KR101915480B1 - 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-6 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 - Google Patents
신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-6 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해서 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
비브리오 속(Genus)에 속하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 균은 주모성 편모가 있는 통성혐기성균으로 그람 음성 간균이며, 전 세계적으로 기수지역이나 연안의 해수 및 수산물 등에서 널리 검출되는 해양 상재균으로, 수산물 섭취와 관련된 세균성 식중독의 주요 원인균으로 알려져 있다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 대부분은 비병원성이며, 용혈현상을 보이는 것만이 병원성이 있다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균은 혈청학적으로 75종의 협막항원(Capsular, K)과 13종의 균체항원(Somatic, O)으로 분류되어져 있으며, 편모항원(Flagella, H)은 모든 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 공통적으로 존재한다. 따라서 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 혈청형은 K 항원형과 O 항원형의 종류에 의해서 구분된다.
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균은 다양한 어류 및 패류 등에서 비브리오병(Vibriosis)을 유발하여 수산 양식산업에 있어 심각한 경제적 피해를 초래하고 있다. 특히 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염에 의한 어류의 비브리오병은 그 발병 빈도가 높기 때문에 경제적 피해 초래가 크다. 따라서 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염을 예방하고 나아가 감염 처치에까지 활용될 수 있는 방안의 개발이 절실한 실정이다.
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방이나 치료 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 이들 항생제들에 대한 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다.
최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성으로 인하여 박테리오파지는 대상으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 세균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
세균을 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 세균 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 발생 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-세균제로 주목을 받고 있다.
앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 박테리오파지의 세균에 대한 높은 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.
이에, 본 발명자들은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고, 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 서열 정보를 확보한 후에 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음에 이 조성물이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP)을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP)을 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP)을 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용되는 약욕제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
박테리오파지 Vib-PAP-6은 본 발명자들에 의해 분리된 후에 2017년 4월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 13246BP).
또한, 본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Vib-PAP-6을 유효성분으로 포함하는 약욕제 및 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Vib-PAP-6은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 효과적으로 사멸시키므로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”라는 용어는 (ⅰ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지; 및 (ⅱ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅱ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 본 발명의 박테리오파지를 특정 지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 본 발명의 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Vib-PAP-6이 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Vib-PAP-6은 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1× 1030 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 약욕제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다. 이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-6을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 기존의 항생제 등에 기반을 둔 방식에 비하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래시켜 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[비브리오 파라헤몰리티쿠스 균종에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.
도 1은 박테리오파지 Vib-PAP-6의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Vib-PAP-6의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 Vib-PAP-6의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
도 2는 박테리오파지 Vib-PAP-6의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 Vib-PAP-6의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 비브리오
파라헤몰리티쿠스
균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주들은 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균으로 동정(Identification)된 것들이다.
박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 LB(Luria-Bertani) 배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화 나트륨, 10 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 3-4시간 동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에는 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복 실시하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.
상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. LB 배지에 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액 3 ㎖(OD600이 1.5)을 LA(Luria-Bertani Agar) 평판배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화 나트륨, 10 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액에 첨가해 주어 4-5시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 37℃에서 4-5시간 동안 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후에 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때, 신규 확보된 박테리오파지는 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.
이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음에 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.
상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Vib-PAP-6으로 명명한 뒤, 2017년 4월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13246BP).
실시예
2: 박테리오파지
Vib
-
PAP
-6의 유전체 분리 및 유전체 서열 분석
박테리오파지 Vib-PAP-6의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/㎖) 100 μl를 첨가한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음에 이를 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Vib-PAP-6의 유전체를 다량 확보하였다.
이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 마크로젠에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행한 다음 박테리오파지 Vib-PAP-6의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Vib-PAP-6 유전체는 58,632 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 Vib-PAP-6의 유전체 서열 정보를 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 50% 이상의 상동성을 가진 박테리오파지 서열은 확인할 수 없었다.
이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 Vib-PAP-6은 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 Vib-PAP-6은 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단할 수 있었다.
실시예
3: 박테리오파지
Vib
-
PAP
-6의 비브리오
파라헤몰리티쿠스
균에 대한
사멸능
조사
분리된 박테리오파지 Vib-PAP-6의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주들은 균주은행을 통하여 분양을 받거나 본 발명자들에 의해 분리되어 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균으로 동정된 것들로 총 25주였다. 박테리오파지 Vib-PAP-6은 실험에 대상이 된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 25주 중에 ATCC33844 균주를 포함하여 총 23주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Vib-PAP-6의 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 및 에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Vib-PAP-6은 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.
이상의 결과로 박테리오파지 Vib-PAP-6은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 우수한 사멸능을 가지며, 다수의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주들에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Vib-PAP-6이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.
실시예
4: 박테리오파지
Vib
-
PAP
-6의 비브리오
파라헤몰리티쿠스
균 감염 예방에 대한
실험예
9 ㎖의 LB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Vib-PAP-6 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 LB 배지를 담은 튜브에는 동량의 LB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액을 넣어 주었다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Vib-PAP-6 액을 첨가해 준 튜브에서는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.
| 구분 | OD600 흡광도 값 | ||
| 배양 0분 | 배양후 60분 | 배양후 120분 | |
| 박테리오파지 액 미첨가 | 0.49 | 1.12 | 1.61 |
| 박테리오파지 액 첨가 | 0.49 | 0.26 | 0.17 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-6이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Vib-PAP-6이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예
5: 박테리오파지
Vib
-
PAP
-6을 이용한 비브리오
파라헤몰리티쿠스
균에 의해 유발되는
질환에 대한 예방 동물시험
농어 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm) 60마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 시험 전기간 동안에 걸쳐 실험군(박테리오파지 투여군)의 농어들에게는 1× 108 pfu/g의 박테리오파지 Vib-PAP-6을 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험개시일로부터 7일째가 되는 날부터 2일간 1× 108 cfu/g 수준으로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 급이하는 사료에 포함시켜 하루 2회씩 급이하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염을 유도하였다. 시험 개시일로부터 9일째가 되는 날(비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염 유도 후 2일째)부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 비브리오병 발생 상태를 조사하였다. 비브리오병 발생 상태 조사는 체색 흑화지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 체색 흑화지수 측정은 통상 사용되는 Dark Coloration(DC) score(정상: 0, 연한 흑화: 1, 진한 흑화: 2)를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 2와 같았다.
| DC score(mean) | ||||||
| 날짜 | D9 | D10 | D11 | D12 | D13 | D14 |
| 대조군(박테리오파지 미투여) | 0.76 | 0.80 | 0.88 | 0.88 | 1.00 | 1.08 |
| 실험군(박테리오파지 투여) | 0.28 | 0.12 | 0.04 | 0 | 0 | 0 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-6이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
6: 박테리오파지
Vib
-
PAP
-6을 이용한 비브리오
파라헤몰리티쿠스
균에 의해 유발되는 질환에 대한
치료예
박테리오파지 Vib-PAP-6의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 효과를 조사해 보았다. 농어 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm) 60마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 108 cfu/g 수준으로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료를 하루 2회씩 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료 급이 마지막 날부터 비브리오병의 임상증상을 보이는 개체가 두 수조 모두에서 확인되었다. 3일간의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 실험군(박테리오파지 투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-6을 포함(1× 108 pfu/g)하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 강제감염 후부터 3일째가 되는 날(시험 개시 8일째)부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 비브리오병 발생 상태를 조사하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 비브리오병 발생 상태 조사는 실시예 5에서와 같이 체색 흑화지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 3과 같았다.
| DC score(mean) | |||||||
| 날짜 | D8 | D9 | D10 | D11 | D12 | D13 | D14 |
| 대조군(박테리오파지 미투여) | 0.87 | 0.97 | 1.10 | 1.17 | 1.13 | 1.30 | 1.33 |
| 실험군(박테리오파지 투여) | 1.00 | 0.90 | 0.83 | 0.73 | 0.40 | 0.17 | 0.13 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-6이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
7: 사료첨가제 및 사료의 제조
박테리오파지 Vib-PAP-6 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(50%, w/v)한 다음에 동결 건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루형태로 분쇄하였다. 상기 제조과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.
이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 250배의 양어용 생사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.
실시예
8:
약욕제의
제조
약욕제는 다음과 같이 제조하였다. 박테리오파지 Vib-PAP-6 액을 이용하여 약욕제 1 ㎖ 당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함되도록 약욕제를 제조하였다. 약욕제의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ㎖ 당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-6이 포함되도록 상기 박테리오파지 Vib-PAP-6 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 약욕제로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.
이렇게 제조된 2종의 약욕제는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 약욕제로 사용하였다.
실시예
9: 농어 사육에서의 사양 효과 확인
실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 및 약욕제를 이용하여 농어 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 1,000 마리의 농어 치어를 500 마리씩 한 그룹으로 총 2개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 약욕제로 처치한 그룹-B)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 250마리씩으로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Vib-PAP-6이 적용된 소그룹(소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 농어는 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm)였으며, 각 시험 소그룹의 농어 치어는 일정 간격을 두고 위치한 격리된 각각의 수조에서 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 4와 같이 구분되고 지칭되었다.
| 적용 | 소그룹 구분 및 표시 | |
| 박테리오파지 Vib-PAP-6 적용 |
박테리오파지가 적용되지 않음 |
|
| 사료로 급이한 그룹 | A-① | A-② |
| 약욕제로 처치한 그룹 | B-① | B-② |
사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 4의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이 하였으며, 약욕제 처치의 경우에는 실시예 8에서 설명한 약욕제 제조 방식에 따라 제조한 약욕제를 표 4의 구분에 따라 약욕제의 희석액에 어체를 담그는 방식으로 실시하는 통상적인 약욕제 처치 방식에 따라 처치하였다. 그 결과는 표 5와 같았다.
| 그룹 | 폐사개체수/시험개체수 | 폐사율(%) |
| A-① | 9/250 | 3.6 |
| A-② | 42/250 | 16.8 |
| B-① | 8/250 | 3.2 |
| B-② | 54/250 | 21.6 |
이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료의 급이와 본 발명에 따른 약욕제의 처치가 농어 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 농어의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
이상의 결과로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd.
<120> Novel Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-6 and its use
for preventing proliferation of Vibrio parahaemolyticus
<130> KP090527
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 58632
<212> DNA
<213> Bacteriophage Vib-PAP-6
<400> 1
cactatatat aaatgcagct acccaaaatg aagcacgcta aaatcgcgcg tgggccgctt 60
tagcacccta gccaatacca ttgcattgat ccgcgcacag cgccgcgcac acgcacatac 120
agcgactcgg aagcttgcga gccaagctat tcgcaatgta caccttttcg gggtgtggtc 180
gggatatcgc tgaacatcac acttctaaag aaatataatc taaaacagct aaagaaaggt 240
aatcgaagga aggacgacgg ctcgtcagtc ttctggctat agcgaaccgc cagttttttc 300
atttgccagt tttttaaatt cgagtgacca catagccaag tgctgcaacc gtcaccgacg 360
caacaactgc caaggttatg caaccccatt tcaatgtttc aatttgttct ttggcgcgtc 420
gtaacttgcc ttgtgcgact gtaacgttgt ttatttccat tgcccattgt tgttttagat 480
gttcaacatg gtctcttttg taagcgtgca gcaaatccaa aagctctggg ctaacgtaca 540
tatcaacttc tgcgccaaag taattccctt gctcaatgag ttcataagga actgtaccca 600
tgtcgtgctc tagtatttca aatcgttctg caaagcgcac gaatttgatt tgcggataga 660
caccgtattc cacagactca ttgcagggcg tttcacctct gcgtgtgggc gtttcggtga 720
tgggcgtttc gcgaacatct ttcagatatt ggttcatccc cggctctacg tctttatatt 780
caattgttgc tactttcatc attcaaatac cttttggttg tgtttgtcag acaactcgtc 840
aaactgagtc cgaaattaag gttactatat attgctatta ctacttgtta cccaaagtca 900
agccgttttt gcacaagtgg cacaactttt ttgcacacaa ctagcattaa gtccgttaaa 960
agtaatatct tgctatacca tatgaattat tcaatataaa gcttatatat atagtagtta 1020
aattaaaaga cattattatt atttatatat attttattta tttagattta actttactat 1080
tagatgctta tagtttgctt tatttaccct taaaagtagt gcgcaaatga cccacctatt 1140
cagggatatg agaaatcact agatcgcccc ccccaccgtt ttttgggtaa ctttgcgcac 1200
ttgcgctaag taactgtttt tacccccaaa aaacgggtta tccacatgta cactcactgt 1260
acaacatacc cctgaattgg taacatgttt tttattagaa gtaagttgta tcttttaact 1320
aagcgtactc aatagacctt ctagcagtac actatatata gctaagaaca gcaaactata 1380
ttcccaacag aaagtaacgc aataaacata aactctgcta tatagctata atacacactt 1440
tcagttaccc ttcaataagc tatgtcttgt agtaccagtg ctctgcacat aatatataaa 1500
gcacaaccag tatacgcagt cccaatactc tgcacgttat tagtaaagcg catggtcttg 1560
ctaggcaggt actctgtgca ttgtaaagac aagtattata aagcatagcc ggtactctgc 1620
gcattgctta tagctgacag gtatgtggtc acaataaagt atagggttgt cttgttaatt 1680
aaaggtgtat gcatataata aagcgcatac attgaacgca aagaggaaca aacaatggta 1740
gctgtaaaca ataatgtagt aggtacaacg gaacagcctt tcgagcgcgg tatggcttct 1800
gacatggcaa tgccgagcat gagcgaacaa gacatgctaa cattcatccg cgagaagtat 1860
gatggccagg agttatttaa cgccctctat atttccgttg ctgacatttg ccagatggtt 1920
gatgttaccc ctgttagcgt tactaacaag cttcgcaagt atcctcgctt taagattggc 1980
aactcttggt actggaaacg cactgacgac atgatggagt ttattcaagc ttggattaag 2040
atgcgaggtt aagtagatgg atatgccttg gcagctgaag aagctgcgtc gttggtgctt 2100
tacaggcaca gagtttgacg gcgggatggc taaggctccg tttgcttatg tggacggtaa 2160
gttcgtcccg atttcggtaa ctagtgacca caataagcta gttagttatg aagaactttt 2220
acccttgctt gagcaacacc ctgaacgcgg gtttggcttt gtccttactg aaggcgatgg 2280
gtttacagta gctgatattg acattggtga tgatactggt gttgaggcta ctgagcaatg 2340
gtggaaagct gtgcagtctt accaaaccta tacggaagct tcccgttccg gtggtggcta 2400
tcacttatgg tttggaggtg agattgcggg ttcatacaaa cgtggtgggc tagagttata 2460
ctccaaggaa cgtttcatta tctgtacggg taatgttatt cttggatatg acattcgtta 2520
cgatcctggg cttatagatc agtttaacca atacatctcg aattcccgta aggtagacaa 2580
cattgcggac atagacgaac ctgagaagat gagcgatgct gatctactta atgaggttta 2640
cgcttatgac cacagtggta agtttgaatg ccttatgacg ggtgattggg acaagtacct 2700
tgagatcatg aagcagcagg gtgctcatgg cgtggatgtg tttgatgcct cgcgtgctga 2760
cagtgcgttt atgacaatcg taacgtacta cacacgcaac attgaacagt gtaaacgctt 2820
gtggcgcatg tctgcacttg ctaatcttga gcttcgctat cccggcaacc gtaagaagca 2880
gcacgagaag cgcaaccatg taggaagcga ccgtctgtta cacttagcta ttaaacaagc 2940
ggcgactgag aacatgaaag acgaagagct acgcaaagcc cacgctgagg aaggtgctaa 3000
actcgcaaaa gagttacacg cgaagcgcaa taccaacgcg caaacgggta acactgagcc 3060
aaagtaccag atgccaccgc tccaagggaa acttcaatac ccgcctggat ggatggggga 3120
acttgcgaag cacttttaca acacaggtgt gaagcagatt aaggagtttg ctattgcaga 3180
agccttgtct cttgcgtctg gtttgtttgg tcgcgcttac aacattagcg gaacgggtct 3240
caacaattac tttatggtgt tggcgccctc cggtactggt aagtcacagc taacggcagc 3300
acctcaagag tttatgcgtc tgttggaacg ggagcaaggt gtaattgatg caagcaagtt 3360
tgtggtcagt gaagccttta cgcaccgtaa ctctatgatg aaagtgttcc aagagaatac 3420
atctttcttg cacgctttat cggagtttgg taatcacttc cgtgcaatgg taaaccctga 3480
cggttctacc cgtactgtgc gtgaccttat ggttgaaacg tactctaagt ctggtgcgta 3540
tgatgtgcta ggtggtgttc gctacacgga catggacaaa acggttaaca ttaaccatgc 3600
ggttgcttat agcttccttg gagaatgtgt accagaaacg ttctacgact gtctaaacga 3660
agaggcgttt ggtgacggtt ttgtatcgcg ctttatcttc tcagagttta gtggggaagt 3720
gccatacgat aacattgata agggtgtgcg acctagtccc gctctaattg accacatgac 3780
taacgctgtg ctttgtatga gctctgcatt gcgtgaccca aaccatgtgg acgttatgcc 3840
gattgcgcta cctccggaca tttctgaaaa gttccgcaca ctgtcgcgtt actgtacgga 3900
catggtgaac caacaaaata cgtcccatgc ttggaatgca acatggacac gtactaacct 3960
gaaggtgatg aagatatccg cattgcttgc ggtgatggat aaccctacca tgcctaaggt 4020
ttgcgagcag catatgaact gggcttggga ctatgtgcta cgtcacaacc accttgtctg 4080
ggatgctgtt cagagtggta aggttacaat ggacggtaca acacaacgtc gcgccgagct 4140
cattgcatct gttatgcaga agtttgtgac tgaaccgtac cttaacatgt cggcatccgt 4200
tcgtcgcgtg tataaagaag agttacaccg tgatggctta gtgagtcgtg ctgctattgt 4260
acgtagcgtt ggtcgaagta agttgttcgc ggatactggt ggacgtggtg ttgaagacca 4320
tatcaacgca gcgttacgtc acttggaagc aatggatgtc attcgttcct ttactaagaa 4380
ggaaatgcgt gacaagtatc aagcccgttg tgaagcttat ctatatttgg gggagtaaca 4440
tgaaaaaatt ggaagtgtta cgtgcacagc tccatgcata cattgacgaa tgtattgatg 4500
cttgtatgga ggaagctgtt gttgatagcg ttacggacgt ttattgcaca cctgctgaat 4560
tggtgttgga ttttgttcgc aaatcgtgtt caacacctta cgttgaattg ggtagtgact 4620
ttcgacgtgg ttgcaaacta gaagcacatc ttgacggtgt tataccgctt ggtgtcattt 4680
gtcgcgcact atccaggaat aaagcgtttc gacacgaaac ccagactggt tctgttatgg 4740
ttttgcgcac cttaaataca ctcaccgaga agggtgtact tcagcgttta tcacgtgggg 4800
aaatgtccga taagtacggt gcacgtagtc ttggctttaa attgatttag tctagtaaat 4860
accccgttcg cggggtatta tatacacact taataaacaa acacacaaaa ggggtttcct 4920
gtgtctaatg tatctactcc gcaacttgcg gaactaattg taaaagttgt tgcttgggct 4980
gacgctcgtg gttttaaaga aggcgctacg cttgtttcac agcaagtaaa aggtgaagaa 5040
gagcagggtg agttcgctgc taaccttgtg cgtctagccg aaggtgaagc tgttacggta 5100
ctggatgacc ttggtgatca aacggttgtt ggtattatcc aagcgcacat gtcaggttta 5160
gaccctgtgc agttgatgga aagcgtttac ctacgtgacc ctgatgacga tgcgggtttg 5220
acgttctgtc gtttggttgc tgcacatggt gcactagctg cggcggttgg tcgtaagcgt 5280
gatattaaac aaccgctcat tgacttcttc agtttgctgt ttaccatgtg tgccgcaatg 5340
gaagttagcc ctgagttagc tctggagacc gcttacgatg agattaaaga tcgtggtggt 5400
aaatggattg atggtacttt tgtaaaggag gctgaccttg gctaagttag ctagtcatat 5460
cactgtggac ggggttacgt actccgtttc acgtagcaag ttcggttact acgcaaccaa 5520
gaacggtcag cgcgtaactg gtaattttaa gaacctagat ttgcttgaga aagctttgga 5580
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acttccaaca accatgcgag cgaccgcttt gcgcgtaagc tttacttcta ccctgactac 5700
ggtctagtgc tgactgttgc gggtaatgca ccaagcttta tcgaagttgt tgattgggct 5760
gtgggtgaga ttgctactga gcaacgcttt tcagtgcctg acggtgactt cactgtttta 5820
gctgttcgcg taactccagg gcttccgaac atgatctaca caggtttccg cggaccggac 5880
aaccaatgtg gtcacatgga acgtgagtac gaaaagcgta ccgctattgg tagcgggggt 5940
cagtttgcac ttggtgcaat ggctatgaaa ggttctgcgg ttgaagctat tgaaatcgca 6000
atggacttgg atgtttatac tggtggtggt attgactggt ttgatacgat taccatggaa 6060
cacagtgcgg atgtaattcg tcgcaccctt aaaacagatt ggcctacgtg ggttccacct 6120
atgtctgagc ctgaagcacc ggagaaccct gaagatgaac aataagattg ctcactttac 6180
acccgacatg acaaacgacc aaatgatcca cgcatggtcg ttgaaccaag ctttgctgaa 6240
agagcttaaa actgtggaaa tggaacagcg taagcaaatt gctgagaaga tgttccctga 6300
cgctaaaaac ggtactaaca agcacgaact aggggcgggt tatgtgctca agtatgtgcg 6360
cggtgaagaa accaagctcg atcctactgt gttcgaattg ctacgcccag acctacctga 6420
gcacgtaatt gacaaggcgg ttaagtttac cccgtcgcta attgctaagg gtttcaaaga 6480
ccttagtatg gaagaccgtg agaagttgga agacgcgctt gttactaagc ctaagtcacc 6540
aacacttgat attgttcctc caaaggagaa gaaagatgaa atctaataaa ggttttaccc 6600
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aactgttaga cgctagtgat catgcacgtg tcgcgtcgtt aacgcaatct gaacagtctg 6720
ctgaaattgc tgtgtttaaa gcacgcgagc tagaccgaca ggaagtgctt gcacgcaaga 6780
ctgattcgtg gggtccgcag gataccctga ttaccgacct acttgaaacg gggttacagt 6840
ttaaagctac aggtgaccac actggttatt tctactttga gggtaaagat aacgctcagt 6900
gtcgcttaat gatcaaccta ctccgcgaaa gttcctatag taacggtggt gaaggtatag 6960
ctgaagcgcg gaccgataag tgttaacgat ttagtctagt aatgtgtgct atgtgcggta 7020
ttatgtaccc catagcgcac agttaaatcc ctatagtgta ttaactcagt gcactatatg 7080
aatttaacta agtaatctag cttatttgcg gtggtgctgt attatgtacc ccataccaaa 7140
caagcgttca accaaaacaa atcccggagg atttatgaaa aacaatgctg ctatcgctct 7200
aatgaccctt gtcgctgcta actgcgtaac tgttaacgtg cgtttcaaag accacaacgg 7260
caacgctgtt ggtcaggcgt acacgtacaa agctccaaaa gacatggagt tggaagcggg 7320
tgacgaagtg gttgtggacg caccaagcac cggcatgacc gtagttgtgg tcactgacgt 7380
tcacacaaca gctaagatcg acattgaagc accattccgt tacaaatgga ttgttgctaa 7440
ggttgaccgc aaagcctacg acgaccttct agctaaggac gacgctgcaa ctgagaaagt 7500
tgaagagttg cagcgtgaag cacagaaaac acgtgcactt gaaaccctta tggccgagct 7560
aaacttggac aaagacggtt tggcagacct actgaaaaat cttgcttaat tggtgcggtg 7620
ggggtactat gtactcccta acctaaccgg agttgttaaa tggcaatcca actagaatct 7680
tcaaatatgt tagcagttgc aaacggtgtt aaaatgtcca tctacggacg ttcgggtatg 7740
ggtaagacca tgctgagctg tacagcaccg gcaccgctga tcatcagtgc agagcgcggt 7800
ctgctatctc ttaagaaaga gaacattgag cgcgtttggg gtgttaacac gcccggcatt 7860
acttacgagc tgccagttat tcaaattgag acaattgacg acttaattga agctgaagct 7920
tactgtcgca ctaacccaca agcacagcag tttcaaacaa tcattgttga ctctgttagt 7980
gaagtggcgg aaaaagttct tgcgcacgct aaaaagggtg caaaagatcc acgtcaagct 8040
tacggtgtaa tgcttgaacg catgttggaa gtaattaaaa gcttccgtga cctagacggg 8100
aaacatgtgg tgttactgtt taaagaagaa cgtaacaagg atgagggtac aggtctaacc 8160
cttgcaggtc cttccgttcc tggacagaag cttggcccag cttcccctta tctaacagat 8220
gaggtgttcc aactctttag cggtcgcaat cccgaccaga gttcttaccg agctctgcga 8280
actcaaccag acttcagcgc ggacgcaaaa gaccgttctg gtgcactgga cgaaattgag 8340
ttcccacata ttggtagcgt tatcaacaaa atcttgggct cgcaagctca accacagcaa 8400
taataggata tatccatgaa acttaaagca cttactgtag caattctttc ttcaatcggt 8460
actggcgcag gtcttggcgc gatgttcgac gctaaccaag tttctccaaa cgaggctttt 8520
gaaaacttgc cgcttggttg gtacgttgca cgcatcgttg actcagaaga gaaaccgaac 8580
agttctaaca acggttcaca catcctgcta acacttgaag ttattgcacc tcagcagtac 8640
gcaggtcgta agctttggga tcgcttgaac ctaaacaacc cgaaccaaac tgcggttgaa 8700
attgcacagc gcacactgtc tgctatctgt cacgcaacta acgtgatgca gctacaagac 8760
acaatgcaac ttcacggtat cccaatggaa gtgaaggttg gtctgtctaa accacaagac 8820
ggttacgagc agcgtaacga aatcaaaggc taccgtactg cgaacgctgc gggtggcggt 8880
cagcaacagt ttggcggtca acagcagaac tttgccgcgc aaggtcagca agctgcacca 8940
caacaacagt ggaacggcgg tcaacaacag caacagcaac cagtgcagca acagcagcaa 9000
tggaacgcac cgcagcagca acagcaagca ccacagcagc agcaacaaca gcaggtagtg 9060
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ccgcaacaag aagcagctcc gcaaggtggt gatgtgcaac agcaaccttg gcagaacagc 9180
gctccgcaac agcaagagca gcaacagcag caacagcaac aacaggtaaa tcagcaacct 9240
gtacaagaca acggtcaggg taaccctagc caagtgcagt ccgatccaaa cgctcagcaa 9300
gctgcacaag gtggcaaccc accatgggca caacaataat tcagctgact tagtctagca 9360
tagtttaata cagggggtta caataccccc tgtattcgta attaaggaaa gtaaaagcat 9420
gttagagcgt caacaactac cggaaccaac taactgtcac gcatgtgggc atgaccacgt 9480
gcagttcgta aaccacaaag ttgtgtacgg tacagagaaa ggaaactggc cttacatttg 9540
gttgtgcagt tcgtgcggtg ctgttgtgtc ctgccacgag ggtacacgca acccgaaagg 9600
tttcatgtgc gataagcaca ccgcaaagat gcgtcaaaaa gcacaccacg tattcgataa 9660
gatctggaag cgttacatgt attgctcacg tgtgcacgct tatgcatccc tagcagcatc 9720
tatgaaaatt aactttgatg attgccacat aggtcagttt aacgctgagg aatgtgagta 9780
cgttatcaaa tggagtaagg agcgtctaaa gttgtacaaa tctaagaaga agcaaaaagc 9840
tgtttaccgt ggaggtaaga agcgcgtcat aaaggataaa ggatcatggt aggaattaca 9900
accaactttg cgaaccctgt tcagcacgca acagaaacac ttaaagcaat tgagaactca 9960
cttgctgcgg ataattgtgg tcaattccgc cagaacctgc gtgacttatt gcctaagatg 10020
gaagacgcgt accgtgcaca agaggataag taccgtaatc accaaggtgc ttctggcatt 10080
ggtaacgaat gcaaccgtga aattcaattg aaatggcgtt gggttgctgc tcctaagttt 10140
gacccgcgtc tattacgttt gtttaaccgc gggcatctcg aggaagcgcg tttcttatcg 10200
atgttaatgt gtattcctgg cgttcagctt tggtatgaaa cacctgaagg tgggcaaatc 10260
aagtggaacg attacggtgg gcattatggc tcagcgttgg atggggttgc ggtaggtatt 10320
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tttaacaagt tcgttaaaga cggttgtcgt gtggagaact ttacttacta tgtgcagtgt 10440
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tttatcaacg caacagggca gacttgacgc aattgctaac agtttaaaac ccgattgtct 12060
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catgtttaca acagttacgg taagttactg gaagtgttcc atggctctga agatgaaatc 13080
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taactttggt ttggagctta actaatgctt tacattcttg atacaactaa catgaagtta 13740
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ccaacagact tatcggttgt cctcaaactg cgtaagcaat ggatgaacga atgggaagct 14220
ttgggtatta aaaagaccac cgcttcatca accttgggtg cttggcaaaa gtcacgcttg 14280
gcatcttgat aacacgttaa aatttatttg ctttaagggt ttacagtgtg cgagttttcc 14340
gtataatggg aaccctaaag cggtaaaagc taacttattt aatttattcc tatcggagac 14400
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cgtccagata cactatgtgg tcgcgtatgg gctatcgcag acgaaatgtc agctaagaaa 14640
caagctccag tggcggtcgc agatctactt gtggttactg acgctgaagg tcttaacgca 14700
ggtaacgtcc gttgtgagta cgctgcatgg cgtaaattcc acggtgtaac tggtcgcatc 14760
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gtgcacagac aggttctctt gcgttatgtt gtgcacgtta aggatccatg ttttgattgc 55500
agtgcacgtc cactgatcat attcagggta tgttgcttca taccactcaa tgtattgaag 55560
cacttcttgg ttaactattt ccatcatgta gaccttatgt tattgcggaa agtatgtaca 55620
ttatacaaag tgtgtagcgc attgctagac aaccttctaa aacctcaaat ctttttggac 55680
ggcggataaa gttgtcacca tctcggccgg catatattgt cgacgatcat cgggcccccg 55740
gcggcacgtc caggtcatcg ccctatgtac accgaagagt atgatatacc cctcaaagct 55800
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tctgaggaaa taaataatcg atgcggcatc tccggcgacc ataaaaagcc gcccatcgtg 55920
gcacccccac cccttcgggg catgtgcagc gaatgcttca acacggaacg aatcgctgta 55980
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cacgccgaag cgtgctagtt ggtatggtta ttgcttagtg catagttatg caggtcggtc 56100
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aagaaagcta gtgtgaacat atttaccacc ttagtcgata cagctataag caacgccgaa 56520
catggctagt gcgcatggtg caaataagaa aacagttaat gtgagcatgg tgtcagtcct 56580
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gtaaatatcc tacaccttgc actttaagct gtgcggtgaa ccagttgcgc acttcgacac 57120
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gtttaacaag ctgttaatat ggtcgtcgtt gcaaccgtcg ttatatagca tggtgatgta 57240
acatgttttg ttgtccgcac ccatacgtcg cagcataccc caacgcagcg caaccaaccc 57300
gtcgtcgtac atgtcactag tcatataatg attaataaca tcacttgtga ttgagacacc 57360
gttgagcagt ttaccaagct tttcaataat aacaccctga gcggtttcgc tcgcttttaa 57420
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ttttgcgaaa aataccaaaa aagtcacaat ccgtttaaaa gtgtgcgcaa tgtcgcatta 58560
tcatgaatta atgaactaaa taggtgattt aatccttgct tttagtcttt acctagtgta 58620
accgcgcacg ca 58632
Claims (7)
- 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 미오비리대 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP).
- 제1항의 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP)을 유효성분으로 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가제 또는 약욕제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
- 제2항에 의한 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제 형태인 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제2항에 의한 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 사람을 제외한 동물을 담그는 처치를 실시하는 단계를 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물이 약욕제 형태인 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
Priority Applications (2)
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