CN113528461B - 分离的杀鲑气单胞菌噬菌体、其组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分离的杀鲑气单胞菌噬菌体、其组合物及应用。本发明人筛选获得一种可高效杀灭杀鲑气单胞菌的噬菌体，其具有强的感染能力以及强的裂解效用，在细菌宿主中潜伏期短。本发明的噬菌体可被应用于农业、医学、环境等领域以对抗其细菌宿主，其作为抗生素替代物具有良好的发展前景。

Description

分离的杀鲑气单胞菌噬菌体、其组合物及应用
技术领域
本发明属于生物技术和微生物学领域，更具体地，本发明涉及一种分离的杀鲑气单胞菌噬菌体、其组合物及应用。
背景技术
近年来，随着水产养殖行业迅速发展，水产养殖规模不断扩大。随着集约化、规模化的养殖方式不断推广，对于水产动物的疾病的防治显得越来越重要，有效的防治可促进养殖业的发展。细菌性病害作为一种重要的水产疾病，该病害的有效防治可促进养殖行业有序运行，避免大规模病害导致的经济损失。
杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是革兰氏阴性短杆菌，属于嗜冷无动力气单胞菌，广泛分布于水生环境中。杀鲑气单胞菌包括五个亚种如无色亚种(Achromogenes)、杀鲑亚种(Salmonicida)、杀日本鲑亚种(Masoucida)、史氏亚种(Smithia)以及产果胶亚种(Pectinolytica)。该菌是引起鱼类疥疮病或溃疡病的主要病原菌，可经皮肤、鳃、口及血液等途径传染，感染鲑科、鲤科、鳍科、鳗鲡科、鲆科、蝶科等多种鱼类。目前，在水产养殖中主要通过抗生素的方式对杀鲑气单胞菌进行防控。但是，抗生素的大规模使用会伴随多重耐药菌的出现，影响了水产的质量安全性。
因此，本领域需要寻求一些抗生素替代物对多重耐药杀鲑气单胞菌进行病害防控，以减少抗生素的使用量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离的杀鲑气单胞菌噬菌体、其组合物及应用。
在本发明的第一方面，提供一种分离的噬菌体，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2021631。
在一个优选例中，所述的噬菌体具有包括选自下组的特征：
(a)包括头部和尾部，头部呈二十面体；
(b)属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科；
(c)对酸性和碱性环境具有适应性，耐受pH3～11环境；较佳地在pH4.0～9.0范围内保持稳定性或保持活性，更佳地pH5.0～8.0范围内保持稳定性或保持活性；
(d)对高温和低温具有适应性，耐受0～50℃；较佳地在0～40℃范围内保持稳定性或保持活性，更佳地0～30℃(如5、10、15、20、25、28℃)范围内保持稳定性或保持活性；
(e)噬菌斑呈透明圆形，周围带有光晕，直径约为3.0～3.5mm；
(f)宿主内潜伏期为10～30分钟；较佳地15～25分钟；更佳地18～22分钟；
(g)感染复数为100:1～1:1000；较佳地1:1～1:100；更佳地1:10(0.1)；
(h)针对杀鲑气单胞菌的裂解量为100～500PFU/细胞；较佳地200～400PFU/细胞(如250～300PFU/细胞)；
(i)针对杀鲑气单胞菌的裂解率超过95％；较佳地超过97％；
(j)培养的效价高于108PFU/mL；较佳地高于5*108PFU/mL。
在另一优选例中，(a)中所述噬菌体的头部长95±10nm，宽91±10nm，尾部长度为109±10nm。
在另一优选例中，所述噬菌体的头部长95±5nm，宽91±5nm，尾部长度为109±5nm。
在另一优选例中，(c)中，耐受pH3-10环境。
在本发明的另一方面，提供所述的噬菌体的应用，用于抑制其细菌宿主；或用于制备抑制其细菌宿主的组合物；其中，所述细菌宿主为杀鲑气单胞菌。
在一个优选例中，所述的应用为非治疗性的应用；例如针对环境中的所述噬菌体的宿主(如杀鲑气单胞菌)进行抑制。
在另一优选例中，所述组合物为药物组合物、食品组合物、饲料组合物、清洁剂和/或消毒剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为疫苗组合物；更佳地，该疫苗组合物预防所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病。
在另一优选例中，所述药物组合物为治疗组合物；更佳地，该治疗组合物治疗所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病；更佳地，所述鱼类疾病包括：杀鲑气单胞菌感染引发的疥疮病。
在另一优选例中，所述饲料组合物中，所述噬菌体作为饲料添加剂。
在另一优选例中，所述清洁剂或消毒剂为环境清洁剂或环境消毒剂。
在另一优选例中，所述鱼类为海水鱼类。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制细菌的组合物，其包含前面任一所述的分离的噬菌体。
在一个优选例中，其还包含生物学可接受的载体。
在另一优选例中，所述组合物中噬菌体大于或等于103PFU/mL。
在另一优选例中，所述组合物中噬菌体为103～1010PFU/mL。
在另一优选例中，所述组合物中噬菌体为104～109PFU/mL，如105、106、107、108PFU/mL。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的噬菌体制备组合物的方法，包括：扩增所述的噬菌体；将之与载体混合，所述的载体为生物学可接受的载体。
在一个优选例中，所述的载体包括但不限于：溶剂、佐剂、缓冲液、冻干保护剂、润湿剂、渗透剂、分散剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、充填剂、助剂、表面活性剂或控释剂。
在另一优选例中，所述扩增培养包括：将所述噬菌体接种其细菌宿主培养物(培养液)，从而所述噬菌体侵染其宿主，进行复制；较佳地，其细菌宿主为杀鲑气单胞菌。
在另一优选例中，所述组合物为药物组合物、食品组合物、饲料组合物、清洁剂和/或消毒剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为疫苗组合物。
在另一优选例中，该疫苗组合物预防所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病。
在另一优选例中，所述药物组合物为治疗组合物。
在另一优选例中，该治疗组合物治疗所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病。
在另一优选例中，所述鱼类疾病包括：杀鲑气单胞菌感染引发的疥疮病。
在另一优选例中，所述饲料组合物中，所述噬菌体作为饲料添加剂。
在另一优选例中，所述清洁剂或消毒剂为环境清洁剂或环境消毒剂。
在另一优选例中，所述噬菌体制剂的剂型包括(但不限于)：液体制剂或固体制剂；更佳地包括：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶。
在另一优选例中，所述组合物为pH3.0～11.0，更佳地pH 4.0～9.0(如pH 5.0～9.0，更具体如pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)。
在本发明的另一方面，提供一种抑制病原微生物或杀虫的方法，所述方法包括：以前面任一所述的噬菌体对需要进行细菌抑制的对象进行处理；所述的细菌是能被所述噬菌体感染(侵染)、进而裂解的细菌；较佳地，所述细菌为杀鲑气单胞菌。
在一个优选例中，处理时，在pH3.0～11.0，更佳地pH 4.0～9.0(如pH5.0～9.0，更具体如pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)下进行；
在另一优选例中，处理时，在0～50℃，更佳地在0～40℃，进一步更佳地0～30℃(如5、10、15、20、25、28℃)下进行。
在另一优选例中，所述的应用和方法为非治疗性的应用和方法，其不以人或动物为直接的预防或治疗对象(如针对含有病原体的区域(如公共场所，鱼类养殖水)/器具等进行消杀，或针对可能被病原体附着的食物、饲料等进行消杀)。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制细菌的试剂盒/药盒，所述试剂盒/药盒包含：前面任一所述的噬菌体；或前面任一所述的组合物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
本发明上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：
图1、本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF的噬菌斑图。
图2、本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF的电镜图。
图3、本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF的最佳感染复数实验的结果图。
图4、本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF的一步生长曲线图。
图5、本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF酸碱耐受性实验的结果图。
图6、本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF热稳定性实验的结果图。
图7、本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF对宿主菌AS01的裂解曲线结果图。
图8、本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF对宿主菌AS01对于大菱鲆的治疗效果实验结果图。
具体实施方式
本发明人致力于鱼类抗菌防病的研究，在大量的筛选工作中，得到了一株杀鲑气单胞菌，进而分离获得一种高效杀灭该杀鲑气单胞菌。本发明的噬菌体具有强的感染能力，在细菌宿主中潜伏期短，具有强裂解效用。本发明的噬菌体可被应用于农业、医学、环境等领域以对抗其细菌宿主，其作为抗生素替代物具有良好的发展前景。
术语
如本文所用，所述“病原体”是对于人、动物、植物或环境具有危害性的微生物，尤其为对鱼类有危害性的微生物。更具体地，“病原体”是指能由本发明的噬菌体裂解/损坏的微生物，所述微生物包括本发明所述的噬菌体的细菌宿主；较佳地，所述细菌宿主是杀鲑气单胞菌，当本发明的噬菌体作用于所述细菌宿主时，宿主发生裂解/损坏。
本发明中，所述“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
如本文所用，“生物学可接受的载体”是用于将本发明的噬菌体传送给需要处理的对象(包括病原体宿主、病原体所在的环境(场所、器具、食物、饲料等)或病原体宿主所在的环境)的载体。所述的载体可以是但不限于：药学上可接受的载体、食品学上可接受的载体、饲料学上可接受的载体和/或化学上可接受的载体。所述载体通常在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持本发明的噬菌体的生物活性的载体。
如本文所使用的，“组合”是指使用多于一种活性物质被联合运用或合并在一起。
如本文所用，当提及噬菌体或含有其的组合物时，如本文所使用的，术语“裂解率”、“抗菌活性”和“抗病原体活性”可互换地用于指杀死和/或抑制病原体(尤其是细菌宿主)的生长或繁殖的能力。
噬菌体及其应用
噬菌体是一种以细菌为宿主的病毒，在自然界中广泛存在，种类丰富。噬菌体具有很高的宿主特异性，毒性低，可以清除生物被膜，对微生态环境破坏较小等特点。噬菌体侵染宿主菌后，会产生大量子代噬菌体并进行新一轮感染，从而使用低剂量噬菌体就能起到防治的效果。
本发明人利用双层平板法从山东大菱鲆养殖场的病鱼中筛选得到一株杀鲑气单胞菌，然后以杀鲑气单胞菌为宿主，从该养殖场的废水中分离得到一株杀鲑气单胞菌噬菌体，将天然分离获得的该噬菌体命名为vB_AsM_ZHF，保藏号为CCTCC NO:M 2021631。
本发明人进一步的分析显示，所述噬菌体包括选自下组的特征：
(a)包括头部和尾部，头部呈二十面体；
(b)属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科；
(c)对酸性和碱性环境具有适应性，耐受pH3～11环境；较佳地在pH4.0～9.0范围内保持稳定性或保持活性，更佳地pH5.0～8.0范围内保持稳定性或保持活性；
(d)对高温和低温具有适应性，耐受0～50℃；较佳地在0～40℃范围内保持稳定性或保持活性，更佳地0～30℃(如5、10、15、20、25、28℃)范围内保持稳定性或保持活性；
(e)噬菌斑呈透明圆形，周围带有光晕，直径约为3.0～3.5mm；
(f)宿主内潜伏期为10～30分钟；较佳地15～25分钟；更佳地18～22分钟；
(g)感染复数为100:1～1:1000；较佳地1:1～1:100；更佳地1:10(0.1)；
(h)针对杀鲑气单胞菌的裂解量为100～500PFU/细胞；较佳地200～400PFU/细胞(如250～300PFU/细胞)；
(i)针对杀鲑气单胞菌的裂解率超过95％；较佳地超过97％；
(j)培养的效价高于108PFU/mL；较佳地高于5*108PFU/mL。
本发明的噬菌体是活性生物，一旦获得了本发明的噬菌体，就可以用本领域已知的手段来大批量地制备。这通常是将其与细菌宿主接触、其侵入宿主细胞后大量复制、最终通过裂解宿主细胞而得以释放。
本发明的噬菌体可以是天然分离的vB_AsM_ZHF，也包括其变体，例如对其进行分子遗传操作(如基因组改造)来获得其突变体，从而调整/改进其某一方面的性能，例如通过分子遗传操作(改变其一种或多种蛋白的活性)来进一步促进其侵染宿主的能力、扩展其宿主种类、缩短其在宿主中的潜伏期和/或增强其对宿主的裂解能力。
也即，本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF可作为出发噬菌体，通过实验室驯化、遗传育种、分子遗传操作等手段进行进一步改良而获得产量更高或活性更强的衍生型噬菌体。以本发明的vB_AsM_ZHF作为出发噬菌体，通过这些人工操作手段进一步筛选优化获得的噬菌体，也被包含在本发明的整体范围内。
作为一种可选的方式，本发明也提供了分离自本发明的噬菌体的活性生物分子(例如，分离的噬菌体多肽或其活性片段、变体或衍生物)。由于本发明的噬菌体是全新的，其基因组以及由其基因组所编码的活性多肽也可被包含在本发明中，潜在地其一条多肽或多条多肽的组合也可用于作为抑制细菌宿主的用途或其它用途。所述的抑制可以是部分抑制或全部抑制。例如，分离自所述噬菌体的一条、两条或多条多肽，能够发挥侵染细胞的作用；而其它的一条、两条或多肽多肽则能够发挥溶解细胞的作用。
本发明的噬菌体对水产养殖中的致病性细菌宿主(如杀鲑气单胞菌)具有强的裂解效用。根据本发明的实施例，其对于杀鲑气单胞菌的裂解率可达98％。从而，可为规模化工业生产噬菌体、用于水产养殖中病原体细菌(尤其为杀鲑气单胞菌)的抑制提供噬菌体来源。
根据本发明的实施例，本发明的噬菌体在pH在5.0-8.0范围内孵育2小时后仍然可以维持较好的活性，在pH＝11以及pH＝3时，噬菌体仍然存在一定活性，该噬菌体对酸性环境和碱性环境均具有良好的耐受性。
根据本发明的实施例，本发明的噬菌体经50℃处理2小时后，效价仍保持在107pfu/ml以上。因此其具有良好的高温耐受性，同时其在低温下也具有良好的稳定性。
根据本发明的噬菌体的特点，其具有广泛的应用，包括但不限于如下的应用：
(1)抑制和抑制细菌宿主(如杀鲑气单胞菌)的生长；
(2)制备杀灭杀细菌宿主(如杀鲑气单胞菌)的产品；
(3)制备抑制细菌宿主(如杀鲑气单胞菌)生长的产品；
(4)制备预防和/或治疗细菌宿主(如杀鲑气单胞菌)所致鱼类疾病的产品；
(5)制备预防和/或治疗由细菌宿主(如杀鲑气单胞菌)引起的炎症反应的产品；
(6)本发明的噬菌体可作为饲料添加剂，或可制备环境消毒剂，作为杀菌的有效成分。
所述的应用中，所述鱼类为可被所述的病原体(细菌宿主)感染的任何鱼类。例如，可以为海水鱼类或淡水鱼类，较佳地为海水鱼类。
本发明的噬菌体可被单独应用，也可与一种或多种其它类型的噬菌体联合应用。
在应用时，本发明的噬菌体或多肽可以单独施用或与载体混合、形成组合物加以施用。
组合物/制剂/试剂盒
本发明提供了一种组合物，其中含有有效量的噬菌体，以及余量的生物学上可接受的载体。本发明的组合物可以另外包含赋形剂或稳定剂。
所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶囊。
应理解，只要能够将本发明所述的噬菌体在保持全部或部分活性的情况下递送到所需处理的对象的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，作为一些优选的方式，所述组合物可以是冻干剂、液体服用剂/注射剂、喷洒剂或喷雾剂。
浓缩型的组合物中活性成分(多肽)的含量较高，如可含有108～109PFU/mL噬菌体含量；而稀释型组合物中活性成分含量较低，例如可以含有103～106PFU/mL噬菌体含量；中等含量则例如可以是106～108PFU/mL。此外，还可以包含其他合适的成分，如前面所列举的各种生物学上可接受的载体。根据本发明实施例，本发明的噬菌体组合物中，所述噬菌体的剂量大于或等于103PFU/mL是相对合适的，但考虑到一些特定的应用，本发明也不限于此。
在需要的情况下，本发明组合物中还可以含有其它的活性杀生物剂(可以是生物类杀生物剂，也可以为化学类杀生物剂如抗生素)，以实现通过一次使用而将本发明噬菌体特异性病原体以及其他有害生物进行共同杀灭。
本发明的噬菌体、含有其的宿主细胞或含有其的组合物，还可被包含在容器或试剂盒中。较佳地，所述的试剂盒中还包括使用说明书等，以便于本领域技术人员应用。
所述的噬菌体制剂，剂型为口服固体制剂、液体制剂或冻干制剂，可以经过口服、药浴和注射等方式应用于预防和/或治疗杀鲑气单胞菌。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明中，筛选、分离到能够高效裂解细菌宿主的噬菌体，该噬菌体对水产养殖环境中致病性细菌宿主具有强裂解效用，本发明可为规模化生产噬菌体、用于水产养殖环境中致病性细菌宿主的防治提供了新型的噬菌体来源。
(2)本发明提供的噬菌体具有强的感染能力；针对杀鲑气单胞菌的潜伏期仅为20分钟，爆发量约为284PFU/细胞；其潜伏期短、裂解量高，是抑制杀鲑气单胞菌的优选噬菌体。其在pH＝5.0-9.0的范围内能维持较好的活性，噬菌体的效价可以维持在108PFU/mL，随着pH值的上升或降低，噬菌体的效价有明显下降，但其在酸性或碱性环境下均有较好的稳定性。且具有良好的宿主特异性，有利于环境安全。
(3)本发明提供的噬菌体可用于工业化大规模生产，可由宿主菌杀鲑气单胞菌特异性扩增；该噬菌体还可以作为消毒剂用于养殖场水体和养殖池的消毒，从而治疗动物养殖场污染；该噬菌体还用于制备药物，进而用于其细菌宿主、尤其是杀鲑气单胞菌引起疾病的预防和治疗。
综上，本发明提供的噬菌体，其具有高效感染、强效裂解，对酸性和碱性环境具有良好的耐受能力，对高温和低温具有良好的适应能力，其在水产养殖中具有非常理想的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、杀鲑气单胞菌AS01的分离及鉴定
为了获得有效杀灭鱼类病菌的生物，本发明人进行了多年的研究及大规模筛选。本发明人在辽宁大菱鲆养殖场的大菱鲆病鱼中分离得到一株杀鲑气单胞菌，命名为AS01。以该杀鲑气单胞菌AS01为宿主，本发明人从环境中分离得到一株杀鲑气单胞菌噬菌体，命名为vB_AsM_ZHF。
本发明人从发病的病鱼中对肝脏和脾脏进行组织取样，在TSA固体培养基上进行四区划线，28℃倒置培养24～48h后，挑取平板上长出菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察后在平板上挑选革兰氏阴性的短杆菌的菌落进行再次划线，对上述步骤重复3次，直到平板上形成大小形态统一的菌落，然后挑取单菌落接种于5mL TSA培养基中，28℃200rpm振荡培养12h，得到浑浊的菌悬液。
随后，本发明人对得到的菌液进行生理生化鉴定，并对其16sRNA进行测序和序列比对，确定该菌株为杀鲑气单胞菌，其16sRNA序列如下(SEQ ID NO:1)：
tgcagtcgagcggcagcgggaaagtagcttgctacttttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgcctgggga
tctgcccagtcgagggggataacagttggaaacgactgctaataccgcatacgccctacgggggaaaggaggggac
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caacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtctggaatcctgcagagatgcgggagtgccttcgggaatcagaa
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ggttgcaccagaagtagatagcttaaccttcgggagggcgttac
本发明人将该菌株命名为AS01，在-80℃冰箱中保存。
实施例2、杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF的分离鉴定
(1)样品前处理
对辽宁大菱鲆养殖场中废水进行采样，用8层纱布对采集的水样进行过滤，然后将滤液在4℃下进行8000×g离心5min，用孔径为0.22μm的微孔滤膜对离心后的上清液进行过滤，并于4℃保存备用。
(2)噬菌体样品富集培养
取40ml滤液，10ml 5×TSB培养基和1ml对数生长期的杀鲑气单胞菌AS01培养液，加入250ml摇瓶中，以100rpm 28℃过夜培养。取1ml培养液，8000×g离心5min，取离心后的上清液用孔径为0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌。
(3)噬菌体分离
用SM缓冲液对滤液进行梯度稀释，取0.5mL稀释液和0.2mL杀鲑气单胞菌AS01菌悬液混合并常温孵育10min，然后加入55℃左右的半固体TSB培养基，均匀混合后倒于已经提前制备好的TSA固体平板上。在28℃下培养12-36h。观察双层平板上是否有噬菌斑的存在，若出现噬菌斑，则说明存在噬菌体。
(4)噬菌体斑纯化
用灭菌枪头挑取噬菌斑，并于1mL SM缓冲液中反复吹打，放于4℃过夜孵育，然后将噬菌体浸出液进行梯度稀释，用双层平板法观察噬菌斑形态。上述纯化步骤重复三次后得到一种噬菌体形态大小相同的噬菌体，将其命名为vB_AsM_ZHF。该vB_AsM_ZHF的噬菌斑示意图由图1。根据图1可知，该杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF形成的噬菌斑呈透明圆形，周围带有光晕，直径约为3.0～3.5mm。
(5)过滤除菌及保存
将纯化后的噬菌体培养液在8000×g离心5min，取离心后的上清液用孔径为0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，在滤液中加入甘油使终浓度为30％，于-80℃保存。
(6)测定噬菌体效价
将噬菌体培养液8000×g离心5min，将上清液过0.22μm滤膜，将滤液用SM缓冲液进梯度稀释，用稀释液制作以杀鲑气单胞菌AS01为宿主菌的双层平板，于28℃恒温倒置培养。
噬菌体效价(pfu/mL)＝噬菌斑个数×稀释倍数。
经测定，该噬菌体的效价可以达109PFU/mL。
实施例3、噬菌体的形态观察
用磷钨酸负染法对噬菌体样品进行前处理。取20μL经0.22μm滤膜过滤后噬菌体培养液滴加在铜网上，10min后用吸水纸将多余的液体吸干。在室温下静置2min，将20μL 2％磷钨酸染色滴加在铜网上，染色30s后立即用吸水纸吸去将多余的磷钨酸溶液。在室温下静置5min，用透射电子显微镜观察噬菌体形态。
杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF的电镜图如图2。根据图2所示，噬菌体vB_AsM_ZHF头部为二十面体，尾部由中空的结构及外鞘组成。该噬菌体头部长95nm，宽91nm，尾部长度为109nm。
根据噬菌体分离与命名的规则、以及该噬菌体形态来分析，其属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。
实施例4、最佳感染复数测定
按照1：100的接种比例将处于对数生长期的杀鲑气单胞菌AS01菌悬液加入TSB培养基，按照感染复数分别为1：1、1：10、1：100、10：1、100：1、1000：1的比例，将噬菌体培养液加入TSB培养基中，28℃100rpm振荡培养8h，4℃进行8000×g离心5min，取离心后的上清液用孔径为0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，并用双层平板法测定效价。
所述杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF的感染复数实验的结果图如图3所示。根据图3，当感染复数为1:10时(即图中MOI为0.1时)，噬菌体的效价最高。测定结果说明，vB_AsM_ZHF的感染复数可以为100:1～1:1000；相对优选的感染复数为1:1～1:100；其中最佳感染复数为1:10。
实施例5、噬菌体生长曲线的测定
将噬菌体与1ml杀鲑气单胞菌菌悬液以1:100的感染复数混合，孵育10分钟，在12,000×g下4℃离心2分钟。用1ml TSB培养基重悬沉淀，并重复3次。将悬浮液加入10ml TSB中，并在28℃振荡培养。用双层平板法测定噬菌体效价，每10分钟测定噬菌体的滴度。通过将最终噬菌体滴度除以初始噬菌体滴度来计算爆发大小。
所述杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF的一步生长曲线图如图4所示。根据图4，噬菌体在感染宿主菌后20min内效价没有明显变化，说明其潜伏期约20min，感染后20-60min内噬菌体的效价逐渐增加，说明噬菌体裂解期约为40min。
通过计算，噬菌体的裂解量为284PFU/细胞，说明该噬菌体有很强的复制能力和裂解能力。
实施例6、酸碱耐受性实验
用稀HCl溶液和稀NaOH溶液将生理盐水的pH调为3、4、5、6、7、8、9、10、11，用上述不同pH值的溶液将1010PFU/mL噬菌体溶液稀释至108PFU/mL，将稀释液在4℃下孵育2小时，用SM缓冲溶液梯度稀释后用双层平板法测定噬菌体的效价。
所述杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF酸碱耐受性实验结果如图5。由图5可知，在不同pH值的体系中，噬菌体vB_AsM_ZHF在pH＝5.0-8.0范围内可以保持良好的活性。随着pH值的上升与降低，噬菌体的效价有一定的下降。但在pH＝11以及pH＝3时，噬菌体仍然存在一定活性。
该结果说明，本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF对酸性环境和碱性环境均具有良好的耐受性。
实施例7、热稳定性实验
本发明人将108PFU/mL噬菌体溶液分别在36℃、50℃、60℃、70℃的条件下孵育2小时，用SM缓冲溶液梯度稀释后用双层平板法测定噬菌体的效价。
所述杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF热稳定性实验的结果如图6所示。根据该结果可知，噬菌体在36℃保持稳定，在60℃噬菌体活性下降约一半，在70℃时完全丧失活性。
因此，本发明的噬菌体vB_AsM_ZHF在低温(如0-10℃或更低)和常温环境(如10-28℃)中可以保持良好的活性，且具有较为理想的高温(如30-50℃)耐受性。
实施例8、裂解率实验
取1mL噬菌体vB_AsM_ZHF和1mL宿主菌AS01菌液在28℃孵育10分钟，用SM缓冲液梯度稀释，将稀释液涂布于平板上进行平板菌落计数，于28℃培养24小时。
同时，以1mL SM缓冲液和1mL宿主菌AS01菌液在28℃孵育10分钟作为对照组。
噬菌体的裂解率＝(1-实验组菌落数/对照组菌落数)×100％。
测定结果显示，杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF的裂解率达98％，对宿主有较好的裂解效果，适合在水产养殖过程中使用。
实施例9、噬菌体对宿主裂解曲线
在96孔板中将2μL处于对数生长期的细菌宿主悬浮液和噬菌体溶液以感染复数为1:10加入至100μL 2×TSB培养基，用去离子水将最终体积补充至200μl，28℃振荡培养60h。以不加噬菌体溶液作为对照。用酶标仪每隔1分钟检测OD600，结果如图7所示。
根据图7，当体系中没有加入噬菌体时，随着宿主菌的生长，OD600在1小时内缓慢增加，在1-7小时内呈指数增加，在7-45小时内缓慢增加，当加入噬菌体的宿主，在前1小时，宿主菌的OD600同样有所增加，随着宿主菌进入对数生长期，噬菌体逐渐开始裂解宿主，在45小时内宿主菌的OD600没有明显的提升，但是随后未被裂解的宿主菌开始逐渐生长，宿主菌的OD600逐渐增大。
实施例10、噬菌体治疗杀鲑气单胞菌感染效果评价
本发明人选取大菱鲆(30克±2克)作为试验用鱼，随机分为5组，即3组噬菌体治疗组(AS+Phage)、1组攻毒对照组(AS+PBS)和1组空白对照组(PBS+PBS)，每组20尾。以8×104CFU/尾的杀鲑气单胞菌对噬菌体治疗组和攻毒对照组进行肌肉注射攻毒，空白对照组肌肉注射PBS溶液，注射体积为100μL/尾。同时以8×102PFU/尾，8×104PFU/尾，8×106PFU/尾的杀鲑气单胞菌噬菌体溶液对噬菌体治疗组进行腹腔注射给药，攻毒对照组和空白对照组腹腔注射PBS溶液，注射体积为100μL/尾。养殖20天观察大菱鲆死亡情况。
由图8可知，空白对照组在20天内没有鱼死亡，攻毒对照组的毒发期在6-8天，存活率为10％。噬菌体治疗组在8-16天均有鱼逐渐死亡，给药剂量为8×102PFU/尾的噬菌体治疗组存活率为60％，给药剂量为8×104PFU/尾的噬菌体治疗组存活率为70％，给药剂量为8×102PFU/尾的噬菌体治疗组存活率为75％。
噬菌体治疗组的存活率均明显高于攻毒对照组，说明本发明所述的杀鲑气单胞菌噬菌体可以保护鱼体免受杀鲑气单胞菌侵害。
同时，该噬菌体的应用，未观测到对于环境中其他生物的毒副作用。
生物材料的保藏
本发明的杀鲑气单胞菌噬菌体vB_AsM_ZHF(Aeromonas salmonicida phage vB_AsM_ZHF)已在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)保藏，保藏日期：2021年5月31日，其保藏编号为CCTCC NO:M 2021631。经保藏中心检测为存活的噬菌体。
以上内容仅是本申请的优选实施例，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员而言，本申请可以具有各种修改和改变。在本申请的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换，改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学
上海纬中生物科技有限公司
<120> 分离的杀鲑气单胞菌噬菌体、其组合物及应用
<130> 214672
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1412
<212> DNA
<213> 杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)
<400> 1
tgcagtcgag cggcagcggg aaagtagctt gctacttttg ccggcgagcg gcggacgggt 60
gagtaatgcc tggggatctg cccagtcgag ggggataaca gttggaaacg actgctaata 120
ccgcatacgc cctacggggg aaaggagggg accttcgggc ctttcgcgat tggatgaacc 180
caggtgggat tagctagttg gtggggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc cctagctggt 240
ctgagaggat gatcagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 300
cagtggggaa tattgcacaa tgggggaaac cctgatgcag ccatgccgcg tgtgtgaaga 360
aggccttcgg gttgtaaagc actttcagcg aggaggaaag gttggcgcct aatacgtgtc 420
aactgtgacg ttactcgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 480
acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgcag gcggttggat 540
aagttagatg tgaaagcccc gggctcaacc tgggaattgc atttaaaact gtccagctag 600
agtcttgtag aggggggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg 660
aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac aaagactgac gctcaggtgc gaaagcgtgg 720
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtcg atttggaggc 780
tgtgtccttg agacgtggct tccggagcta acgcgttaaa tcgaccgcct ggggagtacg 840
gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900
tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catgtctgga atcctgcaga 960
gatgcgggag tgccttcggg aatcagaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020
tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ctgtcctttg ttgccagcac 1080
gtaatggtgg gaactcaagg gagactgccg gtgataaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggc gcgtacagag 1200
ggctgcaagc tagcgatagt gagcgaatcc caaaaagcgc gtcgtagtcc ggatcggagt 1260
ctgcaactcg actccgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cgaatcagaa tgtcgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg ttgcaccaga 1380
agtagatagc ttaaccttcg ggagggcgtt ac 1412

Claims (28)

1.一种分离的噬菌体，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO: M2021631。
2.权利要求1所述的噬菌体的应用，用于制备抑制其细菌宿主的组合物；其细菌宿主为杀鲑气单胞菌。
3.如权利要求2所述的噬菌体的应用，其特征在于，所述组合物为药物组合物、清洁剂和/或消毒剂。
4.如权利要求3所述的噬菌体的应用，其特征在于，所述药物组合物为疫苗组合物，该疫苗组合物预防所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病，所述鱼类疾病包括杀鲑气单胞菌感染引发的疥疮病。
5.如权利要求3所述的噬菌体的应用，其特征在于，所述药物组合物为治疗组合物，该治疗组合物治疗所述噬菌体的细菌宿主感染相关的鱼类疾病，所述鱼类疾病包括：杀鲑气单胞菌感染引发的疥疮病。
6.如权利要求3所述的噬菌体的应用，其特征在于，所述清洁剂或消毒剂为环境清洁剂或环境消毒剂。
7.一种用于抑制杀鲑气单胞菌的组合物，其包含权利要求1所述的分离的噬菌体。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，其还包含生物学可接受的载体。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物中噬菌体大于或等于103PFU/mL。
10. 如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物中噬菌体为103～1010 PFU/mL。
11. 如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物中噬菌体为104～109 PFU/mL。
12.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药物组合物、清洁剂或消毒剂。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述清洁剂或消毒剂为环境清洁剂或环境消毒剂。
14.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型包括：液体制剂或固体制剂。
15.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型包括：冻干剂，水溶液，乳液，悬浮剂，粉剂，颗粒剂或微胶囊。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述水溶液为可喷洒溶液。
17.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述粉剂为可湿粉剂。
18.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH值为pH3.0～11.0。
19. 如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH值为pH 4.0～9.0。
20.一种应用权利要求1所述的噬菌体制备组合物的方法，包括：扩增培养权利要求1所述的噬菌体，将之与载体混合，所述的载体为生物学可接受的载体。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述扩增培养包括：将所述噬菌体接种其细菌宿主培养物，从而所述噬菌体侵染其宿主，进行复制，其细菌宿主为杀鲑气单胞菌。
22.一种非治疗性的抑制病原微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1所述的噬菌体对需要进行细菌抑制的对象进行处理；所述对象为细菌附着的区域或器具，所述区域为公共场所或鱼类养殖水；所述的细菌是能被所述噬菌体感染、进而裂解的杀鲑气单胞菌；所述对象不是人或动物。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，处理时，在pH3.0～11.0下进行。
24. 如权利要求23所述的方法，其特征在于，处理时，在pH 4.0～9.0下进行。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，处理时，在0～50℃进行。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，处理时，在0～40℃进行。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，处理时，在0～30℃下进行。
28. 一种用于抑制杀鲑气单胞菌的试剂盒或药盒，其特征在于，所述试剂盒或药盒包含：
权利要求1所述的噬菌体；或
权利要求7～19任一所述的组合物。
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