7200

gttcaggcca tgcttaagag caaaggcttt gcaacactcg acaaaaatcc actgaatctt 7260

gcctcgttaa ctcttgagac gaattgggaa ttccgagaag gaatccaaat caagttcaat 7320

gttctgcgtg aagacgtaat gaatattgga acaatgtctg acgccagtgt tggcggcaaa 7380

ttctatgatg gtggtgaacc catcctaatt aagggaatct aaatggcaat tccaatttcc 7440

gatatcatcc aggtcaacat cgcggtatct ccgaatgctg ttgccgtgga aggttttggt 7500

cctctgctct ttctttcgaa ggagtttaaa cctactgctg ccgaagtagt tcctgttcgt 7560

caatatacga gcatggctgc tgtatctgct gatttcccat ctggtgaaat ctataatgca 7620

gctttagcgt ggttttctca gaaaccgact ccgaagtatt tccttgtggg tgctatcact 7680

catgaagatg ttactccggc aacttctggg tctgtcacgg catcttctgt tgcaactctg 7740

gaaactatca ctgcgttaac caacggtgtg ctgtccgtta acgttgatgg cgtagaccgt 7800

tctaccgccc caatcaactt ctcttcggcc tccgactttg acgctgctac ctctatggca 7860

aatgctgcac tggttgctgc tggtattcca gttaccatgt ccaacaacaa gggcactttc 7920

aaagttgtta ccaagtctgt aggctctggc tctattattg gtaacgtata cggctctgct 7980

gctccagcat tcgagctgga ttccgaatca agtccggtat atgtgcatgg tactgatgaa 8040

gtatctgtag gctctgacct gagcgcaatc ctcaactcaa cgttcgactt cttcttcgtt 8100

gcaatcgacc gcaaatatcg cggcagtgct tctggcaata ttcagatgac tgttgctaaa 8160

tgggcagaag caaacgagaa agtattcggc tgggctgata gcgacccgca gattctggtt 8220

gttggtgcag aatctagctt caaacgagct aaagaacaga acctccagcg taccctgctg 8280

gtatatgatg cctctgacaa tggtgacgag tatccggaga tttctatcct gggccgtgca 8340

tctactgtca acttcaacgt tgcaaactct gcactcgttc tggcatttaa acaaggtccg 8400

gctatcaaga ctgctgacct gtccccgaac cagcttgctg cacttgagcg tgtaaatggt 8460

aacgcattca tcaacgtggg tgggaacact atgttctaca acggcaagat ggctgacggc 8520

acttggttcg ataccgttca gggcgtatct tggctgacct ctaaagttcg tgccaacgtg 8580

ttcaacctgt tctacacctc tacgaccaag attccttgga ccgatactgg tgtggctctg 8640

gtaaaccagc aggttactct ggctctggaa ctggctgtga ccaatggtct gattgctcca 8700

ggttacgaca atgaaggcaa cttctaccct gatggttaca aagtcttgtc tactgacatg 8760

gctctgatgc aatctcagaa aggcgctcgt atctgggaag gcacttcctt cattgcaatt 8820

ggctctggcg cattgcaggg tgcagttatc tccggcaact tcgttcagta agggtgcgat 8880

aagtgaatcc aaatagcgtc cgtgttggtg agatatttac gaccaggcac ggagacctaa 8940

ttgttgaaaa atatattaac gccaatgaag ttgttgtaag gttcctatct acaaactctg 9000

taaagataac ctcgtcagga aacattcgca aagggctagt taaagacttg tgtgcaccaa 9060

cagtattcgg tgttgggtgt attggtgtcg gaaaatattt atcaagtagc cgaagggtta 9120

aatcttctgc atatatttgc tggcacaaca tgattaaacg ttgctactgc aaggagtacc 9180

aagaaaagta tccttggtat tctgagtgta cagtatctga agaatggttg aactttcaga 9240

attttgcaga gtggtactac gcaaacttta aggaaggatt tgaactggat aaggatatta 9300

aatgctttgg aaataaagtg tactccaaag agacttgtca gtttgtccct cccagcataa 9360

acagaagcca caagtcggcg tacacacttc gcacgcgtgg caagaagact aattttttag 9420

tcggaggtta gtccaattaa gcagtactca ttttataata ccgacctcat tatcgacggt 9480

gctcgtgtag atggttttac ttctggtaac tccatcatca ctgctcgtcg taacgcacct 9540

caacacctgc ctgttattga cgcatatggt aagttggctg tagctactac ggctgacttg 9600

tctggtacta ttactttccc gcttctgcaa accgcagact ggaacgaaat cctgtacagc 9660

cgtgctcagt taactcaggc aactggcctg tctggtaaca aatctctgtg gcaaccgctc 9720

cagattcaga ttgttgacaa gatgggtgat gtgctggtca atggtgtaaa cggcgctatc 9780

ttgcagcaac ctgcaattca gcgtggtgta tccttcacgt ctaacgtgtg ggctatcttt 9840

gtagaacgcc tccagattaa gactggctct tatccggaaa ttggcgttta attggagtaa 9900

gtatggcttg tgaattgctt caacgtgaat tcacaaactc caaaggcgaa acggtgctag 9960

tcgttgttcg acaattgtcg gcttcggctg cactgtctct tcacgcggag ttggtaagca 10020

agctaggctc acgagtattt ccattcatcg aaggcaaata taacttcgct gatattattt 10080

acttgatgca gcaagtggag cataccgtat tcacagaact gtttaagcgt gttatcagca 10140

tgcactcgtc catagatgga caagaaatca aacctgcatt gtatgatatg cagttcaatg 10200

gcgaattgat gttgtcttgc catgtctttg ctttcgtgct cgaagcaaac ttccttgatt 10260

ttttcaagca agggctcgaa atcaacgaac agagacgatt ggaggcggag gaagcatcca 10320

agctggcaga gcagaagaat tcgagtccgg agacagttta gtatccctgt tccccgacat 10380

aaaatatttt ctgcatcgtc ctataatcga agacagttct ctctgcaagt tacatgaatt 10440

gcaagatgga acctattcga ttatggactt attgctattc catgacattc tcgatttgcg 10500

taagaaactc gaaccagtag atgaagacaa tggctaatca aaaagattta atgaagttga 10560

gcgttaatga attaattgca ttaggctctc aaagcggtct gactttccac gctggtatga 10620

agaagtcgca catggttcaa caacttagtg cgagcgctgc ttcgggatgg ctggatacaa 10680

atgcagaatt aatgggtggg tcgtttgaag atgacagttt aattactgaa tctctgggcg 10740

actcttccat gatttcagac gctgcccaca ttgcacaagt gctttcaagt gcaggctaca 10800

cagaagcatt tcatgcagca atgaatggcc catcacacca tgtagaagct gttcacgcat 10860

acatggaaag gcttggtgtc aacacagacg atgtgtggat gcacatgcca aagccaaatc 10920

cgaacttacc gcaaggtagt ttcaatatgc ttaatgccta catgcgagat actttgcaag 10980

ggcatcaaga tattatgcca gaaatcccag gccactatgc tggtgatatt atggctgagt 11040

actccaccaa ccgtggagat attgccaaat ctatgggcta tcttgctcat atgtatgttg 11100

accgtcaaca atatgacgac ccagaccgct atgcacgaga tgtttatcgt gtagccaaac 11160

gtttagaatc agaattgccg caaaacttcc gtgaagttgc tgctgtatct gcaatgaatg 11220

taggtaataa gtcggggcca agagtttcat acatggattc tcttcctcaa cttggttccg 11280

aatctattgt tggtgatatt caacatcctc gccaaccact taacgcatct ggcctgcctt 11340

taggctctat gggttctgcc attaaagctg aatattcttt atctgcatca ttatctggct 11400

ccccaggttg gtctgatgca agtaaatctt tatatcaaga tgtatctggc gtagttaaat 11460

ctgctgctaa ggtatatgct ggtggttcag agcgagggat gaacgcatat cgcactcaat 11520

cttctgaccg agatttgatt cttgattctg catctcgtta tacagacctt gcagatgctc 11580

gttctggtta tgacaaccta aagaaagata ttggtgatga ccctcgttac tctggtgcat 11640

ctattcgtgg cgtactggaa aatgctcacc aatataatga agctgaaatc agtaagactt 11700

tcgaccctgc tgaacgttta agaaatactg gacctactga acttagtaca tccagtgagt 11760

ttacggcaaa tctagatgaa ccgacaagtt ggaactctgc aagggataga agagagtcta 11820

ttgctattgc aaatctcgat agtgctagcg ttagacagcc tagttcggtt aagtaccacg 11880

atgcgctcga acaaggtacg caggaatggc ttgattttcg taagcagtat gatattactg 11940

gctctactat tggtgattat ttgggccaca accccgcaac caataatagc ccaatacata 12000

caatgggcga aaagattggc ctcacagtaa gaaaggattc accacgagcg cgtgagaact 12060

ttgagcgtgg acatagatta gaggcgtggg ccagacccag ggtaggtgaa cgatatgggg 12120

ttgaaataac tgaaactggt gcaatcacaa acgacgacta tcctggcatg atgtactcgc 12180

ctgatgggtt aattggtgat gatgctttgt gggaacataa agctccaaat aactttaaag 12240

atttggaaac aaccccaaac tacatggacc agatgcaact tggtatgcat ttgagtggtc 12300

gtagtcgcac actgtttacc caaactgttg gcgaggaatc cagaagtcag tgggttgaag 12360

ccgacccaac gtggtttgaa cgtaacaaga acaagatttt atcctctcaa gcacgtatga 12420

atgctggccg cgagtttatg gaaagctcca accttgaggg caaagacctt gttaatgaaa 12480

cccgcaaagt catgtccggt gatgggattt ggggctatca gactcgtgac catagggaag 12540

gtgagggata cactgctggc aagcgaggga tggctaaata tagtgctgct gctggcactg 12600

ccgatgaccc gtttattggc tcccattctt cctacagtcc agaggcatcc acctctagtt 12660

accaaccaaa ctctgctaca cacgagcaaa attctccgtc tcctgcagga agtggagata 12720

ctggaaatga ctcgatggca ttgtctgtta agaaaggtat ccttgctgct caggaagaga 12780

ataagcaaaa gggtatcagt gcagatgcag actttgatgg caaagctgac tcaatgggtt 12840

ggaatcagga acgattcgat gctgccaatg gtggtggaag tggtggtggc ggtggtcgtg 12900

gcggtcactt cacaagtggt ggtaactact tcgatgacta tggtcgtatg ggtggttcct 12960

tagctgctgg cattgctggt ggtagtattg gttcggcatc caacggagtt atgcaagcat 13020

tgatggcaac tcctgccgga cgtatggctg ctgtaggcat tggtgctatt cagattggca 13080

atgaagctgc tgaatacatg aatgacttta tcggcaactc gcttgatgct ggtgttatga 13140

atcctaatga atactcttcc atgtcgcaag gcttggagat gttaggactc aactcacaac 13200

aagcggcacg tctgaatcaa accacacata gtgcctacaa caccatgctt aacggcgacc 13260

ccagcgccgc tgtgaacatc gttcgcggca gtaggggatt gctcaccata ggtgatattc 13320

gtgcgacagg cggcgaccct gtggccctag ctcgcatcat gcaggaaagg ggcaaggagc 13380

gtggctggag tcaggcccgt atcgcaggtg ctgccgaaat ggctggcctg aatgggatgg 13440

cgcgagccta cgaccgcacg gaatacagcc atgagcgagc aggttcggtg gtagaagcgg 13500

gtagaaactc tgactttgcc gaaggtatgg ctcagtcaga aatgttgcag gtggagcgcg 13560

cacagctcct gccagggcat aacgtgccac aaagtgtgtt atctcacggt gctgcactgt 13620

tcgaagctgg aagcactgct gctggtgctg ccaactctgg ttacagccaa gctcgccaag 13680

ttgctgcaaa tgtgtatgac ttcatagcca aggaagaatc tggtgggagg gaatacaaca 13740

aggatggcac acgagttaca agcccaactg gtgctcgtgg aatcatgcag gttcttcctt 13800

ccactgctcg tgacccaggt tatggaatca aaccttctga tggaagtcct gaagaagatg 13860

ctcgtgttgg tcgtgaattg tacgatgcaa tgtacaagcg ttatggtggc gaccacgaga 13920

aagcaatggc tgcttacacg gatggaccca gaactgttga caaggctgtc gataagtttg 13980

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tgaacaacgg tgcgcaacaa agaagataag gagttgggga gaaatcccca gctttccttt 14280

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ttgaagtaat agtttcacgt aaagaagacc caagtattcg gacggtattt aaatcacatc 14400

gtattgattt tgaagtccgt tctactgttg ggtggcccgc cgatacagca aacataactc 14460

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tgcctcgcat tgaacgcgag aaagttcagg tagtcacttc ctagaacagt ggccgggaac 41460

agacctagac aaaagtgctt gagaacgtta gctctgtctt gccagcatta atggcacgtt 41520

ggccgcgtaa aggccacagc gtctgaccaa cgtatcggtc aaccaaattc aatggattcg 41580

tagagttaat taaacctgca cgacgggata gggatgaagc atccgaggcc gactgtgtaa 41640

ttgctggctt actataaacc agccgaatcc gccaaatcaa tgggctagtg caaatgtcag 41700

tcactagaag atgtgttgca aaacgtcttc catgatgtgc aaagtgtcag tcacgtgccc 41760

accactttcc taacagttat gcctctgttc aaaaggctca agttagcgtc tggcataccg 41820

tagcgatacg gcttagttgc gctgattgtg ttgtgcagaa agaaagttca ggcttttatt 41880

tgggttactc ctcatcccga agttagctgg attcagaatc caggctatgt tcctatacac 41940

atgaaatatg caagtcgagg gttcttaatg ttcaaacatg atgcgagcat taagcgggtt 42000

tatacttttc cccgatggtc cccataaaca aggctgattc acttgggcgg ttcgaatcaa 42060

atttaataag tgttttgtaa cagttcacgt caggacactt acttaaattt taactggaga 42120

gaaacatgaa aactgctgaa attgccgaag agatttataa ggccgtaata gccaaccaaa 42180

ttaccagtga agtcctgcac atggatattg aagaagttcg caatgccttt ggcggttttg 42240

caatcttgtc aatagaggct gcggaagcac tgacaagcac gtacaatcaa cgcgagtatg 42300

aaaagcgttc tgtactaaat gcgtcgctga aagaaattca ggcgtcgtta aaataatacc 42360

attgttatgg tgcggagcta attaatctcc caccatatga accggagagc aaatgattac 42420

tgcaacactc gttgaccaca tgggcagcga cctcacaact gttaatgctg cacgagtttc 42480

ttatggtgca gagtcgcatg aaatgtctct gcgagatgag aagctgattg agtttcttgc 42540

aaagcataag cacattacgc cgttccgtca cgcacaggta acactgcgct gcaaagctcc 42600

aatcttcatt gcacgtcagc ttggcaaaca tcaaactggc tttagttgga atgaggttag 42660

ccgtcgttac aaagatggtg aagcaattga ggtcgaattc ttcattccag atactgtgtt 42720

tggtcgtcct gaaaagttga tgactcagac tgcgcagccg ttgccacaag attttgccga 42780

tgacattcaa tatcgtatgg aaagccataa caaggcttgc atcgtagaat atgaaatgtt 42840

aattggtttg gggattgctc cagagcaagc tcgcatggtt ctgccacaat ccatgatgac 42900

tgagtgggtt tggactggct ctctttatgg ctgggcatcc atgtacaatc aacgttcctc 42960

cgaacatgcg caatatgaag ttcgcttgtt tgcggaagaa gtgaataaaa ttatgtcaga 43020

actgtttccg atttgctgga aggctttgac caatcaggaa taatataaat gaacgtcaag 43080

caatgtgttg ccaagattaa gcacgatgta ccagactgta aatccacatc tggcaagtct 43140

ttacaggttt ggttgaatgt cgatgaagct ggtaataaga acttctctgg ttactgcttt 43200

gcatgtggcg ttctcgttcc gaatccgtat ggcaataatc cggagaatat tccggaaatt 43260

aaagtcaaga ctccagaaga aattcaggaa gaaattgacg aagtaacctc gtgccctcca 43320

tttgatttag accatcgcag tattgaacca gagttctgga aagctgctgg tgttcgccta 43380

ctctactcag agtttgatgg taagactcca aatgctttgg cgcatggata taccaagaat 43440

ggcaaacttg ttcgctggaa gattaaactt ctgaacaaga aagttatgtg gtcggttggt 43500

gacacccagg gtaacgaccc ttacaactgg atggctgcaa aagcaattgg cggtaagaca 43560

ctgttcatta cagaaggtga agaagactgt atcgcattgc gtcaaatctt gaaaactatg 43620

aaccgtggtg gtgcatatga agatttggat tttgctgtaa ttagtttgag tgacgggagt 43680

gattccgtac acaaatgttt gtcaccagtt gcagaagaaa ttaagcaacg ttgggagcag 43740

gttgttatcg tatttgacga cgatgaacct gggcgtaaag ctgcaaaaga agcgtgtcga 43800

ttgttgcctg gtgcaatgat tgcaactctt ccagctaatg atgccaacga ttgtctgaag 43860

cgtggcttgc tcaaagctac tcagtctgct gttgtattcc gtgctgctcg tcctcttcct 43920

acagcactcg tcaataaaga acttctcatg gaagagcttg atgacgaagt tgaacagggt 43980

gtggactatc cttggcccaa gttaacagac ttaatgtttg gtcaacgacg tgccgaagtt 44040

atctcaattg gtggtgcaga aggtggtggt aaaactacac tgtcacgaca gattgtgcat 44100

cacaacattg ttcagcatga ttggggagtg tttactgcat acatggagga aactcctaca 44160

gaaacactgc gccgaatggc tggccttaat gacaacttgc catattggga acctgcgttt 44220

actcgcgaag accctcgata tgatgaagct aagttccgtc aaactgctgc gaagatgctt 44280

cgtaacatgg agatttggga ccgcaagcaa gctggagaag acccttatga aacttgggat 44340

gggttaaaga caattcttcg tcagattggt ccagacattg atatgtttgt tcttgataac 44400

ttaacctact tatcggaagg gatttctgcc tcagagaaga acgacttctt aggcaagctg 44460

tatgcagaca ttactaagct agcagaccaa taccagttcc atgtcaatat cctgtcacac 44520

cttaaccccg tggcaaaagg tcagcgacct catgaagatg gtggacgtat caagaagtca 44580

gactttactg gctctcgtgc tgctgctaaa tattctcatg gcatgtttgg ctttgaacgt 44640

aatagtcagg cagttgaccc aaactgttct atcattcgtt ccattaaggc tcgtaagagt 44700

ggtaaaacag aaggctttaa gacttactac gacaccgaat ctggtcgaat cattcaacgt 44760

tcttgggaag attcactgtt cgaaactaaa gagattgttc aacttactaa gaagaacggt 44820

ccacatcaat aacagagctg ctgcgctgca tggttcgccc accagcgcag tcctccttaa 44880

tatggattaa gtaatgtccg atgaacaaaa gatttctctg tggcgaagta tgttttccta 44940

cacagaggat ggtaaacttt ataggaagat ggagtccggc aagttgaaac ttgttggtag 45000

cccttgtgga cgagataggc tctatttgaa tgtgcgtgtc gggaagtcct tcgaatacgt 45060

gcaccggatt atctttggga tgcactatgg attcttgcct aagcaagttg accacaaggt 45120

tggatttgac aactccccaa gcaaccttcg tgccgcaaac aaccaacaaa ataattgtaa 45180

cgtcgttagg aaacttggcg ctgtaccatt cagaggtgtg tccaggttga agaatggaac 45240

gtatacagca aaaataagaa atggaaactc aagaatatat attgggacgt ttcgcactgc 45300

cagacaagct gcaatggcgt acaatgaatt tgcaataaaa ctccacggag agtttgcgat 45360

aatcaatagg aacatatgat gctctatcct tggaaagata tgtatgccag tgacattgaa 45420

acaactggtt tgttggagca gatgaggaaa caggctgcac cacgtcttca caacattgga 45480

tacattgatg ttcaaactcg tgaagaaact gtgattgagt ggacgcaacg aaaatccatt 45540

caagactttc tggacacagg tccaacacta atcatgcaca acggcgcaac ctttgacttt 45600

gaagcattga agttccttgg ttatgacgtt tcaaaatgta ctctgattga tacactattt 45660

atcagttggt atctccaacc tcgtcgtgtt aagcatggac ttgaaggtta tggtgaagag 45720

tttggtgtgc ctaaaccagt cattgacgat tgggaaaatc aaactcagga agaatataac 45780

catcgtgtga tggaagactg taagattcag ttaaagctgt gggaacagca atatattcaa 45840

ctcctcaaaa tttataaatc tcctagcgaa gttaaacgct tcattgaata cttgatgacg 45900

aaagctcgcc aacaggttat tcagcaacgt actcgttgga agttgaacat tgagaaggca 45960

ttggcattta aggccaagct ggaaccaatg attaaagaga agaccgacgc attggaagca 46020

tcaatgccgc gtattcctga agttgtaatt aagactcgtc cagccaaatg ccacaagatg 46080

aatggacagt tgtctgctgc tggcttgaag tggaaagcta tttgcgatgc gaatggcctg 46140

gactggaaag acccagagat aggcatcaaa attatcaagg gctacaaaga accgaacgct 46200

ggttctcacg tacagattaa ggattggttg ttcagcttag gctgggtgcc agaaacattt 46260

aagtttgacc gcaataagga aacaggtgaa actcgccaga ttcctcaaat cactgtgaag 46320

gatgaagatg gcaatcctga aatatgtcca agcctccata agttggcaga aagaaacccc 46380

gaatctggca ttcaacatct tattgggatg ggcgtgtata aacaccgtct gtctgttgtt 46440

aacggttttc ttcgcgacgt cgatgaagac ggatacctta ctgcacgatg tggtggcctt 46500

accaatactt tacgccttaa acatcgcgaa cttgttaacc tcccttctat tcgtgtattt 46560

ggcggtgaag aactgcgttc aatgctggaa gcgtggcgtg aagactacga acagttaggt 46620

tctgacttgt gttccttgga agaccgttgt aaacaccact tccaatggat gtatgaccct 46680

gaatatgtta agaagcagtt ggcaccagac tatgatgctc accttgcaat cggcgtaatc 46740

ggtggattta ttaccgaaca agaatctcag gaccacaagg acggaattaa gaagtgtaaa 46800

caacgtccaa tgtttaagac cacgaactat gcgtaaattg atgcgcatgt aaaatccctt 46860

taattcggtg gaactctctg ccgcagagac aataccgagc gaagcatgaa aagaaattac 46920

caacctgctt tcatgaacgt gtaacgacta gccgtaaggc gtacacccaa gtgggtggaa 46980

acgggggacc cgacataggt cggtgatgat atagtctgct ctgcatggtg acatgcagct 47040

ggattcgttc cggcatgaaa ttaacgactt cgtgtgaaca atgtaaatgg tcaatatggt 47100

gctggtattc ctactgtagc tcgttctgct agctgtgacc agactactgc tgcacgactg 47160

cataaagcat attgggactt gaactggtct attaaagaga ttgctgctaa cactaaagtt 47220

atcacagttg atggtcagat gtggcagcag aatccagtaa acaaattctg gtattcattg 47280

cgtacagaga aagaccgctt ctccacattg tgtcagggca ctggtgcata tgtgtttgat 47340

atttggtgta acaacattat tgcaatttgc aacgaacgtt ggggctgcga cccgcttctg 47400

tctggacaat tccacgatga attgattctc caggttaaga aaggcttccg tgatttgtgg 47460

acggacttgc ttaatgaagc aatggaccga accaacaaag aacttaaact caatcgtgat 47520

tgtgcatgtg atgtacaatt tggcgataac tacgcagaga ttcactaatg gttgttgtat 47580

ctatattcga caaagtggac catttccatt ttgtcaagaa aggcgaagac gcacgggaag 47640

ctgtgctgtc tgtaattacc gagaatgctg aaacattatt tggaagtgat tatgatacca 47700

atccaatgta tcaggcattc gttaaaactt tatctagtcc tgccgtcaat gagcaagagt 47760

taatctcttg tatgaacgac ctggacttct ccctagttat cactcaactg taatttaaag 47820

gtactcaaaa tggcatttgc tgctcctacc ctggcctcga acaagactcc ttctgctgca 47880

ccattactgg aagcgggtgg ttatcctgct cgtgtttgcc gtattatcga cctgggctta 47940

cagcctggtt ctgctaaata tcctaccccg tctctgaaac ttctggttac tttcgaattg 48000

ctcgacgagt acatgaaaga agttgacagt gaaggtaaaa tggtcatggt tcaagaccca 48060

gacgaagatg acggcatcat gatggcgaag aatcttgaag acaagccgcg ttggtttgac 48120

tttgagttta cctataatgc tgacggcttc atgggcgaga actcccacat ctacaaattc 48180

gctaaagcga ttgatgcact ggaagttaaa cctaacctgg aacaaggtat tcagggccat 48240

cctgccaaga acctgccaga ttggttgggc gaacctctga ttgttggcat tgttcagtat 48300

accaagcagt ccggtaagaa tgctggccag gttgcaaaca aagttgctac cttctctccg 48360

atgaaatcca aagagaagaa agaagctaaa gcactggtta acccgactgt cttcttcgac 48420

atgtccgagc cggacctgga agtattcaac aagctgcctg gtggcgaatc tccgtatgca 48480

atcaagaacc gcattacttc cggtgttgat ttctacaaga ctaagctgtc tgctctgtta 48540

ggtggcaaac ctgccgatga tggtgctgta ccgaatcagg cttctgatga agaagttgat 48600

gcagccatga aagctgaact ggaagcacaa gctgctgcga aagcacagcg tgaagctgaa 48660

ggtggtgcaa gcacgactgc catgccgttc taactataaa tatggctcct tcgggagcct 48720

ttaattttgg agcttaccaa agtgagtaag aaacgagtat tgttgctggt cgattttgat 48780

atggtggcat ttagccattg tgcggcagaa gaatttggga aagagccaga agatataaat 48840

ttctcgaaga ttcaaatgtc aatggactct aagatggagt tcttgtctaa gcgttctggc 48900

gcaactcatg tcatgggttt cgtatctcct tctaagacaa tgcgaaacgt gtttgccgaa 48960

aattataaag gcaaccgcga taacgtatgg cgtccagaga acttaaagaa tgccaaggcc 49020

cacttgcttg ttgcatggaa tgggtattgg atgaaaggtc tggaagcaga tgacctcctt 49080

gctgtattcg cacgtcatga atatgacatg acaatgggta aacgtaatga gattaagagc 49140

ctcactcgta ttggtccgtg cacatatgat gaagtctgga ttgcatcgtt ggacaaagac 49200

ttgcgccaaa tcgggcagaa cggtggtgtt ggtccggtaa tcaaacacta ccaatgggaa 49260

cgtgaaaccc agggcattgg tgagaaaatt ataatcccta aagattatgg tgaactcaaa 49320

ctaatcatca aggacaatgg caaaacgaag aagaaagaag ttaaaggcaa tggccctaaa 49380

ttcttcttgc atcaattgct tattggcgac tcaacagata acgttatggg ttgcggagtt 49440

cttgaagaaa agatttacaa aactggtgcc aaagccggag aaacttattt ccgtcgtgat 49500

ggcgttggtg cagttgcttc attcgagatg ctggatggta caacctccta tgcagaaggt 49560

ttgaagaaag ttattggtgc atatattatg cgcttcggag atggttggga acaggagctg 49620

ctcaaagtgg cccgccttgt ctatatgcac catcaaattg aaaagggtaa ttgtgttcgc 49680

ttgtggcatt acaagaacat taacgaatac tttgacctta aagagaatcg tatcctcact 49740

caagaagagt acctccagaa ataattggag ttggaatggc ttacggttat tgtggaacgg 49800

aagccaagtt tgtatcttgg ctccaatctg ctattcgaag tgtttggtct aaacacccaa 49860

gcaaacttgc gctaatacaa tctcgacgca ttgcattgaa ggtcggtggc tcaaagaaac 49920

caatcttcca cattcaatgc taccattgca agaagttgta taagctcaaa gagattgaag 49980

taaaccacaa agttcaagtt ggtggcctcc ttaagttgga ggatttacac cgctttgtgg 50040

acaacctact attggttcag ccagaagatt tggaattgct gtgtaaagat tgtcacagca 50100

ttattacata catggaacga tatggtgtgt cacgtcgtga tgcagtcatt gagaagaagt 50160

gtattgcatt tgccaaacta actgacgaag agcaaattgc caagtgcaat cttgccaaaa 50220

tagagccagt tcctaaaacc aaaatcggac gcaagaacgc tgttcgagaa tacctgagaa 50280

agaatcttaa tgtctattaa gctcctcgct gatggtacaa gatatacaaa ggctcacgca 50340

catgattggg aagacccaaa ctgtcttatt cgtggtcgat gcgaattgta catcaaaatt 50400

gacggcatac gagcgattcg taatgcttct ggtgaggtat ggagccgcaa ctctaaacct 50460

ctccctcact gcgaccatct caaatttaaa gatgcagaaa tctttcgcgg ttcctggaac 50520

gagacttcat ctatccttgg gcgtatcgac cctccgacca taccgttatc gcaagaaaac 50580

gtttatgagt tgagtgatgg tgctgttgac ccacgcctgt acatcggctg gtgcaaggac 50640

ccaagcaatg aaaaccttaa ggcattgatg gataaatatc tggcgcttgg tcatgaaggt 50700

attattgtcc gtgatgcaaa aggtaaatgg tggaaggtcg ttccgtattt gtatgccgac 50760

gttcgtgtaa caggtatgaa agaaggcact ggtgcactca aaggtatgtg cggctccatc 50820

tctacagcat acggctctgc tggctctatg gtgaaagatt gtctttcctc tgtcggtgtt 50880

ccagaagata acatagcaat acgccgttgg ttgtggagcc acaaggatac actaattggc 50940

tcgattattc aagtccggta tcgtgaaaag acagaggctg ggaagtttag attcccatca 51000

ctggtgagac tgcgtaccga caaaaatgaa gagagcctcg attgattacc caagaaagat 51060

taaaacaact ttaccactac aacgagttgt caggtctgtt cacacacttg gttacaggaa 51120

aggttgcagg atgttacaac aaggtatacg ccactatagg catagactat gggacgtatt 51180

cagtgcacca actggccttc ctgtacatga cgggaaaaat tccaaagtgc atagaccata 51240

tagacagaga taaacataac aatgcttggc acaatctccg tgaagctact ttctcagaga 51300

acctgcataa tgtaggaacc acaagtagga actcaaccgg agttaaggga gtttcttttg 51360

attctaagag acgcaagtat tgtgcacaaa tctgtgtaaa tggttccaga aaatttcttg 51420

gcagattcag ttccttacaa gatgctgaaa atgccctact ggagtataga catgactaat 51480

ctcgctgtaa ttctaaatgg cccacctggt tgcgggaaag acactatagc caacttaatt 51540

gtagaacggt gcaactccct caatccagtc atcaaacatc aatttaagga tgcactgtat 51600

gagcacactg ctaaacatta tcaagttgac ttggataagt ttatccattt cgccagtgac 51660

cgcgagctta aagactccgt gtcgttggct gggctgcacg ggaaaacccc gcgtcaggca 51720

ctcattcatg ttagcgaaga catatgtaag cctcgctacg gtaatggtta ctttggctcg 51780

gttgaagcta atcgtatccg cgaacttaag gggcgtgtac gtggccctat taatgtcatt 51840

tatcccgatg gtggcttcgg agatgaagtt ctcgcaattg agtctgagtt tgattgtgta 51900

cttattgtgc gccttcatcg cgatggctat gatttcgcgg gcgattctcg taattacctc 51960

aacctgccaa acactaaaac acgttggtca gttgacgaac accttttaaa taataaaatc 52020

tttgatggtg tctggaaagt tgaaaactgg atggaccgaa tcaaatggag catcgaaaaa 52080

tgagttgcat cacccaagtt gttgctgtaa agcgagtgca tcctaatgcg aaattacctg 52140

tgtacgctac tgctggcgct gctgctgctg acgtttgcac tatctccgat agcactgttg 52200

ttatcaatcc cggctgctct gctgttttcg atactggcct ccagttcgaa gtaccagttg 52260

gatacgaact caaagtacat agccgttctg gtcacggctt taagtctggt attcgcctgg 52320

caaactgcac aggaattctg gactccgatt atcgtggcaa tcttatggtt aagctgcaca 52380

atgactcgga cacagccttt gtggttcagc caggtgaacg tatttgtcag gtgcaagtta 52440

gtaaagctac tcaacaccat ttcgttgaag ctgtagaact taataccaca gagcgtggaa 52500

cttcgggttt cggttctaca ggcagagttt agtagattgt ggagaaacca ctctaactta 52560

ttggaaccta attgaaatga aactgtcctc tcctgttgta gtaaataatc gcaaagttaa 52620

atttgcatac ctcaagtcta atgtcacctc tactggtggc gggacttatc tcacccgtgc 52680

acttgcagtt cgcaacgaaa caggtgcgga tgttatcgtt ttcatgcttc ctcgtggtga 52740

gaacacaatc aagaacgtcg aacgtatcaa gcgtgggcgc gaagatttaa tgtcggctgt 52800

taagccgctg atactgccat ttaagattgt ggtggttgtt ggttctaccc aagcatatct 52860

ggaagatttc tataaagata tggcctggag cgatattaaa tattaagcga cacgcgtaat 52920

tagggaggct atctggcctc ctatcttatt cggagtcgct tatgcgcaca atacaatgtc 52980

ccaactgcca ttatgaaatt gcagaagatg atttcataac gcagcaatgt cctatctgtg 53040

attcatacat gccactaaac cgcctgtatt taaaggccga ttctggttta ggcagcatca 53100

ttcgcatcaa tcccgtgcaa actcagccat tagtggattg tgattaaaaa caaagagaac 53160

gaatcaatgt caaaaactga agatttgggc ccagagttta acgatgcagt tgccagctat 53220

ctcgttaaga actacgggga cgtactcaaa gtttccagag aaagattctg tattctgtct 53280

ttgccattgc tccgtcgata tatttcagaa aatactgcaa tagttgacag ctatgaagaa 53340

caaattcaag cagagttaga aggccagggt cttgaaaacg atgctgtact gcgttcagtt 53400

ttcagagcac aacttgagcg tcttcgctct ggcgacaaga aagactcgac tgcctatgca 53460

gatgagttga agaaaggtat tcaagcaggt gttactgacc gtgttgcagg ttccactttg 53520

gaggagccta actcggagta cgataacacc gatgaacttg tagacaagat tctgcatgac 53580

ccacataacg tggacccaac tgtaatccct gccaaggttg cagaacgtgt tcgcaaaatc 53640

ttgatgaaaa gtttcgaagc ctttggtaaa tggcagttcc atatccaaat gggatttcca 53700

tttcaagcac aagactttca cgatgtaata ttcagtgttg gccagaaggt tgttgatggt 53760

gagattgacc gcttaatagt gaccattcct ccacgacact ctaagactca gctcatgagt 53820

attgcattgc ccttgtattc attttgccac aatgaatcaa gccataacat tatcacctcg 53880

tatgcagaag acgttgttct tgaatcgagt ggttacatcc gtgctgtaat gatggaccca 53940

ctattccaac gcatattccc gaaggtgaga atagacccga acaaacgttc tcttgagcgt 54000

tggggtacga ccaaagctgg tgtaatgcac gctgttccta ctggtggtaa gctaactggt 54060

aaaggtgctg gactactggt tgcaaactat tccggctgct ttgtggtcga tgacgtaatc 54120

aagcctaaag atgcctactc cgacacagtt cgagcagaaa tcaacgaccg gtcttgcgaa 54180

tgatggttgc ataaccgact 54200

Claims (8)

1.一种保藏号为KCTC 13130BP的肌病毒科噬菌体Esc-COP-7，其特征在于：

携带具有特异性杀灭大肠杆菌的能力，并具有如SEQ ID NO：1的核苷酸序列所示的基因组。

2.一种用于防止致病性大肠杆菌感染及治疗致病性大肠杆菌感染的组合物，其特征在于：

该组合物包含根据权利要求1所述的噬菌体Esc-COP-7作为有效成分。

3.一种饲料添加剂，其包含权利要求2所述的组合物。

4.一种用于非人类动物的饮用水添加剂，其包含权利要求2所述的组合物。

5.一种消毒剂，其包含权利要求2所述的组合物。

6.根据权利要求1所述的噬菌体Esc-COP-7在制备用于预防和治疗致病性大肠杆菌感染的药物中的用途。

7.根据权利要求2所述的组合物在制备用于预防和治疗致病性大肠杆菌感染的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述组合物以饲料添加剂、非人类动物的饮用水添加剂或消毒剂的形式给药到受试者。

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