KR101381336B1

KR101381336B1 - 신규한 박테리오파지 ｐｖｐ-1 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 용도

Info

Publication number: KR101381336B1
Application number: KR1020120067811A
Authority: KR
Inventors: 성기홍; 최대건; 김재훈
Original assignee: 주식회사 씨티씨바이오
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2014-04-25
Also published as: KR20140000541A

Abstract

본 발명은 새롭게 분리 및 동정된 신규 파지 및 이를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 증식 억제 또는 사멸용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 선박 평형수 처리용 조성물, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항생제, 소독제, 및 어패류 사료첨가제 등 다양하게 활용될 수 있다.

Description

신규한 박테리오파지 ＰＶＰ-1 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 용도{Novel bacteriophage PVP-1 and its use for preventing proliferation of Vibrio parahaemolyticus}

본 발명은 새롭게 분리 및 동정된 신규 박테리오파지, 이를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 선박 평형수 처리용 조성물, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항생제, 소독제, 및 어패류 사료첨가제에 관한 것이다.

비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)는 비브리오 과(family Vibrionaceae )에 속하는 그람 음성 간균으로, 주로 간질환, 알코올 중독 및 당뇨병 등 면역상태가 저하된 기저질환을 가진 사람이 본 박테리아에 오염된 어패류를 생식 또는 불완전 조리 후 섭취하였을 경우나 오염된 해수에 상처가 노출되었을 경우에 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 한국과 일본을 포함한 아시아의 여러 국가에서는 어패류를 생식하는 식습관으로 인하여 매해 발생이 끊이지 않으며, 집단 발생율이 높아 문제되는 질환으로 알려져 있다. 최근 서구의 여러 나라에서도 어패류를 생식하는 경우가 증가함에 따라 미국과 유럽 등을 중심으로 본 박테리아 감염에 의한 질병의 발생이 세계 곳곳으로 확산되고 있는 실정이다. 본 감염성 질병은 어패류 중에서도 특히 굴과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 본 박테리아는 수온이 상승하면 활발하게 번식하므로, 국내에선 매해 여름 본 박테리아의 유행 시기(6~9월)에 특별히 굴의 판매 및 유통을 금하고 있다. 특히 최근 집단 급식의 증가 등으로 본 질병의 대유행 가능성이 예견되어 주의를 요하고 있다.

한편, 박테리오파지는 박테리아에 특이적으로 감염되는 바이러스로 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 박테리아를 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 파지를 이용한 치료법은 항균제 개발 이후 동유럽과 구소련에서만 지속적으로 연구되어 왔으나, 최근 항생제의 오남용으로 인해 다재 내성(Multidrug-resistant)을 지닌 병원성 세균 및 슈퍼박테리아 출현 빈도가 높아지고 기존 항생제의 많은 문제점들이 부각되면서, 항균제의 대안으로서 각광받고 있다. 더욱이, 박테리오파지는 항균제 대비 개발시간이 짧고 개발비용이 적게 소요되며, 세균선택성, 지속성 및 부작용 등의 측면에서 우위가 인정된다.

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 용균활성을 가지는 새로운 박테리오파지를 분리하고, 이를 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 선박 평형수 처리용 조성물, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항생제, 소독제, 및 어패류 사료첨가제를 제공하는 것이다.

일 양태로, 본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 파지에 관한 것이다.

구체적으로, 형태학상 시포리비대(siphoviridae) 과(family) 카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order)에 속하고,

상기 파지는 수탁번호 KCTC 12130BP의 파지인 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 한국의 남해 산 굴 양식장의 해수에서 수집한 침전물 샘플을 채취하여, 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에 대한 특이적 사멸능을 가지는 파지를 분리 및 동정하였으며, 이를 PVP-1로 명명하고 2012년 2월 3일에 생물자원센터에 수탁번호 제KCTC 12130BP호로 기탁하였다.

본 발명자들은 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) ATCC 33844를 숙주로 이를 용균하는 파지(이하, PVP-1라 칭함)를 분리하고, PVP-1가 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에 플라크를 형성하여 용균 활성(bacteriolytic activity)을 가짐을 확인하였다.

또한, 이들 PVP-1을 전자현미경을 통해 형태학적으로 관찰한 결과, 시포리비대(siphoviridae) 과(family) 카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order)에 속하는 것으로 판명되었다.

또한, PVP-1의 게놈을 분석한 결과, 이중-나선 DNA(dsDNA)로 구성되고 게놈 크기는 약 100 kb 이며, PVP-1 전체 게놈은 다른 파지와 상동성을 보이지 않아서, PVP-1는 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 감염능을 가지는 사포리비대 과에 속하는 최초의 박테리오파지인 것으로 판명되었다.

본 발명에 따른 파지 PVP-1는 통상적인 파지 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, NB(nutrient broth), TSB(tryptic soy broth) 액체 배지, 또는 TSA(tryptic soy agar) 고체배지 등을 사용할 수 있다. 배양은 통상의 배양조건으로 수행할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동 건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

PVP-1는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에 감수성을 나타낸다.

바람직하게, 상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 ATCC27969, ATCC33844, ATCC17802, VP01, VP02, VP03, VP04, VP05, VP06, VP07, VP08, VP09, VP10, VP11, VP13, VP14, VP17, VP18, VP20, VP21, VP22, VP23, VP24, VP25, VP26, 또는 VP27이다.

바람직하게, 상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스는 다제 내성 균주이다.

따라서, 또 다른 양태로, 본 발명은 파지 PVP-1 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 또는 이를 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 증식을 억제시키거나 또는 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태로, 본 발명은 파지 PVP-1 또는 이의 배양물, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 항생제, 소독제 및 어패류 사료첨가제에 관한 것이다. 바람직하게, 파지 PVP-1 또는 이의 배양물, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 증식 억제 또는 사멸용 항생제, 소독제 및 어패류 사료첨가제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 항생제, 소독제, 및 사료첨가제는 기존의 것에 비해 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 대한 특이성이 매우 높으므로 익균은 죽이지않고 비브리오 파라헤몰리티쿠스만 사멸시킬 수 있어 부작용이 없고, 항생제 내성균 및 다제 내성 병원균도 사멸시킬 수 있어 그 효과가 탁월할 뿐만 아니라, 병원균의 내성 내지 저항성을 유도하지 않으므로 기존의 것에 비하여 제품수명이 길다.

본 발명의 명세서에 있어서, 상기 '항생제'는 방부제, 살균제, 및 항균제를 포함하는 의미이다.

상기 사료첨가제는 어패류 사료에 첨가될 수 있다.

또는, 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키지 않고, 사료 제조시 직접 PVP-1 또는 이의 배양물을 첨가하여 제조할 수도 있다.

상기 어패류에는 굴, 조개, 게, 새우, 또는 어류가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로, 본 발명은 파지 PVP-1 또는 이의 배양물, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 선박 평형수(밸러스트수; ballast water) 처리용 조성물 및 이를 이용한 선박 평형수의 생물학적 처리 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 파지 PVP-1 또는 이의 배양물, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 증식 억제 또는 사멸을 위한 선박 평형수 처리용 조성물 및 이를 이용한 선박 평형수의 생물학적 처리 방법에 관한 것이다.

상기 선박 평형수 처리용 조성물은 선박 평형수에 존재할 수 있는 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 사멸시키거나 또는 이의 증식을 억제시킬 수 있다.

선박 평형수란 배에 짐을 싣고 내릴 때 한쪽으로 기울여지지 않게 균형을 잡아주거나, 추진 장치(screw propeller)가 해수면 위로 떠올라 항해할 수 없게 되는 사태를 막기 위해 배의 아래쪽 탱크(tank)에 싣거나 쏟아내는 바닷물을 말한다.

본 발명의 명세서에 있어서, 상기 '선박 평형수'는 선박 평형수를 보관 하는 탱크(ballast water tank)에 들어 있는 물과 선박 평형수를 보관하는 탱크에 넣기 전에 펌프(pump)를 통하여 끌어올려진 물 둘 다를 지칭한다.

본 발명의 명세서에 있어서, 상기 '선박'이란 해양 환경에서 운항되고 있는 모든 형태의 배를 의미하며 잠수선, 부유선, 부양식 플래트폼, 부양식 저장설비, 그리고 부양하고 있는 것으로서 제품의 저장 및 하역을 위한 설비를 포함한다.

상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 선박 평형수 처리용 조성물, 항생제, 소독제 및 어패류 사료첨가제는 용액, 현탁액, 유화액과 같은 액상으로 제조될 수 있으나, 파지 건조체에 기반하여 분말제, 과립제, 정제, 또는 캅셀제와 같은 고상으로도 제조될 수 있다.

상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 선박 평형수 처리용 조성물, 항생제, 소독제 및 어패류 사료첨가제에는 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 상기 허용가능한 담체란 생물체를 자극하지 않고 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체를 말한다. 실제 포장에 사용하기 적합한 안정적인 제제화를 목적으로 계면활성제 또는 증량제 등을 사용하여 수화제, 입상수화제, 액상수화제, 액제, 수용제, 수용성입제 또는 캡슐화제의 형태로 제조될 수 있다. 상기 계면활성제의 일예로 알킬(C₈~C₁₂)아릴설포네이트, 디알킬(C₃~C₆)아릴설포네이트, 디알킬(C₈~C₁₂)설포숙시네이트, 리그닌설포네이트, 나프탈렌설포네이트축합물, 나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 알킬(C₈~C₁₂)나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 폴리옥시에틸렌알킬(C₈~C₁₂)페닐설포네이트와 같은 설포네이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬(C₈~C₁₂)설페이트, 알킬(C₈~C₁₂)아릴설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C₈~C₁₂)설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C₈~C₁₂)페닐설페이트와 같은 설페이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 폴리옥시알킬렌숙시네이트와 같은 숙시네이트화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 나트륨 벤조에이트, 알킬카르복실레이트 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬(C₁₂~C₁₈)에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C₈~C₁₂)페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C₈~C₁₂)페닐폴리머, 에틸렌옥사이드 프로필렌옥사이드 코폴리머와 같은 비이온성 계면활성제, 폴리카복실레이트, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상이 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 계면활성제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 증량제로는 벤토나이트(bentonite), 활석, 클레이, 카올린, 탄산칼슘, 규사, 경석, 규조토, 산성 백토, 제올라이트, 펄라이트, 화이트 카본, 암모늄 설페이트, 요소, 포도당, 덱스트린(dextrin), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 포도당 및 전분, 물 등이 단독으로 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 증량제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 선박 평형수 처리용 조성물, 항생제, 소독제 및 어패류 사료첨가제에서의 파지 농도 내지 파지 건조체의 함량은 사용 목적에 맞게 임의로 조정될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 예를 들어, 선박 평형수 처리용 조성물의 경우 선박 평형수의 양, 단위부피당 비브리오 파라헤몰리티쿠스 개체수 및 해당 조성물(또는 항생체, 소독제, 내지 어패류 사료첨가제)에서의 PVP-1의 함량, 조성물의 제제화 방법 또는 투여 방법과 같은 요인들에 의해 다양하게 조정될 수 있다.

상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 선박 평형수 처리용 조성물, 항생제, 소독제 및 어패류 사료첨가제에는 PVP-1 외에 유효 박테리오파지가 추가로 포함될 수 있으며, 상기 유효 박테리오파지는 바람직하게는 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 대한 용균 활성을 가진 것이나 이에 한하지 않고 그 외 박테리아에 대한 용균 활성을 가진 파지도 포함될 수 있다.

또한, 상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 선박 평형수 처리용 조성물, 항생제, 소독제 및 어패류 사료첨가제를 처리하는 경우, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸을 위해 종래 통용되던 방법과 병용할 수 있다.

또 다른 양태로, 본 발명은 파지 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 감염성 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 이를 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 파지는 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 대한 특이적 사멸능을 가지므로, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염에 의해 유발되는 다양한 질병의 예방 또는 치료에 효과를 나타낸다. 바람직하게, 상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병은 위장염, 식중독, 또는 창상감염이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병에는 이러한 질병으로부터 발현되는 증상도 포함되며, 예를 들어 구토, 복통, 발열, 오한, 또는 수양성 설사가 있다.

상기 '예방 또는 치료'에는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병의 예방, 억제, 및 경감이 포함된다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 사료 또는 음수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료 방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 일이다. 특정 대상에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 새롭게 분리한 파지는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 증식 억제 또는 사멸 효과가 있고, 특히 다제 내성(내지 항생제 내성) 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 대해서도 증식 억제 또는 사멸능을 가지므로, 위장염, 식중독, 또는 창상감염과 같은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병 예방 또는 치료에 효과적이며, 선박 평형수 처리용 조성물로 활용할 수 있을 뿐만 아니라 사료, 항생제 또는 소독제로 사용할 수 있다. 따라서, 양식 산업의 경쟁력 및 국민보건 향상에 이바지할 것으로 기대된다.

도 1은 PVP-1 gDNA 및 12가지 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonucleases)에 의한 분해물의 펄스-필드 젤 전기영동한 결과(Pulsed-field gel electrophoretogram)를 나타낸 것이다. M 라인은 낮은 범위 PFG 마커를 나타낸 것이다 (새로운 잉글랜드 바이오랩). 1 라인은 분해되지 않은 파지 gDNA를 나타낸 것이다. 2-13 라인은 각각 SacII, Sau3AI, MspI, XbaI, NotI, HindIII, SmaI, SphI, NcoI, HpaII, SpeI 및 EcoRI 에 의해 생성된 파지 gDNA 분해 패턴을 나타낸 것이다(새로운 잉글란드 바이오랩). PVP-1의 게놈 크기는 약 100 kb로 예측되었다.
도 2는 음성 염색된 PVP-1을 전자현미경으로 관찰한 것이다. 각각, A는 PVP-1의 단독 확대 사진을 도시한 것이고, B는 PVP-1이 집단으로 모여있는 사진을 도시한 것이고, C는 PVP-1이 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 증식을 억제한 사진을 도시한 것이다.
도 3은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 ATCC 33844에 대한 PVP-1의 용균 활성을 나타낸 것이다. MOI(muliplicity of infection) 0.01, 1, 및 100 으로 PVP-1과 공배양하였다. 그 결과는 세번의 시험을 통해 평균±표준편차 값으로 기재하였다.

<재료 및 방법>

대상 박테리아 및 파지의 샘플링

한국의 남해 산 굴 양식장의 해수에서 수집한 침전물 샘플을 100 ml이상 채취하여 파지 분리에 사용하였다.

파지 분리 및 숙주역 조사

파지 분리 및 그것의 플라크-형성 유니트(plaque-formingunits(PFUs))의 수 계산을 위해 통상적으로 사용되는 이중-층 아가법(double-layered method)(AdamsM (1959) Bacteriophages. Interscience Publishers, NewYork)을 이용하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) ATCC 33844를 파지 분리용 숙주 박테리아로 사용하였다. 플라크 형태는 인큐베이션 18-24 시간 경과 후에 관찰하였다. 분리재료를 20℃ 에서 36 시간 동안 인큐베이션하고, 10,000×g 에서 20분 동안 원심분리한 후, 0.45μm 크기의 필터을 통해 여과하여 90ml에 10×TSB 10ml을 첨가하고, 숙주 박테리아 10⁶~10⁷ CFU를 접종하여 12시간 이상 배양하였다. 5,000rpm 20 분간 원심분리를 하여 상층액을 채취하고, 숙주 박테리아 10⁸을 TSA 한천배지 표면에 도포한 후 상층액 5~10ul를 떨어뜨린 후 25℃에서 18시간 배양하였다. 용균이 일어나는 경우 10진 희석하여 역가 특정하고 플라크 모양을 관찰하였다. 순수한 파지 균주를 세번의 일련의 단일-플라크 분리를 통해 수득하였고 이를 PVP-1로 명명하였다. 여과된 파지 용해물을 12 시간 동안 4℃의 1M의 NaCl 내에서 10% (wt/vol) 폴리에틸렌 글리콜 8000을 이용해 침전시켰고, 4℃에서 10분 동안 10,000×g로 원심분리하여 회수하였다. 정제된 파지는 CsCl 단계 구배 울트라원심분리 (밀도 구배:1.15, 1.45, 1.50 및 1.70g/ml; 250,000×g;22h; 4℃)하고, SM 버퍼(10-mM NaCl, 50-mMTris[pH7.5] 및 10-mM MgSO₄)에서 투석하고 사용 전까지 4℃암소에 보관하였다.

PVP-1 의 숙주역은 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)를 접종한 이중-층 아가 플레이트에 10μl의 희석된 파지 부유액(3.3×10⁷PFU/ml)을 떨어뜨려 결정하였다. 그리고 나서, 상기 박테리아를 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션시켰고, 플라크가 형성되는지 여부를 체크하였다.

분리된 파지의 유전체적 분석

정제된 파지 게놈 DNA(gDNA)를 Son JS et al,. (2010) Complete genome sequence of a newly isolated lytic bacteriophage, EFAP-1 of Enterococcus faecalis, and antibacterial activity of its endoly sin EFAL-1.J Appl Microbiol 108:1769-1779에 기재된 바와 같이 준비하였고, 그리고 파지의 유전체적 분석을 위하여 우선적으로 지침서에 기재된 바에 따라 DNase I (20U/μl)(Takara), RNase A (5U/μl)(intron) 및 Mung bean nuclease (20U/μl)(Takara)에 대한 파지 게놈의 반응 여부를 조사하였다. 먼저 10⁹ PFU/ml 이상의 파지 stock을 Proteinase K로 캡시드(capsid)를 제거한 후 PCI (phenol-chloform-isoamyl alcohol)로 처리된 상층액을 이소프로판올(isopropanol)로 처리한 후 70% 에탄올(ethanol)로 세척하는 과정을 거쳐 TE 버퍼(buffer)에 최종적으로 게놈을 농축하였다. 이렇게 농축된 파지의 게놈은 0.7% 아가로스 젤(1X TAE 버퍼)에 전기영동되어 대조군(control)으로 사용되었으며, 각각의 파지군은 DNase I와 RNase A, Mung bean nuclease에 의해 처리된 후 양성밴드의 유무를 통하여 결과가 판단되었다.

추가로, 파지 gDNA의 유전체 크기 및 제한효소 절단 패턴을 정확히 관찰하기 위해 Uchiyama J et al., (2008) Iso-lation and characterization of a novel Enterococcus faecalis bacteriophage EF24C as a therapeutic candidate. FEMS Microbiol Lett 278:200-206에 기재된 바에서 약간 변형한 방법에 따라 펄스-필드 젤 전기영동(PFGE; pulsed-feild gel electrophoresis)을 수행하였다. 간략히 말해, 500 μl의 파지 부유액을 2% (wt/vol) NuSieve GTG agarose(FMC BioProducts)와 혼합하고, 플럭 몰드(plug mold)에 붓고, 고체화하였다. 상기 플럭은 소량의 분해 버퍼(500 mM EDTA, 10 mM Tris [pH 8.0], 1% SDS [wt/vol] 및 1 mg/ml 의 proteinase K) 안으로 몰드를 통해 펀치되었고 밤새 50°C 에서 인큐베이션시켰다. 분해 버퍼를 따라내고, 상기 샘플을 TE 버퍼를 사용해 3회 세척하고, 그리고나서 10 U 의 SacII, Sau3AI, MspI, XbaI, NotI, HindIII, SmaI, SphI, NcoI, HpaII, SpeI 및 EcoRI (New England Biolabs)으로 각각 1시간 동안 37°C에서 분해시켰다. 상기 플럭은 TE 버퍼를 사용해 3회 세척하고, 0.5X TBE 내 1.2% Pulsed Field Certified agarose (Bio-Rad)의 웰(wells) 내 넣고, molten 0.5% NuSieve GTG agarose를 이용해 덮어씌웠다. 상기 샘플은 0.5X TBE 버퍼 내에서 14°C 에서 16시간 동안 5 내지 15초간 펄스 램프와 함께 6 V/cm 로 CHEF-DR III System (Bio-Rad)를 이용해 전기영동하였다.

분리된 파지의 전자현미경 분석

분리된 파지의 형태학적 분류를 위해 투과전자현미경(TEM) 관찰을 수행하였다. 파지 스톡을 구리 그리드에 로드(load) 한 후에, 1% 우라닐 아세테이트로 음성 염색하고 건조하였다. 전자현미경 촬영은 서울대학교 관악캠퍼스 농업생명과학대학교 부속 NICEM에서 이뤄졌다. 상기 파지의 형태는 Zeiss TEM EM902 (Zeiss)를 이용해 80 kV의 전압으로 관찰하였다. 파지 크기는 10번 이상의 측정으로 계산하였다.

분리된 파지의 게놈 분석

게노믹 DNA를 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.에 공지된 방법에 따라 추출하고, 표준 샷건 시퀀싱 리젠트 및 454 GSFLX Titanium Sequencing System (Roche) (약 50×coverage)을 이용해 시퀀싱하였다. 전체 게놈 서열은 SeqMan II sequence analysis software (DNAStar)을 이용한 시퀀스 어셈블리에 의해 수득하였다. 추정 ORFs(오픈 리딩 프레임)은 Glimmer 3.02 및 GeneMark.hmm 을 이용해 예측하였고, ORF의 기능은 BLASTP 및 InterProScan 을 이용해 분석하였다. 추정되는 tRNA 유전자는 tRNAscan-SE (v. 1.21) software를 이용해 찾아내었다.

Broth - culture 상태의 숙주 박테리아에 대한 파지 감수성 검사

후보군에 속해있는 다수의 파지 중 수중 생존능이 우수한 파지들을 선발하여, 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에 대한 PVP-1의 용균 활성을 평가하기 위해 사용하였다. PVP-1 (1.1x10⁹PFU/ml)과 비브리오 파라헤몰리티쿠스 ATCC 33844 (9.0x10⁶CFU/ml) 균주를 이용하여 진행되었으며, 정제된 파지 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) ATCC 33844를 10 ml의 깨끗한 TSB 내에서 MOI(multiplicity of infection, 박테리아와 박테리오파지의 정량적 비율) 0.01, 1, 100의 3군으로 나누어 실험을 진행하였다. 상기 제조물을 20°C 에서 250 rpm 으로 흔들면서 공배양하였다. 파지가 없는(control) TSB 내에 접종된 박테리아는 대조군으로 사용하였다. 흡광도(OD₆₀₀)는 접종 후, 24 h 경과할 때까지 측정하였다.

<결과>

파지 분리 및 숙주역

총 11번의 분리 시도로 1종의 파지를 분리하였다. 파지는 3회의 클로닝 과정을 통하여 순수 분리되었다. PVP-1라고 명명된, 파지는 남해 산 굴 양식장의 해수에서 분리되었고, 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) ATCC 33844에서 플라크를 형성하였다.

분리된 30주의 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 뿐만 아니라 1종의 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)를 대상으로 하여 각각의 감수성 및 숙주역을 조사하여 최종적으로 확정지었다. 분리된 30주의 비브리오 파라헤몰리티쿠스는 모두 다제 내성 균주이다. 30주의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 중에서, 27주의 비브리오 파라헤몰리티쿠스는 플라크를 형성하였다. 그러므로, PVP-1가 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 감수성을 나타내는 것으로 판단된다. 그러나, PVP-1 는 이번 연구에 사용된, 1종의 비브리오 불니피쿠스에 대해서는 감수성을 보이지않았다(표 1).

분리된 파지는 4℃ 암소에 보관하였다.

PVP -1의 분류 및 성상

1) 유전체 성상에 따른 파지의 분류

일반적으로, 시포리비대(Siphoviridae) 파지는 이중 나선(ds) DNA 게놈을 가지는 것으로 공지되어 있다. 마찬가지로, PVP-1 의 gDNA는 DNase I 에 의해서는 완벽히 분해되지만, RNase A 또는 Mung bean nuclease 에 의해서는 완전히 분해되지 않았다. 그러므로, 그것은 ds(double strand) DNA 로 추정되었다. 아울러, gDNA 는 SphI, NcoI, EcoRI 에 의해 분해되었고, 그리고 그것의 크기는 대략 100 kb 으로 추정되었다(도 1).

2) 분리된 파지의 형태학적 분류

파지는 Ackermann 분류법에 따르면, 형태면에서 시포리비대(Siphoviridae) 과(family) 카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order) 으로 분류되었다(도 2). 꼬리 길이 및 폭은 각각 129 ± 7 nm (mean ± SD) (n = 10) 및 14 ± 2 nm (n = 10)이고, 머리 직경은 63 ± 6 nm (n = 10)이였다.

PVP -1의 게놈 분석 결과

PVP-1의 이중나선구조의 넌리던던트(nonredundant) DNA 게놈은 111,506 bp의 길이를 가지고 G+C 함량은 39.71% 였다. 40 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 총 157 ORFs 및 19 tRNAs (1 슈도진(pseudogene) 포함)가 확인되었는바, 이는 PVP-1이 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 감염능을 가지는 사포리비대 과에 속하는 최초의 박테리오파지임을 보여준다. 45 ORFs 와 상동성이 있는 단백질은 젠뱅크 데이터베이스(GenBank database)에서는 발견되지 않았고, 나머지 ORF 중 69 및 40은 각각 공지된 파지-관련 단백질 및 박테리움-관련 단백질과 상동성이 있는 단백질을 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 파지 PVP-1 내, 상기 40 박테리움-관련 유전자 중, 5 ORFs (orf34, orf38, orf79, orf85, 및 orf97)는 비브리오-관련 단백질과 상당한 상동성을 보였고, 35 ORFs 는 광범위한 종(phyla)을 아우르는 비관련(unrelated) 박테리아와 다소 유사했다. 69 파지-관련 ORFs의 기능을 추정하고자 바이오인포매틱 분석(Bioinformatic analyses)을 수행하였고, 그들 ORFs를 적어도 세개의 기능적 역할(functional role)로 그룹화하였는바, 즉 DNA 대사(metabolism) (orf2, orf3, orf4, orf6, orf7, orf12, orf14, orf15, orf16, orf17, orf18, orf21, orf28, orf32, orf42, 및 orf52), 바이러스 형태발생(viral morphogenesis) (orf139, orf141, orf143, orf144, orf148, orf149, orf153, orf155,orf156, 및 orf157), 및 용균 특성(lytic property) (orf73, orf82, 및 orf83)이다. DNA 대사 및 바이러스 형태 발생 유전자를 포함하는 ORFs 대부분은 기능적 역할에 의해 시퀀싱한 게놈의 각 말단에 함께 모여있었고 T5 또는 T5-유사 파지와 유사하였다(≤79%). 이는 PVP-1 과 상기 파지들 간의 근접한 유전적 관련성을 보여준다. 그러나, 시포리비대 과에 속하는 해양 비브리오 파지(phiHSIC 및 SIO-2) 와는 전혀 서열 유사성을 나타내지 않았으며, PVP-1 내 유전자의 대부분의 서열이 다른 시퀀싱된 파지 또는 박테리아와 유사하지 않아, 신규함을 알 수 있었다.

비브리오 파지 PVP-1의 게놈 서열은 젠뱅크 데이터베이스에 어세션 넘버(accession number) JQ340389로 기탁되었다.

비브리오 파라헤몰리티쿠스에 대한 PVP - 1 의 효능효과 검정: 숙주 세포 용균 테스트

PVP-1 의 박테리아 용균 활성도를 비브리오 파라헤몰리티쿠스 ATCC 33844 배양물을 대상으로 테스트하였다(도 3). 비브리오 파라헤몰리티쿠스 배양물이 PVP-1 으로 감염되지 않았을 때(control), OD₆₀₀ 값은 인큐베이션 동안 계속해서 증가하였다. 그러나, PVP-1 감염 후 24시간 경과할 때까지, MOI 0.01, 1 및 100 에서는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 ATCC 33844의 생존이 현저히 억제되었다.

생물자원센터

KCTC12130BP

20120203

Claims

카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order), 시포리비대(siphoviridae) 과(family)에 속하는 PVP-1(수탁번호 KCTC 12130BP).
제1항의 박테리오파지 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus ) 증식 억제 또는 사멸용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스는 다제 내성 균주인 것을 특징으로 하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 증식 억제 또는 사멸용 조성물.
제1항의 박테리오파지 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 선박 평형수(밸러스트수; ballast water) 처리용 조성물.
제1항의 박테리오파지 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 위장염, 식중독, 또는 창상감염을 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제1항의 박테리오파지 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항생제.
제1항의 박테리오파지 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 소독제.
제1항의 박테리오파지 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 어패류 사료첨가제.