JP6262881B2 - 新たなバクテリオファージ及びこれを含む組成物 - Google Patents

Description

本発明は、鳥類病原性大腸菌(ＡＰＥＣ)に特異的な死滅能を有する新たなバクテリオファージ、これを含む組成物及び前記新たなバクテリオファージ又は前記組成物を利用し、鳥類の感染性疾病を予防又は治療する方法に関するものである。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下「Ｅ．ｃｏｌｉ」ともいう）は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属するグラム陰性の短桿菌であり、哺乳動物をはじめ多様な動物の腸管内に存在する正常細菌叢の一つである。ほとんどの大腸菌は、日和見感染を誘発することもあるが、非病原性である。しかしながら、一部の高病原性菌株は、ヒトをはじめ動物内で様々な腸疾患及び敗血症などを誘発することが知られている。

このような大腸菌の中で、特に鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ， ＡＰＥＣ）は、鳥類、例えば、鶏、アヒル、七面鳥などの呼吸器を介して感染を誘発する大腸菌であり、呼吸器の粘膜を通して体内に進入することが知られている。前記鳥類病原性大腸菌は、鳥類の呼吸器疾病を主に家禽類に発病させることなどにより、家禽産業に莫大な経済的被害を与えて問題となっている。

一方、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は、特定の細菌に感染し、感染した細菌の成長を抑制・阻害する細菌特異的ウイルスを意味する。バクテリオファージは、抗生剤に比べて宿主特異性が強いだけでなく、近年、抗生剤の使用に対する耐性菌出現の問題が深刻になるにつれて、その活用に対する関心が高まっている。

そして、世界諸国でバクテリオファージに対する研究が活発に行われており、バクテリオファージに関する特許出願と、これを活用した組成物に対して米食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）の承認などを取得しようとする取り組みが増加している状況である。

しかし、養鶏を始めとする鳥類の飼育において重要な問題となっている鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防及び／又は治療するためのバクテリオファージ関連技術は、いまだに足りない状況であり、したがって、このようなバクテリオファージ及びその関連技術の開発が要求されている。

本発明者らは、抗生剤の使用による耐性菌の出現及び抗生剤の肉類内残留問題などを解決し、大腸菌感染性疾病を効率的に予防及び治療するための研究を重ねた結果、家禽類の呼吸器疾病を起こす鳥類病原性大腸菌に対して特異的な死滅能を有する新たなバクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）を自然界で分離することに至った。

また、前記新たなバクテリオファージの形態的、生化学的、遺伝的特性を同定し、前記バクテリオファージが耐酸性、耐熱性及び耐乾性などに優れていることを確認し、これを活用した抗生剤、消毒剤、飼料添加剤、その他の組成物などを開発し、更に鳥類に発病する感染性疾病の予防又は治療用の組成物及びこれを利用した疾病の予防又は治療方法を開発した。

本発明は、鳥類病原性大腸菌に特異的な死滅能を有する新たなバクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）の提供を目的とする。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）を有効成分として含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防及び／又は治療用組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）を有効成分として含む抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤又は洗浄剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を利用し、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防及び／又は治療する方法を提供することを目的とする。

本発明の一様態によれば、鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的な死滅能を有する、新たなバクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）が提供される。

本発明の他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）を有効成分として含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用の組成物が提供される。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）を有効成分として含む抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤又は洗浄剤が提供される。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を鳥類に投与する段階を含む鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法が提供される。

本発明のバクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）は、鳥類病原性大腸菌を特異的に死滅させる効果を奏する。

また、本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）は、耐酸性、耐熱性及び耐乾性に優れていて様々な温度、ｐＨ及び乾燥条件範囲で鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用の組成物として活用できる。また、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）を有効成分として含む抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤又は洗浄剤などに活用できるという効果がある。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）又はこれを有効成分として含む抗生剤を提供し、従来の抗生剤に比べて鳥類病原性大腸菌に対する特異性が非常に高く、益菌は殺さずに特定病原菌のみを死滅させることができ、薬物耐性を誘導しないため、従来の抗生剤に比べて製品寿命を延長できるという効果がある。

また、本発明は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）又はこれを有効成分として含む組成物を鳥類に投与すると、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療できるという効果がある。

新たなバクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）（以下、「ΦＣＪ２４」ともいう）の電子顕微鏡写真である。 新たなバクテリオファージΦＣＪ２４のＰＦＧＥ結果を示す図である。 新たなバクテリオファージΦＣＪ２４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。 新たなバクテリオファージΦＣＪ２４の耐酸性実験結果を示すグラフである。 新たなバクテリオファージΦＣＪ２４の耐熱性実験結果を示すグラフである。 新たなバクテリオファージΦＣＪ２４の耐乾性実験結果を示すグラフである。

以下、本発明に関してより詳しく説明する。本明細書に記載されなかった内容は、当該技術分野又は類似分野の熟練者なら十分に認識・類推できるため、その説明を省略する。

本発明の一様態は、鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， ＡＰＥＣ）に特異的な死滅能を有する、新たなバクテリオファージΦＣＪ２４（ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ）（以下、「ΦＣＪ２４」ともいう）を提供する。

鳥類病原性大腸菌は、鶏、アヒル、七面鳥などの鳥類の呼吸器を介して感染する大腸菌であり、鳥類感染性疾病、具体的には鳥類大腸菌症を誘発する。具体的には、前記鳥類病原性大腸菌は、呼吸器の粘膜を通して鳥類の体内に進入し、敗血症、肉芽腫、気嚢炎、卵管炎、関節炎などの様々な疾病を誘発する大腸菌である。前記鳥類病原性大腸菌は、一般的な大腸菌と同様にグラム陰性の桿菌であり、周毛性鞭毛があるため運動性があり、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を分解して酸とガスを生成する好気性又は通性嫌気性菌である。

前記鳥類病原性大腸菌は、普通の培地でもよく育ち約７℃〜４８℃の温度で発育が可能であり、発育最適温度は約３５℃ないし約３７℃である。特に鳥類の体温に近い約４２℃で病原性因子の発現が効果的に行われる。また、鳥類病原性大腸菌は、ｐＨ４．５〜ｐＨ９．０の範囲で発育が可能である。

バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）は、特定の細菌に感染し、当該細菌の成長を抑制・阻害する細菌特異的ウイルスであり、単一あるいは二重鎖のＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又はＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を遺伝物質として含むウイルスを意味する。

具体的に、本発明の一様態のバクテリオファージΦＣＪ２４は、鳥類病原性大腸菌に選択的に感染する種特異性を有するバクテリオファージであり、正二十面体ヘッド（ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｃａｐｓｉｄ）と収縮性のないテール（ｌｏｎｇ ｎｏｎ−ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｔａｉｌ）で構成された形態型（ｍｏｒｐｈｏｔｙｐｅ）Ｂ１のサイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するバクテリオファージである（図１参照）。バクテリオファージΦＣＪ２４の塩基配列と他のバクテリオファージの解読塩基配列の相同性を比較した結果を表１に示した。バクテリオファージΦＣＪ２４の耐酸性においてｐＨ３．５からｐＨ１１．０まで活性を失うことなく安定的であり（図４）、耐熱性においては５０℃以上で２時間暴露しても１ログ（ｌｏｇ）以上減少しなかった（図５）。耐乾性においてはバクテリオファージΦＣＪ２４のタイターは、６０℃で２時間乾燥したとき約１ログ（ｌｏｇ）減少した（図６）。バクテリオファージΦＣＪ２４の塩基配列の一部は、フリーテキスト上の配列番号１及び２である。

前記バクテリオファージΦＣＪ２４は、本発明者らが新たに分離したバクテリオファージであり、２０１３年１０月２５日に韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘濟１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１４６２Ｐで寄託した。

本発明の他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物が提供される。

前記バクテリオファージΦＣＪ２４は、鳥類病原性大腸菌を特異的に死滅させる抗菌活性を有するため、鳥類病原性大腸菌の感染で誘発される疾病を予防・治療する目的として利用することができる。前記鳥類病原性大腸菌の感染性疾病例として、鳥類大腸菌症（Ａｖｉａｎ ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）を挙げることができるが、これに制限されるものではない。

前記鳥類大腸菌症は、鳥類の呼吸器などに病原性大腸菌が感染して発生する疾病であり、その症状として気嚢炎（ａｉｒｓａｃｃｕｌｉｔｉｓ）、肝包膜炎（ｐｅｒｉｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、腹膜炎（ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ）、心臓周囲炎（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｔｉｓ）、卵管炎（ｓａｌｐｉｎｇｉｔｉｓ）、臍炎（ｏｍｐｈａｌｉｔｉｓ）、骨髄炎（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）又は敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）など様々な病変を示し、感染した鳥類の成長低下及びへい死を誘発する。

本明細書で用いられる用語「予防」は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む組成物を対象体に提供して、該当疾病を抑制したり、発病を遅延させたりする全ての行為を意味する。

本明細書で用いられる用語「治療」は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４及び／又は前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む組成物を対象体に提供して、既に感染した該当疾病の症状を好転又は改善させる全ての行為を意味する。

本様態の前記鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４を５×１０^２〜５×１０^１２ｐｆｕ／ｍｌ含有してもよく、好ましくは、前記バクテリオファージΦＣＪ２４を１×１０^６〜１×１０^１０ｐｆｕ／ｍｌ含有してもよい。

本様態の前記鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体を追加的に含むことができ、前記担体とともに製剤化され、食品、医薬品、飼料添加剤又は飲用水添加剤などに提供され得る。本明細書で用いられる用語「薬学的に許容可能な担体」は、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。

本様態で使用可能な前記担体の種類は、特に制限されず、当該技術分野で通常的に使用され、薬学的に許容される担体ならいずれも使用することができる。前記担体の非制限的な例として、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、テキストローズ溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどがある。これらは単独又は２種類以上を混合して使用することができる。

また、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び／又は静菌剤など他の通常の添加剤を添加して使用することができ、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び／又は潤滑剤などを付加的に添加し、水溶液、懸濁液、油濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は精製などで製剤化して用いることができる。

本様態の前記鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物の投与方式は、特に制限されず、当該技術分野で通常的に使用される方式で行うことができる。前記投与方式の非制限的な例として、組成物を経口投与又は非経口投与方式で投与することが挙げられる。

前記経口投与用の剤形の非制限的な例として、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ローゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、錠剤、水溶性懸濁液、油性懸濁液、調剤粉末、顆粒、エマルジョン、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップ又はエリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）などを挙げることができる。

本様態の組成物を錠剤又はカプセルなどの剤形に製剤化するため、ラクトース、サッカロース（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ）、ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（Ｍａｎｎｉｔｏｌ）、デンプン、アミロペクチン（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）又はゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）などの結合剤；ジカルシウムホスフェート（ｄｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの賦形剤；トウモロコシデンプン又はサツマイモデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、ステアリン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、フマル酸ステアリルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｙｌ ｆｕｍａｒａｔｅ）又はポリエチレングリコールワックス（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｗａｘ）などの潤滑剤などを含ませることが可能であり、カプセル剤形の場合には上述した物質以外にも脂肪油などの液体担体などを更に含ませることができる。

本様態の組成物を非経口投与する方法として、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与又は局部投与などを利用することが可能であり、前記組成物を疾患部位に塗布又は噴霧する方法も利用することができるが、これらに制限されることはない。

前記非経口投与用の剤形として、例えば皮下注射、静脈注射又は筋肉内注射などの注射用形態；坐剤注入方式；又は呼吸器を通して吸入を可能とするエアロゾル剤などのスプレー用として製剤化することができるが、これらに制限されることはない。前記注射用剤形として製剤化するためには、本様態の組成物を安定剤又は緩衝剤とともに水に混合した溶液又は懸濁液として製造し、これをアンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）又はバイアル（ｖｉａｌ）の単位投与用に製剤化することができる。前記エアロゾル剤などのスプレー用として剤形化する場合、水分散された濃縮物又は湿潤粉末が分散できるように、推進剤などを添加剤とともに配合することができる。

本様態の前記鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用組成物の適切な塗布、噴霧又は投与量は、前記組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間及び／又は投与経路と、投与対象となる動物の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、摂取する食べ物、排泄速度などの要因によって可変的であり、一般的に熟練した獣医師なら目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定して処方することができる。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む抗生剤が提供される。

本明細書で用いられる用語「抗生剤」は、薬剤の形態としてヒトを含む対象体に提供され、菌を死滅させることが可能な効能を有する製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤及び抗菌剤を総称する概念である。

本様態の前記バクテリオファージΦＣＪ２４又はこれが含まれた組成物を有効成分として含む抗生剤は、従来の抗生剤に比べて鳥類病原性大腸菌に対する特異性が非常に高いため、益菌は殺さずに特定の病原菌のみを死滅させることができ、薬物耐性を誘導しないため、従来の抗生剤に比べて製品寿命を延長できる効果がある。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む鳥類用飼料添加剤又は飲用水添加剤が提供される。

前記鳥類用飼料添加剤又は飲用水添加剤の適用対象である「鳥類」は、特に限定されるものではなく、本様態において、前記鳥類は、具体的には家禽類であってもよい。

本明細書で用いられる用語「家禽類」は、家畜の中で鳥類に属する動物を総称する概念である。前記家禽類は特に限定されないが、鶏、アヒル及び七面鳥などからなる群より選択される一つ以上を含むことができる。

本様態の前記鳥類用飼料添加剤又は飲用水添加剤は、前記バクテリオファージΦＣＪ２４又はこれを含む組成物を飼料添加剤又は飲用水添加剤の形態として別に製造して飼料又は飲用水に混合する方式で使用するか、前記バクテリオファージΦＣＪ２４又はこれを含む組成物を、飼料又は飲用水を製造する際に、直接添加する方式で使用することができる。

本様態の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤として用いられる前記バクテリオファージΦＣＪ２４又は前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む組成物は、液状又は乾燥状態であり、例えば、乾燥した粉末形態であってもよい。

例えば、本発明のバクテリオファージΦＣＪ２４は、粉末形態として飼料添加剤重量の０．０５〜１０重量％、好ましくは、０．１〜２重量％の割合で混合され得る。

本様態の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤を乾燥した粉末形態として製造するための乾燥方法は、特に制限されず、当該技術分野における通常的な方法を用いることができる。前記乾燥方法の非制限的な例として、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などがある。これらは単独又は二つ以上の方法を共に利用する方式で行うことができる。

本様態の前記飼料添加剤又は飲用水添加剤には、非病原性の他の微生物を追加的に添加することができる。添加できる前記微生物の非制限的な例として、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素及び／又は糖転換酵素の生産が可能であるバチルスズ・ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの枯草菌；牛の胃のような嫌気的条件で生理的活性及び有機物分解能を有するラクトバチルス菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）などの乳酸菌；家畜の体重と牛乳の産乳量を増加させ飼料の消化吸収率を高める効果があるアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などの糸状菌；及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母；からなる群より選択され得る。これらは、単独又は２種類以上を混合して使用することができる。

本様態の前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤は、必要に応じて他の添加剤を更に含ませることができる。使用できる前記添加剤の非制限的な例として、飼料又は飲用水の品質低下を防止するために添加する決着剤、油化剤、保存剤など；飼料又は飲用水の効用増大のため添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク質態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤又はオリゴ糖などがあり、その他飼料混合剤などが含まれ得る。これらは単独で使用されてもよいし、２種類以上が共に添加されてもよい。

本発明の前記飼料添加剤は、飼料１００重量部に対して、０．０５〜１０重量部で含まれることが好ましく、０．１〜２重量部で含まれることがより好ましい。本発明の前記飲用水添加剤は、飲用水１００重量部に対して、０．０００１〜０．０１の重量部で含まれることが好ましく、０．００１〜０．００５重量部で含まれることがより好ましい。前記範囲内では、鳥類病原性大腸菌に対するバクテリオファージΦＣＪ２４の活性が十分に発揮できるという利点がある。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む飼料添加剤又は飲用水添加剤を飼料又は飲用水に添加するか、前記バクテリオファージΦＣＪ２４を飼料又は飲用水に直接添加して製造する飼料又は飲用水が提供される。

本様態で用いられる飼料は、特に制限されず、当該技術分野における通常的な飼料を用いることができる。前記飼料の非制限的な例として、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、デンプン類、フクベ類又は穀物副産物類などの植物性飼料；タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、 単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類又は飲食物などの動物性飼料などがある。これらは、単独または２種類以上を混合して使用することができる。

本様態で用いられる飲用水は、特に制限されず、当該技術分野における通常的な飲用水を用いることができる。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む、消毒剤又は洗浄剤が提供される。前記消毒剤又は洗浄剤の剤形は特に制限されず、当該技術分野で知られた剤形で製造されて使用され得る。

前記消毒剤は、鳥類病原性大腸菌を除去するために撒布することができ、鳥類の活動領域、屠畜場、へい死地域、調理場所又は調理設備などに撒布することができるが、これらに制限されることはない。

前記洗浄剤は、鳥類病原性大腸菌に暴露されたか、暴露される可能性のある鳥類の皮膚表面又は身体の各部位などを洗浄する用途で用いることができるが、これらに制限されることはない。

本発明の更に他の一様態によれば、前記バクテリオファージΦＣＪ２４又はこれを有効成分として含む組成物を利用し、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法が提供される。

本発明の更に他の一様態によれば、鳥類病原性大腸菌に感染したか感染する恐れがある鳥類に前記バクテリオファージΦＣＪ２４又は前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む組成物を薬学的に有効な量で投与する段階を含む。前記バクテリオファージΦＣＪ２４又はこれを含む組成物の適切な１日当たりの総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で医師によって決定され、これは当該技術分野における通常の知識を有する者において自明なことである。

特定の鳥類に対する前記バクテリオファージΦＣＪ２４又は前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む組成物の具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、該当個体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別又は食餌はもちろん、前記バクテリオファージΦＣＪ２４又はこれを含む組成物の投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間などを考慮して決定することが可能であり、同時又は異時において共に使用される薬物とその他の組成物の成分などをはじめとした多数の因子及び医薬分野においてよく知られている類似因子にしたがって可変的である。

本発明の前記バクテリオファージΦＣＪ２４又は前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む組成物は、薬学的製剤の形態として鳥類に噴霧式鼻腔投与、鳥類の飼料又は飲用水に直接添加しこれを摂食させる方式で投与することが可能であり、飼料添加剤又は飲用水添加剤の形態で飼料又は飲用水に混合して投与することができる。

本様態の前記バクテリオファージΦＣＪ２４又は前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む組成物の投与経路及び投与方式は、特に制限されず、目的とする該当組織に前記バクテリオファージΦＣＪ２４又はこれを含む組成物を到達させることができる限り、任意の投与経路及び投与方式で行うことができる。すなわち、前記バクテリオファージΦＣＪ２４又は前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む組成物は、経口又は非経口の様々な経路を介して投与することが可能であり、その投与経路の非制限的な例として、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻側内又は吸入などに投与され得る。

以下、実施例をもって本発明をより詳しく説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることはない。

［実施例１］
鳥類病原性大腸菌に感染するバクテリオファージの分離

＜実施例１−１＞
バクテリオファージスクリーニング及び単一バクテリオファージの分離
韓国忠清道清原郡にある養鶏農場で鶏の糞便から得た試料５０ｍｌを４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上澄み液を０．４５μｍのフィルターで濾過して、試料液を用意し、これを利用してソフトアガーオーバーレイ（ｓｏｆｔ ａｇａｒ ｏｖｅｒｌａｙ）方法を行った。前記ソフトアガーオーバーレイ方法は、トップアガー（ｔｏｐ−ａｇａｒ、０．７％の寒天を利用して固体培地上に付着させたもの）で成長した宿主細胞を利用してバクテリオファージが溶菌することを観察する方法をいう。

具体的には、建国大学校獣医科大学で入手した鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）の振とう培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μｌと、１０×ＬＢ培地（トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ））1０ｇ／ｌ；酵母抽出物５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ（１０ｇ／ｌ）２ｍｌに前記試料液１８ｍｌを混合し、これを３０℃で１８時間培養した後、前記培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄み液を０．４５μｍのフィルターで濾過した。その後、ＬＢ平板培地上に０．７％（ｗ／ｖ）寒天３ｍｌと鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）振とう培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μｌの混合液を注いで固まった後、その上に試料液１０μｌを滴下し、３０℃で１８時間培養して、溶菌斑の形成を確認した。

一つの溶菌斑には一種類のバクテリオファージが存在すると知られているため、形成された前記溶菌斑から単一バクテリオファージを分離した。具体的には、前記溶菌斑を４００μｌのＳＭ溶液（ＮａＣｌ ５．８ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ ２ｇ／ｌ；１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ５０ｍｌ）に加えて室温で４時間放置し、バクテリオファージ溶液を得た。

続いて、前記バクテリオファージ溶液１００μｌを０．７％（ｗ／ｖ）寒天１２ｍｌ及び鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）振とう培養液（ＯＤ_６００＝２）５００μｌと混合し、１５０ｍｍ直径のＬＢ平板培地を利用したソフトアガーオーバーレイ方法を行い、完全に溶菌するまで培養した。培養が終わった後、前記ＬＢ平板培地に１５ｍｌのＳＭ溶液を加えて室温で４時間放置し、バクテリオファージ溶液を得た。

前記溶液を回収し、１％（ｖ／ｖ）クロロホルムを加えた後、１０分間混合し４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を得て、前記上澄み液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、最終試料を得た。

＜実施例１−２＞
バクテリオファージの大量培養及び精製
実施例１−１で得た前記バクテリオファージを、鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）を利用して大量培養し、これからバクテリオファージを精製した。

具体的には、鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）を振とう培養して１．０×１０^１０ｃｆｕとなるように分注し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、これを４ｍｌのＳＭ溶液に再浮遊させた。ここに前記バクテリオファージを１．０×１０^６ｐｆｕで接種し、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．０００１で滴定した後、常温で２０分間静置した。

続いて、これを１５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で６時間培養した。培養が終了した後、最終体積の１％（ｖ／ｖ）となるようにクロロホルムを添加し、２０分間撹拌し、制限酵素であるＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅ Ａの各々を最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように添加し、３０℃で３０分間静置した。その後、最終濃度が各々１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）となるように塩化ナトリウムとポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ， ＰＥＧ）を加えて４℃で３時間更に静置し、４℃及び１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して沈殿物を得た。

得られた前記沈殿物を５ｍｌのＳＭ溶液で懸濁させ２０分間室温で静置した後、クロロホルム１ｍｌを加えて撹拌し、４℃及び４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄み液を得た。前記上澄み液を０．４５μｍのフィルターで濾過した後、グリセロール密度勾配法（密度：４０％、５％グリセロール）を利用した超遠心分離（３５０００ｒｐｍ、１時間、４℃）を行ってバクテリオファージを精製した。

本発明者らは農場の糞便サンプルから試料を採取し、鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ， ＡＰＥＣ）に対する特異的死滅能を有する前記バクテリオファージを「ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅΦＣＪ２４」と命名し、２０１３年１０月２５日韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１４６２Ｐ号で寄託した。

＜実施例２＞
ΦＣＪ２４の形態観察
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２４を０．０１％のゼラチン溶液に希釈し、２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液で固定した。これを炭素コーティングした雲母板（ｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃａ ｐｌａｔｅ （約２．５ｍｍ×２．５ｍｍ））に滴下し、１０分間適応させた後、滅菌蒸留水で洗浄した。

その後、炭素被膜（ｃａｒｂｏｎ ｆｉｌｍ）をカッパーグリッド（ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄ）に挟んで２％ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で６０秒間染色して乾燥した後、透過電子顕微鏡（ＪＥＭ−１０１１、８０ｋＶ、倍率×２０００００）で検鏡した（図１）。

図１は、バクテリオファージΦＣＪ２４の透過電子顕微鏡写真であり、バクテリオファージΦＣＪ２４は、形態学的に正二十面体のヘッド（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｃａｐｓｉｄ）と収縮性のないテール（ｌｏｎｇ ｎｏｎ−ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｔａｉｌ）で構成された形態型（ｍｏｒｐｈｏｔｙｐｅ）Ｂ１のサイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）に属することが分かった。

＜実施例３＞
ΦＣＪ２４の全ゲノムＤＮＡのサイズ分析
前記実施例１で精製したバクテリオファージΦＣＪ２４からゲノムＤＮＡを抽出した。

具体的には、精製されたバクテリオファージΦＣＪ２４の培養液に２０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、５０μｇ／ｍｌのタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）、及び０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）を加えて、５０℃で１時間静置し、同一体積のフェノール（ｐＨ８．０）を加えて撹拌した後、室温及び１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。

前記上澄み液を同一体積のＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）と混合し、室温及び１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液を得た。前記上澄み液を同一体積のクロロホルムと混合し、室温及び１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、その上澄み液を得た。前記上澄み液に３Ｍの酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）を全体体積に対して１０％（ｖ／ｖ）となるように加えて混合し、２倍体積の冷たい９５％エタノールを更に加えて混合した後、−２０℃で１時間静置した。

続いて、０℃で１０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を除去して沈殿物を得た後、これに５０μｌのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて溶解させた。前記抽出したＤＮＡを１０倍希釈しＯＤ_２６０で吸光度を測定し、濃度を測った。

その後、１μｇのＤＮＡを１％ＰＦＧＥ（ｐｕｌｓｅ−ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）アガロースゲルにロードし、バイオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）ＰＦＧＥシステムの７番のプログラム（サイズ範囲２５ｋｂ〜１００ｋｂ；スイッチタイムランプ（ｓｗｉｔｃｈ ｔｉｍｅ ｒａｍｐ）０．４秒〜２．０秒、線形（ｌｉｎｅａｒ ｓｈａｐｅ）；順方向電圧（ｆｏｒｗａｒｄ ｖｏｌｔａｇｅ）１８０Ｖ；逆方向電圧（ｒｅｖｅｒｓｅ ｖｏｌｔａｇｅ）１２０Ｖ）を利用して常温で２０時間展開させた（図２）。

図２は、バクテリオファージΦＣＪ２４のゲノムＤＮＡの電気泳動写真であり、バクテリオファージΦＣＪ２４のゲノムＤＮＡは、約５３ｋｂｐのサイズであることを確認することができた。

＜実施例４＞
ΦＣＪ２４のタンパク質パターンの分析
１０^１１ｐｆｕ／ｍｌタイター（ｔｉｔｅｒ）の精製されたバクテリオファージΦＣＪ２４溶液１５μｌと、５×ＳＤＳ試料溶液３μｌとを混合し、５分間沸騰させた後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図３）。

図３は、バクテリオファージΦＣＪ２４を対象として行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を表す電気泳動写真であり、約１０．３ｋＤａ、１２．５ｋＤａ、１５．１ｋＤａ、４３ｋＤａ、４９．３ｋＤａ、６０．４ｋＤａ、９４．９ｋＤａサイズの主要タンパク質を確認することができた。

＜実施例５＞
ΦＣＪ２４の遺伝的特性の分析
前記実施例１で精製されたバクテリオファージΦＣＪ２４の遺伝的特性を調べるため、バクテリオファージΦＣＪ２４のＤＮＡを遺伝子分析機器であるＦＬＸチタニウムシークエンサー（ｔｉｔａｎｉｕｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を用いて分析した。株式会社マクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）で、ＧＳとデ・ノボアセンブリソフトウェア（ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を用いて遺伝子の組換えを行った。オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）はＧｅｎｅＭＡｒｋ．ｈｍｍ、Ｇｌｉｍｍｅｒ ｖ３．０２及びＦＧＥＮＥＳＢソフトウェアを用いて行われた。ＢＬＡＳＴＰとインタープロスキャン（ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ）プログラムを用いてオープンリーディングフレームの名称を命名（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）した。

前記バクテリオファージの塩基配列は、従来に報告されたバクテリオファージ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｐｈａｇｅ ｐｈｉＥＢ４９， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｐｈａｇｅ ＫＢＮＰ２１）の塩基配列と様々な類似性を示したが、全てのフラグメントが１００％一致するバクテリオファージは存在しなかったことを確認した。これにより、前記バクテリオファージは、新たに分離されたバクテリオファージであることを確認することができた。

表１は、バクテリオファージΦＣＪ２４の塩基配列と、前記従来に報告された２種類のバクテリオファージを解読した塩基配列との相同性を比較した結果を示す。

前記製造されたバクテリオファージΦＣＪ２４のＤＮＡを、遺伝子分析機器を用いて分析した塩基配列の一部結果は、配列表フリーテキスト上、配列番号１及び２である。

＜実施例６＞
ｐＨによるΦＣＪ２４の安定性の調査
バクテリオファージΦＣＪ２４が胃腸内の条件と同様に低いｐＨで安定性を保つことができるかを確認するため、様々なｐＨ範囲（ｐＨ２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．５、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０）で安定性の調査実験を行った。

実験のための様々なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５）、クエン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５）、リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５及びｐＨ７．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．０））を各々０．２Ｍで製造した。

前記各ｐＨ溶液１８０μｌと、２．０×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌタイターのバクテリオファージ溶液２０μｌとを混ぜた後、２時間常温で静置した。対照群は同一方法で２．０×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌバクテリオファージ溶液２０μｌをＳＭ溶液１８０μｌに混ぜた後、２時間常温で静置した。その後、これらを段階希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法を利用して各段階の希釈液を１０μｌずつ滴下した後、３０℃で１８時間培養し、溶菌の有無によってタイターを測定した（図４）。

図４は、バクテリオファージΦＣＪ２４の耐酸性実験結果を表したものである。図４に示した通り、対照群に比べてバクテリオファージΦＣＪ２４は、ｐＨ３．５からｐＨ１１．０まで活性を失うことなく安定的であることが確認された。

＜実施例７＞
温度によるΦＣＪ２４の安定性の調査
バクテリオファージの製品剤形の中で飼料添加剤として利用した場合、バクテリオファージの剤形過程において熱が発生する可能性があり、熱に対する安定性を確認するため下記の実験を行った。

具体的には、１．６５×１０^１１ｐｆｕ／ｍｌ濃度のバクテリオファージΦＣＪ２４の溶液１００μｌを、３７℃、４５℃、５３℃、６０℃で、１０分、３０分、６０分、１２０分静置した後、得られた実験培養液を段階希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μｌずつ滴下した後、３０℃で１８時間培養して、溶菌の有無によってタイターを測定した（図５）。

図５は、バクテリオファージΦＣＪ２４の耐熱性実験の結果を表したものである。図５に示した通り、バクテリオファージΦＣＪ２４は、５３℃においては１２０分暴露されるまで１ログ（ｌｏｇ）以上減少せず、６０℃においては時間の経過に従って活性が減少した。

＜実施例８＞
乾燥に対するΦＣＪ２４の安定性の調査
バクテリオファージの製品剤形の中で飼料添加剤として利用する場合、バクテリオファージの剤形過程で乾燥過程があり、乾燥条件に対するΦＣＪ２４の安定性を確認するため、下記の実験を行った。

耐熱性確認実験によって導出した結果に基づいて、真空濃縮遠心分離機（ＳｐｅｅｄＶａｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を利用し、乾燥実験を行った。２．５×１０^１０ｐｆｕ／ｍｌタイターのΦＣＪ２４の溶液２００ｕｌを２時間６０℃で真空乾燥し、得られたペレット（ｐｅｌｌｅｔ）をＳＭ溶液２００ｕｌに入れて４℃で１日間完全に再浮遊させた後、タイターを測定した（図６）。

図６は、バクテリオファージΦＣＪ２４の耐乾性実験結果を表したものである。図６に示した通り、乾燥後に、元のタイターと相対的な安定性を比較すると、６０℃で２時間乾燥した場合、活性が約１ログ（ｌｏｇ）減少することが分かった。

＜実施例９＞
野生分離株の鳥類病原性大腸菌に対するΦＣＪ２４の感染範囲の調査
バクテリオファージΦＣＪ２４が、実験で用いられた鳥類病原性大腸菌（Ｅ１０−４）以外に、建国大学校獣医科大学で分離した野生分離鳥類病原性大腸菌４６株、検疫院で分離した鳥類病原性大腸菌１０株、全北大獣医科大学で分離した鳥類病原性大腸菌７株、コミファーム農場で分離した病性鑑定鳥類病原性大腸菌２６株に対して溶菌活性を有するか否かについて確認した。

具体的には、各菌株の振とう培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μｌを混ぜてソフトアガーオーバーレイ方法を行い、１０^９ｐｆｕ／ｍｌタイターのバクテリオファージΦＣＪ２４溶液を１０μｌずつ滴下した後、３０℃で１８時間培養して溶菌斑形成の有無を観察した（表２）。前記結果は表２に示した。

表２で示した通り、バクテリオファージΦＣＪ２４は、一般の養鶏農家で鳥類大腸菌症の原因菌である鳥類病原性大腸菌（Ｏ−１、Ｏ−７８血清型を含む）に対して効果的な感染能を示すことを確認することができた。

また、前記Ｏ−７８血清型は一般的に養鶏農場で分離される鳥類病原性大腸菌のうち、最も頻繁に検出される菌株であると知られている。

配列表を添付して提出。

Claims (12)

1. 鳥類病原性大腸菌（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に特異的な死滅能を有し、配列番号１又は２に示すＤＮＡ塩基配列を含む、受託番号がＫＣＣＭ１１４６２ＰであるバクテリオファージΦＣＪ２４。
2. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用の組成物。
3. 前記感染性疾病は、鳥類大腸菌症であることを特徴とする、請求項２に記載の鳥類病原性大腸菌による感染性疾病の予防又は治療用の組成物。
4. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む、抗生剤。
5. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む、鳥類用飼料添加剤。
6. 請求項５の鳥類用飼料添加剤を含む、鳥類用飼料。
7. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む、鳥類用飲用水添加剤。
8. 請求項７の鳥類用飲用水添加剤を含む、鳥類用飲用水。
9. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む、消毒剤。
10. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２４を有効成分として含む、洗浄剤。
11. 請求項１の前記バクテリオファージΦＣＪ２４又は請求項２の前記組成物を鳥類に投与する段階を含む、鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法。
12. 前記感染性疾病は鳥類大腸菌症であることを特徴とする、請求項１１に記載の鳥類病原性大腸菌による感染性疾病を予防又は治療する方法。

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