CN110317792A - 副溶血弧菌噬菌体vp-hyp2及其应用 - Google Patents

副溶血弧菌噬菌体vp-hyp2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了副溶血弧菌噬菌体VP‑HYP2及其在防治南美白对虾致病性副溶血弧菌感染中的应用,属于生物技术领域。本发明利用双层琼脂平板法从台州南美白对虾养殖废水中分离到一株噬菌体,命名为副溶血弧菌噬菌体VP‑HYP2,保藏编号为:CCTCC NO:M2019227。本发明提供的副溶血弧菌噬菌体VP‑HYP2 pH耐受范围广,热稳定性强,使用本发明提供的副溶血弧菌噬菌体VP‑HYP2处理对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌后,在短时间内细菌数目显著减少,因此,本发明提供的副溶血弧菌噬菌体VP‑HYP2在防控对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌中具有很好的应用前景。

Description

副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2及其在防治南美白对虾致病性副溶血弧菌感染中的应用。
背景技术
南美白对虾是我国主要的水产养殖品种之一,在渔业经济中占有重要地位。近年来,南美白对虾产业正面临严重的急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosisdisease,AHPND)的困扰,给南美白对虾养殖产业造成了巨大的经济损失。研究表明,南美白对虾急性肝胰腺坏死病的病原菌主要是一种具有毒性基因pirA和pirB的副溶血弧菌,对虾一旦感染该致病弧菌,致死率极高。
抗生素药物是当前防治对虾急性肝胰腺坏死病较为有效的药物,但大量和频繁使用抗生素会带来耐药性问题和环境污染问题,已不符合当前渔业可持续发展的需求。因而,开发适用于渔业生产的抗生素替代品是当前研究的热点。
噬菌体是一类专门寄生于细菌、螺旋体、真菌等细胞中的病毒,又称为“细菌捕食者”,广泛分布于自然界中。根据噬菌体对其宿主的作用方式,噬菌体可分为烈性噬菌体(virulent phage)和温和性噬菌体(temperate phage)。烈性噬菌体感染后立即在宿主细胞内开始自身的生命循环,进而引起细菌细胞的裂解,因而在利用噬菌体控制细菌的研究应用中常使用烈性噬菌体。
相比于其他的细菌去除或控制方法,噬菌体防治具有如下特点:(1)专一性强,对其他菌群无影响,不会破坏环境中的菌群生态平衡;(2)对细菌耐药性适应性强,对多重耐药超级细菌同样有效;(3)研制开发周期短,筛选新的噬菌体只需要几周或几个月的时间;(4)噬菌体的培养和增殖成本低;(5)噬菌体随细菌裂解而消亡,不会有残留。
在水产养殖上,噬菌体防治已被应用于多种鱼虾的致病菌,如变形假单胞菌、绿脓假单胞菌、加氏乳球菌等。这些研究表明,用噬菌体代替抗生素防治水产养殖中的致病细菌是安全的、有效的。因而,噬菌体被认为是一种极有潜力的抗生素替代品,在去除致病细菌,特别是多重耐药细菌上,越来越受到生物技术公司和科研院所的重视。
鉴于此,开发一种可以有效去除南美白对虾急性肝胰腺坏死病的病原菌的噬菌体是目前水产养殖中需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全的、有效的用于防控南美白对虾急性肝胰腺坏死病的噬菌体,以替代抗生素在防治水产养殖中的应用。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种副溶血弧菌噬菌体,其命名为副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2,保藏编号为:CCTCCNO:M2019227。
本发明利用双层琼脂平板法从台州南美白对虾养殖废水中分离到一株噬菌体,该噬菌体具有由SEQ ID No.1的核苷酸序列表示的基因组,其pH的耐受范围pH=4-10,可耐受50℃高温。该噬菌体可特异性地裂解本实验室分离的南美白对虾急性肝胰腺坏死病病原菌副溶血弧菌HY3。将其命名为副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2(Vibrio parahaemolyticus phageVP-HYP2),于2019年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:中国武汉、武汉大学,保藏编号为:CCTCC NO:M 2019227。
本发明还提供了所述的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2在制备抗副溶血弧菌制剂中的应用。
本发明提供了所述的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2在制备抗副溶血弧菌HY3药物中的应用。
本发明提供了所述的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2在制备防治南美白对虾急性肝胰腺坏死病的药物中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种用于防治副溶血弧菌感染的杀菌组合物,包括有效量的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2。
该杀菌组合物主要应用于防治南美白对虾急性肝胰腺坏死病。作为优选,所述杀菌组合物中副溶血弧菌噬菌体的含量≥106PFU/mL。
作为优选,所述杀菌组合物还包括用于抗副溶血弧菌的抗生素。
优选的,所述抗生素为四环素。研究表明副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2与低浓度四环素配合使用,能够有效控制副溶血弧菌HY3的增殖。
本发明还提供一种对虾饲料添加剂,包括所述的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2。
本发明提供一种清洁剂或消毒剂,包括所述的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2。
本发明具备的有益效果:
本发明提供的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2pH耐受范围广,热稳定性强,使用本发明提供的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2处理对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌后,在短时间内细菌数目显著减少,因此,本发明提供的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2在防控对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为基于16S rDNA序列构建的菌株HY3与相近典型菌株的系统进化树。
图2为基于fur基因序列构建的菌株HY3与相近菌株的系统进化树。
图3为南美白对虾感染菌株HY3的测定结果,其中A为健康和HY3感染对虾的照片,B为HY3感染死亡率统计结果。
图4为电镜下的噬菌体VP-HYP2形态图。
图5为噬菌体VP-HYP2的pH稳定性测定结果。
图6为噬菌体VP-HYP2温度稳定性测定结果。
图7为噬菌体VP-HYP2对急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌杀菌效果的测定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步说明本发明的内容。
实施例1南美白对虾急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌HY3的分离鉴定
从对虾养殖场采集发病南美白对虾,用接种环蘸取病虾的肝胰腺部位,划线于TCBS平板上,30℃培养24h。次日,从TCBS平板上随机挑取绿色单菌落,划线于3%氯化钠的LB平板上进行单菌落纯化。反复划线纯化单菌落4次,将纯化的单菌落于-80℃甘油管冻存。
复苏冻存的菌落,抽提基因组。以基因组为PCR模板,用引物PirAB-2020F(5’GCACCGTAAATTTTCAGGTT 3’)和PirAB-2020R(5’CGTTGCAATCTAAGACATAG 3’)扩增毒性基因pirA和pirB及其部分上下游序列。将PCR扩增获得的预期大小条带送上海生工测序,测序结果显示菌株HY3的pirA和pirB基因序列完整(GenBank登陆号MH718270),表明菌株HY3含有引起南美白对虾急性肝胰腺坏死病的致死性毒因子基因。
为明确菌株HY3的分类地位,以菌株HY3的基因组为PCR模板,用通用引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’)扩增16S rDNA序列。将PCR扩增的预期大小条带送上海生工测序,并对测序序列进行分析和构建系统进化树,结果显示菌株HY3与副溶血弧菌聚为一支(如图1所示)。进一步,用引物fur_V_fw(5’TAACCYYTTGAASTTGAASTTCG 3’)和fur_TS_rv(5’CGWAYDGGHTAYTTCTGTGYDGAT 3’)对菌株HY3的fur基因进行PCR扩增,并送上海生工测序,将测序序列构建系统进化树,结果显示该菌株与副溶血弧菌聚为一支(如图2所示)。结合菌株HY3在TCBS平板上的菌落特征,将菌株HY3鉴定为副溶血弧菌。
实施例2副溶血弧菌HY3致病性鉴定
采用浸泡攻毒方法对菌株HY3的致病性进行试验,具体如下:从附近养殖场取来健康的南美白对虾(约1g),在人工海水(每1kg海水晶兑33L蒸馏水)中适应4-5d。每组15只对虾,设置3个平行组;实验组浸泡于病菌浓度为1(OD600)的人工海水中,对照组浸泡于无病菌的人工海水中,都浸泡15min。将浸泡后的对虾取出,实验组转入病原菌浓度为0.01(OD600)的3L海水中,对照组转入3L的无病原菌人工海水中。试验期间,每天正常投喂、吸污、换水,记录对虾死亡情况,感染后观察7d,统计对虾累计死亡率。结果如图3A所示,与未接种的对照组相比,接种菌株HY3的南美白对虾表现出典型的急性肝胰腺坏死病特征,对虾出现空肠空胃,肝胰腺发黄或发白症状。累积死亡率统计显示,浸泡攻毒处理组的对虾累积死亡率随着实验时间的延长而增多,感染后第3d对虾累积死亡率超过50%,在第7d时对虾的累积死亡率接近100%,而对照组在实验过程中没有发生死亡现象(如图3B所示)。
实施例3噬菌体VP-HYP2的分离鉴定
以急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌HY3为宿主菌,利用双层琼脂平板法从台州南美白对虾养殖废水中分离到一株噬菌体,该噬菌体具有由SEQ ID No.1的核苷酸序列表示的基因组,命名为副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2。利用磷钨酸负染法,在透射电镜下观察确定了该噬菌体的形态,如图4所示。
为了使该噬菌体在平板上的噬菌斑更明显和清晰,双层琼脂平板中需加入5%甘油和0.3μg/ml四环素。
将分离纯化的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2送至中国典型培养物保藏中心保藏,保藏时间为2019年4月3日,保藏编号为:CCTCC NO:M 2019227,保藏地址为:中国武汉、武汉大学。并于2019年4月18日检测存活。
实施例4噬菌体VP-HYP2的pH稳定性测定
将上述分离到的噬菌体分别置于pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的SM缓冲液中(噬菌体滴度约106PFU/mL),30℃孵育1h,待作用时间结束后用双层平板法进行计数,重复三次取平均值,观察噬菌体滴度的变化。
实验结果如图5所示,可知噬菌体在pH4~9的范围内活力差异不大,说明分离到的噬菌体pH耐受范围较广。
实施例5噬菌体VP-HYP2热稳定性测定
取滴度约106PFU/mL的噬菌体液1.0mL于无菌EP管中,分别于50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中,分别在作用10min、20min、40min、60min后取出,进行双层平板法进行计数,重复三次取平均值,观察噬菌体滴度的变化。
实验结果如图6所示,可知噬菌体可以耐受50℃的温度环境,说明分离到的噬菌体可以耐受环境中的较高温度。
实施例6噬菌体VP-HYP2对急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌杀菌效果的评价
向20ml LB培养基(氯化钠浓度为3%)中接种副溶血弧菌HY3(控制菌液起始OD600为0.1),以MOI为0.1的比例加入噬菌体,四环素的浓度为0.15μg/ml,设置不接噬菌体组作为对照,于30℃、150rpm摇床中培养,时间点取样并测OD600值,重复三次取平均值,观察副溶血弧菌OD600值的变化。
实验结果如图7所示,可知噬菌体处理能在短时间内抑制急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌的增殖,与低浓度四环素配合使用效果更好,表明分离到的噬菌体防控急性肝胰腺坏死致病性副溶血弧菌的效果较好。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 台州学院
<120> 副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74126
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2(Vibrio parahaemolyticus phage VP-HYP2)
<400> 1
gtatataggg aaaacccgat tccctaccgt gtatagatta taatttattg ttgctagttg 60
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tgatcggcgg tctcgccgtt gatgtgctcc aagtattcag actggaattt atccgcgtac 3900
tcacacgcta gatcattaag tgttccgtgt tcgtcgtaac ggtccgaaaa gtggtagcgg 3960
ttatccgctg catagattga agtttcaaga ttcatgatta tagcccgccc gtaattgatt 4020
taagttgtga tagcttcgct ttaagttcgc ggatctgatc ttccaagggc ttgatcgctt 4080
gatgtgcctc gatcactttt ccaatcggga taatctccaa cggctggaag tcccacgcct 4140
gatctttttc acgactccaa atattagtaa agtcctcata gtagcagcaa ccaacgttac 4200
taactgtaaa cgttgttttc acgcggacgc ggatcaccgt gtcggtaaca tctaaaaaag 4260
cttgatggat cttgccagcc gtcgccgcgt tatcgagaat ggatctcaag tcttcgtgat 4320
cctttttaaa gaaatcgttt gacgtggttt tgatcttaaa gccttcagat aggcgagcga 4380
tcagaacggg cgcaacctca ttcataaaac ggtttgcagt gttcaccgcg ttagtgcggt 4440
tagtaagttt ttgttcaata gaaaaatagt tgtttaaatc gcgcatgata tgcccttact 4500
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gcaaggacgc cacacaaaac cgcactaact agatccattg tgaaaacttc agaacgcggc 4740
tttacgtttg ccagcttaat tccacggtaa gcaagcttta gagattccgc gaaatattcg 4800
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ccttgtaata ctggttaggg aattgcttgc taatgattgc acaaccgtcg tcagttgtac 6360
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ttgcttgatc catttcttgc ccagtgttga gctgttggca ataaacgcgt tataaatcgc 6780
cttccctgtc cacgtgtgac caccgtgctg ctcaaagata gcaagcgggt cattaaagat 6840
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gaaaagggta tcgcctaaag tcttaaggta aggcgcacgc tgtaggtttt ttgctagtag 7080
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tgctttccgt ggctttcttg acaagctcct tttgtccttc gatgtcaccc ttacggcgta 7680
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gatctcggat ctgctccagc gtgtaatccg catctttaag gcgcttgaag ttgatcgcct 7860
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agtaattcgt ctttgcatgc tacaagcgca gttgcaaatg atggtactaa tagtttctta 9600
ctcattagag tttccttttt actaaagtta agggattatt cccggttgct gttaattata 9660
cgtggttaaa aagttgttta ggtgaacttg cgttcttttt ccatacggcg taagcactgc 9720
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ccgctacgct ctcccacctc gtcatcaaac tcgatactaa tcgaagtaac tgtacgcttt 9840
aggaacggaa gccacttacg gtgccactgg cgtcgctcac ggtagcaagt tgccttgcgg 9900
tgctgaactt ccccggactc taatacatac gtgtaatcaa agatttcttt ttcaatctcc 9960
tcgttcttcc acgcttggtc gccatttacc caatgcccgt ctttgtgcat tacatgatgg 10020
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ggagaacctt tactaagatt aacaagaatc ttctctatgt cacgtgctcc gtggtaggcg 72300
cggaggctcc acgtcttacg gcactgatac atagctgtgt tgtaaaagaa cggactcccc 72360
tctggtccca agaacttctc catatcctta gtaaagaatg ggtttcccgg tccgaactta 72420
gcagccatag tcgggtcaac gtctttaggc tctgggtcga acccgaagta cattgcagtg 72480
catcccaaag ctgctgcata cgcttccgcg tcttcacggg taacgctctg ttcgttaccg 72540
cgtaggtcga tagtatttgc cattttacta attctccaat ttcatgagtg ttgttgagtt 72600
gtacacacga tcccagaact ccagaatggt aatggtctcc tcgtaccagc tatattcgaa 72660
gttctggcgg tcccatccat ccgggtccat tacgacaatc ccggtgagct gagcccagtg 72720
gacgcttgta cgttttacta gaggtaaacg ctttctactc aatgtggtgc cctccttcct 72780
tcttgactac ccagatgatc tcaggcttag gcttaccctg atctttacca tcccactgca 72840
agaacgcatc aggtatcggc gggagaggct tagccccatc ccaaccacca agaacgtgtc 72900
cgtttatctg gagttcatgt cctacggtca cattacgcca gaggtaaggt cgtgcgtacg 72960
ggtgtggaaa ccagaaacgc ttcttgattg ggacggcttc caagaactgt acggctcctg 73020
ctgccatttt actaatcctt cttcagactt tctgcattac gtgtctgtat ctggaacgcc 73080
gtaaacacac atttactaaa gttctccata cgcttgcagt tcaaagccac ctgcaaatat 73140
tcctgtgtac gttgggagag accaataccg gggatgtctt ctaccatgcg cttacagtgc 73200
tttagcgatt tgccgtctgt gagtgcttta gtaatatcct tcaagttgta taccgcttcc 73260
atagactgct cgtaccaacc agcctgtacg cgagtaagct cctcgctcat attgaagtct 73320
ttcatgttac taatccttct tagttagtgg gtgtataaag agtatatgcc acagtgttac 73380
taactgcaac tattatttac taatcctttg taggcggtgg tctaagtttt cccttccggg 73440
gtgcaaagcc gagtgcctgc gcataactcc aaccgaactt gtatacccgg tcctctactg 73500
tgcgcaatga gaatcctagc gatttacacc aagcacgcaa gttcagcctc ttcctgtcct 73560
tagtaatcaa tacctccgtt ttagtaatag tagtgcgcac gccaaagagt acccactcca 73620
tatcatcccg gtacttccca ccaaggcgtc gctgtatact ggatttatga aagccgaacc 73680
tatctgccca cacctgttga ttcagcgtct ccccatcgta cgttagtaaa acacttcttc 73740
gctggttgcg gttttgctct tgggtagtgg ctgcacgcat attccccggc tcgtaatcac 73800
catcgttatc cctacggtcc atagtcaggt cattcccatc tacgaggtag ccgaaatcgt 73860
cataccattt agtaaatgag ttacgccatt ctgggcatac gctgatcccg cgccctccgt 73920
agttcttgta ccttgggtcc tttgggttgt ggcagcgtgc taccatgcgt gcgtgctttc 73980
tttgcatacg atgacattga tagcatacgg aagccttcgc agagccccgc acaattcgaa 74040
tgggggcatg tccccggaag catcggtcct cgactacaat caatctcctc ttcggtctgg 74100
tcatctggtc ctccgtttta gtaaaa 74126

Claims (10)

1.一种副溶血弧菌噬菌体,其特征在于,其命名为副溶血弧菌噬菌体VP-HYP2,保藏编号为:CCTCC NO:M2019227。
2.如权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体在制备抗副溶血弧菌制剂中的应用。
3.如权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体在制备抗副溶血弧菌HY3药物中的应用。
4.如权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体在制备防治南美白对虾急性肝胰腺坏死病的药物中的应用。
5.一种用于防治副溶血弧菌感染的杀菌组合物,其特征在于,包括有效量的如权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体。
6.如权利要求5所述的用于防治副溶血弧菌感染的杀菌组合物,其特征在于,所述杀菌组合物中副溶血弧菌噬菌体的含量≥106PFU/mL。
7.如权利要求5所述的用于防治副溶血弧菌感染的杀菌组合物,其特征在于,还包括用于抗副溶血弧菌的抗生素。
8.如权利要求7所述的用于防治副溶血弧菌感染的杀菌组合物,其特征在于,所述抗生素为四环素。
9.一种对虾饲料添加剂,其特征在于,包括如权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体。
10.一种清洁剂或消毒剂,其特征在于,包括如权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体。
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