CN111316999A - 一种含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂及其制备方法和应用，属于生物消毒技术领域，消毒剂的有效成分包括大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227，其配比为1:1:1，消毒剂中还包括十二烷基磺酸钠、SM缓冲液及0.1M蔗糖；将效价≥1×1010pfu/ml的消毒剂以50‑100ml/m3的剂量喷洒于生活环境中时，对常见致病菌具有广谱杀菌作用，特异性强，其中SM缓冲液和蔗糖可以保护噬菌体效价的稳定性，有利于消毒剂的长期使用和保存；对生活环境净化效果好，安全无毒。

Description

一种含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物消毒技术领域，具体涉及一种含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂及其制备方法和应用。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli)，是属于肠杆菌科埃希氏菌属的革兰氏阴性兼性厌氧杆状细菌。它们主要寄居在人和动物的肠道内，并与其他兼性厌氧菌占据了肠道菌群的0.9％，绝大多数的大肠杆菌对人体无害，甚至有助于消化食物和维持人体免疫力。但研究发现，大肠杆菌少数的血清型对机体具有强致病能力，它可侵入人体胃肠道使人致病，原因是存在潜在的毒力因子，如志贺样毒素、特异粘附素和肠溶血毒素。其中志贺样毒素(Shigatoxin,Stx)是最主要的毒力基因，它可以导致患者腹痛、腹泻，严重者会出现出血性肠炎(HC)并引发溶血性尿毒症(HUS)，甚至死亡。污染的肉类食物与水果蔬菜等是大肠杆菌主要感染途径。所以我们应继续加大对大肠杆菌污染的防控，提前预防，未雨绸缪，从源头切断危害。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有"嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则更多，占45％，中国每年发生的此类中毒事件也非常多。其广泛分布于自然界，可以引起人和动物的感染。在人体主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股沟、会阴部和新生儿脐带残端等部位，偶尔也寄生于口咽部、皮肤、肠道及阴道口等，是医院感染常见的病原体之一。在医院里，耐甲氧西林和其他抗生素的金黄色葡萄球菌广泛流行，对万古霉素不敏感的菌株也有所增加，给临床治疗带来了很大的困难。金黄色葡萄球菌除了引起感染外，其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒，为人类带来非常严重的公共卫生负担。溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。
噬菌体是一种感染细菌的病毒，广泛分布在淡水、海洋环境、土壤表层、食物、粪便、人和动物以及其他环境。噬菌体对真核生物细胞(例如动物或植物)无害，并且很少引起人类的副作用。噬菌体是裂解性或溶源性的，但只有被证明安全和具有广泛宿主范围的裂解性噬菌体可以用于食品的生物防控。噬菌体及其内溶素可以以几种方式掺入食品系统中，例如喷雾、浸渍、固定、单独或制成“噬菌体鸡尾酒”使用。使用噬菌体的一个优点是可以选择性地控制细菌群体，而不干扰天然微生物群，并且对食物的物理化学和感官性质没有显著的影响。大肠杆菌作为一种致病性较高的细菌，用噬菌体作为其抗菌剂具有天然、安全、高效、无残留等优点，具有广阔的发展前景，因此受到越来越广泛的关注。
中国发明专利申请CN103289963A(一株具有环境消毒能力的噬菌体及其用途)中，针对鸡养殖厂的环境污染问题，分离出了一株大肠埃希氏菌噬菌体，可作为一种安全的生物消毒剂用于环境消毒，直接喷洒于养殖场地面、空气、粉尘、鸡粪等环境中，具有明显的消毒效果。然而该专利方法制备的消毒剂仅能针对环境中的某一种单一致病菌起作用，因此杀菌的广谱性低。中国发明专利申请CN102349548A(一种以噬菌体为主要组分的环境生物消毒剂及其应用)中，提供了一种以大肠杆菌噬菌体、肠炎沙门氏菌噬菌体、鸡白痢沙门氏菌噬菌体、福氏志贺氏菌噬菌体、肉桂提取液、白头翁提取液、辅剂为原料制成的生物消毒剂，其中辅剂可选择水或甘油，这种生物消毒剂用于养殖场中常见致病菌的杀灭，具有针对性强、消毒效果好的优点；然而这种消毒剂中各种噬菌体的浓度仅达到了104pfu/ml，因此噬菌体的效价也较低，杀菌效果较低。同时，目前现有技术中的噬菌体消毒剂适合用于家禽、家畜类养殖场的环境消毒，不适宜用作普通空间环境中的消毒。
发明内容
本发明欲解决的问题是现有技术中噬菌体消毒剂中噬菌体的效价低、适用范围窄、以及稳定性差导致的保存时间短等技术问题。
为解决上述技术问题，本发明公开了一种含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂，所述消毒剂的有效成分为噬菌体菌液，所述噬菌体菌液中包括大肠杆菌噬菌体CCTCCNO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCCNO.M2019227。
上述大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCCNO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227均是从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购得，其中大肠杆菌噬菌体于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其分类命名为Escherichia coli bacteriophage，保藏编号为CCTCCNO.M2016539。金黄色葡萄球菌噬菌体于2016年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，其分类命名为Staphylococcus aureus subsp.aureus bacteriophage，保藏编号为CCTCCNO.M2016535。溶血性链球菌噬菌体于2019年4月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，其分类名为Hemolytic streptococcus bacteriophage，保藏编号为CCTCC NO.M2019227。
进一步地，所述噬菌体的有效含量≥1010pfu/ml。
进一步地，按体积百分数计，包括如下组分：噬菌体菌液60％-70％、0.003M十二烷基磺酸钠10％-20％、SM缓冲液5％-10％、0.1M蔗糖5％-10％。其中十二烷基磺酸钠是一种助溶剂，是市面上常用的阴离子表面活性剂；SM缓冲液是噬菌体稳定剂，可以在消毒剂的保存过程中维持噬菌体的效价；蔗糖为一种常见的二糖，和SM缓冲液联用，能够更好地稳定噬菌体的效价。
进一步地，所述噬菌体菌液中大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227的配比为1:1:1。
进一步地，所述SM缓冲液与0.1M蔗糖的体积比为1:1。
进一步地，所述SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2g MgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
本发明同时要求保护一种含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCCNO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227活化后，分别用PBS溶解并稀释后，混合均匀，得到噬菌体混合菌液；
(2)配制SM缓冲液；
(3)配制0.003M十二烷基磺酸钠溶液和0.1M蔗糖溶液；
(4)将SM缓冲液、0.003M十二烷基磺酸钠溶液和0.1M蔗糖溶液加入到噬菌体混合菌液中，混合均匀。
本发明同时要求保护一种含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂的应用方法，具体为：将效价≥1×1010pfu/ml的所述生物消毒剂以50-100ml/m3的剂量喷洒于生活环境中，进一步地，以50ml/m3的剂量喷洒于生活环境中，以杀灭大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌，从而确保生活环境的清洁卫生。
采用本发明的制备方法得到的消毒剂具有较好的环境稳定性和杀菌能力，其中，消毒剂中噬菌体的效价和环境稳定性均采用双层平板法进行评价，具体地，双层平板法的实验步骤如下：
(1)倒平板：将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10ml培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
(2)稀释噬菌体：按10倍稀释法，吸取0.5ml大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5ml1％蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，重复此步骤，依次稀释到10-6稀释度。
(3)噬菌体与菌液混合：将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1ml于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1ml无菌水，并分别于各管中加入0.2ml大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
(4)接种上层平板：将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5ml分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37℃培养。
(5)观察并计数：观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于计算公式：N＝Y/V×X(N：效价值，Y：平均噬菌斑数/皿，V：取样量，X：稀释度)。
本发明的消毒剂对生活环境的杀菌效果测定按照实验方法《消毒技术规范》(2002版)要求进行，采用悬液定量杀菌实验。
与现有产品相比，本发明得到的环境消毒剂具有以下优点：
(1)本发明所涉及的裂解性噬菌体对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌具有广谱杀菌作用，特异性极强，其辅料中的SM缓冲液和蔗糖可以保护噬菌体效价的稳定性，这有利于该消毒剂的长期使用和保存。
(2)生活中常用化学消毒剂的种类包括：含氯消毒剂，过氧化物类消毒剂，醛类和醇类消毒剂，含碘消毒剂和酚类消毒剂，化学消毒剂氧化能力强，高浓度可刺激、损害皮肤黏膜，腐蚀物品。本发明的生物消毒剂对环境和人安全无毒，且克服了化学消毒剂的腐蚀性和刺激性气味。
(3)本发明得到的噬菌体环境消毒剂适合于各种生活环境的喷雾消毒，适用范围广且杀菌效果好。
具体实施方式
下面通过具体实施例进行详细阐述，说明本发明的技术方案。
实施例1
噬菌体消毒剂的制备
将购买得到的噬菌体在本实验室进行保存和纯化后，进行活化，分别用PBS溶解后稀释，使每种噬菌体的浓度均≥1010pfu/ml，且三种噬菌体的浓度相等，然后将其他辅料用超纯水配制到对应浓度后，按照以下体积比加入各种辅料进行混合，混合均匀，得到消毒剂，其配方组成如下：
大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539 20％；
金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535 20％；
溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227 20％；
0.003M十二烷基磺酸钠(SDS)溶液20％；
SM缓冲液10％；
0.1M蔗糖10％。
其中，SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2g MgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
实施例2
将购买得到的噬菌体在本实验室进行保存和纯化后，进行活化，分别用PBS溶解后稀释，使每种噬菌体的浓度均≥1010pfu/ml，且三种噬菌体的浓度相等，然后将其他辅料用超纯水配制到对应浓度后，按照以下体积比加入各种辅料进行混合，混合均匀，得到消毒剂，其配方组成如下：
大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539 10％；
金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535 30％；
溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227 20％；
0.003M十二烷基磺酸钠(SDS)溶液20％；
SM缓冲液10％；
0.1M蔗糖10％。
其中，SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2g MgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
实施例3
将购买得到的噬菌体在本实验室进行保存和纯化后，进行活化，分别用PBS溶解后稀释，使每种噬菌体的浓度均为109pfu/ml，然后将其他辅料用超纯水配制到对应浓度后，按照以下体积比加入各种辅料进行混合，混合均匀，得到消毒剂，其配方组成如下：
大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539 20％；
金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535 20％；
溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227 20％；
0.003M十二烷基磺酸钠(SDS)溶液20％；
SM缓冲液10％；
0.1M蔗糖10％。
其中，SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2g MgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
实施例4
噬菌体消毒剂的制备
将购买得到的噬菌体在本实验室进行保存和纯化后，进行活化，分别用PBS溶解后稀释，使每种噬菌体的浓度均≥1010pfu/ml，且三种噬菌体的浓度相等，然后将其他辅料用超纯水配制到对应浓度后，按照以下体积比加入各种辅料进行混合，混合均匀，得到消毒剂，其配方组成如下：
大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539 20％；
金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535 20％；
溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227 20％；
0.003M十二烷基磺酸钠(SDS)溶液20％；
SM缓冲液16％；
0.1M蔗糖4％。
其中，SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2g MgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
对比例1
将购买得到的噬菌体在本实验室进行保存和纯化后，进行活化，分别用PBS溶解后稀释，使每种噬菌体的浓度均≥1010pfu/ml，且三种噬菌体的浓度相等，然后将其他辅料用超纯水配制到对应浓度后，按照以下体积比加入各种辅料进行混合，混合均匀，得到消毒剂，其配方组成如下：
大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539 30％；
金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535 30％；
0.003M十二烷基磺酸钠(SDS)溶液20％；
SM缓冲液10％；
0.1M蔗糖10％。
其中，SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2g MgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
对比例2
将购买得到的噬菌体在本实验室进行保存和纯化后，进行活化，分别用PBS溶解后稀释，使每种噬菌体的浓度均≥1010pfu/ml，且三种噬菌体的浓度相等，然后将其他辅料用超纯水配制到对应浓度后，按照以下体积比加入各种辅料进行混合，混合均匀，得到消毒剂，其配方组成如下：
大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539 60％；
0.003M十二烷基磺酸钠(SDS)溶液20％；
SM缓冲液10％；
0.1M蔗糖10％。
其中，SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2g MgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
对比例3
将购买得到的噬菌体在本实验室进行保存和纯化后，进行活化，分别用PBS溶解后稀释，使每种噬菌体的浓度均≥1010pfu/ml，且三种噬菌体的浓度相等，然后将其他辅料用超纯水配制到对应浓度后，按照以下体积比加入各种辅料进行混合，混合均匀，得到消毒剂，其配方组成如下：
大肠杆菌噬菌体ATCC 11303-B4 20％；
金黄色葡萄球菌噬菌体ATCC27692-B1 20％；
溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227 20％；
0.003M十二烷基磺酸钠(SDS)溶液20％；
SM缓冲液10％；
0.1M蔗糖10％。
其中，SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2g MgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
其中大肠杆菌噬菌体ATCC 11303-B4：分类命名为Escherichia colibacteriophage，保藏编号为ATCC 11303-B4；金黄色葡萄球菌链球菌噬菌体ATCC27692-B1：分类命名为Staphylococcus aureus subsp.aureus bacteriophage，保藏编号为ATCC27692-B1，两种噬菌体均从美国模式培养物集存库(ATCC)购得。
实施例5
消毒剂稳定性测定
将实施例1-4和对比例1-3制备的消毒剂在4℃保存，在保存30天后，消毒液外观无变化，仍为无色、透明。之后通过测量噬菌体效价来确定其稳定性，方法如下：
(1)倒平板：将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10ml培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
(2)稀释噬菌体：按10倍稀释法，吸取0.5ml大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5ml1％蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，重复此步骤，依次稀释到10-6稀释度。
(3)噬菌体与菌液混合：将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1ml于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1ml无菌水，并分别于各管中加入0.2ml大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
(4)接种上层平板：将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5ml分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37℃培养。
(5)观察并计数：观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于计算公式：N＝Y/V*X(N：效价值，Y：平均噬菌斑数/皿，V：取样量，X：稀释度)。
将实施例1-4和对比例1-3中制备得到的消毒液进行效价测定，每组100ml，确定起始效价为1×1010pfu/ml，之后将三种噬菌体原液进行混合后，取50ml，分别用50ml PBS，SM缓冲液及0.1M蔗糖进行重悬，将此9组噬菌体4℃放置30天后，分别测定其效价，检测结果如表1所示。
表1实施例1-3和对比例1-3中得到的消毒剂的检测结果
Figure BDA0002399176750000081
Figure BDA0002399176750000091
可以得出，实施例1-3中采用本发明的制备方法得到的消毒剂对噬菌体效价的保护作用好，可见采用消毒剂的稳定性较好，能够长期保存。而实施例1中三种噬菌体的配比为1:1:1以及SM缓冲液与0.1M蔗糖的体积比为1:1时，得到的消毒剂对噬菌体效价的保护作用最好。
实施例6
对实施例1-4和对比例1-3中制备得到的消毒剂按照实验方法《消毒技术规范》(2002版)要求进行，采用悬液定量杀菌实验，作用时间为1h，结果如表2所示。
表2实施例1-4和对比例1-3中得到的消毒剂的杀菌实验结果
Figure BDA0002399176750000092
结果显示，当三种噬菌体比例在1:1:1，且三种噬菌体均为1010pfu/ml，噬菌体菌株分别为大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535、溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227时具有最好的杀菌效果。
实施例7
环境杀菌作用检测
在生物实验室随机选取10个点(每个点均为1m2×20cm)作为试验区，并做标记，将9株浓度为1×108cfu/ml的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌三种菌株的混合液均匀喷洒于生物实验室试验区，然后以实施例1获得的噬菌体消毒剂(效价为1×1010pfu/ml)以50ml/m3的剂量对试验区喷洒消毒，1h后检测菌残留量，发现其中2个试验区仍有残留，4h后检测大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，溶血性链球菌残留，10个试验区均未检测到菌株残留。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制发明，凡在本发明的设计构思之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂，其特征在于：所述消毒剂的有效成分为噬菌体菌液，所述噬菌体菌液中包括大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227。
2.如权利要求1所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂，其特征在于：所述噬菌体的有效含量≥1010pfu/ml。
3.如权利要求2所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂，其特征在于：按体积百分数计，包括如下组分：噬菌体菌液60％-70％、0.003M十二烷基磺酸钠10％-20％、SM缓冲液5％-10％、0.1M蔗糖5％-10％。
4.如权利要求3所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂，其特征在于：所述噬菌体菌液中大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC NO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227的配比为1:1:1。
5.如权利要求4所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂，其特征在于：所述SM缓冲液与0.1M蔗糖的体积比为1:1。
6.如权利要求4所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂，其特征在于：所述SM缓冲液的配制方法包括如下步骤：在每50ml浓度为1M、pH为7.5的Tris-HCl中加入0.1g明胶、2gMgSO4·7H2O和5.8g NaCl。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将大肠杆菌噬菌体CCTCC NO.M2016539、金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCCNO.M2016535和溶血性链球菌噬菌体CCTCC NO.M2019227活化后，分别用PBS溶解并稀释后，混合均匀，得到噬菌体混合菌液；
(2)配制SM缓冲液；
(3)配制0.003M十二烷基磺酸钠溶液和0.1M蔗糖溶液；
(4)将SM缓冲液、0.003M十二烷基磺酸钠溶液和0.1M蔗糖溶液加入到噬菌体混合菌液中，混合均匀。
8.一种如权利要求1-6中任一项所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂的应用方法，其特征在于：将效价≥1×1010pfu/ml的所述消毒剂以50-100ml/m3的剂量喷洒于生活环境中。
9.如权利要求8中所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂的应用方法，其特征在于：将效价≥1×1010pfu/ml的所述消毒剂以50ml/m3的剂量喷洒于生活环境中。
10.如权利要求8所述的含有噬菌体的喷雾型环境消毒剂的应用方法，其特征在于：采用双层平板法评价所述消毒剂的效价。
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