KR101756088B1 - 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Ｖｉｂ-ＰＡＰ-2 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 포도비리대 박테리오파지 Vib-PAP-2(수탁번호 KCTC 12910BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Ｖｉｂ-ＰＡＰ-2 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도{Novel Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-2 and its use for preventing proliferation of Vibrio parahaemolyticus}

본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 포도비리대 박테리오파지 Vib-PAP-2(수탁번호 KCTC 12910BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 방법에 관한 것이다.

비브리오 속(Genus)에 속하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 균은 그람 음성 간균으로 인체에는 급성 식중독 및 장염을 일으키고 어류에는 비브리오병(Vibriosis)을 일으킨다. 어류에서의 비브리오병의 감염 증상은 매우 다양한데, 체색 흑화 증상을 보이기도 하고 체표 궤양(Skin ulcer)이 나타나기도 하며 때로는 지느러미의 발적 및 체표 발적 증상을 보이기도 한다. 또한 해부해 보면 간의 출혈이나 울혈이 관찰되기도 한다.

비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염에 의한 어류의 비브리오병은 그 발병 빈도가 높고 이로 인한 경제적 피해가 크기 때문에 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염을 예방하고 나아가 감염 처치에까지 활용될 수 있는 방안의 개발이 절실한 실정이다.

어류 양식 산업은 부족한 식량자원을 손쉽게 얻을 수 있다는 점에서 해마다 급속한 성장을 거듭하고 있다. 어류 양식장에서는 세균성 질병의 치료 방법으로서 과다하게 항균 화학요법제인 항생제가 사용되고 있는데, 이러한 결과로 다양한 약제에 대한 내성을 지닌 균이 빈번하게 발생하고 있어서, 어류 양식 어가에 상당한 경제적 손실을 입히고 있는 실정이다. 또한, 이러한 항생제의 과다한 사용은 국민 건강을 위협하고 나아가서는 양식 어류의 소비 심리를 위축시켜서 전반적인 수산업의 경쟁력 저하를 야기할 수 있다. 따라서 세균에 의한 어류 질병을 방지할 수 있고 또한 이들의 감염을 효과적으로 처치할 수 있는 항생제 외의 방법의 개발이 절실하다 할 수 있다. 특히, 최근 수산물의 식품으로서의 안전성이 주요 사회적 관심사가 되고 있기 때문에 그 방법이 친환경적이면 더욱 바람직하다.

최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 자연 친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(Infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성은 목적으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 어류 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 그러나, 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 그 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하고 그 만큼 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 박테리아에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.

박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후 박테리아 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다. 특히 최근 항생제 사용에 대한 정부 차원의 규제가 전 세계적으로 강화됨에 따라 박테리오파지에 대한 관심이 더욱 높아지고 있으며 산업적 활용 사례도 증가하고 있다.

앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종류에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지의 확보가 필요하다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 다양한 유용 박테리오파지들(비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 박테리오파지들)의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발도 필요하다.

이에, 본 발명자들은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 유전자 서열을 확보한 후 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음 이 조성물이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지 및 처치에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 포도비리대(Podoviridae) 박테리오파지 Vib-PAP-2(수탁번호 KCTC 12910BP)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Vib-PAP-2를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Vib-PAP-2를 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염 방지 및 처치 목적의 약욕제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염 방지 및 처치를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 포도비리대 박테리오파지 Vib-PAP-2(수탁번호 KCTC 12910BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지 및 처치 방법을 제공한다.

박테리오파지 Vib-PAP-2는 본 발명자들에 의해 분리된 후 2015년 9월 22일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 12910BP).

또한, 본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Vib-PAP-2를 유효성분으로 포함하는 약욕제 및 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Vib-PAP-2는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 효과적으로 사멸시키므로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질병의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 대표적인 질병인 비브리오병에 대한 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”이라는 용어는 (ⅰ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염의 방지; 및 (ⅱ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅱ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발된 질환의 병적 상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서의 “분리” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 특징들을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Vib-PAP-2가 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Vib-PAP-2는 1× 10¹ pfu/㎖ 내지 1× 10³⁰ pfu/㎖ 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1× 10³⁰ pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 10⁴ pfu/㎖ 내지 1× 10¹⁵ pfu/㎖ 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g로 포함된다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만, 약욕제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다.

이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 비록 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지 및 처치 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 기반을 둔 방식에 비하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다. 통상적으로 항생제 등의 화학물질을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래하여 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 분리하여 조성물의 유효성분으로 사용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점 또한 제공할 수 있다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.

도 1은 박테리오파지 Vib-PAP-2의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Vib-PAP-2의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 투명한 부분은 시험대상 박테리아가 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 선별에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균은 한국생명공학연구원 미생물자원센터로부터 분양받아 사용하였다(분양번호 KCTC 2729).

박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 LB(Luria-Bertani) 배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화 나트륨, 10 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 3-4시간동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우 박테리오파지의 수(Titer)가 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 5회 반복 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.

상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. LB 배지에 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액 3 ㎖(OD₆₀₀이 1.5)을 LA(Luria-Bertani Agar) 평판배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화 나트륨, 10 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.

비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음 이를 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 배양액에 첨가해 주어 4-5 시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 37℃에서 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 1차 순수분리 과정에서 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 기술한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 신규 확보된 박테리오파지는 형태적 특징으로 판단할 때 포도비리대(Podoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.

이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 4-5 시간 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.

이렇게 하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Vib-PAP-2로 명명한 뒤, 2015년 9월 22일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(수탁번호 KCTC 12910BP)에 기탁하였다.

실시예 2: 박테리오파지 Vib -PAP-2의 유전체 분리 및 서열 분석

박테리오파지 Vib-PAP-2의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/㎖) 100 μl를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol):클로로포름(Chloroform):이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Vib-PAP-2의 유전체를 다량 확보하였다.

이렇게 얻어진 박테리오파지 Vib-PAP-2 유전체에 대하여 Roche 454 GS Junior 기기를 이용한 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 실시하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Vib-PAP-2 유전체는 43,221 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.

확보된 박테리오파지 Vib-PAP-2의 유전체 서열을 기반으로 Web상의 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 박테리오파지 Vib-PAP-2의 유전체 서열은 비브리오 박테리오파지 VP93의 유전체 서열(Genbank Accession No. FJ896200.1)과 비교적 높은 상동성을 가지고 있는 것으로 확인되었다(Query coverage/identity: 95%/94%). 그러나 박테리오파지 Vib-PAP-2는 환형의 유전체를 가짐에 반하여 비브리오 박테리오파지 VP93은 선형의 유전체를 가져 서로 상이한 박테리오파지라 판단할 수 있었다. 또한, Web상의 NEBcutter V2.0(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/index.php) 프로그램을 이용하여 박테리오파지 Vib-PAP-2의 유전체 서열과 비브리오 박테리오파지 VP93의 유전체 서열을 비교분석한 결과, 박테리오파지 Vib-PAP-2의 유전체를 단일 절단(Single cut)할 수 있는 제한효소의 종류가 8개(AhdI, BglI, BsaI, BseYI, BssHII, EarI, MscI, PsiI)인데 반하여, 비브리오 박테리오파지 VP93의 유전체를 단일 절단할 수 있는 제한효소의 종류는 10개(AcuI,,,,,,,,,)인 것으로 보아 서로 상이한 박테리오파지임을 다시 한번 확인할 수 있었다.

이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 Vib-PAP-2는 기존에 보고된 바 없는 신규한 박테리오파지라고 판단할 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 Vib-PAP-2는 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단하였다.

실시예 3: 박테리오파지 Vib -PAP-2의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능 조사

분리된 박테리오파지 Vib-PAP-2의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균은 본 발명자들에 의해 분리되어 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균으로 동정된 것들로 총 14주이었다. 박테리오파지 Vib-PAP-2는 실험에 대상이 된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 중 13주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Vib-PAP-2의 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 및 에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida)에 대한 사멸능 조사도 별도 실험으로 실시하였는데, 그 결과로 박테리오파지 Vib-PAP-2는 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.

이상의 결과로 박테리오파지 Vib-PAP-2는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 특이적인 사멸능을 가지며, 다수의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Vib-PAP-2가 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지 및 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.

실시예 4: 박테리오파지 Vib -PAP-2의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 예방에 대한 실험예

9 ㎖의 LB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 10⁸ pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Vib-PAP-2 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 LB 배지를 담은 튜브에는 동량(100 μl)의 LB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액을 넣어 주었다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Vib-PAP-2 액을 첨가해 준 튜브에서는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.

비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 억제

구분	OD600 흡광도 값
	배양 0분	배양후 60분	배양후 120분
박테리오파지 액 미첨가	0.52	0.92	1.84
박테리오파지 액 첨가	0.53	0.31	0.15

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-2가 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장을 저해하여 감염을 억제할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Vib-PAP-2가 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염을 방지하는 목적의 조성물 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.

실시예 5: 박테리오파지 Vib -PAP-2를 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 예방 동물실험

농어(Sea bass)를 이용하여 박테리오파지 Vib-PAP-2의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염 예방 효과를 조사하였다. 농어 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm) 50마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 실험군(박테리오파지 투여군)의 농어들에게는 1× 10⁸ pfu/g의 박테리오파지 Vib-PAP-2를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험개시일로부터 7일째가 되는 날부터 2일간 실험군과 대조군 모두에 대하여 각 군에 급이하던 사료에 추가로 1× 10⁸ cfu/g 수준으로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 오염시킨 후에 이를 하루 2회씩 급이하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염을 유도하였다. 2일간의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염 유도 다음날(시험 개시일로부터 9일째가 되는 날)부터는 다시 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 오염이 없는 각 군에 맞는 사료를 급이하였고, 이날부터 매일 모든 시험동물들을 대상으로 비브리오병 발생 상태를 조사하였다. 비브리오병 발생 상태 조사는 체색 흑화지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 체색 흑화지수 측정은 통상 사용되는 Dark Coloration(DC) score(정상: 0, 연한 흑화: 1, 진한 흑화: 2)를 측정하는 방식으로 실시하였다.

시험 결과는 표 2와 같았다.

체색 흑화지수 측정 결과 (평균치)

날짜	D9	D10	D11	D12	D13	D14
대조군(박테리오파지 미투여)	0.68	0.72	0.76	0.92	1.08	1.20
실험군(박테리오파지 투여)	0.16	0	0	0	0	0

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-2가 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 원인으로 하는 감염 질환의 예방에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 박테리오파지 Vib -PAP-2를 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 질환 처치예

비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 비브리오병이 유발된 농어에서의 박테리오파지 Vib-PAP-2의 처치 효과를 조사하였다. 농어 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm) 60마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 10⁸ cfu/g 수준으로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료를 하루 2회씩 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료 급이 마지막 날부터 비브리오병의 임상증상을 보이는 개체가 두 수조 모두에서 확인되었다. 3일간의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 실험군(박테리오파지 투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-2를 포함(1× 10⁸ pfu/g)하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험 개시일로부터 8일째가 되는 날부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 비브리오병 발생 상태를 조사하였다. 비브리오병 발생 상태 조사는 체색 흑화지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 체색 흑화지수 측정은 통상 사용되는 Dark Coloration(DC) score(정상: 0, 연한 흑화: 1, 진한 흑화: 2)를 측정하는 방식으로 실시하였다.

시험 결과는 표 3과 같았다.

체색 흑화지수 측정 결과 (평균치)

날짜	D8	D9	D10	D11	D12	D13	D14
대조군(박테리오파지 미투여)	0.93	1.00	1.07	1.13	1.23	1.37	1.40
실험군(박테리오파지 투여)	0.87	0.80	0.77	0.63	0.40	0.23	0.20

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-2가 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 원인으로 하는 감염 질환의 처치에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 사료첨가제 및 사료의 제조

박테리오파지 Vib-PAP-2 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 10⁸ pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-2가 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(50%, w/v)한 다음에 동결건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루 형태로 분쇄하였다. 상기 제조 과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.

이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 250배의 양어용 생사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.

실시예 8: 약욕제의 제조

박테리오파지 Vib-PAP-2 액을 이용하여 약욕제 1 ㎖당 1× 10⁸ pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-2가 포함되도록 약욕제를 제조하였다. 약욕제의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ㎖당 1× 10⁸ pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-2가 포함되도록 상기 박테리오파지 Vib-PAP-2 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 약욕제로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.

이렇게 제조된 2종의 약욕제는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 약욕제로 사용하였다.

실시예 9: 농어 사육에서의 사양 효과 확인

실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료와 약욕제를 이용하여 농어 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 500 마리의 농어 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm)를 250 마리씩 한 그룹으로 총 2개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 약욕제로 처치한 그룹-B)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 125마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Vib-PAP-2가 적용된 소그룹(소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 각 시험 소그룹의 농어는 일정 간격을 두고 위치한 격리된 각각의 수조에서 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 4와 같이 구분되고 지칭되었다.

농어 사양 시험에서의 소그룹 구분 및 표시

적용	소그룹 구분 및 표시
	박테리오파지 Vib-PAP-2 적용	박테리오파지가 적용되지 않음
사료로 급이한 그룹	A-①	A-②
약욕제로 처치한 그룹	B-①	B-②

사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 설명한 사료 제조 방식에 따라 제조한 사료를 표 4의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이 하였으며, 약욕제 처치의 경우에는 실시예 8에서 설명한 약욕제 제조 방식에 따라 제조한 약욕제를 표 4의 구분에 따라 통상적인 약욕제 처치 방식에 따라 처치하였다.

시험 결과는 표 5에 제시되어 있다.

농어 사양 시험에서의 폐사율

그룹	폐사개체수/시험개체수	폐사율(%)
A-①	3/125	2.4
A-②	25/125	20.0
B-①	8/125	6.4
B-②	32/125	25.6

이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료의 급이와 본 발명에 따른 약욕제 처치가 농어 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 농어의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

KCTC KCTC12910BP 20150922

SEQUENCE LISTING <110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Novel Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-2 and its use for preventing proliferation of Vibrio parahaemolyticus <130> KP090440 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 43221 <212> DNA <213> Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-2 <400> 1 gtcattaccc agttgagcaa tgatttcacg catcttatct gtgtctgaga tacggaagaa 60 gctcatccca gttgggaaaa gcgtccgtgt cagtttacta gcaaggttgt taaccaacat 120 agcaccgtga gattggaagt cgcgttgaag tgatacgcgc tctccgtctt tgttctcacg 180 tgtaaaaacg gtaggcactg tccagaaagc ataacgctct gaactcagag taacctcaga 240 gtcctcatac ttagcgaaca gagcctcgtg agtctcttga gtatgcatac agtaccttat 300 aatcctaagc ttgaactaac gtcagccatc ttgcgtttac gagttgtaag accaagagca 360 tcatcggctg ctagatttgc agaaccgcct gtctcaacct taactacgtc gtcaagagct 420 ttgttagctt ggagtgtgtt agcttcacgc attcgagtct gttcggcttc gaactgtttc 480 ttctgcgcat cagcttggcg gcgtgcttct cgtgccgcat ctttaccact atcgaatccc 540 atgtttcacc ttgtagtact tgagtctgta ctcgtactcg ccctgcttgt gagggatgag 600 cacccagtcc agacgttgtg 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Claims (7)

1. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 포도비리대 박테리오파지 Vib-PAP-2(수탁번호 KCTC 12910BP).
2. 제1항의 박테리오파지 Vib-PAP-2(수탁번호 KCTC 12910BP)를 유효성분으로 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 비브리오병 방지용 또는 치료용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 약욕제 또는 사료첨가제 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 비브리오병 방지용 또는 치료용 조성물.
4. 제2항에 의한 박테리오파지 Vib-PAP-2(수탁번호 KCTC 12910BP)를 유효성분으로 포함하는 조성물에 사람을 제외한 동물을 담그는 처치를 실시하는 단계를 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 비브리오병을 방지 또는 치료하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 약욕제 형태인 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 비브리오병을 방지 또는 치료하는 방법.
6. 제2항에 의한 박테리오파지 Vib-PAP-2(수탁번호 KCTC 12910BP)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 비브리오병을 방지 또는 치료하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제 형태인 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 비브리오병을 방지 또는 치료하는 방법.

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