CN116732006A - 副溶血弧菌噬菌体解聚酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了副溶血弧菌噬菌体解聚酶及其应用，所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶可以特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，有助于辅助预防或治疗感染副溶血弧菌所引发的疾病，避免产生耐药性。并且，本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有耐酸碱和热稳定性高的优点，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及副溶血弧菌噬菌体解聚酶及其应用。
背景技术
副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）可引起人体出现呕吐、眩晕等反应，严重时可致死亡，是危害公共健康的主要致病菌之一。可造成海水鱼类体表发炎充血、南美白对虾发生急性肝胰腺坏死综合征，给水产养殖造成了巨大的经济损失。
当前，应对副溶血弧菌引起的水产疾病主要采用抗生素和化学药品进行防治。然而，不合理的药物使用导致副溶血弧菌多重耐药性的增加以及鱼类等水产品存在药物残留等问题，严重威胁人体健康。因此，寻求安全有效的绿色替抗产品已成为水产养殖的研究重点。
研究者试图利用中草药、益生菌等进行联合防控，但这些防治效果不佳。噬菌体解聚酶通常水解细菌表面多糖，如荚膜多糖、脂多糖、胞外多糖等一类噬菌体衍生酶。国内尚未有关副溶血弧菌噬菌体解聚酶的报道。
因此，目前针对副溶血弧菌噬菌体解聚酶仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种副溶血弧菌噬菌体解聚酶。根据本发明的实施例，所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明实施例的副溶血弧菌噬菌体解聚酶可以特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，有助于辅助预防或治疗感染副溶血弧菌所引发的疾病，避免产生耐药性。并且，本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有耐酸碱和热稳定性高的优点，在16℃放置30天，仍可保留75%活性，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种分离的核酸分子。根据本发明的实施例，所述分离的核酸分子编码前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体含有前面所述分离的核酸分子。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有下列至少之一：前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子和表达载体。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗副溶血弧菌感染药物。根据本发明的实施例，所述抗副溶血弧菌感染药物含有下列至少之一：前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体和所述重组细胞。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种联合药物。根据本发明的实施例，所述联合药物包括：前面所述抗副溶血弧菌感染药物；血清。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体和所述重组细胞中的至少一种在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗因感染副溶血弧菌所引发的疾病。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种降解副溶血弧菌表面多糖的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体和所述重组细胞中的至少一种与副溶血弧菌进行共培养。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种体外杀灭副溶血弧菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、所述分离的核酸分子、所述表达载体和所述重组细胞中的至少一种与副溶血弧菌和杀灭副溶血弧菌的制剂进行共培养。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的电泳图；
图2显示了根据本发明一个实施例的平板实物图，其中（A）为0.5~256 μg解聚酶pdep-101在平板上生长后的实物图；（B）为PBS及0.016~0.25 μg解聚酶pdep-101在平板上生长后的实物图；
图3显示了根据本发明一个实施例的不同pH值下蛋白活性示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的不同温度下蛋白活性示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的解聚酶pdep-101在不同温度下作用不同时间下蛋白活性示意图；
图6显示了根据本发明一个实施例的解聚酶pdep-101与不同细胞培养下蛋白活性示意图；
图7显示了根据本发明一个实施例的解聚酶pdep-101联合人血清的杀菌效果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提出了副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子、表达载体、重组细胞、药物、联合药物、用途和杀死副溶血弧菌的方法，下面将分别对其进行详细描述。
副溶血弧菌噬菌体解聚酶和分离的核酸分子
在本发明的一个方面，本发明提出了副溶血弧菌噬菌体解聚酶。根据本发明的实施例，副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其相比具有至少80%同源性的氨基酸序列。
根据本发明实施例的副溶血弧菌噬菌体解聚酶（在本文中，亦称为“解聚酶pdep-101”）特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，与其他用于杀灭副溶血弧菌的制剂共同作用，实现杀菌目的，有助于发挥辅助预防或治疗感染副溶血弧菌所引发的疾病，避免产生耐药性。并且，本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶同时具有耐高温和耐酸碱性，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
AVIAAGYAADAEAAFDNFTDLYLGAKATDPITDNDGNSLQVGATYWNTTSNDLRYWSGATWDIPEQTAIQAANDAVAARDDAQVSETNAANSASAASTSESNAAQSASDALASENAASTSESNAATSESNAATSASSAAASENNAAQSAVDAQQSADDTAAIVPSLQSQIEDRVTYPDLTTAQGDVLGGKLIKGSNSETVENGDEIPAGTTHLRVLVGGKPTIVAMSPIASGIVNSLTDKGAVIGGDDVSFTRHLEVSTVFDLMNHPLISEGFTVETEGYYTPGDGGGNTYEIVAPGTGVEDGGSFINLTGSGFQAKGIFEGHDVDIRQFGVLRNGEKDTNAFKAALTFCFSNNKNLDVSVDIHVTDVTINSGVGSVTCSNGVIIAHPDSDQSDVYGSELLTFGAGVSGSEFYLKIDLNGLPKSGVALEGEGNKSDLIYVSNGVVTQPRTRNIWGARISNDRNIVGTVKTEGFSFYEDPMVGVYSVVVDNHCQDTEIQRIISNGSAAILNNGKRTNVGYVRSEKSEDNAVYEIEGAEELHIGTLVVSECSDEVLVLSKNKLARIDTIIATNCARGIGIAETDNSSVGTLIWNSELGSIQDSGSPLYFRPTQVGRTSSFTIDHMIINGKWDNGAPIYTLDNGEIGTLTIGKITANLVYSNVNATKYLGFWSANTDRIQIGDINVTVTDETGTLSSSDTFLLTLPGLLSLPSNIGGITLSNGGGSHNVRAINITEPNLVISNTPTVRADIGTPFIPQNDTQQTTRFYGSGAVPTNGTWKKGDTVWNQFPTAGGHLGWVCVTGGTPGAWKKFGDIEP（SEQ ID NO：1）
在本发明的另一方面，本发明提出了一种分离的核酸分子。根据本发明的实施例，分离的核酸分子编码前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶。由此，根据本发明实施例的分离的核酸分子编码的蛋白可特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，有助于辅助预防或治疗感染副溶血弧菌所引发的疾病，避免产生耐药性。并且，本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有耐酸碱和热稳定性高的优点，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
根据本发明的实施例，分离的核酸分子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其相比具有至少80%同源性的核苷酸序列。
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在本发明中，术语“同源性”是指核苷酸序列或者氨基酸序列之间的相似程度，同时本发明所说的具有(一定程度)同源性的核苷酸序列或者氨基酸序列对应的蛋白至少在用于本发明的功能方面具有相同或更好的活性。
在本发明中，术语“至少80%同源性”指与各参考序列至少为80%，可为81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%的相似程度。
尽管本发明采用的是由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQID NO:1的副溶血弧菌噬菌体解聚酶pdep-101，但是可以理解，pdep-101的任何功能等效变体均适用于本发明中，功能等效变体相较于SEQ ID NO:1所示的pdep-101可以具有一个或者多个氨基酸的插入、替换和/或缺失，但是依然具有SEQ ID NO:1所示的pdep-101的相同功能/作用。
需要说明的是，前面针对副溶血弧菌噬菌体解聚酶所描述的特征和优点，同样适用于该分离的核酸分子，在此不再赘述。
表达载体和重组细胞
在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，表达载体含有前面所述分离的核酸分子。由此，根据本发明实施例的表达载体可以将分离的核酸分子表达为副溶血弧菌噬菌体解聚酶，其可以特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，有助于辅助预防或治疗感染副溶血弧菌所引发的疾病，避免产生耐药性。并且，本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有耐酸碱和热稳定性高的优点，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
在本发明中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。表达载体可包括主要用于将DNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA的载体以及主要用于DNA的转录和/或翻译的表达的载体。示例性地，表达载体可以为质粒、噬菌体、粘粒或病毒等。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，重组细胞含有下列至少之一：前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子和表达载体。由此，根据本发明实施例的重组细胞可以特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，有助于辅助预防或治疗感染副溶血弧菌所引发的疾病，避免产生耐药性。并且，本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有耐酸碱和热稳定性高的优点，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入表达载体的原核细胞或真核细胞。
需要说明的是，前面针对副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子所描述的特征和优点，同样适用于该表达载体和重组细胞，在此不再赘述。
药物、联合药物和用途
在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗副溶血弧菌感染药物。根据本发明的实施例，抗副溶血弧菌感染药物含有下列至少之一：前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子、表达载体和重组细胞。由此，利用根据本发明实施例的药物可以特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，有助于辅助预防或治疗感染副溶血弧菌所引发的疾病，避免产生耐药性。并且，本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有耐酸碱和热稳定性高的优点，方便储存和使用，对使用环境要求宽泛，应用价值高。
根据本发明的实施例，药物进一步包括药学上可接受的辅料。
在本发明中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本发明中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
根据本发明的实施例，药物进一步包括：用于杀灭副溶血弧菌的制剂，所述用于杀灭副溶血弧菌的制剂包括：血清。采用本发明的副溶血弧菌噬菌体解聚酶可以特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，再在血清的作用下实现高效杀灭副溶血弧菌的作用。
根据本发明的实施例，血清选自人血清。由此，人血清与副溶血弧菌噬菌体解聚酶，可以进一步增强杀菌效果。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子、表达载体和重组细胞中的至少一种在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，药物用于预防或治疗因感染副溶血弧菌所引发的疾病。
根据本发明的实施例，疾病包括：肠胃炎、伤口感染、败血症、肝胰腺坏死综合征。
在本发明中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本发明使用的“治疗”涵盖动物的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本发明使用的“治疗”涵盖将药物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本发明所述药物给予有需要的个体。
在本发明中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入患者。本发明的药物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉、肌肉、皮下、皮层、口服、局部、鼻腔、肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，肽被消化，肽键断裂，因此口服给药的药物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解或破坏。优选地，本发明的药物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。
本发明的药物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型、给药途径、患者年龄、性别、体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。
需要说明的是，前面针对副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子、表达载体或者重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该药物、联合药物和用途，在此不再赘述。
方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种降解副溶血弧菌表面多糖的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子、表达载体和重组细胞中的至少一种与副溶血弧菌进行共培养。由此，利用本发明的方法可以特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，有助于杀灭副溶血弧菌。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种杀灭副溶血弧菌的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子、表达载体和重组细胞中的至少一种与副溶血弧菌和用于杀灭副溶血弧菌的制剂进行共培养，所述用于杀灭副溶血弧菌的制剂包括血清。由此，副溶血弧菌噬菌体解聚酶可以特异性地降解副溶血弧菌表面多糖，再在血清作用下实现高效杀灭副溶血弧菌的作用。
根据本发明的实施例，血清选自人血清。由此，可以进一步增强副溶血弧菌杀灭效果。
需要说明的是，本发明对于副溶血弧菌的存在状态不做严格限定，既可以存在于受试者表面，也可以存在于受试者内部。对于受试者的类型不在严格限定，可以为动物或植物，当为动物时，不以疾病的诊断或治疗为目的，例如为对副溶血弧菌的微生物学研究或者副溶血弧菌噬菌体解聚酶的蛋白组学研究。
根据本发明的实施例，共培养的温度为4~60℃，pH值为4~10。在一些实施例中，共培养的温度为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃；pH值为5、6、7、8、9。由此，副溶血弧菌噬菌体解聚酶具有耐高温和耐酸碱的特性，在上述共培养条件下仍具有较高的酶活性，从而更好地发挥辅助杀灭副溶血弧菌的作用。并且，方便存储和使用，应用价值高。
需要说明的是，前面针对副溶血弧菌噬菌体解聚酶、分离的核酸分子、表达载体或者重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例中，采用的主要材料如下：
pET-28a-sumo载体：购买于Invitrogen公司。
BL21(DE3)感受态细胞：购买于Invitrogen公司。
洗涤液洗脱液配方：Tris 20 mmol/L、NaCl 500 mmol/L、咪唑50-500 mmol、甘油5%、Tween0.05%。
实施例1 重组蛋白的构建与表达
1. 按照SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列合成得到目的片段基因dep-101。
2.构建重组质粒
（1）将目的片段与pET-28a-sumo载体分别与限制性内切酶BamH I和Hind III在37℃酶切1.5 h；
（2）将酶切后的产物在T4连接酶的作用下4℃过夜连接，连接体系条件如下：
将测序成功的重组质粒pET-28a-sumo-dep-101，转化BL21(DE3)感受态细胞中，按照1:100的比例向1000 mL的LB液里（含50 mg/mL Kan）加入重组质粒BL21(DE3)-pET-28a-sumo-dep-101。37℃摇床振荡培养至菌液OD600nm=0.4，加入终浓度为0.7 mmol IPTG，25℃摇床中160 rpm诱导培养12h。利用Constant Systems高压细胞破碎仪破碎菌体，获得未纯化的裂解酶蛋白。
利用Ni-His亲和株纯化蛋白，将未纯化的蛋白经HiTrap Q Sepharose FF column(GE Healthy Care)，使用洗涤液（咪唑浓度20 mmol）洗涤三次（每次1 mL）后不同咪唑浓度的洗脱液洗脱（50 mmol、100 mmol、150 mmol、200 mmol、250 mmol、300 mmol、350 mmol、400 mmol、450 mmol、500 mmol），收集流出液，将流出液通过PBS（pH=7.4）透析咪唑，使用50-kDa蛋白浓缩柱浓缩目的蛋白pdep-101。
解聚酶pdep-101蛋白纯化后的胶图见图1，其蛋白大小为96.4-kDa（目的蛋白85.2-kDa，sumo蛋白11.2-kDa）。解聚酶pdep-101蛋白纯度检测结果为25.6 µg/mL。
实施例2解聚酶pdep-101抑菌效果
取出保存在-80℃副溶血弧菌（ATCC 17802），将适量菌液划线在TCBS培养基上。在30℃温箱孵育16h。挑取单克隆至LB培养中，在30℃温箱孵育12h。取100 μL副溶血弧菌与6mL软LB混合（含0.7%琼脂），倾倒在LB固体（含1.5%琼脂）平板上。待晾干后，取3μL不同稀释度的解聚酶pdep-101点在双层平板上。待晾干后，在30℃温箱倒置孵育12h。
结果如图2所示，0.032μg解聚酶pdep-101仍旧对副溶血弧菌形成透亮的晕环。
实施例3pH对解聚酶pdep-101的酶活影响
提取副溶血弧菌胞外多糖(EPS)，将冻干的EPS加入适量的不同pH溶液buffer溶解（pH=2、3、4、5、6、7、8、9、10），以达到所需的使用浓度。取900 µL EPS (2 mg/mL)稀释液与100 µL解聚酶pdep-101 (25.6 µg/mL)混合，在30℃温箱孵育2 h。解聚酶pdep-101对EPS的降解作用通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）来进行检测，具体步骤包括，加入130μl DNS并煮沸10min。使用多功能酶标仪在OD450nm读长下检测数值，其中最高数值的pH被标为100%，其它各组的数值=检测的数值/最佳检测的数值×100%。该试验一式三份。
结果如图3所示，解聚酶pdep-101在pH值在4-10范围内，酶活性保持在80%以上，其中在pH值为6-8范围内活性保存在98%以上。
实施例4温度对解聚酶pdep-101的酶活影响
解聚酶pdep-101对不同温度的敏感性试验与上述pH试验方法一致。不同的是所选择酶活性较高的pH buffer (pH=6)。混合物分别在4℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃环境下孵育2 h。使用多功能酶标仪在OD450nm读长下检测数值，其中在最佳pH(30℃)下的读值被标为100%，其它各组的数值=检测的数值/最佳检测的数值×100%。该试验一式三份。
结果如图4所示，解聚酶pdep-101在4-40℃范围内，酶活性没有活性下降；在50℃条件下，酶活性保持在90%以上；在60℃条件下，酶活性保持在85%以上；在70℃条件下，酶活性保持在10%左右；而超过80℃，酶活性完全丧失。
实施例5解聚酶pdep-101在不同温度下作用时间
提取副溶血弧菌101胞外多糖(EPS)，将冻干的EPS加入适量的PBS（pH7.4）溶解。取900 µL EPS (2 mg/mL)稀释液与100 µL解聚酶pdep-101 (25.6 µg/mL)混合，分别在-80℃、4℃、16℃、30℃和42℃五个不同温度孵育。每个温度组分别孵育1 d、7 d、10 d、15 d、20d和30 d。在反应时间结束后，解聚酶pdep-101对EPS的降解作用通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）来进行检测，具体步骤包括，加入130μl DNS并煮沸10min。使用多功能酶标仪在OD450nm读长下检测数值。其中在各个时间点-80℃条件下被标为100%，其它各组的数值=检测的数值/最佳检测的数值×100%。该试验一式三份。
结果如图5所示，解聚酶pdep-101放置在4℃ 30d仍旧保持90%以上的酶活性；在16℃ 30d仍旧保持75%以上的酶活性；在30℃和42℃放置30d，解聚酶pdep-101基本失去活性。
实施例6 裂解酶cpp-J1对细胞毒性影响
分别将人源的293T、A549、Huh7三种细胞培养至1×104个。在每个细胞板中，加入解聚酶pdep-101（终浓度25.6 μg/ml），37℃细胞培养箱中培养24 h后，移除培养基。每孔加入20 μl MTS试剂（Promega Cell Titer 96TM Aquesous One Solution CellProliferation Assay），2 h后在OD490nm检测吸光度，该试验一式三份。
结果如图6所示，解聚酶pdep-101对三种细胞无毒性作用。Prism 8.0软件比较各组间差异（NSP＞0.01）。
实施例7解聚酶pdep-101联合人血清杀菌效果
取100 µL（~108CFU）副溶血弧菌与解聚酶pdep-101 (25.6 µg/mL)混合后加入终浓度为75%来健康人的血清。混合物在30℃培养箱孵育2 h。对照组分别是单独的解聚酶pdep-101和血清。10倍倍比稀释统计存活的细菌的数目。该试验一式三份。
结果如图7所示，解聚酶pdep-101联合人血清具有增强杀菌效果，副溶血弧菌至少降低6-log数量级。Prism 8.0软件比较各组间差异（NSP＞0.01，***P＜0.01）。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (14)
1.一种副溶血弧菌噬菌体解聚酶，其特征在于，所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子编码权利要求1所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶。
3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述分离的核酸分子。
5.一种重组细胞，其特征在于，含有下列至少之一：权利要求1所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、权利要求2或3所述分离的核酸分子和权利要求4所述表达载体。
6.一种抗副溶血弧菌感染药物，其特征在于，含有下列至少之一：权利要求1所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、权利要求2或3所述分离的核酸分子、权利要求4所述表达载体和权利要求5所述重组细胞。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，进一步包括：用于杀灭副溶血弧菌的制剂，所述用于杀灭副溶血弧菌的制剂包括血清。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述血清选自人血清。
9.权利要求1所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、权利要求2或3所述分离的核酸分子、权利要求4所述表达载体和权利要求5所述重组细胞中的至少一种在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于预防或治疗因感染副溶血弧菌所引发的疾病。
10.根据权利要求9所述用途，其特征在于，所述疾病包括：肠胃炎、伤口感染、败血症、肝胰腺坏死综合征。
11.一种降解副溶血弧菌表面多糖的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、权利要求2或3所述分离的核酸分子、权利要求4所述表达载体和权利要求5所述重组细胞中的至少一种与副溶血弧菌进行共培养。
12.一种杀灭副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述副溶血弧菌噬菌体解聚酶、权利要求2或3所述分离的核酸分子、权利要求4所述表达载体和权利要求5所述重组细胞中的至少一种与副溶血弧菌和用于杀灭副溶血弧菌的制剂进行共培养，所述用于杀灭副溶血弧菌的制剂包括血清。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述共培养的温度为4~60℃，pH值为4~10。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述血清选自人血清。
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