KR101915493B1 - 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-8 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 - Google Patents

신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-8 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101915493B1
KR101915493B1 KR1020170058073A KR20170058073A KR101915493B1 KR 101915493 B1 KR101915493 B1 KR 101915493B1 KR 1020170058073 A KR1020170058073 A KR 1020170058073A KR 20170058073 A KR20170058073 A KR 20170058073A KR 101915493 B1 KR101915493 B1 KR 101915493B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bacteriophage
vibrio parahaemolyticus
pap
vib
composition
Prior art date
Application number
KR1020170058073A
Other languages
English (en)
Inventor
윤성준
전수연
권안성
송현민
정지인
강상현
Original Assignee
주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 인트론바이오테크놀로지 filed Critical 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority to KR1020170058073A priority Critical patent/KR101915493B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101915493B1 publication Critical patent/KR101915493B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/10—Washing or bathing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-8 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도{Novel Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-8 and its use for preventing proliferation of Vibrio parahaemolyticus}
본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해서 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
비브리오 속(Genus)에 속하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 균은 주모성 편모가 있는 통성혐기성균으로 그람 음성 간균이며, 전 세계적으로 기수지역이나 연안의 해수 및 수산물 등에서 널리 검출되는 해양 상재균으로, 수산물 섭취와 관련된 세균성 식중독의 주요 원인균으로 알려져 있다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 대부분은 비병원성이며, 용혈현상을 보이는 것만이 병원성이 있다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균은 혈청학적으로 75종의 협막항원(Capsular, K)과 13종의 균체항원(Somatic, O)으로 분류되어져 있으며, 편모항원(Flagella, H)은 모든 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 공통적으로 존재한다. 따라서 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 혈청형은 K 항원형과 O 항원형의 종류에 의해서 구분된다.
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균은 다양한 어류 및 패류 등에서 비브리오병(Vibriosis)을 유발하여 수산 양식산업에 있어 심각한 경제적 피해를 초래하고 있다. 특히 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염에 의한 어류의 비브리오병은 그 발병 빈도가 높기 때문에 경제적 피해 초래가 크다. 따라서 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염을 예방하고 나아가 감염 처치에까지 활용될 수 있는 방안의 개발이 절실한 실정이다.
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방이나 치료 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 이들 항생제들에 대한 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다.
최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성으로 인하여 박테리오파지는 대상으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 세균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
세균을 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 세균 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 발생 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-세균제로 주목을 받고 있다.
앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 박테리오파지의 세균에 대한 높은 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.
이에, 본 발명자들은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고, 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 서열 정보를 확보한 후에 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음에 이 조성물이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP)을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP)을 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 감염하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP)을 유효성분으로 포함하는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용되는 약욕제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
박테리오파지 Vib-PAP-8은 본 발명자들에 의해 분리된 후에 2017년 4월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 13248BP).
또한, 본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Vib-PAP-8을 유효성분으로 포함하는 약욕제 및 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Vib-PAP-8은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 효과적으로 사멸시키므로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”라는 용어는 (ⅰ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 감염 방지; 및 (ⅱ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅱ) 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 본 발명의 박테리오파지를 특정 지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 본 발명의 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Vib-PAP-8이 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Vib-PAP-8은 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1× 1030 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 약욕제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다. 이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-8을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 기존의 항생제 등에 기반을 둔 방식에 비하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래시켜 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[비브리오 파라헤몰리티쿠스 균종에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.
도 1은 박테리오파지 Vib-PAP-8의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Vib-PAP-8의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 Vib-PAP-8이 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 Vib-PAP-8이 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 Vib-PAP-8의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주들은 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균으로 동정(Identification)된 것들이다.
박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 LB(Luria-Bertani) 배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화 나트륨, 10 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 3-4시간 동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에는 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복 실시하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.
상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. LB 배지에 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액 3 ㎖(OD600이 1.5)을 LA(Luria-Bertani Agar) 평판배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화 나트륨, 10 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액에 첨가해 주어 4-5시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 37℃에서 4-5시간 동안 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후에 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때, 신규 확보된 박테리오파지는 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.
이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음에 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.
상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Vib-PAP-8로 명명한 뒤, 2017년 4월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13248BP).
실시예 2: 박테리오파지 Vib - PAP -8의 유전체 분리 및 유전체 서열 분석
박테리오파지 Vib-PAP-8의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/㎖) 100 μl를 첨가한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음에 이를 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Vib-PAP-8의 유전체를 다량 확보하였다.
이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 마크로젠에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행한 다음 박테리오파지 Vib-PAP-8의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Vib-PAP-8 유전체는 58,496 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 Vib-PAP-8의 유전체 서열 정보를 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 50% 이상의 상동성을 가진 박테리오파지 서열은 확인할 수 없었다. 한편, 본 발명자들에 의해 자연으로부터 분리된 박테리오파지인 박테리오파지 Vib-PAP-6(수탁번호 KCTC 13246BP)의 유전체 서열과의 상동성에 대해서도 BLAST 조사를 이용하여 비교해 보았다. 그 결과, 박테리오파지 Vib-PAP-8의 유전체 서열은 박테리오파지 Vib-PAP-6 유전체 서열과는 비교적 높은 상동성을 가지고 있는 것으로 분석되었다(Query coverage/identity: 92%, 및 95%). 그러나 박테리오파지 Vib-PAP-6과 비교할 때, 박테리오파지 Vib-PAP-8은 유전체를 구성하고 있는 염기의 수에서 차이가 있을 뿐만 아니라 유전체 상의 개방형 해독틀(Open Reading Frame, ORF)의 개수도 78개로 (박테리오파지 Vib-PAP-6은 79개) 차이가 있었다. 이러한 사실에 근거하여 두 박테리오파지는 서로 상이한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다.
이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 Vib-PAP-8은 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 Vib-PAP-8은 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단할 수 있었다.
실시예 3: 박테리오파지 Vib - PAP -8의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능 조사
분리된 박테리오파지 Vib-PAP-8의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주들은 균주은행을 통하여 분양을 받거나 본 발명자들에 의해 분리되어 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균으로 동정된 것들로 총 25주였다. 박테리오파지 Vib-PAP-8은 실험에 대상이 된 비브리오 파라헤몰리티쿠스 25주 중에 CCARM0135 균주(참조, CCARM: Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, 항생제내성균주은행)를 포함하여 총 22주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Vib-PAP-8의 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 및 에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Vib-PAP-8은 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.
이상의 결과로 박테리오파지 Vib-PAP-8은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 우수한 사멸능을 가지며, 다수의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주들에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Vib-PAP-8이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.
실시예 4: 박테리오파지 Vib - PAP -8의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염 예방에 대한 실험예
9 ㎖의 LB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Vib-PAP-8 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 LB 배지를 담은 튜브에는 동량의 LB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 배양액을 넣어 주었다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Vib-PAP-8 액을 첨가해 준 튜브에서는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.
비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장 억제
구분 OD600 흡광도 값
배양 0분 배양후 60분 배양후 120분
박테리오파지 액 미첨가 0.49 1.12 1.61
박테리오파지 액 첨가 0.49 0.26 0.17
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-8이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Vib-PAP-8이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예 5: 박테리오파지 Vib - PAP -8을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 동물시험
농어 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm) 60마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 시험 전기간 동안에 걸쳐 실험군(박테리오파지 투여군)의 농어들에게는 1× 108 pfu/g의 박테리오파지 Vib-PAP-8을 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-8이 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험개시일로부터 7일째가 되는 날부터 2일간 1× 108 cfu/g 수준으로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 급이하는 사료에 포함시켜 하루 2회씩 급이하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염을 유도하였다. 시험 개시일로부터 9일째가 되는 날(비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 감염 유도 후 2일째)부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 비브리오병 발생 상태를 조사하였다. 비브리오병 발생 상태 조사는 체색 흑화지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 체색 흑화지수 측정은 통상 사용되는 Dark Coloration(DC) score(정상: 0, 연한 흑화: 1, 진한 흑화: 2)를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 2와 같았다.
체색 흑화지수 측정 결과(평균치)
DC score(mean)
날짜 D9 D10 D11 D12 D13 D14
대조군(박테리오파지 미투여) 0.76 0.80 0.88 0.88 1.00 1.08
실험군(박테리오파지 투여) 0.28 0.12 0.04 0 0 0
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-8이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 예방에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 박테리오파지 Vib - PAP -8을 이용한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료예
박테리오파지 Vib-PAP-8의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 효과를 조사해 보았다. 농어 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm) 60마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 108 cfu/g 수준으로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료를 하루 2회씩 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료 급이 마지막 날부터 비브리오병의 임상증상을 보이는 개체가 두 수조 모두에서 확인되었다. 3일간의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균이 오염된 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 실험군(박테리오파지 투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-8을 포함(1× 108 pfu/g)하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 농어들에게는 박테리오파지 Vib-PAP-8이 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 강제감염 후부터 3일째가 되는 날(시험 개시 8일째)부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 비브리오병 발생 상태를 조사하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 비브리오병 발생 상태 조사는 실시예 5에서와 같이 체색 흑화지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 3과 같았다.
체색 흑화지수 측정 결과(평균치)
DC score(mean)
날짜 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
대조군(박테리오파지 미투여) 0.87 0.97 1.10 1.17 1.13 1.30 1.33
실험군(박테리오파지 투여) 1.00 0.90 0.83 0.73 0.40 0.17 0.13
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Vib-PAP-8이 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 사료첨가제 및 사료의 제조
박테리오파지 Vib-PAP-8 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-8이 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(50%, w/v)한 다음에 동결 건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루형태로 분쇄하였다. 상기 제조과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.
이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 250배의 양어용 생사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.
실시예 8: 약욕제의 제조
약욕제는 다음과 같이 제조하였다. 박테리오파지 Vib-PAP-8 액을 이용하여 약욕제 1 ㎖ 당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-8이 포함되도록 약욕제를 제조하였다. 약욕제의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ㎖ 당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Vib-PAP-8이 포함되도록 상기 박테리오파지 Vib-PAP-8 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 약욕제로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.
이렇게 제조된 2종의 약욕제는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 약욕제로 사용하였다.
실시예 9: 농어 사육에서의 사양 효과 확인
실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 및 약욕제를 이용하여 농어 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 1,000 마리의 농어 치어를 500 마리씩 한 그룹으로 총 2개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 약욕제로 처치한 그룹-B)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 250마리씩으로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Vib-PAP-8이 적용된 소그룹(소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 농어는 치어(체중: 5~7 g, 체장: 8~10 cm)였으며, 각 시험 소그룹의 농어 치어는 일정 간격을 두고 위치한 격리된 각각의 수조에서 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 4와 같이 구분되고 지칭되었다.
농어 사양 시험에서의 소그룹 구분 및 표시
적용 소그룹 구분 및 표시
박테리오파지
Vib-PAP-8 적용		 박테리오파지가
적용되지 않음
사료로 급이한 그룹 A-① A-②
약욕제로 처치한 그룹 B-① B-②
사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 4의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이 하였으며, 약욕제 처치의 경우에는 실시예 8에서 설명한 약욕제 제조 방식에 따라 제조한 약욕제를 표 4의 구분에 따라 약욕제의 희석액에 어체를 담그는 방식으로 실시하는 통상적인 약욕제 처치 방식에 따라 처치하였다. 그 결과는 표 5와 같았다.
농어 사양 시험에서의 폐사율
그룹 폐사개체수/시험개체수 폐사율(%)
A-① 9/250 3.6
A-② 42/250 16.8
B-① 8/250 3.2
B-② 54/250 21.6
이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료의 급이와 본 발명에 따른 약욕제의 처치가 농어 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 농어의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
이상의 결과로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
KCTC KCTC13248BP 20170412
SEQUENCE LISTING <110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Novel Vibrio parahaemolyticus bacteriophage Vib-PAP-8 and its use for preventing proliferation of Vibrio parahaemolyticus <130> KP090529 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 58496 <212> DNA <213> Bacteriophage Vib-PAP-8 <400> 1 ttaactacga cagacatgtg gtcatctcct tcttaaccca ttcaatgaac tctttacgtt 60 cgattgcaat acgtgcgtaa accttgtcct cgtctccggg ctcagtcagt agctcaatac 120 cgaagtattt cttagacatg tctaggaacg ggtggatacc gaagtattct gggaacccct 180 tattaaggcg gtgctcattg agcttttgtg accacagtgt gcgcacacgg ttgaattgct 240 cggcgtgcaa agataggttc tcttgcgtca cgttgtgcac gttaaggatc cattccttaa 300 ttgcagtaca cgtccagtga tcgtattcag ggtacgttgc ttcataccac gcaatgtatt 360 gaagcacttc ttcgttaagt atttccatca tgcagacctt atgttattgc agaaagtatg 420 tacattatac aaagtgtgta gcgcattact agacaacctt ctaaaacctc aaatcttttt 480 ggacggcgga taaagttgtc agcatctcgg ccggcatata ttgtcgacga tcatcgggcc 540 cccggcggca cgtccaggtc atcgccctat gtacaccgaa gagtatgata tacccctcaa 600 agctgtacac acatcgataa gctgtacatc ggtcatactg tatgtatata cagggtgaaa 660 catatctgag gaaataaata atcgatgcgg catctccgac ggctataaaa agccgcccat 720 cgtggcaccc ccaccccttc ggggcatgta caccgaatag ttcaacaggg agtggatcgc 780 tgtacgcaca gcataaagct gttgttcaca ataagaacaa tagctaacga catcgacaaa 840 aaagcacgcc gaagcgtgct atgttggtat ggttattgct tagtgcatag ttatgcaggt 900 cggtctactt cctcacctgt tgtgtaatgt atgaatagta gaccgctatg gtcctcaagt 960 gttaccaagc tgtcgcacag cacccatgtg gtcaccatgt cactcacacg gtgtcgcatc 1020 gcaccagtac agcacacctc gatggtgtta aacacgtcgt ccagtataac ttcctcgtcc 1080 atgtcacctt gggacagcat accagtgtga tcacagcgat accagttgta gtgagacaac 1140 agctcttcga ttgcaggttt gacgtaacaa agtttattaa tatccatgtg aataacccct 1200 aaagtgtagc tgcgtattga cacgcgaaaa caatgattgc aaaaagtgta ccaacaaata 1260 aaccgtatga aatatctgac atagtgttaa ccccactttt cgtctaagtt aaagatgtga 1320 cctagtagcg cagctacagg gaaaaataat ataaagaaca atagcgtgaa catgtgctta 1380 cccctttggt atgtacttat attatgaatt ttgcggggta atgtcaacga aaaaagtgtg 1440 cagtagcgca cacttttgta atgaaagttc taaacaggtt atccacaagg acgtacagct 1500 catgaccaca tgtacgggaa ttcgctgtac gcccaccttg aacttctgtg gataagttga 1560 tttgcgacgt tagcgcaaga tcaatactaa gagcaaggtg aaggtcaatc agcgttacac 1620 gcgcttacag ggacaatata agcattcttg actggtcgac cgtaaccagt tacaacggtt 1680 tcgacttcca atgcaaacgg tataccaagc gcttcagctt tagcattgag aaattccatg 1740 cgggcacaca gtggaacatt tttgtgtgcg gtacgcttta agcggtaaaa cttcatacga 1800 tacccaagta cagctttagg atgctttttc accttattgc tgtacaagcg taaatatcca 1860 acaccttgta ttccaagttg tgctttgaac cagttgcgca cttcaacacg gttttcgatg 1920 ttaataacat aagacattat agttgcacct cgcggaatgt gattaagtgg tttaacaagc 1980 tgttaatatg gtcgtcgttg cagccgtcgt tatatagcat ggtgatgtaa catgttttgt 2040 tgtccgcacc catacgtcgc agcatacccc aacgcagcgc gaccaacccg tcgtcgtaca 2100 tgtcactagt catataatga ttaataacgt cacttgtgat tgagacaccg ttgagcagct 2160 taccaagctt ttcaataatg acaccctgag cggttgcgct cgcttttaac ttactgttaa 2220 cgactggacg cacttgcatt tccattcgag atctgttagc aatatttgac ataattaaga 2280 ctccggttta cgaaccataa ataataagat tataaagaaa taagctgcta cggggattag 2340 tgcgcacagt acagcgatta gaaccatgcg caccagaaag cggcacatta agctttagat 2400 ttagtgtgac cctcgaactt gcgccacacg tacagctcga tgactgcgtt gttttcgtta 2460 gcacccacct cacgcgccca cgctttaagc tgcttcggca ttggtactag acccgtttca 2520 gcatagatgc ggtcacattc gtcccataca gcgcgacacg caccgcctac gctaggtcgt 2580 ttgatgccat tcttctcttc acggtttttc tcaatcttga taccgcggcc aaacagtttc 2640 accgttttag gtgcttcgca tggtaacgct acaccgcgca acactgcaac cgagttaaca 2700 acgttaggaa tgacgacctt cggagttcct tggaaccaac gaccctcagc gttttgctgc 2760 ggcatgtggt cagcgtccgc aacacccgca cgacgaagag ctttgattag accagatttg 2820 ttagcgtatg ttttgatagt tgacatagtg aattacccct ttaggtatta ttaacaagat 2880 ggttattagt gcaccccgta gggcgcactg tataacaacc ctgttaagct acgttgacag 2940 atactgagaa gtggccgtca ccgcatggtc gagcattaag aactaaatta gtgtcttcta 3000 aataacgctg cattagttcc acgctaccct tgcaccagtg cagctgaacg cgacctgacc 3060 acattttggt ggtgctgtcg ataaggccga cttcggtgcg gtcactgatt gcgatgcgac 3120 caacttgaac acctgctgat ttagctgctt tacgaagtgc acgaactgct gaagtagttg 3180 ttagcttaga cataatattt accttttata tagtggggtt tgctttattg ctgtaccccg 3240 ttgctgtgtg tacataatgc gaaatattca ctcacctgta aagcgaattt ttgcgaaaaa 3300 taccaaaaaa gtcacaatcc gtttaaaagt gtgcgcaatg tcgcattatc atgaattaat 3360 gaactaaacg ggtgatataa tccttgcttt tagtctttac ctagtgtaac cgcgcacgca 3420 cactatatat aaatgcagct accccaaatg aagcacgcta aaatcgcgtg tgggccactt 3480 tagcacccta gccaatacca ttgcattgat cagcgcacaa agccgcgcac acgcgcatac 3540 agcgactcgg aatcttgcga gccaagctat tcgcaatgta caccttttcg gggtgcggtc 3600 gggatatcgc tgcacatcac acttctaaag aaatataatc taaaacagct aaagaaaggt 3660 aatcgaaggg aggacgacgg ctcgccagtc ttctggctat agcgaaccgc cagttttttc 3720 atttgccagt tttttaaatt cgagtgacca catagccaag tgctgcaacc gtcaccgacg 3780 cgacaactgc caaggttatg caaccccatt tcaatgtttc aatttgttct ttggcgcgtc 3840 gtaacttgcc ttgtgcaact gtgacgttgt ttatttccat tgcccattgt tgttttagat 3900 gttcaacatg gtctctttta taagcgtgca gcaaatccaa aagctctggg ctaacgtaca 3960 tatcaacttc tgcgccaaag taattccctt gctcaatgag ttcataagga accgtgccca 4020 tgtcgtgctc tagcatttca aatcgttctg caaagcgcag gaatttgatt tgcgggtaga 4080 caccgtattc cacagaatca ttgcagggcg tttcacctcc gcccgtgggc gtttcaccga 4140 tgggcgtttc gcgaacatct ttcagatatt ggttcatccc cggctctacg tctttatatt 4200 caattgttgc tactttcatc gttcaaatac ccttttagtt gcgtttgtca gacaactcgt 4260 caaactgagt ccgaaattaa ggttactata tattgctatt actagttgtt acccaaagtc 4320 aagctgtttt tgcacaagtg gcacaacttt tttgcacact actagcatta agtccgttaa 4380 aacacttaaa tagtaatacc aattgaattg ttcttaataa agcatatata tatagtagtt 4440 aaattaaaag acattattat tattattata tattttattt attggaactt taatttacta 4500 ttagatgctt ttattttact actagttgga ctagaaagta gtgcgcaact ggcacaattt 4560 tgagggggcc tagagatatc cacagatccc cccccccttc gttttttggg taacttgtgc 4620 ccctttacgt aaccccctgt ttttacaaac aaaaaacggt tttttttgtg cgcacttaag 4680 gcagcattcg acccctgact tgcgcactac ttttttatta gtataaagtt gtgtttatta 4740 gctatacaca ctcaatagac cttctagcag cacactatat atagctaaga acagcaaact 4800 atattcccaa cagaaagtaa cacatacaac ataaactctg cttattagct ataatataca 4860 ctttcagtta cccttcaagc acacttgtct tgcagtacca gtgctctgca cataatatat 4920 aaagcacaac cagtatacgc agtcccaata ctctgcacat tattagtaaa gcgcatggtc 4980 ttgctaggca ggtactctgt gcattgcaaa gacaagtaat ataaagcaca gccggtactc 5040 tgcgcattgc taataactga caggtatgtg gtcacaataa agtatagggt tgtcttgtta 5100 attaaaggcg tatgcatata ataaaccgca tacattgaac gcaaagagga acaaacaatg 5160 gtagctgtaa acaataatgt agtaggtaca acggaacaac cgttcgagcg cggtaatgcg 5220 cctgacatgg caatgccgag catgagcgag caagacatgt taacattcat ccgcgagaag 5280 tatgatggcc aggagttatt taacgccctc tatatttccg ttgctgacat ttgccagatg 5340 gttgatgtta cccctgttag cgttactaac aagcttcgta agtatcctcg ctttaagatt 5400 ggcaactctt ggtactggaa acgtactgac gatatgatgg agtttattca agcttggatt 5460 aagatgcgag gttaagtaga tggatatgcc ttggcagctt aagaagctgc gtcgttggtg 5520 ctttacaggc acagagtttg acggcgggat ggctaaggct ccgtttgctt atgtggacgg 5580 taagttcgtc ccgatttcgg taactagtga ccacaataag ctagttagtt atgaagaact 5640 tttacccttg cttgcacaac accctgaacg tgggtttggc tttgtcctta ctgaaggaga 5700 tgggtttacg gtagcggata ttgacattgg tgatgacact agtgttgagg ctactgagca 5760 atggtggaac gctgtgcagt cttaccagac ctatacggaa gcttcccgtt ccggtggtgg 5820 ctatcactta tggtttggag gtgagattgc aggttcatac aagcgtggtg ggctagagtt 5880 atactccaag gaacgtttca ttatctgtac gggtaatgtt attcttggat ataacattcg 5940 ttacgatcct gggcttatag accagtttaa ccaatacatc tcgaattccc gtagggtaga 6000 caacattgcg gacattgatg aacctgagaa gatgagcgat gctgatctgc ttactgaggt 6060 ttacgcatat gaccacagtg gtaagtttga atgccttatg acgggtgatt gggacaagta 6120 ccttgagatt atgaagcagc agggtgcaca cggcgtggat gtgtttgatg cctcgcgtgc 6180 tgacagtgcg tttatgacaa ttgtaacgta ctacacacgc aacattgaac agtgtaaacg 6240 cttgtggcgc atgtctgcac tcgctaatct tgagcttcgc tatcccggca accgtaagaa 6300 gcagcacgag aagcgcaacc atgttggaag cgaccgtctg ttacacttag ctattaaaca 6360 agcggcgact gagaacatga aagacgaaga gctacgcaaa gcccacgctg aggaaggtgc 6420 taaactcgca aaagagttac acgcgaagcg caataccaac gcgcaaacgg gtaacgctga 6480 gccaaagtac cagatgccac cactccaagg gaagcttcaa tacccgcctg gatggatggg 6540 ggaacttgcg aagcactttt acaacacagg tgtgaagcag attaaggagt ttgctattgc 6600 agaagcctta tcccttgcgt ctggtttgtt tggtcgcgct tacaacatta gcggaacggg 6660 tctcaataac tactttatgg tgctggctcc gtccggtact ggtaagtcac agctaacggc 6720 agcacctcaa gagtttatgc gtctgttgga acgtgagcaa ggtgtaattg atgcaagcaa 6780 gtttgtggtc agtgaagcct ttacccaccg taactctatg atgaaagtgt tccaagagaa 6840 tacatccttc ttgcacgctt tatcagagtt tggtaatcac ttccgtgcaa tggtaaaccc 6900 tgacggttct actcgtactg tgcgcgacct tatggttgaa acatactcta agtccggtgc 6960 gtatgatgtg ctaggtggtg ttcgctacac ggacatggac aaaacggtta acattaacca 7020 tgcggttgct tatagcttcc ttggcgaatg tgtaccagaa acgttctacg actgtctaaa 7080 cgaagaggcg tttggtgacg gttttgtatc gcgctttatc ttctcagagt ttagtgggga 7140 agtaccatac gataatattg ataagggtgt gcgacctagc cccgctctaa ttgaccacat 7200 gactaacgct gtgctttgca tgagctctgc attgcgtgac ccaaatcatg tggacgttat 7260 gccgattgct ttacctccgg acatctctga aaagttccgc acactgtcgc gctactgtac 7320 ggacatggtt aaccaacaga atacgtccca tgcttggaac gcaacatgga cgcgtactaa 7380 cttgaaggtc atgaagatat ctgcattgct tgcggtgatg gataacccta ccatgccgaa 7440 ggtttgtgaa caacatatga actgggcttg ggactacgtg ctacgccaca accaccttgt 7500 ctgggatgct gttcaaagcg gtaaggttac aatggatggt actacacagc gacgcgctga 7560 gcttattgct agcgttatgc agaagtttgt cgagcaacct tatgttaata tctccacgtc 7620 cgtgcgacgt gtgtacaaag aagacctaca tcgcgatggt ttggtaagcc gtgctgctat 7680 tgttcgcagc gttggccgaa gcaagctgtt cgcagatact ggtggtcgag gtgttgaaga 7740 ccacattaac gcagctttgc gtcacttgga agctatggac gttattcgtt cttttactaa 7800 gaaggaaatg cgtgacaagt accaagctcg atgtgaagca tacttatatt taggagagta 7860 atatgaaagc tattgaagcg cttcgcgcgc aattacatgc acaagtggac gcggctattg 7920 acacgtttat gcagtctagc cctgagtgtg agacccctaa gtttccggtt tgggaacgtc 7980 aagaagaagt tgtactgtcc caaattaagt atttcttaga cggcgatcat tcaactttac 8040 ttgaagaggt tcgagatgcg tacgaccaac agttgcacgt agagggttgt gtacctgttg 8100 cagtcttggc aatgaccctc aaacatgatc atatttttac cgtcgatggg tttaccgtgc 8160 acgacgttat ttttaacgtt tgtgaccata tgttcgagcg gggtattttg gatattatgg 8220 atgactcccg tgggttgcgc gttaaattga tttagtctag taaatacccc gttcgcgggg 8280 tattatatac acacttaata aacaaacaca caaaaggggt ttcctgtgtc taatgtatct 8340 actccgcaac ttgcggaact aattgtaaag gttgttgctt gggctgacgc tcgcggtttt 8400 aaagaaggtg ctacacttgt gtcgcagcaa gtaaaaggtg aagaagagca gggtgagttc 8460 gctgctaacc ttgtgcgtct agccgaagga gaagctgtta ctgtacttga tgaccttggt 8520 gatcagacgg ttgttggtat tatccaagct cacatgtcag gtttagaccc tgtacagttg 8580 atggaaagcg tttacctacg tgaccctgat gacgatgcgg gtttaacgtt ctgtcgtttg 8640 gttgctgctc atggtgcact agctgcggcg gttggtcgta agcgtgatat taaacaacag 8700 ctcattaact tcttcagttt gctgtttacc atgtgcgccg caatggaagt tagccctgag 8760 ttagctctgg agactgccta cgatgagatt aaagatcgtg gtggtaaatg gattgacggt 8820 acatttgtga aggaggctga ccttggctaa gttagctagt catattactg cgaacggggt 8880 tacgtactcc gtttcgcgca gcaagttcgg ttactacgca accaagaacg gtgagcgtgt 8940 aactggtaat ttcaagaacc tagatttgct tgagaaagct ttggagcgtc tataatgacc 9000 acagcagcat ttgacggtaa gttgtttgct acggataagc aagtgacttc caacaaccat 9060 gcgagcgacc gctttgcgcg taagctttac ttctaccctg actacggcct agtgctgact 9120 gttgcgggta atgcaccaag ctttatcgaa gttgttgatt gggctgtagg tgagattgct 9180 actgagcaac gctttgcagt gccagacggt gacttcactg tgctagctgt tcgcgtaact 9240 ccaggacttc caaacatgat ttacacaggt ttccgcggac cggacaacca atgtggtcac 9300 atggaacgtg agtacgaaaa gcgcaccgct atcggtagcg ggggtcagtt tgcacttggt 9360 gcaatggcta tgaaaggttc tgcggttgaa gctattgaaa tcgcaatgga cttggatgtt 9420 tatactggtg gtggtattga ctggtttgat acgattacca tggaacacag cgcggatgta 9480 attcgtcgca cccttaaaac agactggcct acatgggttc cacctgtgtc tgaggctgaa 9540 gcaccggaga cccctgaaga tgaacaataa gattgctcac tttacacctg acatgacaga 9600 cgaccaaatg atccacgcat ggtcgttgaa ccaagctttg ctgaaagagc ttaaaactgt 9660 ggaaatggaa cagcgtaagc agcttgctga aaagatgttc cctgacgcta aaaacggtac 9720 taacaagcac gaactaggtg cgggttatgt gctcaagtat gtgcgcggtg aagagaccaa 9780 gctcgatcct actgtgttcg aattgctacg cccagaccta cctgagcacg taattgacaa 9840 ggctgttaag tttaccccgt cactaattgc taagggtttc aaagacctta gtatggaaga 9900 ccgtgagaag ttggaagacg cgcttgttac taagcctaag tcaccaacac ttgatattgt 9960 tcctccaaag gagaagaaag atgaaatcta ataaaggttt tacccttatc gaactggtaa 10020 ttgttattat cgtccttggt gtactagctg ccacagctat gccaaaactg ttagacgcta 10080 gtgatcatgc acgtgtcgcg tcgttaacgc aatctgaaca gtctgctgaa attgctgtgt 10140 ttaaagcacg cgagctagac cgacaggaag tgcttgcacg caagactgat tcttggggtc 10200 cgcaggatat cctgattacc gacctacttg aaacggggtt acagtttaaa gctacaggtg 10260 accacactgg ttatttctac tttgagggta aagataacgc tcagtgtcgc ttaatgatca 10320 acctactccg cgaaagttcc tatagtaacg gtggtgaagg tatagctgaa gcgcggaccg 10380 ataagtgtta acgatttagt ctagtaatgt gtgctatgtg cggtattatg taccccatag 10440 cgcacagtta aatccctata gtgtattaac tcagtgcact atatgaattt aactaagtaa 10500 tctagcttat ttgcggtggt gctgtattat gtaccccata ccaaacaagc gttcaaccaa 10560 aacaaatccc ggaggattta tgaaaaacaa tgctgctatc gctctaatga cccttgtcgc 10620 tgctaactgc gtaactgtta acgtgcgttt caaagaccac aacggcaacg ctgtcggtca 10680 ggcgtacacg tacaaagctc caaaagacat ggagttggaa gcgggtgacg aagtggttgt 10740 ggacgcacca agcaccggca tgaccgtagt tgtggtcact gacgttcaca caacagctaa 10800 gatcgacatt gaagcacctt tccgttacaa atggattgtt gctaaggttg accgcaaagc 10860 ctacgacgac cttctagcta aggacgacgc tgcaactgag aaagttgaag agttgcaacg 10920 tgaagcgcag aaaacacgtg cacttgaaac ccttatgacc gagttaaact tggacaaagg 10980 tggtttggaa gagctactga aaaatcttgc ttaattggtg cggtgggggt actatgtact 11040 ccctaaccta accggagttg ttaaatggca atccaactag aatcttcaaa tatgttagca 11100 gttgcaaacg gtgttaaaat gtccatttac ggacgttcag gtatgggtaa gaccatgctc 11160 agctgtacgg caccggcacc gctaatcatc agtgcggagc gcggtctgct atctcttaag 11220 aaagagaaca ttgagcgtgt ttggggtgtt aacacgcccg gcattactta cgagctgcca 11280 gttattcaaa ttgagacaat tgacgactta attgaagctg aggcttactg tcgcactaac 11340 ccacaagcac agcagtttca aacaatcatt gttgactctg ttagtgaagt ggcagaaaaa 11400 gttcttgcgc acgctaaaaa gggtgcaaaa gatccacgtc aagcttacgg tgtaatgctt 11460 gaacgcatgt tggaagtaat taaaagcttc cgtgacctag acgggaaaca tgtggtgtta 11520 ctgtttaaag aagaacgtaa caaggatgag ggtacaggtc taacccttgc aggtccttcc 11580 gttcctggac agaagcttgg cccagcttcc ccttatctaa cagatgaggt gttccaactc 11640 tttagcggtc gcaatcccga ccagagttct taccgagctc tgcgaactca accagacttc 11700 agcgcggacg caaaagaccg ttctggtgca ctggacgaaa ttgagttccc gcatattggt 11760 agcgttatca acaaaatctt gggctcgcaa gctcaaccac agcaataata ggatatatcc 11820 atgaaactta aagcacttac tgtagcaatt ctttcttcaa tcggtactgg cgcaggtctt 11880 ggcgcgatgt tcgacgctaa ccaagtttct ccaaacgagg cttttgaaaa cttgcctctt 11940 ggttggtacg ttgcacgcat cgttgactca gaagagaaac cgaacagttc taacaacggt 12000 tcacacatcc tgctaacact tgaagttatt gcacctcagc agtacgcagg tcgtaagctt 12060 tgggatcgct tgaacctaaa caacccgaac caaactgcgg ttgaaattgc acagcgcaca 12120 ctgtctgcta tctgtcacgc aactaacgtg atgcagctac aagacacaat gcaacttcac 12180 ggtatcccaa tggaagtgaa ggttggtctg tctaaaccac aagacggtta cgagcagcgt 12240 aacgaaatca aaggctaccg tactgcgaac gctgcgggtg gcggtcagca acagtttggc 12300 ggtcaacagc agaactttgc cgcgcaaggt cagcaagctg caccacaaca acagtggaac 12360 ggcggtcaac aacagcaaca accagtgcag caacagcagc aatggaacgc accgcagcag 12420 caacagcaag caccacagca gcagcaacaa cagcagccag tgcaacagca gcagtggcaa 12480 gatccaaacg cacagcagcc tgtacagcag caacagcaag caccgcaaca agaagcagct 12540 ccgcaaggtg gtgaggttca gcaacaacct tggcagaaca gcgctccgca acagcaagag 12600 cagcaacagc aacagcagca acaacaggta aatcagcaac ctgtacaaga caacggtcag 12660 ggtaatccta gccaagtgca gtctgatcca aacgctcagc aagctgcaca aggtggcaac 12720 ccaccatggg ctcagcagta attcagctga cctagtctag cataagttaa tacagggggt 12780 tacaataccc cctgtattcg ttaataagga aagtaaacta ctatgttaga gcgtcaacaa 12840 ctcccagaac caacacactg ccacaactgc aaccatgacc acgtgcagtt cgtaaaccat 12900 aaagtcgttt acggcacgga gaaaggcaac tggccttaca tttggttgtg ttcttcatgt 12960 ggcgctattg tgtcttgcca cgagggtaca cgcaacccga aaggtttcat gtgcgacaag 13020 cacaccgcaa agctgcgtca aaaagcacac cacgtattcg ataagatctg gaagcgttac 13080 atgtattgtg cacgtgtgca cgcttatgct tccctagcag cgtctatgaa cattaacttt 13140 gatgactgtc acataggtca gtttaacgcc gagcaatgtg agtacgttat ccaatggagt 13200 aaggaacgtc taaagttgta caaatctaag aagaagcaaa aagctgttta ccgtggtggt 13260 aaaaagcgcg tcataaagga taaaggagta tggtaggaat taaaaccaat tttgcgaacc 13320 ctgttcagca cgcaaccgaa acactgaaag caattgagaa cgcactcgct gcggataatt 13380 gtggtcaatt ccgcatgaac ctacgtcagt tattccctaa gatggaagac gcgtaccgcg 13440 ggcaggaaga caagtttcgc aaccaccaag gtgcatctgg tatcggtaac gaatgcgacc 13500 gcgaaattca attaaagtgg cgctggacag cagcaccaaa atttgaaccg cgcttactgc 13560 gtctgtttaa ccgcgggcac ttagaggaag cgcgtttctt gtcaatgtta atgtgcattc 13620 ctggcgttca gttatggtac gaaacccctg aagggggtca aattaaatgg agtgattacg 13680 gtgggcatta cggctcagct ttagacgggg ttgcactagg tattcccgac gttccacaag 13740 gtgcggcgtg ttacacagag tttaaaaccg ctagtgaaag caagtttaac aagttcgtta 13800 aagacggttg tcgcattgag aactttactt actttgtaca gtgtcaacag tgtatgcatt 13860 acatgaattt gccatacact ctctttatgg ttgttaacaa gaatacggat gaattgtatg 13920 cagaaattat cacttatgat aaagaaattg ctgaaaagta cagcaagcgc gctggatcaa 13980 ttattttcgc cgaaggtaag gtatctcgca tctccgataa gattacattt tggaaatgtc 14040 gttggtgtga cgttaaagac gtctgccacg gaaaggaagt tccagatgtc aactgtcgca 14100 cgtgctgtca ttggagtgct gaacccaatg gctcttattc atgtcgacgt ggaaacaacc 14160 acgtacacga caaacagctt gccatgcagg gttgccccga gcacgtgttt gatccatcat 14220 tactaccgtc ctttgaccat gttggtggat cgacggacga caattacacc gtactcagaa 14280 ctcgcagcgg gcgggacttc aaacagggtc cgggatttat cacgtctgtt gagctaaagg 14340 agcttggtac gaagtatgaa gcctagagat tatcaggagt acgggattaa ctcgttcttt 14400 gactactact gcaacggggg taaaggcgac ggtctgttgc tttaccctac aggcacaggt 14460 aagtcgataa tcattgctga aattgtccgc cgcatgtgcg ggcaatggcc tggaacacgt 14520 gttatgatgc tcacgcacgt aaaagagctg attgagcaaa actacgacaa gctaaagact 14580 gtttggcgtc atgcacctgc gggcatctac tctgcgggtg cgggtcgtaa ggacacgcaa 14640 tatccaatca catttggcgg tgtgcaaagt gtggtcaaaa accccgggca gttcggcaaa 14700 attgacttgc taattattga cgagtgtcac cgtataccaa agagcgggaa caccagttac 14760 cagaaggtta tcaagttcct taagaagatg aaccctagaa tgattgtgtt ggggttaacc 14820 gctacagctt accgaatggg tggcggtaca ctccttgaga tgggtatctt cgaccatgtg 14880 ttagttgacg caactgaatt ccatgcgttt aactggttct ttgatcaggg gtacttgtgc 14940 accctgtcac catatcgaac tgaaactgaa attgacctta aaggtgtagg taaacaaggg 15000 ggtgactttg tacagtcgca acttcaaaaa gctacggata aggaagagat tacacatgca 15060 gcagttgcgg agatggttcg tgcagcggaa gaccaaggac gcgagcactg gctaatcttt 15120 gcaacgggtg ttgagcactg tgaccacatt gtcacggaaa tcattgagca gggttacact 15180 gcggtagctg tgcacagtaa gatgagttct aagcagcgcg atgaaaacat taagctgttt 15240 atggacaaga aagttaccgc gcttgtcaac atgggtgtgt taactactgg ttttgatgct 15300 ccgtttgtgg atttgctagg tattcttcga gctactgaat cagcttcgct atgggtgcaa 15360 atacttggtc gcggtacacg tacagattac gcagagggtt acgatttatc aacgcaacag 15420 ggtagacttg acgcaattgc taacagttta aaacccgatt gtcttgtttt ggactttgcg 15480 ggtaacaccc aacgcttagg accgattaac gaccctgtta cacccgagaa gaaaaagaaa 15540 ggtggtggtg aagcacctgt tcgcatttgt gataagtgta actttatgat gcacgcgtcg 15600 ctaaggttct gtcctaagtg tggtacggag tacccacctg agatcaagtt caaagctaaa 15660 gcgggaactg atgagcttat tgcacgcgct aagaagtccg caccgcctcc ggaagtgcat 15720 atattcaaag ttgaccgtgt gttcttcact cgcaagggtg gacgtgcagg taaaccggat 15780 tacttggaaa ttgcttatca tactggtttg cgtaagttta ctcagccgct atgcttggag 15840 cacgaaggtt tcgcgggtaa gaaagcgcgc gactggtggc gtgaagctac aggttgcgac 15900 gacaacgtac ctgaaaccat tgctgacgcc gcacaacgct ttgatgagtg ccgtacacct 15960 cgcaacatcc gtgtacacac caacaagaaa ccttatccac aaatcctaca aatagattat 16020 gagggtcaat atgacggaga agccactacc cctgttattt cgttctaaac aggaagttat 16080 cgtaacacag aagctaatga tggacgcggg cgtgttacag aattgttcta actgcgggca 16140 cgcggaccat gaacacaaca tttgcaagtt gtacaacgca acgccaccaa tgaaagtatg 16200 tggtcagggt tgtaacagtt gggaatacga cattccgttt taacattgtc tagaactttg 16260 tggggtagct tgttatagtt accccactta cttaataggg gttaacaaaa tggcgcaaat 16320 cactcgctta ccaacacata gcaaccgcaa tcagggttgc actgtgtata agggtaaaat 16380 caaaaaggca cgctacctga attgcattcc tggacgctgt gcgcacgttt acaacagtta 16440 cggtcggctc ctagaggtgt tccacggttc tgaagctgaa attattgctc agcttaacaa 16500 gaaaaactat cgtttcgagg gttaacaaaa tgccaaaact tagtgcaaca gctaaagccg 16560 cagcgttcgg cacaatgcaa gttctaaaag caaccgagca gaacaagggt cttcttgctc 16620 cgggattgga aggtttgtct gacggttact tagcgggttt tactgagcgt gtaatgaaag 16680 aaacgcttaa agctgcgtca attgaaaaag gtcgcacagg ttggtggagc gagcacattt 16740 gcacaattgg cgacctaatg gacatgcgtg caaaagcatt agcggataac gaccatgcaa 16800 gcgttatcaa cttcaccgca atgattatgt accgtgaagc ggcgggtgag tgtgtaccac 16860 ctaaaaagat ccaatgtatt tacaacccac aagttagtgt tcgaggttta tttgccgaaa 16920 aggacaaagg ctgtggcatg tgtgaccttg gtaagccagt tcgtactttt atccgcagag 16980 gtgtttacgt tgtggaagtt gaagacggtt ctctttacac gcctagatac gatagtaaga 17040 aatatcccaa tggggagcat cgaatggccc accatgagct tattgaacac atggaaacgt 17100 tttttaactt ggagcttaaa taatgcttta catactcgat acaactagca tgaagttagt 17160 cgcaaccact gacacaatgg aacaagctga gtaccttgcc gacctactgg ttgacggtaa 17220 aagcaacccg cacattgatg acatggggtt cgacgggttg gaagtgttta gcaacgctga 17280 gttggcggcc atttatgacc acactacagg gtctccaatt cgcaaccaac gcgaccgcaa 17340 cgaccgtgag tttttggttg gtttgctgct aaacttagcg cgtgatgtca aagacgagcg 17400 tagtgtcggg gcgttgtacg gcgcgctggg ccgcgtacca actaagccaa gtaaactacc 17460 cgcagcagag ccccgcgcgg ctgctacccc gagcacaagt ggtacaggcg agcgtcaaag 17520 cggtgcaaaa gagcgtattt ttgagcttgc cgatcaagct tgggaagctg cgggtaaacc 17580 aacggatgta tcagttgtcc tcaaactgcg taagcaatgg atgaacgact gggaagctat 17640 tggtatcaaa aagaccactg cttcatcaac tttgggtgct tggcaaaagt cacgcttggc 17700 atcttgataa cacgttaaaa ttatttgctt taggggttgc actgtaggga gttttccgta 17760 taatgggaac cctaaagcgg taaaacgtaa ctttttaaat ttagtccact atcggagaca 17820 gaacaatgaa caaactagca cttttggcac ttccactttt cgcatcaact ggtttcggta 17880 ctgaagcaga acctgaagca agcactgaag cagctggcgc agctactgaa ggcgaagcaa 17940 ctgctaagaa agaaaaagtt gaaaagccta aaatgccttc tcaaaacggc gtaacacgtc 18000 cacgtcctga cacactatgt ggtcgcgtat gggctatcgc ggacgaaatg tcagctaaga 18060 aacaggctcc ggtagcggtt gcagatctac ttgtggttac tgacgctgaa ggtcttaacg 18120 caggtaacgt ccgttgtgag tacgctgcat ggcgtaaatt ccacggtgta actggtcgca 18180 tcatgtctga aaagcaaatg gctgaaaaag cagagaaaga agctgctaaa gaagctaaga 18240 aagctgaaaa agaagcggct aagaaagcac gcgaagaaga acgcgctgct aagaaagctg 18300 aacgtgaagc tgctaaagct gaaaaagaag ctgagaaaaa gcgtaaagct gaagagcgtg 18360 cagcagctaa agcggaaaaa gaagctaaag cagctgaagc aaaagcagct aaagaagctg 18420 aaaagaaagc taaagctgaa gcagcagccg ctgaaaaagc agctaaagca gctaacgcag 18480 ctaaagacgc agaataattc tccggtagtg ctagtcggcg cactttaaga ttaaccgatg 18540 ttgcgaggtg tgatccctcg ctttaatcgt cagcaaaact tggttttgat agtggtactt 18600 atccgagtcc ttaaatcatc cagtacaatc ccccttgtgg ggtgtagatc gcgggtatac 18660 tggtagctat caaaattagg ttttgcgtcc aatacggtgt ttagctcagt ttggtagagc 18720 gcttgctttg ggagcaaggg gtcacaggtt cgaatcctgt aacaccgacc aatccctcta 18780 actgtaacct taccagttca aaacaaggat tcaaatgaat aaccaaccta tatctaaacc 18840 ggacttccgt aaagacggag ctgttctggt gcacaccatt tttcacacca tccaaggtga 18900 aggtattttc tcaggtgaac ctgcaacgtt cgttcgttta agcgggtgca acttgcgttg 18960 tcctggatgc gataccgagt acaccgacgg agctaagtta atgtccgcgg agctaatcac 19020 agccaaggtg gagggaatgc atacctcacc taacaaactt gtggtcatta gtggtggtga 19080 gcctttacga caagagttgt acgctttagt gagtttactc attagtaagg gttacaaagt 19140 gcaaatcgaa actaatggta cgctaggcct cacacctaac atgcgtcacc tgtgttcaat 19200 gttccttggt aaaaccctat ttatcatgtg ctccccgaag ggtcgcatca accgcgatat 19260 tgcagcgtat gtgtcagctt acaagtacgt ccttcattac tgtcatgtta acccttccaa 19320 cggtttacct tcacgtgtac ttgaccttaa agctaagatg ggctaccctg aattcgataa 19380 cgttaagatc ttcctacaac caatggactg taaggatgaa gttgttaacg ctaagaactt 19440 agaagctgtt aagacgtctt gtatgcaaca cggttacacc ctatgcttac aagtacacaa 19500 gttaattaac gtggagtaaa caatcatgtg ttctattttt ggtgcaattc ttaaccctaa 19560 aaccaactac gaaacaatcc aatgtcaaac agctatgacc acaattatgg agcgtagtac 19620 cgagcgcggt cgcgacggtt atggtttcgt acacacccac gaaaagtcaa tgctgaacga 19680 cattgtacat gaagttggcc cgttcgacgt tgagtccctt cgcgttccag atattgcatt 19740 gggtcactcg cgtgtagttg gtaacttccg tgcagaacca acaacagagt tcgttgagat 19800 caaagaaaag tttgatcagc aaccgtactg tgcgaatggt tgggttgtag ctcataacgg 19860 cacaattgca aatgatgtgg aattgcgcac caaccaactt gaaacgcaga ttgacagtgc 19920 tgcaatccct gagtgcatga aaatgatgcc tcgcaatgca aactggcgtc aagtgtttga 19980 agagtttaag cgtggtattc aatcactgaa gggtagctat gcaatcctag ctattaacaa 20040 ccgtgctgaa acagcgatgt atgtagcggc aaactaccgc ccagtgtggt acacagtaac 20100 ggaaagcggg gtgtttttcg caagctcagc aacatacttg gaagaaacat acgagaacgc 20160 agttccgcaa atgcttgcac cttacacggt tgcagttttt aaccattttg gcatcctgca 20220 cacagagtcg ctgtacggcg gcacaggcaa gcgtgcactt gtggtatgca gtggtggcct 20280 ggacagcgtt accgcagcgt gtgcagcgaa agcaaacggt tactcggtag agcttgtaca 20340 ctttgtgtat ggttgccgcg ctgagcagca cgaagtggaa gcggttcacg cagttgcaga 20400 atacatggat gttccgttgc atgtaattcc aatgcacgtg tatgacccga aagactcacc 20460 tttgcttcgt aaagacgaga agattgccgg tggtgaaacg ggtgcggagt ttgcgcacga 20520 atgggttcct gctcgcaacc ttgtgatgtt atcgtatgca actgcatttg cagaagctaa 20580 cgggtttgat accattgctc taggtaacaa cctcgaagaa gcgggtgcgt accctgataa 20640 cgaacctgaa tttatcaacc gctttaatgc gctgttaccg ttcgcagtac gtgacggatt 20700 taaactggaa gtgattcaac cagttggcaa cctaatgaaa catgaaattg tggcattggg 20760 gcacgaagtg ggcgcaccgc ttcatttaac gtggagctgc tacaaacacg gtgagcaaca 20820 ctgtggtcag tgtggtccgt gcttcatgcg taaaacagct ttcgaaatta atggtttgga 20880 agaggtaatt acttatgagt ctgattgcga ataacgggct cgtgtgtgtt ggtgggccat 20940 accaccaaca acgcatcttg cttgaatgcc caaatagcgg tacattaaca ttcaacgcta 21000 atggtatgca cggacgttac gtgtataaaa gttcccctat taacgggggt tatttgaaat 21060 gggaaaacca ctaatgaaac aaacagctat tcgctaccac gatttttgta tgggtcaccg 21120 cgttgtagga cacgaaggta aatgccgtca cttgcacggt cacaactacc gtattcactt 21180 ccactgtgaa gctgcacagt tggatgaagt tggtcgcgta attgactttt cagttattaa 21240 gcaactgctt tgtgagtgga ttgaagacca ttgggatcat aagtttatgg cttggttgga 21300 tgatccgatt atgcgcccaa ttgcggaaga agcgcatggt attattctcc aagaccagga 21360 cattgttgac atgcaaaatt cctttgtgtt tgttgatttc aacccaacag ctgaaaacat 21420 tgcagcgtac ttccttgacc acattggccc taagttgctg tttggcactg gcgtacagct 21480 aacaaaggtt gtacttgagg agactcgcaa atgttcggta gagtgttctt tggattaatt 21540 ggtttacttt atgcggtcat ggtggccgca attcttgcaa aactcggtga accgtcagcg 21600 gtttggctat ttgaaaccct tggtataggt atttaaaatg aataaagata acggtcgcgt 21660 aatgggcgaa atggaaaaac ttgttgaagc tcagctacgc ctaattgaaa accctgaaac 21720 ggtaggtgac attgatcatg caaactgcga actccgtgaa ggtatccaag aaactccaaa 21780 gcgcgttgct aaagcttttg ctaagtggtt tggcggttat ggtatggatg ctggatctat 21840 ccttaagact tttgaagatg gcgccgaagg tgctgattct atggtcgctg ttgtggatat 21900 ccctttttac agtaaatgtg agcatcatat ggctgatatc attggtgtcg caacagtggc 21960 atatattcct aacgggaaaa ttgtgggtct tagtaaactg tctcgcttgg ttgatatgta 22020 tgctcgccgc ttacaagttc aagaacgcct tacgacgcaa attgcggacg ccctcgttga 22080 gcatcttgac ccgattggtg tgggagttaa gattcgtgcc cgacatatgt gcatggagtc 22140 gcgcggagtt tgtcagcagg ggcaccacac tgtcacaacc gctttacgtg gtgttatcaa 22200 aactgaaccg gaaacccgcg ctgagttcat ggctcttggg aacaccggaa aagctctgta 22260 atggttttgt acttcaccct gttcgtggct acgtttgtgt cagtgggttt aagggtagca 22320 cagacacgga acattatgtc gctaaactac aaagcgatgt ttctgacgag cataggcata 22380 gacttctcta tggtgattgg tgtaactagt attgtcagcg aaggttggca agcgttcttt 22440 ccaattgcgc tagggggtgc gcttggttca gtaacctttg cgtatcttca caagaagttt 22500 tacggttagt ctagcatagg tggggcgtgt gggttattat acttgcacgc cttttttatt 22560 accggagtaa aatatggaaa cacatccttt atacatgggt cgcaacgtgg ttgtacaccc 22620 tgacggtgtt accagtcacg cacaggcgat ggacgctatt atcgacacac cggatagctg 22680 cattattaat gttcatccta tgtggtacga cgagctgaaa cgtcaaaacg ccattgactt 22740 ccctaaagac ccaaacgttg ccgcgctgga caagttgcac gcacgtgtaa ccaaaccacc 22800 acgcgacaag attgtggtca caggtaatcc acaaccccaa caatcattcg cttactggtt 22860 atttatggat agctaatatg tcacaaccat tacaagtcta tttagctgcg gtttacacga 22920 acagctatat gccgggagga aaccgttggc ctaagctcaa tgagcaagaa tgccaaatta 22980 tgttggacgc taaacagcac aacatccttg aatcttggca ctacgttggc aagcaaagct 23040 atgttaacaa catgcgtgaa aacaacgcaa agatcttcct cgatagtggt gcattctctg 23100 catacacact cggcgttaaa ttaaaggtgg aagactatgt ggactatata ttacgcaaca 23160 gtgatattat tcgcgtagaa gatggaaacc taatggcgtc cgtgctcgat ggtatcggtg 23220 acccgcaaga aacgtttgaa aaccaaatgg ctatggaacg tttaggtgtg cgtccgttac 23280 cctgtttcca cgcaaacgaa gacgaacgat atttggagtg gtacgtaaag aattacgatt 23340 acatcacact cggtggcatg gttggcgcgt caacacaggc gttgatgcaa tggcttgacc 23400 acatttggga taattaccta accgacccaa gtggcaaccc gcgcattaag gtgcatggat 23460 ttggtatcac cgcagttccg ttgatggagc gttacccttg gtatagctgt gactcatctt 23520 cctggatcca gtccgcgtcg tttggtggta ttgtacttcc agatgaacgt aaaggtgcaa 23580 tcaacctttc agtatctgag aagtcaccgt cacgtcacca gttgggacag cacattgaaa 23640 acatgtcacc aattgagcgt gaacaccttt acaacctgtt acagtcgcaa ggctttgacg 23700 ctgagcgttt agcaaccatt tacgaatcgc gtgcggtgta caacattttc gcttacatga 23760 aaattaacga aattgtcaac caacacaagc gcaacacgaa agcagatatg atacaaggat 23820 tattctaatg tttgacagtg tatataccaa gttaatgcaa gacattctaa ttgagctagg 23880 taactcaccg gaaggtttaa ctattcgcaa gctgtgtaac aaactgaaag tggcaaccgt 23940 gcccgttgag tttgcactcg gtcagttaat gtttgaaaag aaagttaagc gttcaacata 24000 cggtcgtttc acaaaggtga tcgaacatgc ttaaagaact gaaattcgta atgggttcgg 24060 taagtaagaa agacttctta cccgccctat cccactttaa gattgaaaag caacgcgcaa 24120 cggggtacaa cggtcgcatc tcgttaagtg caccaattga ctttgatgtc gattgtattc 24180 caaaggctgc acccttggtg aaagctttgc aacaatgtga agacactgtt gtactaggta 24240 tgacgccggc tggcaagtta tcagttaaaa gtggcaagtt ccgttcatat atccagtgtg 24300 tagatattga accaccacac ccacaaccga gcggtgcgtt tgttgacatt aacggcgacc 24360 agttgttaca agcactcaaa acactggaac cgctaattgc ggacgatgct tcgcgccctt 24420 ggtctaacgg ggtgctattt agcggtagca gtgcattcgc aactaacaac gtcattgctg 24480 cggagtattg gctaggatcg ccattcccgt gcagtgtggt cattccacga gacgcagtta 24540 aggaaatcct tcgtcttaaa gaagcacctg agcggttcca aatggacgac caatccctga 24600 cgttgcacta tagcggtgac cgttggttgc gcaccttgct aattgatgat aagtggcctg 24660 atatgactaa ggtgctcacc gctccaatgg aaggtatggt taacatcccg caaagctttt 24720 atgactcgct tgaccacatt gccccgttta cggataagat cggtcgcgtg cttatggaag 24780 aagggaagat gatgacccac ttggacgggg atgaagaggg cgctattgtt gattgcgagt 24840 ttattacaaa ccgctctaca tttgtgtgca acatgcttcg taaactggac ggggttgcta 24900 caaagttaga tttaactcag taccctaaac cgtgcccgtg ggttggtgaa aatatccgtg 24960 gtgttattat tggtttacgt tggttagaag gacgtctgta atgaaaccta aagttattct 25020 tgtaactggt ggacgtaagt ttaacgaccg tgcgtatgtt gagcgcaagc ttgaagagtg 25080 cttaccgttc tttgatgacg aatttgttat tgtgcagggt gacgcaacag gggtcgattg 25140 gcacgctaag aattgggcaa ttacaaacgg acatcctgtt atttcaatga acgcggcttg 25200 ggacttctat ggtaacaacg cgggcaacat tcgtaacggc tggatgttga aattcacaca 25260 acctgattta ctggtagctt ttcctggcgg tacgggtaca gctgacatgt gtaagcaagc 25320 aaagaaagcg ggggtgactg tgtatgcgtg ctgacgcgct agggttattc tggcaggata 25380 tgccaacctt taagaaaaag aaagaggaag aaattttcaa ccttcctcct gcaacttgga 25440 agtgcagctc gcacttgccg tactatgaag atgcggtaaa catgacgggc attaacatca 25500 tgaccgaaga tgatgttatt gaagcttggc aacaaaagca cctgttcacg ttcgatattg 25560 agtcatatat taactggtgc ttaattggtt tccgtgacga aaacacgggc aagattatct 25620 attgggaaaa gactgctacc gactacggtg acagcgattg gaacctaccc cttccaatgt 25680 tggattggtt tgtgcgtaac atgcacttcg taggtttcaa ctcaatggaa ttcgatatga 25740 cgcttgttac tatggcgatt gcgggtaaat catgtgcgca gatgaaagct gctaccaaca 25800 tgatgatcca agaaaactat cgcgggtggc aagtgttgcg caagctacgt ctaaagaaaa 25860 ttgaagcaaa ccatattgat atcatggaag ttgctccaaa ctttggtagc ttgaaaattt 25920 acaacggccg ttctggtggc aagcgtatgc aggacttgcc gtacgaacac gacgttgagt 25980 taacaccaga tcaaatcgtt gtaacgcgct actactgggc aaacgacttg gacgcaactg 26040 caaccgtaat gagcaagatt caggacgaga tgaagttgcg tgaagaaatg agcgagcaat 26100 atggcgtgga cttgcgtagt aagtccgatg cacagattgc tgaagctgta attgcgcatg 26160 agctggaacg cttaacgggt aagcgaccac agaaaccaac tattgagcca ggaacggttt 26220 accgctacaa tgcaccggcg ttcttgcagt tccaaacacc actaatgaag cagacactgg 26280 aggtagttaa gaactgccta tatgtggtca gttacaaagg cggtattgaa acccctgctc 26340 agcttaaagg gttgaaagta accattggtg aaatgtcgta caagctcggc atcggtggtc 26400 tacacagtac cgaaaagaaa gctacgcaca ttagcgatga aaactaccag ttaagtgacc 26460 acgatgtagc gtcgtactac ccgcgcataa tgctgaacaa caactattac ccacagcact 26520 tgggacgccc tttcctagct gtgtttgata acattgttga aacacgtctg gaagctaaac 26580 acaacggtga cagcaaaacc gcgcaatcac ttaagatcgt tatcaacggt acgtttggta 26640 aattgggttc acaatactca ctgttctatt caccggactt gcttattcac gtaaccctga 26700 cgggtcagtt atcgctattg ctgctaattg agacgttcga gcttaacggg attcaggttg 26760 tgtctgcaaa cacggatggt attgtaatca agtgccacaa gtccaagttt gagctacgcg 26820 agcagatttt ggaatggtgg cagcgtgtaa cagcgttcga gttggaagca acttactatc 26880 aagcgttgtg tagtaaagac gtaaacaact acttcgcggt taagatgcct tacgaggaca 26940 agaaaacagg tgaaatgaag accgacgtga aagcgaaggg tatttatgcg aaacctggat 27000 tgtccaagaa cccaaccaca ccgatctgtg ctgaggcagt aaaagcgttt gtggcgcacg 27060 gtacacctat tgagcaaact attacagcgt gtaaagaccc gtttatgttt acctcggtgc 27120 gtaaggttac tggcggttct gtttggtgta tgtaccgaac ggactttgaa aacccaacta 27180 aagaccaaat ggaagagcac gttcgcaagt gcggttacat cccatatgtg ggaacgttgt 27240 gggttcacag tgctagtgag aaaccggata aggaagcgtg tcgcttagac caagcttttg 27300 aagctagtaa gtggaaccct gtagactatg actaccttgg cggtgcaatt cgttggtact 27360 acgcaaaagc accagaaaag tccaagtatg ttattctgca agctgaaaag ggtagcaaag 27420 ttccaaagac cgaaggtgca aaaccaatga tgacaatgtt ggatcaccta ccggaagact 27480 tggatatgga ttggtatatt aacgaagcca accgcattct aaaagatatt ggacaccctt 27540 gcgctgaata gtctagttta aaaacgtaac ccctgttata gttagttctg taacaggggt 27600 ttttgcataa ggttcacaaa atggttattt cacaatttat tgatgtaatg aaacaaatgg 27660 ggttacaccc acgccgtaac agcacaggcg acgaaaaatg ggaacatgtt cgcgtgtacg 27720 ctcgcacagg tgacgagcca ccaaaccacc gcggaacata cgtgtgcatt gctaagttcc 27780 tgagcggtaa catgtacaac ttcaagtgga tggttggcga ccgcgaagtg cttacaacat 27840 attgcgccta tccaactatc ttcaacgtgt acttggagac caaacgaatt attggtttaa 27900 ccgagtttaa cgaaatacat tgcgcagccg gtgcacttgc tgaagctaag taccacagca 27960 aaaaggaggc gcgagctaaa ctcgaagcgc gcgaccgtga aacacttgac ccgcgacgtg 28020 cacagcgccg caagcaaaac cgcaaaccaa ttaaacgcac aactcgcgta tcttgcattc 28080 cagaagcgac tagaatgttc attgaggcta tgaaagagga attagagtaa tgaccacacc 28140 atacattaac accactatcg cgcaaactaa cgctaaatcg tctggagttt gcatcctgtt 28200 gttcctattg ctcggcgtaa ctggtgcgca ccgttattac gtcaaagggg ttactgtgtt 28260 caacattcta tacacactaa cactcggctt ccttggtatc atggttcttg ttgacttctt 28320 ccttgtgtgg ggcatggctt cgcgtaccaa caccaagtcg cttgagaaag ctttcattaa 28380 agactttgca atgcgagagg gtgcacgaaa tgcaaatggg aattaaattg tacctggacg 28440 ggaaggaagt taaaacaggt tctcgccagt taactgtaaa tgaggagtac cgctcgttct 28500 ttggtattat ggagcaagta cccgcgcaaa ttgaaacaca cctcgaagtt actggcacat 28560 ggacagactt ggaggacggg catgttacgg gaaccctgtt cggcgtgccg tttaccgcac 28620 atgtggtcag taagatatac tgcccgggcg ttgttggtat tcgtgcgggg tttgacgttt 28680 caacacgacg ccaaatggac ttcaccttac tagttgtttt cggagttaac acatgcaccc 28740 aacacaagta aattttccaa tcaaaatgac gctgaaacag cgtgtagctc accgcattag 28800 ttggtggcgc tggcgttatg ctgtttggtg cgggtacttt gcaatggacg gtgagccgct 28860 tcgctgcact cagtgcaact cctggcactg gatggatcat gttgaggttg taacagaccg 28920 cttggattgg acgccttgtg aggtgcgtaa ggagtgcaag cattgcggtc acgttatggg 28980 ttactgggct tatggctatt gggaaccccc atacgcataa acgcataagc ggcccataca 29040 ggccgctttt tatttactgg tacaattgca ttggctaggg ggtaacacag cgtgtacccc 29100 cttttgaatg cgcgctatgg tgcaaccgca ggggtgcggt cggtgcggcg ggtaataatg 29160 cgttggaact ggaagctctt aatgccgcta cgcacagctt ctacttcgat acggtaaaac 29220 tcaggtaacg ggtcacccgt ttcgtccgct ttgggtaagg tgtaagatgt cccgttaata 29280 ccgttctcct gtttaatcag ggaactcgtt gtgtggttgt agatgcgcac gttgtattcc 29340 acacccgctt ctgggccgat gttacccgca gtaaagccgt aaagcttgtc ttgttgctga 29400 atacggtcgc ggtgtgacca cgttatattg aggtctccgc tgaacgtgtt agggaagtgt 29460 gaaccgttaa ttttaacgtt gcccggaggg tatggggtat cccaacgacg tacaggggtg 29520 aacgacttct cagtatcttt gctcaactcc aaacgacctt gcagtgttga gggtagtaac 29580 ttatatttca acgctacacc acgctcctga gctgaatcgt acatttcagc aaagtcgtca 29640 aagaagtaaa ctgttgtgtc tgctgcgtgg cttgcaggaa ccgtgtccat aacaccgcgc 29700 tcgacagtac attgacctgt acttgggtta aacgcggtta acttcatgta ttccttgtca 29760 actgcaatcg cagtgccaac cgcaaccaag tccgcgtcaa ctgtgccaac aatttggaag 29820 ttagttgttg actgttctaa cgctgttgca gttttaccgt gcggaacaaa gtccaacgta 29880 tctgctaatt gatagccacc ttggtctacc cacaactcac agttaatgga gtcagatgca 29940 ggtcgtgcaa cacaacccat gacatattca cgcccagata ggttggtgtt attgaagtta 30000 gtacccaaac gctgaatgat ttcacggtac ggtgtgctgt caatgtagaa gctagttgcg 30060 ggcgccggct ctgttacagg tggtttccat tccgtatctg gtggggtaac aaacaacgct 30120 tccccaatac cgaacacgtc ctgcatacag tcaattgtga tttgcccatc tgtggttgta 30180 ccgtaactga tgttggatac gcgcatgacc acactttgga taccatagtc cggccacgtt 30240 agcacaaacg gtgaaccaac tgttaaagag gcggctttga ttcggttaca cttaatttta 30300 caaccaatta gcggtgttgt tactgcgtgc agctcccgcg ctgcaactgt gttcgctaac 30360 tcaggggtat taataccttg gaactgcttc gtaatgcttg taggagaacc ctgttggcgt 30420 gacagtgcaa tatcctgtac cgtaatggag tctggacgtg cttctgcacg gttgtaaaac 30480 ttaaccgtca cttgactagt tagttcccca acgttagggc gaacaaagtc gctaatctca 30540 acaatgtcgt cttccccaag gtttggaatg tttgcaaccg tataatctgc acgtagtaac 30600 ttcattacga atttacccgt tgtgcggtca acgtatagta cagcaccaac gtgatccata 30660 atcacacgga taaagtcgcc aatctccttc tgcttatccc atagtaagga taaaccgaag 30720 ttctcgtttt tgagagtagt tgcaaccttt ttaaactcaa catcgtcaat tgagcttgca 30780 ggataaccca taccccaagc tgtgtctgtc aaacactcgc gcacaatgtg agcggggttc 30840 atatcgtccc caatacgcgc aaggtttggc tcccattgag cggaaccgtc cgtcttcttc 30900 ataatgcgac gcacgcgagg gtaaattggt ttcaggtaag aggttgtacc agtataaatc 30960 tgcttcgcaa caatggttag cacgccacgc cacgcaggaa tgtcagtacc caactgctcc 31020 tgaaggtaag tgttgcgggg ttgtgttggt tccccaaaca acaaatcgaa cttacctgag 31080 ataccacctt cacggtcgtc gccaccaaat aagttcgctt tatcaactgt aatttcaccg 31140 gagcttgttc taccctcgcc caagtggcgt tcgtccgcaa ataggtctgt aacctcatca 31200 accggaccat gacatactgc catgtggaac cctaaataat agcggtgtcc tactgtttgt 31260 tttttcttgc cgcccatgca gcctccacaa cttcgcgagc catgtggtca cccgtagcaa 31320 gaatctcttc ctcgggtaga ccctctgtaa tgaacttatt ccagtctagg ttgtggcgtt 31380 cgcaaaatgc gcgaacacca cgtgagcaaa agtgcacctg acggacatgc tctaatttga 31440 ctatcatgtt acttccggat aggggttgat cttagatgac cgtaccatac cacatttgga 31500 ccacgaacgt caactgttcc aaacgcaaca gggatttctc gtccaacctc tgccgttggt 31560 gcttggaact cgtccaaccc tgaaggcttt accgcttggg tgcgcggagc catcgcttga 31620 ccaataatta acgcggcaac tacgaccgct aatgcatacc acatgttatc acctatgtaa 31680 atgaactacc accaaacggg ttcttaattg gaatgtaagg ccaacccccg tagttgataa 31740 aattgttgaa tttagtctta caggttgctt gtgagtgatc gcagcctgga agtaatgtaa 31800 cacgttgacc cgcttccgct cctggatgcg ggcgtgaaat ggtaatctta cccgcggatt 31860 cgtgcttggt aactaagcgt gtggaaccgt ctggaaagat taccataccc gccgtgtagt 31920 acccaaccgc agccgcttca ccagtaagtg taatgtccat tacgtcaatt gacccaatgg 31980 tcgccacctt gcggtaagtc gcttcgctaa gcttgcaacc accgtcgaac acctcgtggc 32040 gacacgtttt ctcgtaacgg gcacgcaacc ccgcacgctt gagggcggta aacacagatt 32100 cgcagtcaac tttgaccaca ttaccttgag ccttggttgt cactacgcgc cccttccaat 32160 aaacggatac ttccgttgct gaggaaccgc ttaaatgccc gcggaacaac gttacaacca 32220 ttggaatttc aagtgacgca ccaattaact caactgccaa agagtcgttt cggggtagcg 32280 ttagcgttaa cgtaccctta aatgagtcgt cactcatttc cacatcgtca cgctgaatgt 32340 tcttcggtac atgtattaaa tttccacgcg aaacaggttt agcatgggac gtgaaataac 32400 gagctgaagt tccctgctca aacatgtaca tttctacggg ctgacccgcg gaataacttg 32460 tgtcggggtt actcatacca cctccggaac tgaaataata ggtgcagcaa tgttaatcac 32520 acctgtggat ttacgttgga actcaaagcg gtccgtatca aagcgcatac ggttaagacg 32580 cataatacgc ttaacttccg ccctaggttt atcgccaatc acgggagcaa cagttagggt 32640 gtcaaagtcg ttacctcggg aagcacctgt gacctttgta aaccctaacg tcccgtctgt 32700 atattcaagc attatatgga aaggttcaaa gaatagtgac gcagcagttc gcgctgtctg 32760 caacgcacca tccgcactca caatgtcacg cgcaaggata aagtcggtgt tccaacttgg 32820 aacccaaaat tcaccctgct taccgcgaca gaagtcaagg aagttacgaa cacgctcaaa 32880 ctcagctcta gtatcgcaag accatcgtaa ctgagcgcga gtacgagaat cccaatcgta 32940 cttttgaaaa tcagtgtaca gaccaatctt ggtgtcgatg cggtctaagt caaatccgaa 33000 ctgctcactc tgactagtgc cacccattac cactgggtcc gtcacaactg gtttcccatt 33060 gtataacggg aacgggttgc tagcattaag agtatcatcc aacacttccc aagttacatc 33120 ggcgtccgcg acaccgtagg cagtacgggt aagttgtaag ggttggtcgt gtttctgcaa 33180 ctcaacaaca acaatagtcg catcattgta agcttgcgaa atagggtcaa caaactcaac 33240 cttacttgtg gtcacagctt tgacagggcg aacttcatat ttttcgttgt tgtcgtagat 33300 aaacgcaaat ccagaagcta ccaacccaag cgaaaccgcg tcaaacgcga gctccgtgac 33360 acccatacct atggagccaa cacgtaagaa tttagtccaa tccggtacag cataagtctg 33420 gttaacccat acacgagagt gtgaccacat gttactgagg tccgcttcgc taagttggta 33480 cgccagcgaa attgtcttac gaggcccacg acgcaatgac aaacgctgtt cctttttacg 33540 tgtacgaata acgtctgtta gccattcacg tgtttcaaca aaatccccct tcggcaagta 33600 cggccatgga actacgcgcg aaccagtaat gcggacctga gcgttcttta cagacggcga 33660 tgttttccat gtgtaggtcg catcgataac cgtttctgtt tgtagaccaa cgttcagagt 33720 gtacttagct cgtcctaaag caggaataag atccttcgtg cccgcaccct cacgtgttag 33780 tgtcatccca cgcgtaccaa cctgaacaat attactaatt gtcaacggct gcaagaacgt 33840 gtgccacatg tcaaactcac gcaccgcaac gtcagcacta acaccaaggt ctacacgtgt 33900 aggtgttaga aatacagagt ttttcaaaca ctgccaaggt ccagtactga caaaccccaa 33960 ggacgcagaa gctttggatg ttacccactt gcgctttgtt gttgcaccca cagttagaat 34020 cgagttacca cccgcaacaa cgggggttgc ggttggtaat ggtggttcgg gggtaagggt 34080 gtgggataca cccttaccaa atatatgaac aactgccata attatgtctc tcgaatagcg 34140 aacgcaggtg tgttcgtgcc acccttacca atgcgaggga acatacgata tgtcttaccg 34200 tcgagcgtta gctgcgcgcc aataccagta taagacatgg agccaatctt aaactgtgga 34260 aattcacctt ttggcggtgc cgctcggtat ccaggcgcgg acactttcgg ttgcacacac 34320 ccccaaatag ctggaagtaa cactgtggtc agggacggtg aaaagtacaa gcctgtgtca 34380 atatcaccat aaaaaccctc agtatttgtt gacaaataac tgtttattgt attataagtg 34440 gacgtggagc ccggaccgta acccgccatt tcatacgaat gaaacgtacc gtctgcattc 34500 tgacggcgaa taaatccagg acctaaataa tcgtttgttt ggtggaaagg gcccggattg 34560 ctgctatcgt tgcgaccgtt atgggcgcag tgtcccgcca agtagaagtg cgagtgcgca 34620 ccaaactgtg cgtccgcaca atctaattcc gcacccaaga aagaggcacc cttgccgtct 34680 gcagcatttt ccaaacagaa aataaagtca tttttaccgg tcacgtctgt tttacagaag 34740 tgaagtttgc cgggaagtgg tacgtgctgc aagctaccgg accatccaga gtaattcgta 34800 aattgaccct ctatttgtaa actgctaccg gacacccaac tggacaaatt accgctcgcg 34860 agggcaccgt tatgggatgt tcccatcctc caatgcagac tatctttcca tttctgtcgc 34920 ccagaccgag tgacgtacat gaagcgcgtg caacggtact caacaaacaa atcaggcttt 34980 agttgaatac agacatactc cccgtcatgg ccggctattg tgtatccagc tgcttcgaag 35040 cggtcgcgga gcgcttgaat caagtctgta cgggcagatc cataatcttg tgtagcgtat 35100 gtcattaaga tttctccata attaagtagt cgccgccacc cgcacggtaa acgttttgaa 35160 ctaccaagta ttttttaccg ttggagtgag ttaactcctg cccgtttgca agacctaaac 35220 caccagtccc ataaacacca atgagctcac caacaacctg atgcccatcg attttaataa 35280 ttgtctgcaa cagcgcgcgg tcaccatttt gatatggttc ccatgttggg aagcggtttg 35340 gataccccat gaacgggtga atataggaca ttttaaccca agcttttttc tcatcgtaca 35400 cgggcacagg tttacttcca cgaacgtact gccaacctga ataatcatca cctgtactgg 35460 accaacgacc ttccttattt gtaccaaccc caaaacaaca cagtggatta ggccagtgac 35520 cacgtgatgt atacgtgcgc atgttgccgc cgtagtagta ttgcgccgta cccgacacaa 35580 tacacataaa catgatacgt tccttattca ccattatatg ataatcaatt gtaccgtccc 35640 aaagatacac aaccgtctct gtgtttgtgt tagccaacgt ttcgaacgga acgtcgacaa 35700 atgtgttgga agctttgcac aacaggttac aaatatcggt ttgtgtgttg gtgtgagtct 35760 tccacgcaag ggtaattgtg tcgttaccag tatcaccaac agactggata atcagctcat 35820 gttccgcgtc agcgggagta agtgaacgct tttgcgtcca cccgttggat gttgcgaacg 35880 tgcgcaactt cgcaaggaag tccttatagc cgttcgcagt accactttga tatgccatta 35940 tgccaccatt tgcttaattg tgcgaccatt acgtcgaacc acattcataa taactttttc 36000 tccttctgca gaacccatgt actcagtcat tagagcgggg tctacggagt taataatacg 36060 aatgtttgtt ggactttgca aggcttgttg tgcaccacct tgtcctgact caccaccacg 36120 tgcagcgcgc tctaatagct tacgggtatc ctcgcggccg gtgacgttag ctggaccctt 36180 aacgaactcc ataccgtttt caccaacaat accaaactga ccagcaggga tatgaccacc 36240 cttatcgtac gcgcctgcgt acgaaccacc gccttgcatt tgaacgcttt ggattgtact 36300 aacaatgttt gcagttgcag caacagttga cgcaatagca cccaagttcg caggccatgg 36360 tagagaagct gcgttcgcaa taccttgctg aatcttcata atagagtcgg caatagcaaa 36420 cgctttagac gctgcaaaca tagcacggta aagaccgctt tgctcacccg ccatgccctt 36480 cgcaatggtt aacaagctgt tagacatgtc cattgcggtt tgactaacga attgcgcttt 36540 ctcttgctct aacgctgcaa cctgatcgtt acgttgcttg gtaagctcga gctcaagctc 36600 tgtgcgttgc tcttcagtta actgcgtgtt ctcaaggatt aagttacgac ggcgttcgta 36660 gtattcggta agcttatcaa tgcgcttatc gtaatcgtcg ttacgaatat cctcgtcaag 36720 aacctcttcg cggaacttct cgtttaactg cttctgcaag ttagaacgcg catcactacc 36780 cgcttgcgtg ttctcaagga tgatacgcat acggttgttg taactatgaa gaatagtttc 36840 ttcttccgtg cgtaaatact cctgcaaacg ctcaaactct ttctcacgaa ttttagcttg 36900 cttttccgct tcacgttgtt gtgcaagtgt cggaccagag ctttcatctt gtccaaactg 36960 tgctaaacgg tcacccgcag tagctcggcg agcctcgcgg tctttaaggt actgctcgcg 37020 caaacgctta accgcagcac tctgcgcttc gtacgaatca attgcaacag cgcgctcggt 37080 cttgatacct tctaatgcag tgttacgggc ggcatttaga tcgtcgtagc taaccgctaa 37140 acgttttgct tcaccctcaa agaagtcgtc tacgcgttta agcgcacctt ccatgtcgaa 37200 cccatcgcta aacggatcca acgcttcgcc aattgcaaca gcgtacactt tggaacgcgc 37260 gacaatgtgg tcaaatgtat tttcccaacg ctcgccaatg ttactggtgt aacgctgaat 37320 aacgtctaca aggtactgga actcaatgat aatacgcttg tgcacgtatg caatgttttc 37380 cggtaggtac gtccacatgt caataatgaa ctgcaatgcg tcagcacccg cttccttcca 37440 ctcctgcgga acctcgttcc acatttgggt catccactcc attgcaccgt ttgcttcttc 37500 agcaaggaaa ttccaacggg acgcttctaa ctccaagcgt gcacccattt caccggactc 37560 cattgaagcg ttaaacagct caagtgcatc ggtagcgcga cggaaaccgt cttccatgag 37620 gtctgcaaga cccgccttac caatgttgtc aaccgccatg atgaactggt cttgcatgtt 37680 ggaaacagca ccgccgagcg tttgcatacg acgttccatt tcacctgcga actcattctc 37740 accaagtgca gtcaggtaat cggttacagc tttagaggac ttctcaactg ttgtggttac 37800 accacggaag gtgaacgaca cacggtcgcc catttggttt gctttgatac caaactcttt 37860 tagacgctca aactcaaacg tagcggcgtc agcaactgcc tcaactaact ggttcaggga 37920 cttaccagtc gcagatgctg tgttaccgta gcttcgcaga gcgcgctcag aagggcttaa 37980 acccaagtta gcaagacgga taaaaccgtt tgtaacctgt tcgatatcgt aaggggtttc 38040 gacagcaagg tctttgattg cctccatagc aatcgcagca ccttccattg aacctgtagc 38100 tgtgactaga cgcgcttcca tgtcctggaa acgtttactt acgtcagcaa caacagataa 38160 agctttgaca gcagcagcaa aggcagcagt gaccacagtt gcacccgcaa agactttcgt 38220 taagcctgcg gttgcgcttt gggtcttgcg ggatgcacca gttactttgt caagacgaag 38280 tgctgcaatt tctgcagaca aactgtcgat tttaatctgg aggcgagcta catcagccat 38340 tgtttaggac tctccaaagt gtgtcgtcca tgtcccttaa aagctcaacc tcgcggggtg 38400 taggttcaat tccgtaaaga catgcccaac ttaaaatttc agtgttacta agtggttgag 38460 ggcctttcaa ctgttgatac catttccaga tgtagtccat ttcaggcggt ctttctggta 38520 ggtctcgaag ttccggcggt gtaaaccctg tttgtttttg aacctgtagt aagctgtcgc 38580 ggagggattg tttagacccc tccggacgct tttcaagttt tacttctgct tcgagccagt 38640 tgaggagctc tcttgcttta cctcaaacca atgcgaacgg gtagcagtga aacgtgacag 38700 acgttctttg ttaccgttac tttcacgtaa cagttcctta acaccttcaa acgtaaactc 38760 ttcatccaag ttccaaccca caaccatcgc agcgagcatt tcaatttcaa cttctgcttg 38820 gaagtccgca cttgcgtctt cgtccttaat agcagcagct tcaaccgcgc gacgttttgc 38880 tttagtttca gcacggcgga acgcatccga ctccgtgctt aaaacttcta ggtaaaagtc 38940 agttgacaca gaaccatcag gtaattccaa tggcatgtta cgagtttcgt tagcagtttg 39000 acgggtaaat aaatctgcca gtttcatctt gttatcctta cgcgttaatg cgagttactt 39060 taatgtttgt ttgttcagtt ggatccagga tggcttggaa aggcattgtc agcacaatag 39120 aaccttcacc cgctacgtcc ggttgaccgc cagtgtaaac gatacgcggc attaagaatt 39180 ggtatttgtt acccgcagta tccgcagctt ccaacataag tgagcttgga gtctcgttaa 39240 tgaacttttc aaccaatgct gcgttttcga agtacgcagt gattgaacct gttacgtttg 39300 aacgaccatt ctcagggtaa ataccgtctt tgctacctac aacaaagcga gggttcaaac 39360 cgttttcaat tgtaagacta gcttcagtga ccacagctat gttctctcca ccttcttgga 39420 ttgcacctgt aaacgcatcc attgcacgtg aagtagtcac agcagggtat gtcgcgccag 39480 ttggtgcagt agcccccaac acttgtgact taccaagtac ggagaacgta cctgttacca 39540 ttgcgttcgc gctaaagcta atgttcatgg agttaatttc aacacctttg aacaagaagt 39600 aaggtttgtc tgcaatgtct gcaaagtgac gcatcattgt aaacgaacga cgggttgtac 39660 ccgctttagc ttgcttctgc tttgcgttaa ccggagtcac atcaacccag tccgcagctt 39720 gtagagcacc aagaataaga ccatcaaagg ttaggtggct catttcaaag ttgatatcac 39780 cgccaacttg gtttgcaccc aagcggaaat ctgcaatttg acggtcaccg cgaatctctt 39840 cagattgcag tgagtctttt gcaagaccta acgttacacc cgtattacga acagtcgcca 39900 tagcgggggt gttaggtgtg acaccgtgtt tatctttggt tgtaccctct tcaaccatat 39960 aaagggtatg acgacttcca tcagccatgt taatctccta aagtacgaga atatcttgag 40020 tagtagttaa cagataaagg cactgtgtaa tactcaccgg acgtaaatgc cggtccgggc 40080 gttgcacccc taaatataac atgagcctga ttatgtgtaa agctcttacc cgctttgaac 40140 tgctttgcaa gacgagttgc aagagacagg gcggatttgc cgcctacgtt gggtttaatc 40200 ttaacaagga tttgcaggat gccgcgaatt tcgttttcac ctttgtcacc agtagtgata 40260 gcgcggtcat ctacaaatag gttgtcaata tccaaccaac gttcaccctt tgtggtcagc 40320 tcggagttgg gccaactaac attcacaccg gatgggatgt ggggctttac ggctttaatt 40380 acagcctgtt caacgtcatc ataaatcatt tcgtaacccg tctaatgtta gcctcaacaa 40440 ttgaatccca acgcgcagta ttcacgcgaa ccataccact cggggctttc atagagtggg 40500 actcgtactc aataggtaca gaatacggca agttgttggc aaagtaaaca acatgtttat 40560 agttgatagc ttttgcagaa cgtctaatgc ggtcaagcac ctccatttta gacgggtctg 40620 gtttgtcact tgttttgaag gtttccttat ccaacgttag aaaccagttg ttagccaagt 40680 aacctttatc aacgggggtc tgcatcacaa ttgaagtagc gaggtctata atagcgcccc 40740 gctttacttc ttcaattgct ttgagcgagt tcttaccgaa cttctcaatt acagatgcaa 40800 aatcagccac cgatagtgac cacatacagc actacaatgt tgcccggctg taccttttct 40860 gtacggttgc agctttgcca ctgcccgtca acttccacct catccgttgg aagaatgttt 40920 gcggaaggtt caattaacaa ggagttgtgc ccaataatga aagcaccacc tcggttcata 40980 ccaccaacat ctgaaccaag ctccgacgct gtaaagccgt tagcgcgaac acccttaaca 41040 gtgcgctcag ttggttcact tgtttccatt gtgtcagggt cgtacacacc cttagaacgc 41100 accttgtaag atgtaccaaa tcgctcaata attgggacaa ccttttcaat tatggtgttg 41160 taaaaagcat catcgctcat cggataactc tcccaccaga gcctttagac ataaacgcag 41220 cttttacaag cgcgtccgct ttcgggtaac gtttgaacaa cacagccgcg cccgtggtcg 41280 ctgcaaactc ggtttttgtt gtaattgggc ctacagttac gcgctcactt ttaaccttac 41340 ccgatacatc agcttgcgtc gctgttttcc ataggtcacc gctaaatgat tgcaatgcgt 41400 attccataac cgcttgcttc cacttaacag gtatccccga cacagcggca ccgtgtgggc 41460 tgtacaggcc gtttgcgggt aagcttaacc cttggtcgga tttaagtggc gccgcgctaa 41520 tacgtgcagc ccaacgcgaa tcagcgtatg agctcgcaac ctttaaagcg gtttcctttt 41580 gctccgtact tttacccgac cacactgtgt tgccaaatcg tgcgaagtac gaatccgctt 41640 ccacaacaga gatgtaagaa tctgcacccg caacaccgga accagtttca acagtaattg 41700 ccataaatcc tccaaaaacg aaacaacccc attataaggg gttgtcagta ttatacaatg 41760 tcaccatcaa caaccggctc aacaggttca acaggttcat cattgaccga atcattctgc 41820 tgtacggacc atgcaataaa gcggcgagat tgacccgccg ctaatttata tcctggatga 41880 cgtaaaccgt tcattgggtg atgtctttta atacccttaa caccgcgctt tatcgccata 41940 gttatctcca gttagtcaag catgtcaaga ccgtcaagca tagacttatc attgttcata 42000 agctctttga ttagcttacg acgtttttca cgttcttcaa cttcacccgc ttcagaagct 42060 agaaccatat ctaactgctc tttaagcgac agttctggtt gcttgcaaag ctgacttaga 42120 cggtgaactt cttcgtcgat ttcctggatc ttagcatcaa tgaccacacg tttgccaacg 42180 tagtccttgc gcaacgctgt tagttccaca attgcttctt gcgtctcacc aatgttaact 42240 tcctgcttaa ccattgactc gcgtgcttcg gttgctgctt ttgcccaagg gttcgcaaac 42300 tgcggttctg ggatttcacc gtcacctttt gcgtcgtctt ctgcaacttg gttgccagtg 42360 tcaacaggta ggtcaggttc ggttgtagac tcagcaacca ccacaccacc gtcagcaagt 42420 tccgtattct tacggttaaa ctttggagcg gctgcggtaa tatcagcacg tgtaacttct 42480 tcaccaataa gctcagaaac tacgtcaacg cgaacagcac catcagcagt ccaatgatcg 42540 tcattctcaa cgtcaacttt agctagtgca tctaaaatta cttgtttcat ttggtactcc 42600 aacttgaggg gtcaaagacc cctcggttgt gaattaagct tcacgagtga ttagacgtgc 42660 catcttaatc atcttacgct ctgcgtacac acgcttccag ttgtcaccag acgccaactg 42720 tgcgttagtt ggaccagact ggcctggagt ggttgtgtaa gcgtgaccca cagggtggat 42780 agaccactca acacggttgt gcagaacagt ttgacctgaa ccgttacccg cagaaggttt 42840 acgatccact tcagttggaa cttctggagt accaacacct aggcggaatg caccttgacc 42900 gaacacccaa gtttcgtaca cgccagcagt tgtagacgtt agaccatcat caacaataac 42960 agtacggccc atgtaagtcg ggatgttcac cttaccagtt gcatcaggga taaagtcgat 43020 aaggttgttt ttcttagcac gcgcatacac gattgagtgc atgaacacaa tacctagatc 43080 gtcttcacta tcaccaattg tggtcagcgt atcaatgaac gcagaaccgt tgaaacgagt 43140 tgtcgcggaa gctgcaccag taccagaaat atcgtgggta aggtcgttct taacgtgctc 43200 acctgaaaca ggatcagcag cgttatccgc aaacacaccg cgaacggtag caatgaacat 43260 cgcttgcata cgacgtgtcc agtagtttgc tacacgacca ccaattgcag ccattggatc 43320 acgcgcaata agttgcgcag tcaagtccat tgagctccaa gattggttac ggttcatacg 43380 agttgcaact tcagtcgcag taccgatttt ctttggagtg ctgtttgcac ttgggtcgtc 43440 gttagagtag ttctcttcgt cgttatccaa gtctttccag ccagggacgt taatggtagc 43500 gcccgcgcca gctaggaagt tgtccaagaa cgcatctcgt accaacacac ctgattgaat 43560 taggcgtgat ttttcttctg tttgttgctg tacgtaaggg gtaaacactt gaggtacaac 43620 tacgtccgct agacgtacaa caccagattc acccgcaccg atcgagcgaa gaataggatt 43680 cagtttagcc acaggatatc tcctctatta tggcgtatta acgaaataat gtcgcgtacc 43740 ccatggccgc taacgtaaaa aagggactgc cccatgacag tcccttaaat ataatggata 43800 attgttgtca atgcaacaat tcattttacc atgttggatt tacgccagca gcttgtgcaa 43860 gttgacgagc caatgctgga tttgtttgaa caagtttacc ctgttcagtt aggtttaacg 43920 tctcagcttt ccaagggttg ttttgaccgc caccgccttg accaccttga ccgcccgcac 43980 cttgtgacgc aggccagtag aacggtttgc tgtctttcag gtcgtttaac catacttcag 44040 gcatgatgcc cggagtaaca ccttgtacat ccgctttgac cacaacattg cccgcgtcgt 44100 caacatcgaa cagacctaga cccatgtttg caatgtcttc agcagcttct ggcagtgctt 44160 tagctttaag ggcagcatct tttagcgtac cgcggatctt gtctgtctta acttgtgttt 44220 gcagcgcttc gaatttctct ttgaagctat cacgctcagt agttaactca gtaacttggc 44280 gttgtagcgg tgcagtgtgc tgcgaaagct taccatttac aagctcgtcg atcttactcg 44340 gatcgctttg tgcttcaagt gcttcccaag ctggaacctt atcaaggatg gtaagtacat 44400 cgtcaatcga acgatcacct aacttcgcaa gtgcaccctt cacagccttg tggtcgttac 44460 gctctttgtc caatgcacct tgcaaacggt tgatgtcgtc ttgtgtctta agaccaacaa 44520 cttttgatag aacgtgctta ccgtcctgtt cagtatacag accgcggaaa ggttctggaa 44580 tctcatccgc tgcgttgtaa gacgtcatta gagaaatgtc gtcttcaccg taacctttag 44640 aagacagaag tgcaacctgt gccatcacag cgtgcgataa tagtgtacgt ttcatttata 44700 tactcccgag cccatgctct cttaggaaac taatttttct agttggtcaa tggtcaactc 44760 atacccgtca cgggtaacga acttatccaa agacaatttg ttttgacgga aaagttccgc 44820 cttgcgctta ccaagatact catcctggaa agctgtgcta cgtttacgca gccaatcttc 44880 aaagcgcaag tcagcaggcg catcaccaac caattcgcga cggcggtggc gcatccacct 44940 attatacgct gttttgtacc cataaggcaa gtccccaacc ttattaactt gtccaagttg 45000 gtttttgcga gcaaactctt gcacaagttc tttttcaaac gttggatcca taccgcggcg 45060 gttgaacgct gcatctgtga ccacaggtaa acgcttagat cggcatcgca tgtgaagcgg 45120 aggtatcggt ccttcaccaa tcttaaattt cttgttgtcg ttactagcac attgaatcgt 45180 agttctaccg tctaacgttg cttggaagac ttcgtaatca atgatatctt cgttagcagc 45240 cgcgaggttc gcccatacgt tgttgctaat accgttaatg caggtgatta agttggattc 45300 aatatcggcg cggaacttgc gagacatacc gtctttgtat tggtacttct tggaaccaat 45360 aacacgcgcg accatttgct caacggtttc accgttcacc ataccaatac gggcaacacg 45420 aagcatacgg ttaatgtcac gctgttgcga aagtgtcatc caaccgcgaa gggtattacc 45480 ctcgaatggt tgcactgttg caatcgcagt aatggaagca acgtcaagcg cgtgcatacc 45540 aatcgcaagt ggcatgatat cgtcaaccac cttaatctgt gcaacgtggt caatctttgc 45600 aaactgcttg gcttcttttt caagttcttg cgttagctct tgccatgcag ttctacgcaa 45660 acctattaac ttttgttcaa actctttgag taaacgctgc ccacgcttgg tggtaatggg 45720 tacaccctcc aaaagagcaa cgtactctgt tataagagcg cgtatttcgc gctcggtagt 45780 aagtatgcga tcgttaccta aacgagctaa ctgtgccgca tagcgattga cgtataagct 45840 gtgcaaccac agcttatctt gaagttgctc gttaaacgtc gccattgtcg tctactccgt 45900 cacgtgtacc tttaccagtg tcgtccggat tgttaatgtc aatgtttgtg ccaacgctaa 45960 gcgacgcctc atcctcgttg ccagtgctaa atgacaagtc gtacttatcg tcttccgcaa 46020 gtttcttctg ttcctcttcc cagtcgtaat ctgtgaaacc agaacgctta gaccaactat 46080 gaatagactc aatactaatt ggtgcaccaa gaagtttcgc ttccataata gatttaaggt 46140 caacaggatt accacctttg tcggtgaact ccatgtttgg cgtgaccaca acgtcttcag 46200 ggttgtctcc gagcatttgc gcaagcttac gaaggatgta ctgtaaaccc gcagcaccag 46260 actgggcaat ttgtggaagt gttgctgttt gcgaagctgc acgaatacga agtgcatcac 46320 cggattcctg cgtgttagtg ccagacatca acttggacgt cttcttctcc gcacgcttat 46380 agtcagcttc aagtgcttga cgttgctcag gtagaccttg tgagtcaaca ccgatgtatt 46440 tcgcatcccc gttaactggt agagctaaac gagcgcccgc acccgtacga gttgttttac 46500 catcaccatc gtcatcttca ccaccaacgt caccaatcgt aacaagggtg tcctgtccct 46560 gcatgaacag gttttgacgg tagtcagctt caccgcgata aataagcaat gacaggtcag 46620 caagaccctc aagtggtggg gtatctggaa ttgacaatag gtcgcgcgag ttaacaaacg 46680 tgaacgcaat accgtcaacg tcgttaccct taacacttac aattgtaaat tccttttccg 46740 ccaactcgtc gtcgctttca atctctgcgt aaccgtacac agcgttatca ggaattttac 46800 cgttgtcatc caattgcgca atgcgtttag ttgtagggtc caccaatgca agaacacgtg 46860 acttttcctt ccaaacccaa gcaaaagaat cgttaagctc gtaagaactc tcatccaaca 46920 ttacaaagcg caagttagaa tctgcacgcg aacgcgaact gtcatcccag ttgtacgcag 46980 ttgattcctt gtacaccaag ataacaggct cttccttacc attcctaacg cgaatatcac 47040 ccatcaaacc aaggcgacca gttgttaact gctccgcgtt aatacgtctc aacagtagct 47100 gaagtgtttc accaccatct gacgcacggt cacgcagttg ctcaagcttt ggactgagtt 47160 taatgtttgc aggcttgcgg tgcataatac ctaccgcagt ttccacagca tctttaaaca 47220 cgtcagggta ataagctcgg gtaatatagg tttcataaac cttagaaccc aagctattca 47280 agttggtgtt tgagaaccca tccgcaagca taccggaggt aggcggtagg taagtatcgc 47340 gtttagattt gataacgcga gaaccacctt cacagtcacg gcacattgtc caaaccgaca 47400 acatagccgt gtacagtggg tgatggttta ttttgcgctt agtgccgctc atatgtgaac 47460 cttaatagta accagtagtc ttcttaactt taaagcgttt gcccaaagat agtaccacat 47520 atcgggcttc gtcggcaatg tgatcttctg cgtcggtatc cacatcgtcc atatccttgc 47580 tatcgcgcgg aataggtggc acagttcgta ggaattggtc acagttacgg aacacaaaga 47640 atcctggctt ctcacgtggg aaaccgtcag ggtctggttg cccgttgaca attgcaacgc 47700 gcatcatttc ccaaccgttg tgacgtgagc ctggagactt aatagcacgt tcccaagtaa 47760 caccagaata ttgcttaccg tcaatacgaa cacgcttttt catgtccgtt gcaatacagt 47820 taccgttctg atcatcccaa atggaactat ccgcaggtcc cggcttaact tgacccctaa 47880 taccccaacg aatttcacgc tcaacaatac ccttggatat ttgggttgca agcaagcgca 47940 aaccttcgtt aggaacaccc gtccaaccgt accactcagc aatacgatat acgtcaccgc 48000 ggattgagct gcgaacgttt cccttagcgt caacgtaatc agacccatca ctttccatcc 48060 accaaccaac agagaacgga cgggacgaac cccagtcaaa cgaacggaaa atacgccaac 48120 cttcaggcgg tctaaacggt tccactatat tgtgtgtact tgaccacacg tcgtcgaaca 48180 tacctccgga cgtgatatcc catgaacctt ccaaccatgc agcacgcttg ttcgggtcag 48240 taatggactc aagctccaga acgtattcag gtgacaggta gcggttctcc ttgtacgagc 48300 tgaacaatcg cacctgtgtt ttagtgatgt tttccctacg ttgtgtacgt gggttgaata 48360 cctctttggt atcacgtacc accacgcccg gaggagcggg atcgatgaaa cgctgtttca 48420 cccagttatg cccaactcca tacgggtttg tcgtagaaaa aactaccaat ggaagttcag 48480 gtagaagccc gtcgataatg ttaccttcat cgtcaaacgt caattggtga cgtggcgtat 48540 gctccattgg tagaaaggat gaacggttac acgacatcat catttcgtat aagttaccgt 48600 tcggttgttt ggttaattcg ttccatccaa taaatgggaa ttcttgtccg tggtatttcc 48660 agtagtcatc ttccgttttc atttgacgga atagcaactc ttcgcccgta ggccaaaccc 48720 atttgtagtc accaccgcct ttcaggaact ttgcaccgtc attaaactgc ttataccaac 48780 gctgcgattt aacaattaag tcatccaagt ttttgtattc tcggtcaaag ataacaccgc 48840 gccaaaaact tccgtaaccc aaacccacaa agcgacggaa gaacatgact tggttgtcag 48900 tcttaccgcc gcctcgcgtg ccttccatta agatgtggtt acacggacaa ctaatcgcta 48960 actgttggga gccgggctga ggtttccaaa ttacgttaac gttgtccggt acgttcttct 49020 tgtttttcat accattctaa tcgttcttta tcgcgggctt cgcacttcaa cagggctaac 49080 catagttccc ccgcgaagtc gtggatgtct atatactttg taccatgata ctcaggtaca 49140 ttgcaaacat caagtaactc agcgtccggt ttcagaacga tcgtccgtgt ttccaccacc 49200 gttttcacgc tggaacatcc gcccatattc gacaggatgc acacggttaa gacaagcgta 49260 gtcagactca ggaatgaacg ttttagcttc tcgcaattgc tttgcatggt ttagctccaa 49320 ctctgtaaac ttcactttaa gactttcgcg gtactcacga ttcatcttgt cattctcacg 49380 caaaatagca atggtgtttt cattcacctc agctgcattt tgcaaaagtt caatttcccc 49440 gttaagagaa ttaataacaa gcttcgcact ctttaagcgg gactgagtta cagcagcgta 49500 aataatggta agggcggcaa ctagtgccaa ccccatagtt aaatatttac gaaggtttgt 49560 tagtatcatc ggttttaccc ttaacaccta tctttccgta aacaactttg gctagaactg 49620 caatacttgc gttcgcaccc aaccaaccaa acacaccaac cacaacgcca gaccaatacc 49680 agtccaaccc cgtagctttg cacattagca tagcaaggaa accaacgaag gcagaggaac 49740 aaccttcaag taatgcaaga ccgagagtag gcttctttcc tttgtttgcc tgacgtaggc 49800 agtatgataa cacaccacct acgccagcaa gaccactgaa aagaatcgcc tcaacgactg 49860 taaccttttc ttgtgccatt aaaccattcc gtgagcttct aaacccgcag caagccattc 49920 acgcacatca aaacatggac atgctttcac gtactcatgc gggccaattt taccatcacc 49980 atcccggtct ggagaataat cacggtgacc acgtgtgtcc tccaagcaaa tggtgtcgta 50040 ttgctcgtca agcgcaataa cgtgcttaaa cagagcttcc atttgagggt cagtataagt 50100 gaacgctggc tcaccacgac tatttaaccc gccaattaaa cagatatgaa cagtgtcttt 50160 gttatgtcct tttacacctg caccttggcg agtaatggga cgtccatcgt gaacgttacc 50220 atattggtcg acgataaagt gataaccaat atcagaccaa cctcgcccat gcggtttcgg 50280 ggacgtatgg aaatttcgaa tctcttgtac ggtcatcgaa tgtcctttac gggaaccgct 50340 acaatgaacg gttattcgcc ttgggatcat agttttacct cttgcttgag cttctcttgc 50400 tgcttcgctg cacccttctc ccactcatct aagtttccag tggcaggcac aaccattacc 50460 gaacgtccat ctgcttcagg tggcttctca ttctctagct tgtagatagc ggaaagctta 50520 ctcaaagcag caactcgcgc actgtgcgtc gagcccggac cgcgatagaa cgcctcgcga 50580 aacagtgcag atacaatgcg ctgtttgtcc aaatcttcat cagagggaac aaagtcttcc 50640 ggtatacgac taagatctcg ttggtcattc tgcttccaaa gtgcagaacg gttctcttgt 50700 atttcggtaa tgcattgctg aacgtaaggg tgatcccaga actgcttggc acgctcgagc 50760 gcaacctctg ggtcatagtt taagcgaaga gtagcacgat aggaatcgta gtccttcatg 50820 tactcagcaa tgaaagcgtc aagctctcgt ttttcagaag gatccatgta attagaccct 50880 gtcattagtg tagtggcgtc catggaaacc tcagaaatgg ttacagtcca gataatggta 50940 tagtaagctc actaaaaaag caaggacttc gccttgcttt tgtaaacggt tgcatattct 51000 aaatgctagc caacaatatc acgaagcata cgggacgttt cgcgtttaat agcttgacgg 51060 aacttgtggc agatgcgttc acgctcatcc ggttctaata ctttcgtatt aactacaata 51120 acaccacccg cttcacggtc ggttctaatt ggaacactgt ctttaatgca atgctctaag 51180 cgtgcagacg cacgtgcagc gtcaaccata atttgagctt tgcccgccca gtcacttggt 51240 tgcaacttag ttgtgtcaat gccaccacct gctttctgat tgcgacgttt aagttgcatg 51300 tcaactagac cgtgtgcagc tagtgtgttc acaattgaag attcaatttg gatatctgtg 51360 ttgttgtaaa tccaaacaag gtacgaagta ccgtcactag atttcataag ttccgcacca 51420 gtacatccac ggaagcgtcc aaattgaata gtttcacgta gtgtaataat gttgttactt 51480 gcttttggtt cttttagcgt tacagctacc attctaaacc cctgtaagcc cctgtgggcc 51540 gctttgttaa tgttgccggt acaactgcac cgatcgctag ttaaaacccc gtagcacccc 51600 cgaaagtggt tgtttaaatg cggtgaccac gtgttacggt tgcaccgtgt gcgctgccgg 51660 tattgtggct cgcgctaact acgggtaagc cataggcttt atgttgtaac tatacatatt 51720 tctattgcaa aagcatagac aaaaccgttc attgcgcaac gtacccctaa ttgcgcagaa 51780 aaattacgca ctaatgtggt tttgttcaat ataggcatac accctaatcg gaattaaaaa 51840 ctgttcctta aaacaaatag acctttatat taaacacact atatattatt tattacgtta 51900 tatattttta ttttatattc tatattttac tagttgttgc ttttatgtca ctaactgttt 51960 taacacaaac tagtgtgcaa agtgcgccgc aaaggatccc caaaaatagg cctacctagg 52020 tggcgcactt gcgcacttgc cctttttctc ccctaaaccc ttgttttata acgctttttt 52080 ggtgtgcaca cacaagttta attgctgccc gcagtacgtt cttttaataa agtttgttct 52140 attcgctata cgggtcatcc cggcattggt aaaccgcatt caactatagc aaacaataag 52200 tctatgaatt actctttgat aatgccacat ttgaatttta aaagctaggg tattgcaaaa 52260 gacccatctt taggtcaaaa taaaagcctt gctattgcta acaaggcttc acgtggtata 52320 agcaactaat agcaaagtta attcaaataa accatgctat taataaacct tagacttcta 52380 cttaccgagt tgccactcac cgctcgcaac acgctccaag aatgtggtca agtctatagc 52440 gtcacaagca ctttccaagt aacttgcaac cttgtctgca tcccattcaa ctattagtgc 52500 accgctatca tgtgcaagga acgtcggttg aatgtcgtgt cgccatttgt caaagcgtgg 52560 ggaacgtgga atgtcctgtc ctggaactgg aataccaacc cactgaattc cgcaaccgat 52620 atattgatct tgcgtatccc acaacattgc acggtcaggg tctgtaagtc cacgtgtcat 52680 tgcaaccttg tggagcttat caatttcagg tgtgtacacc aacgcatttt gaaccatacc 52740 cgcagcacgt ttcatgtctt tgttttgacg tttgaaaagc tgcccaagct cattggtttc 52800 actttccatt aggttgtgct gtcgttcgat aaaccctaac acaatcccgt catatgggtt 52860 ttccggtttg atgcgtagga agtaaccctg tttaacagtt gagcgtccga gtttgtacgc 52920 tagatccttg cgcttaaagc aaagaccctc gtaaccgtgc tctattgccc acccgtaggc 52980 gtgcatagcg tcgctttcgc ttacgtaagg gtattgcatt acagcgtgca caatgtggcc 53040 tacaagcgca cacagtgccg taacgtgctg cttataaagc ccgtaacgtt gttcaaacgg 53100 tagatccggt tgctctggat cccaacagtc aaacacgtgg aattccattt ggcgtgcgtc 53160 aatattacct tcaccacgac agcaactatc aatacgcttg aagtcccaac cgtgaacgta 53220 gaactcacct tcgagcataa tattgtggtc atagcagtaa cgctcaaccg cgtcaaagcg 53280 ctcgtagata attgtgttgt tgaatggttt caactggcgg gtaactaagc cttcatctgg 53340 tgtgaactgt gcgcgtacac cttcaagctt aatagattgg aagaagtttt catttagtgc 53400 gtctagctgt gctgttgcag ctaacatcgg cttaaacata gttcatgtcc tttgcagaat 53460 aataaaaaag ggtgttaccg aagcaacacc cttataataa tgtaaggaac aattctatgc 53520 aagacttatt ttagctattt tgggcgcaaa cgtgttaccc aatcaaacac gtaaagctta 53580 cccctttcac gcttcaagcg atagagcata tataagctca ccaccatcca gcccacgctt 53640 acaactagtg cacgttggtc agcagcgcca accaaactca accccattag aatactagat 53700 attaagttac aaaggttgta acgttcacca gtagctttcc aaagggatga ggcaactagg 53760 aaataagcga gtacagctaa taacgcgcct acagtaccga atagatacca cacattaatc 53820 atacaccacc ttcctgaact gcttcataag caagtcgggc tttgaaccaa cgctcaaagt 53880 cttccttgtt aagttctgaa cgaacttgaa cgtagccaga gccgcctgta tggatgtgtg 53940 accacaccat aaagcgccac ttctggcggt tttgacggaa cgctaatagt ggtacttggt 54000 gttcacccgt agccttcagc acttggttcc accacgtatt gatactgagc gcctcttgac 54060 gtttaatttc aatagctaac caaggaattc cgtcaatatc gtaaccaccc agcgcggact 54120 ggttctggtt acgaaacagc ttgataggct ctaaacctag cttgctgtat acttcgtcaa 54180 ccattggttg caggaacttg ataaactcgc gctcgccctc tttaccttta ttcacaacat 54240 gtaccattct aaaatacctc caagtgtgga gctagaacaa cacggtaacg aacaacaaaa 54300 gcacggagtt tcacttcatt ttcctgcggg ttaatggatt gacgccaatt ggacgcgggg 54360 tcataaacgc ggatattctc agcgtccctt gcatctacaa tgatcatgtg caattcggtt 54420 agtaaaccac tcgacacgat caatacatag attgaccccg caaaaatatt ttcaaggtcg 54480 tctggtgttt caacaactac accgtaacgc tcacacactt catggaagcg gcggtttccc 54540 gtttccaaat cagtatgatg acgctcaatt aacttctcaa caggttgacc cgttagcatt 54600 gcaaggcaag cactttggca agagcgtccg cacggctgtg taatgtggtc aatcggttta 54660 agcgtcattt gagtctcctt gtgtaacggt agttgtacca ttatccgcta cagttccgca 54720 agggataacc gcaaacggaa agcctttcga ctctagctcg ctttttatgc ggtagtaaca 54780 gtcaggtgtc acttcccata ccaagcggtc tgtatttaag ttcaaacgga caagaaacgc 54840 ttcaaggtta aggaagcgca gcgtacccgt tttgcacaac ttacgaccaa ggaactcgat 54900 gtgttcttcc tgctcaacca taatttcttg cataccaagt ttgataaggt tgaacccgtt 54960 tcgacactcc aagctgagct cgcccataga acgaaggtct tcaatgctgt aagtgtagtc 55020 cacgtcttca cgcatgaatg tctgcaacac gtttgcggtt gcgccaatac ggtagagctc 55080 ttcaaagccc tgtttcatct tttcgtttac aattgccatg ggctacccct tagttcgttt 55140 tacttcgctt ttcattagac gcttttcacg taacgccttt tgacctgctt ccaacgcttc 55200 gcgctgcttc ttggttgact tttgtccctt acggacacca ctgttaccgt tgtaacgatt 55260 gccgtcagct agcattttgc gacgctgttt gataaagtct tcgattggaa agtacatgac 55320 cacattactc cacgtccagc atgagacgcg catccgggtg gagggtccac gcttgaggtt 55380 taaggatttc aagtaccgcg ctttgtactt tgcagtaaca cgcggaacat aggtcgtttg 55440 tttccatagc ttcgaaacca ttatggttct tgcttgggta aaccaaacga attaacgctt 55500 ggctgtcatt gtcgagctct ttgctgatag gtacaccgca gccgtcgcac acaattgtgg 55560 tcactttagc cattatttgt cctccgtttt agcaatagac cattctttag gttccaacgc 55620 aagaaccgtt gtttcgcggt gatccgctgc gcgaattgtc aacacgccac cagtgctaac 55680 aacaattcgg taataggtgt cactgaactc tgcgatgcac tttagcacac cgaaccaagt 55740 acgcttataa acacgaatca cagttcaatc cccataccag ttaggaaatt atcaacaccg 55800 ttacacatta cattgtaacg acctttcttt tctttgtatg ttttctcagc tgctgcaact 55860 agctgttctt tagacatgtc aaagctacca attgcggaac ctaaattaat agtttgaccg 55920 tcttccattg cgcgtgcgta ttgcaaagac tcttccgcag cttgcatttc aacacgagcg 55980 ttgcgaactt tatcttgcag tttctttaca cgaagttcag ttagggttgc catgtaatcc 56040 tctcttttgt ttaggtggta gatgtccttt atattcaagg aagcgttcct gttccatttt 56100 ggaacccttg ccaccaccag ttgtttgaat aagtacgccc ttttgtctaa gggacttaat 56160 tgcacgcttt aagcgcgctg aactaacacc cataatacag ctaagttcag cgtatgtaaa 56220 gcggtttagc gtaacaatgg tgcagaacac gtcatgctct aagctcccct tttgcaagac 56280 caggaacctc cttgtaatac ttgcgaatgt accaaaccgc aacgctatac gtgtcaccgc 56340 tagttgcgga cttcccgtta atggttacga acttgtaaca cacgttgtaa ccatcacagt 56400 caactataat gatgcgcgaa ttgtgtttgt tggaatacca aacagccccg cacgcgggca 56460 tttcaacaaa gtgggaacac caccaagctc gtaaccagtc aaacattagt tagtacctcg 56520 cgggcgattc cattgttgac gtttgcgacg acggtctcct ttggatgtgc gaccacctaa 56580 ccgacccgct ttcaccttat gggttggaca aatagaaccc ttcagtaact cggcaacaag 56640 accgctttta ccaccaccgc gaccacccat aatcacaact tcaccaccac gaggaagcac 56700 ctcactaata tccgggaagc tgtcactaac aatgaacatg tctggagagt aaccttgcgc 56760 cacaaggtta tcgcgagcct ctgtggtcac aacataagca aactgagcta actcatgccc 56820 gcacttctcc attgcggtag ctagtgagcg gaaagcttgc acagctgatt ctgcactacc 56880 ttcgatgtgt gcaattgcga ttttgttacg ttccgcaagc tcttcgtaga acttgttatc 56940 aattgaaccg tgcttaccaa actgcccgtt gagtaacatt gcgcgagcgg ttgcatccat 57000 tggttcgctt tcagcacgtt gcgtttgcca catttgctca agctcggtct ctcggtcgag 57060 tttcatttct ccacgcttag cttggatgaa ttcctccatt gcttgctcct cttgcttttc 57120 aagctcgagc ataacttcct gctcgcacag tgagaagtgg tcgcgcttaa tgtagagaca 57180 gtttctgcaa ataatgtgac cagttgcatg acaggttgtg gtgttttccg agttgcattt 57240 agtacagttc atttatttac cctccgcaat tgcttttacg tagttctgga ataagcgttc 57300 ttccgcttgc tttaccgagt ggttgcaacc cgttctaaac tgtgctttgc agattgggca 57360 tttgctacca cgtgcactga agttgtccat tgctttctta gcgcgttgaa ttcgttttga 57420 cataataact cctttaaata caataaaagc ggtatagtgt taatataccg cttagaacgt 57480 tcaaaagcta gattacttag tgctaggttg tggcggcgcg ctacaacgca cctccaaaga 57540 agtaacatca aaacctaacg cttcaagttg ggtttcaatt tcgtaagctt catcgtgcca 57600 gaagttgacc acatggttta ttagcttagg ctcgttgcga agcttgccgt gtatgtggtc 57660 atgcccatca atacgtcgaa taaaaccaaa ctcgatatcc atgtcgcgaa tggttttaat 57720 cttctgtagt agtgcttcgt gctgcttcag caagctgttc agcttttcca ggctttgcag 57780 gttcatccgg ttctccatct aagaatttgt ccgcccatcc ttccagttgg tctttgtact 57840 caaccggaag cttatcacga tcccaaccgc aaataattga gatcaactcg ttcattggtt 57900 cagtatccat aacagatact ttcacctgta aaacgctcat tgccatgttt aacgtcccgt 57960 aaaggtagta acaacccccg catctttatt acggggaacc gagtgtcgct cggacccaca 58020 aatcaaagtg aagtgggtgt tagcaactag gatacgcgca ttcatatcgc gaaacgcgta 58080 actaaaacca taatcaaagt catcacgacg cttaatgtgg ttgaacattg tttgtacagc 58140 tttagtagct tcttcgtact gtttacgctt ccacattgaa gctgctttag gtaaagagtg 58200 cattatgtaa tatctccagt gttttaacga ttcgttctgc aagccacatc gctcgcggta 58260 cacctagcac gtccagcgcg agtaaaaatg gaattgcaag gattaagctc agcgatccaa 58320 cgccagcgtg ccaaaaccaa cgccaccacc aacggtcaca catcgcgcca agcatccaaa 58380 cacagaacca aatgagaggc gtgaatacca agaattgcag tataccaagt tcaggtggta 58440 tattactaga cgtgttgttt accgcaacag cagacgcagc aattgccggg gcaacg 58496

Claims (7)

  1. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 미오비리대 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP).
  2. 제1항의 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP)을 유효성분으로 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가제 또는 약욕제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
  4. 제2항에 의한 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제 형태인 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  6. 제2항에 의한 박테리오파지 Vib-PAP-8(수탁번호 KCTC 13248BP)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 사람을 제외한 동물을 담그는 처치를 실시하는 단계를 포함하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 약욕제 형태인 것을 특징으로 하는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
KR1020170058073A 2017-05-10 2017-05-10 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-8 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 KR101915493B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170058073A KR101915493B1 (ko) 2017-05-10 2017-05-10 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-8 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170058073A KR101915493B1 (ko) 2017-05-10 2017-05-10 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-8 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101915493B1 true KR101915493B1 (ko) 2018-11-08

Family

ID=64329903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170058073A KR101915493B1 (ko) 2017-05-10 2017-05-10 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-8 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101915493B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116732006A (zh) * 2023-08-09 2023-09-12 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 副溶血弧菌噬菌体解聚酶及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Appl. Environ. Microbiol. 2009, vol. 75, no. 9, pp. 2659-2667.
Current Opinion in Biotechnology. 2005, vol. 16, Issue 3, pp. 299-307.
GenBank: KX198614.1, 2016.07.05.
J. Bacteriol. 2003, vol. 185, no. 21, pp. 6434-6447.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116732006A (zh) * 2023-08-09 2023-09-12 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 副溶血弧菌噬菌体解聚酶及其应用
CN116732006B (zh) * 2023-08-09 2023-11-17 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 副溶血弧菌噬菌体解聚酶及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101761578B1 (ko) 신규한 장병원성 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＨＰ-2 및 이의 장병원성 대장균 증식 억제 용도
KR101699245B1 (ko) 신규한 파스튜렐라 멀토시다 박테리오파지 Ｐａｓ-ＭＵＰ-1 및 이의 파스튜렐라 멀토시다 균 증식 억제 용도
WO2016108538A1 (ko) 신규한 장출혈성 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＨＰ-1 및 이의 장출혈성 대장균 증식 억제 용도
WO2016108541A1 (ko) 신규한 시가독소생산 F18형 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＯＰ-1 및 이의 시가독소생산 F18형 대장균 증식 억제 용도
KR101822812B1 (ko) 신규한 엔테로코쿠스 패슘 박테리오파지 Ent-FAP-4 및 이의 엔테로코쿠스 패슘 증식 억제 용도
KR101792522B1 (ko) 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-5 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도
KR101609111B1 (ko) 신규한 에드와드시엘라 타르다 박테리오파지 ＥｄＷ-ＴＡＰ-1 및 이의 에드와드시엘라 타르다 균 증식 억제 용도
WO2016108542A1 (ko) 신규한 장침입성 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＯＰ-4 및 이의 장침입성 대장균 증식 억제 용도
KR101727456B1 (ko) 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Ｖｉｂ-ＰＡＰ-1 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도
KR101756088B1 (ko) 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Ｖｉｂ-ＰＡＰ-2 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도
KR20180061774A (ko) 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＯＰ-7 및 이의 병원성 대장균 증식 억제 용도
KR101915486B1 (ko) 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-7 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도
KR101581654B1 (ko) K99형 대장균 감염을 방지 및 처치하는 방법
KR102073086B1 (ko) 신규한 스트렙토코커스 수이스 박테리오파지 Str-SUP-1 및 이의 스트렙토코커스 수이스 균 증식 억제 용도
KR101859973B1 (ko) 신규한 에로모나스 하이드로필라 박테리오파지 Aer-HYP-1 및 이의 에로모나스 하이드로필라 균 증식 억제 용도
KR101291052B1 (ko) 살모넬라 티피무륨 감염을 방지 및 처치하는 방법
KR101723466B1 (ko) 신규한 스트렙토코커스 이니에 박테리오파지 Ｓｔｒ-ＩＮＰ-1 및 이의 스트렙토코커스 이니에 균 증식 억제 용도
US11844818B2 (en) Aeromonas hydrophila bacteriophage Aer-HYP-3 and use thereof for inhibiting growth of Aeromonas hydrophila bacteria
KR101915493B1 (ko) 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-8 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도
KR101875565B1 (ko) 신규한 에로모나스 살모니시다 박테리오파지 Ａｅｒ-ＳＡＰ-2 및 이의 에로모나스 살모니시다 균 증식 억제 용도
KR101796642B1 (ko) 대장균 박테리오파지 Ｅｓｃ-ＣＯＰ-9 및 이의 병원성 대장균 증식 억제 용도
WO2018236086A2 (ko) 신규한 에로모나스 하이드로필라 박테리오파지 Aer-HYP-2 및 이의 에로모나스 하이드로필라 균 증식 억제 용도
WO2018117462A2 (ko) 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Ｖｉｂ-ＰＡＰ-4 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도
KR101915480B1 (ko) 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-6 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도
WO2015020345A1 (ko) 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염을 방지 및 처치하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant