CN106795498A - 新颖噬菌体和包括其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新颖噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)以及一种包含其作为活性组分的组合物。另外，本发明涉及一种使用噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)或所述组合物来预防和/或治疗鸟类的由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法。

Description

新颖噬菌体和包括其的组合物
技术领域
本发明涉及一种具有杀死禽致病性大肠杆菌的特异性能力的新颖噬菌体、一种包括其的组合物、以及一种使用所述新颖噬菌体或所述组合物预防或治疗鸟类的感染性疾病的方法。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli，在下文中也称为‘E.coli’)是一种肠杆菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌属(Escherichia)革兰氏阴性短杆菌，且是存在于包括哺乳动物在内的各种动物的肠道内的正常菌落的一种。大多数大肠杆菌菌株无致病性并且可能引起机会性感染，但是一些高致病性菌株会在包括人类在内的动物中引起各种肠道疾病和败血症。
在这些大肠杆菌菌株中，禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli，APEC)通过例如鸡、鹅、火鸡等鸟类的呼吸道引起感染，且已知通过呼吸道粘膜进入禽类体内。就鸟类的呼吸道疾病而言，禽致病性大肠杆菌主要在家禽中引起疾病，这给家禽业带来巨大的经济损失。
噬菌体(bacteriophage)指一种细菌特异性病毒，其预防和抑制感染有特异性噬菌体的细菌的生长。由于噬菌体具有比抗生素强的宿主特异性，并且近来出现抗生素抗性细菌以及动物体内抗生素残留的问题日益严重，因此噬菌体的应用已引起巨大关注。
已在多个国家对噬菌体积极进行研究，并且除关于噬菌体的专利申请以外，使用噬菌体的组合物获得食品及药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的趋势正逐渐增加。
然而，与噬菌体相关的用于预防和/或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的技术仍不充分，且由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病是在包含家禽饲养在内的鸟类饲养业中的重要问题，因此需要这类噬菌体和开发相关的技术。
发明内容
技术问题
由于针对克服抗生素抗性细菌的出现以及动物体内抗生素残留以及针对有效预防和治疗鸟类的感染性疾病的认真调查，因此本发明人从自然资源分离出一种新颖噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)，其具有杀死引起家禽呼吸道疾病的禽致病性大肠杆菌的特异性能力。
此外，本发明人辨明了所述新颖噬菌体的形态学、生物化学和遗传特性，证实了所述噬菌体具有极好的耐酸性、耐热性和耐干燥性，并且使用所述噬菌体开发出抗生素、消毒剂、饲料添加剂和其它组合物、一种用于预防或治疗鸟类中的感染性疾病的组合物、以及一种使用其预防或治疗疾病的方法。
本发明的一个目的是提供一种具有杀死禽致病性大肠杆菌的特异性能力的新颖噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)。
本发明的另一目的是提供一种用于预防和/或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，所述组合物包含噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分。
本发明的又一目的是提供包含噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或清洁剂。
此外，本发明的再一目的是提供一种使用噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)或包含其作为活性成分的组合物来预防和/或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法。
技术解决方案
本发明的一个方面提供一种具有杀死禽致病性大肠杆菌(Avian PathogenicEscherichia coli)的特异性能力的新颖噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)。
本发明的另一个方面提供一种用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，所述组合物包含噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分。
本发明的又一个方面提供包含噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或清洁剂。
本发明的再一个方面提供一种预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，所述方法包括：向鸟类投予噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)或包含其作为活性成分的组合物。
有利效果
根据本发明的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)有效果，其具有杀死禽致病性大肠杆菌的特异性能力。
此外，根据本发明的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)具有极好的耐酸性、耐热性和耐干燥性，因此不仅可以在各种温度、pH和干燥条件的范围下用作预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的试剂，而且可以用作包含噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、饲料、饮用水、消毒剂、清洁剂等。
此外，本发明提供噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)或包含其作为活性成分的抗生素，且所述抗生素由于下列而有效果：与之前的抗生素相比，所述抗生素具有针对禽致病性大肠杆菌的特异性，且因此选择性地杀死特异性致病菌而不杀死有益细菌，并且所述抗生素不引发抗生素抗性，从而使得与之前的抗生素相比产品寿命延长。
此外，通过向鸟类投予噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)或包含其作为活性成分的组合物，本发明具有预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的效果。
附图说明
图1是新颖噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)(在下文中称为‘ΦCJ24’)的电子显微图像。
图2示出了新颖噬菌体ΦCJ24的PFGE的结果。
图3示出了新颖噬菌体ΦCJ24的SDS-PAGE的结果。
图4是示出新颖噬菌体ΦCJ24的耐酸性实验结果的图形。
图5是示出新颖噬菌体ΦCJ24的耐热性实验结果的图形。
图6是示出新颖噬菌体ΦCJ24的耐干燥性实验结果的图形。
具体实施方式
在下文中，将更详细阐述本发明的实施例。这里将不再赘述所属领域的普通技术人员所显而易见的细节。
本发明的一个实施例提供一种具有杀死禽致病性大肠杆菌(Avian PathogenicEscherichia coli，APEC)的特异性能力的新颖噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)(在下文中称为‘ΦCJ24’)。
禽致病性大肠杆菌指通过例如鸡、鹅、火鸡等鸟类的呼吸道传播且能够引起鸟类的感染性疾病、特别是禽大肠杆菌病的大肠杆菌。具体来说，禽致病性大肠杆菌通过呼吸道粘膜进入鸟类体内，并引起各种疾病，例如败血症、肉芽肿、气囊炎、输卵管炎、关节炎等。正如普通的大肠杆菌一样，禽致病性大肠杆菌是革兰氏阴性菌，具有周生鞭毛进行移动，并且是好氧或兼性厌氧菌，从而分解乳糖(Lactose)和果糖(Fructose)而产生酸和气体。
禽致病性大肠杆菌在常见培养基中生长良好，且能够在约7℃至约48℃的温度下生长，理想生长温度介于约35℃至约37℃。具体来说，在接近鸟类体温的约42℃下，致病性因子有效地得到表达。此外，禽致病性大肠杆菌能够在介于pH 4.5至pH 9.0下生长。
噬菌体(bacteriophage)是能够感染特定细菌并抑制所述细菌生长的细菌特异性病毒，并且是包含单股或双股脱氧核糖核酸DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)作为遗传物质的病毒。
具体来说，根据本发明实施例的噬菌体ΦCJ24是具有选择性地感染禽致病性大肠杆菌的物种特异性的噬菌体，且在形态学上属于B1形态型(morphotype)长尾噬菌体科(Siphoviridae)，具有二十面体衣壳(isometric capsid)和长的不可收缩尾部(long non-contractile tail)(参见图1)。对噬菌体ΦCJ24的核苷酸序列与其它噬菌体的解码核苷酸序列的同源性进行了比较，且结果在表1中示出。噬菌体ΦCJ24在pH 3.5到pH 11.0下显示稳定的耐酸性，并未丧失活性(图4)，且在耐热性方面，当暴露在50℃或更高温度下2小时时显示出约1对数或更小的活性降低(图5)。在耐干燥性方面，噬菌体ΦCJ24在60℃下干燥2小时时显示出约1对数的活性降低(图6)。噬菌体ΦCJ24的部分核苷酸序列在序列表的序列编号1和2中列出。
噬菌体ΦCJ24是由本发明人分离的新颖噬菌体，且在2013年10月25日以保藏编号KCCM11462P保藏于韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms，韩国首尔西大门区弘济1洞361-221)。
本发明的另一个实施例提供一种包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物。
因为噬菌体ΦCJ24展现出能够特异性地杀死禽致病性大肠杆菌的抗细菌活性，所以噬菌体ΦCJ24可以用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌感染引起的疾病。由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的实例包括禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)，但并不仅限于此。
本文中的术语“禽大肠杆菌病”指发生于鸟类的呼吸道中的由致病性大肠杆菌感染引起的疾病，且其症状包括气囊炎(airsacculitis)、肝周炎(perihepatitis)、腹膜炎(peritonitis)、心包炎(pericarditis)、输卵管炎(salpingitis)、脐炎(omphalitis)、骨髓炎(osteomyelitis)或败血症(septicemia)，由此造成被感染鸟类的生长迟缓和死亡。
本文中的术语“预防”是指通过向动物投予噬菌体ΦCJ24和/或包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的组合物以抑止或减缓对应疾病或延迟对应疾病发生的全部举措。
本文中的术语“治疗”是指通过向动物投予噬菌体ΦCJ24和/或包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的组合物来使感染性疾病的症状好转或减轻的全部举措。
根据此实施例的用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物可以5×102到5×1012pfu/ml包含噬菌体ΦCJ24、具体来说可以1×106到1×1010pfu/ml的量包含噬菌体ΦCJ24。
根据此实施例用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物还可包含医药学上可接受的载剂，并且可与所述载剂一起配制，以提供食物、药物、饲料添加剂或饮用水添加剂等。本文中的术语“医药学上可接受的载剂”指既不刺激有机体也不抑制所投予化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。
适用于此实施例的载剂的类型并无特别限制，而是可以利用在所属领域中常用的任何医药学上可接受的载剂。载剂的实例可包括盐水、蒸馏水、林葛尔氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油和乙醇，但并不仅限于此。这些可以单独使用或以其2种以上的组合形式使用。
此外，必要时，可以向根据本发明的组合物中添加其它常用添加剂，如抗氧化剂、缓冲溶液和/或细胞抑制剂，并且还可向根据本发明的组合物中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂而配制成可注射配制品，例如水溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、颗粒和片剂。
投予根据此实施例的用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物的方法并无特别限制，而是可以使用相关领域中常用的任何方法。投药方法的一个实例可包括口服或非经肠投药。
口服的剂型的实例可以包括含锭、糖锭剂(troches)、片剂(lozenge)、水溶性悬浮液、油性悬浮液、配制的散剂、颗粒、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆或酏剂(elixirs)等。
为了将根据此实施例的组合物配制成例如片剂或胶囊等的剂型，还可包含粘合剂，例如乳糖、蔗糖(Saccharose)、山梨糖醇(Sorbitol)、甘露糖醇(Mannitol)、淀粉、支链淀粉(Amylopectin)、纤维素(Cellulose)和明胶(Gelatin)；赋形剂，例如磷酸氢钙(dicalcium phosphate)；崩解剂，例如玉米淀粉和甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁(magnesium stearate)、硬脂酸钙(calcium stearate)、硬脂基反丁烯二酸钠(sodiumstearyl fumarate)和聚乙二醇蜡(polyethylene glycol wax)，而对于胶囊配制品，除上述物质外，还可包含液体载剂，如脂肪油。
非经肠投予此实施例的组合物的方法可以包括例如静脉注射、腹膜内投药、肌肉内投药、皮下投药和局部投药，以及将根据本发明的组合物施用或喷雾到患部的方法，但并不仅限于此。
为了调配非经肠剂型，举例来说，此实施例的组合物可以调配成用于注射的剂型，例如皮下注射、静脉内注射和肌肉内注射；栓剂；或用于喷雾的剂型，例如气雾剂以便能够通过吸入器吸入，但并不仅限于此。为了调配用于注射的剂型，可以将此实施例的组合物与稳定剂或缓冲剂一起于水中混合，以制备溶液或悬浮液，将制备的溶液或悬浮液配制成以单位投药的剂型，例如安瓿(ampoule)或小瓶(vial)。在将组合物配制成例如气雾剂等用于喷雾的剂型时，可以将组合物与推进剂等以及添加剂配制在一起，以便在其中分散水分散性缩合物或湿粉。
根据此实施例的用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物的适宜施用、喷雾或投药剂量可以根据以下因素而不同：例如动物的年龄、体重和性别、疾病症状程度、摄取的实物、排泄率等以及配制组合物的方法、投药方法、投药时间和/或投药途径，并且具有普通技术的兽医可以易于确定用于所需治疗的有效剂量并对此开出处方。
本发明的另一个实施例提供包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的抗生素。
本文中的术语“抗生素”意指以药物形式投给动物(包含人类)、展现出杀死细菌的功效的制剂，并且用作防腐剂、杀菌剂以及抗细菌剂的统称。
此实施例的包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的抗生素具有以下效果：与典型抗生素相比，所述抗生素具有针对禽致病性大肠杆菌的特异性，且因此不杀死有益细菌，而是杀死特异性致病菌；并且所述抗生素不引发抗药性，与典型抗生素相比使产品的寿命延长。
本发明的再一个实施例提供一种用于禽饲料或禽饮用水的添加剂，所述添加剂包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分。
作为施用所述禽饲料添加剂或禽饮用水添加剂的对象的鸟类并无特别限制，但是此实施例中的鸟类特别指家禽。
在本文中，家禽是家畜中属于鸟类的动物的通称。家禽并无特别限制，且可以包括选自鸡、鹅、火鸡等组成的群组的至少一种。
所述禽饲料添加剂或禽饮用水添加剂可通过使用噬菌体ΦCJ24或包含其的组合物单独制备饲料添加剂或禽饮用水添加剂并且将添加剂与饲料或饮用水混合的方式使用、或通过在制备饲料或饮用水的过程中直接添加噬菌体ΦCJ24或包含其的组合物的方式使用。
根据此实施例的以饲料添加剂或饮用水添加剂形式使用的噬菌体ΦCJ24或包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的组合物可以呈液态或干燥状态，例如呈干燥粉末形式。
举例来说，以饲料添加剂的重量计，根据本发明的噬菌体ΦCJ24以0.05至10重量％、具体来说0.1至2重量％的量以粉末形式混合。
用于干燥根据此实施例的饲料添加剂或饮用水添加剂以产生干燥粉末的方法并无特别限制，而是可利用相关领域中常用的任何方法。干燥方法的实例可包含风干法、自然干燥法、喷雾干燥法和冰冻干燥法，但并不仅限于此。这些方法可以单独使用或以其2种以上组合形式使用。
根据此实施例的饲料添加剂或饮用水添加剂还可包含其它非致病性微生物。所述微生物可以从由以下组成的群组中选出：能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖转化酶的芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；在例如牛胃的厌氧条件下具有生理活性和有机物质降解能力的乳酸菌，例如乳杆菌属(Lactobacillus sp.)；具有增加动物重量、增加产奶量以及增加饲料消化吸收率的效果的霉菌，例如米曲霉菌(Aspergillus oryzae)；以及酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。这些微生物可以单独使用或以其2种以上组合形式使用。
根据此实施例的包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂还可视需要包含其它添加剂。可用的添加剂的实例可包含粘合剂、乳化剂和防腐剂，其是为了防止饲料或饮用水的质量劣化而添加；氨基酸、维生素、酶、有益细菌、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取剂或寡醣，其是为了增加饲料或饮用水的效用而添加；以及其它饲料补充剂等。这些添加剂可以单独使用或以其2种以上组合形式使用。
以饲料的100重量份计，根据本发明的饲料添加剂可以0.05到10重量份、具体来说0.1到2重量份的量存在。以饮用水的100重量份计，根据本发明的饮用水添加剂可以0.0001到0.01重量份、具体来说0.001到0.005重量份的量存在。在这些范围内，所述添加剂使得针对禽致病性大肠杆菌的噬菌体ΦCJ24的活性得以充分展现。
本发明的又一个实施例提供通过向饲料或饮用水中添加包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂或向其中直接添加噬菌体ΦCJ24所制备的饲料或饮用水。
此实施例中使用的饲料并无特别限制，而是可利用相关领域中常用的任何饲料。饲料的实例可包括植物饲料，例如谷物、根用蔬菜、食品加工副产品、藻类、纤维、药物副产品、油脂、淀粉、谷物残渣或副产品等；以及动物饲料，例如蛋白质、无机物质、油脂、矿物质、单细胞蛋白、以及浮游动物或动物性食物。这些饲料可以单独使用或以其2种以上组合形式使用。
用于此实施例的饮用水并无特别限制，而是可利用相关领域中常用的任何饮用水。
本发明的又一个实施例提供包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的消毒剂或清洁剂。消毒剂或清洁剂的剂型并无特别限制，而是可利用相关领域中常用的任何剂型。
为了去除禽致病性大肠杆菌，可以将消毒剂喷雾于鸟类的栖息地、屠宰场、死亡区域、厨房和烹饪设备等，但并不仅限于此。
清洁剂可以用于清洗暴露或可能暴露于禽致病性大肠杆菌的鸟类的皮肤或身体部位的表面，但并不限于此。
本发明的另一个实施例提供一种使用噬菌体ΦCJ24或包含其作为活性成分的组合物来预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法。
具体来说，此实施例的预防方法或治疗方法包括向暴露或可能暴露于禽致病性大肠杆菌的鸟类投予医药学上有效量的噬菌体ΦCJ24或包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的组合物。对所属领域的技术人员显而易见的是，噬菌体ΦCJ24或包含其作为活性成分的组合物的适宜总日剂量可由医师在合理医学判断的范围内确定。
对于某些鸟类来说，噬菌体ΦCJ24或包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的组合物的具体医药学有效剂量可通过考虑到要实现的反应的种类和程度、对应个体的年龄、体重、一般健康状况、性别或饮食、噬菌体ΦCJ24或包含其的组合物的投药时间和投药途径、组合物的分泌速率、治疗周期等来确定，且可根据医学领域中现有的各种因素以及类似因素而不同，包括同时或在不同时间使用的药物的成分。
噬菌体ΦCJ24或包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的组合物可通过鼻喷雾以医药制剂形式投予鸟类，或直接添加到禽饲料或饮用水中以便被吸收，且可以饲料添加剂或饮用水添加剂形式与饲料或饮用水混合并且随后投予。
噬菌体ΦCJ24或包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的组合物的投药途径和投药方法并无特别限制，而是可以通过任何途径和方法实现，只要投药使噬菌体ΦCJ24或包含其的组合物能够到达预期组织即可。即，噬菌体ΦCJ24或包含噬菌体ΦCJ24作为活性成分的组合物可以通过各种口服或非经肠途径投予，且投药的实例可以包括经口、经直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、经皮、鼻内及吸入，但并不仅限于此。
在下文中，将参照优选实例更详细阐述本发明。应理解，这些实例不应被理解为以任何方式限制本发明。
[实例1]-分离感染禽致病性大肠杆菌的噬菌体
<实例1-1>
噬菌体的筛选和单一噬菌体的分离
将从一家位于忠清道清原郡的家禽农场附近收集的鸡粪便获得的50ml样品在4,000rpm下离心10分钟，且通过0.45μm过滤器过滤所得的上清液以制备样品液，随后使用所制备的样品液进行软琼脂覆盖法(soft agar overlay)。软琼脂覆盖法指使用在顶部琼脂(使用0.7％琼脂附着到固体培养基上)中生长的宿主细胞来观察噬菌体溶解的方法。
具体来说，将150μl从韩国建国大学兽医系获得的禽致病性大肠杆菌(E10-4)的振荡培养溶液(OD600＝2)和2ml 10×LB培养基(10g/l的色氨酸(tryptone)；5g/l的酵母提取液；10g/l的NaCl)与18ml经过滤的样品液混合，随后在30℃下培养18小时，并将所得的培养液在4,000rpm下离心10分钟，且通过0.45μm过滤器过滤所得的上清液。随后，将由3ml0.7％(w/v)琼脂和150μl禽致病性大肠杆菌(E10-4)的振荡培养溶液(OD600＝2)组成的混合溶液倾倒于LB培养基平板中并固化，将10μl样品液滴在上面，接着在30℃下培养18小时，由此证实噬菌斑形成。
由于已知每一噬菌斑中存在一种噬菌体，所以本发明人尝试从所形成的噬菌斑中分离单一噬菌体。具体来说，向噬菌斑中添加400μl SM溶液(NaCl5.8g/l；MgSO47H2O22g/l；1M Tris-HCl(pH 7.5)50ml)并且在室温下放置4小时，由此获得噬菌体溶液。
随后，将100μl噬菌体溶液与12ml0.7％(w/v)琼脂和500μl禽致病性大肠杆菌(E10-4)的振荡培养溶液(OD600＝2)混合，将其用于使用直径为150mm的LB培养基平板实施软琼脂覆盖法，进行培养，直到噬菌体完全溶解。培养完成后，向LB培养基平板中添加15mlSM溶液并在室温下放置4小时，由此获得噬菌体溶液。
向所获得的溶液中，添加1％(v/v)的氯仿并混合10分钟，接着在4,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液，将上清液通过0.45μm过滤器过滤，由此获得最终样品。
<实例1-2>
噬菌体的大规模培养和纯化
使用禽致病性大肠杆菌(E10-4)大规模培养在实例1-1中获得的噬菌体，并且随后从其中纯化噬菌体。
具体来说，将禽致病性大肠杆菌(E10-4)振荡培养，并以1.0×1010cfu接种，随后于4,000rpm下离心10分钟，并重悬浮于4ml SM溶液中。为此，以MOI(感染复数)＝0.0001以1.0×106pfu向其中添加噬菌体，接着在室温下放置20分钟。
此后，用其对150ml LB培养基进行接种，并在30℃下培养6小时。培养完成后，向最终体积的1％(v/v)的体积添加氯仿，随后搅拌20分钟，向其中分别以1μg/ml的最终浓度添加作为限制酶的DNase I和RNase A，并在30℃下放置30分钟。随后，添加氯化钠和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，分别至1M和10％(w/v)的最终浓度，且在4℃下放置3小时，随后在4℃和12,000rpm下离心20分钟，由此获得沉淀物。
将获得的沉淀物悬浮于5ml SM溶液中，且随后在室温下放置20分钟，边搅拌边向其中添加4ml氯仿，随后于4℃和4,000rpm下离心20分钟，由此获得上清液。通过0.45μm过滤器过滤上清液，随后使用甘油密度梯度法(密度：40％，5％甘油)进行超速离心(35,000rpm，1小时，4℃)，由此纯化噬菌体。
本发明人从农场鸡粪便收集的样品中分离出具有杀死禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenic E.coli，APEC)的特异性能力的噬菌体，所述噬菌体被称为“噬菌体ΦCJ24”并且在2013年10月25日以保藏编号KCCM11462P保藏在韩国微生物培养中心(Korean CultureCenter of Microorganisms，韩国首尔西大门区弘济1洞361-221)。
<实例2>
ΦCJ24的形态学观察
将实例1中经纯化的噬菌体ΦCJ24稀释在0.01％明胶溶液中并且随后用2.5％戊二醛(glutaraldehyde)溶液固定。将所得的噬菌体滴加在经碳涂覆的云母板(carbon-coated mica plate(约2.5mm×2.5mm)上，使其适应10分钟，然后用蒸馏水洗涤。
随后，将碳膜(carbon film)安放在铜网(copper grid)上，用4％乙酸双氧铀(uranyl acetate)染色60秒、干燥并使用透射电子显微镜(JEM-1011，80kV，放大倍率为×200,000)进行检查(图1)。
图1是噬菌体ΦCJ24的透射电子显微图像，其中噬菌体ΦCJ24的形态学特征为具有长不可收缩尾部(long non-contractile tail)的二十面体衣壳(isometric capsid)，表明所述噬菌体属于B1形态型(morphotype)长尾噬菌体科(Siphoviridae)。
<实例3>
ΦCJ24的总基因组DNA尺寸分析
从实例1中经纯化的噬菌体ΦCJ24提取基因组DNA。
具体来说，向纯化的噬菌体ΦCJ24的培养液中添加20mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50μg/ml蛋白酶(proteinase)K和0.5％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)，并在50℃下放置1小时，边搅拌边向其中添加等量的苯酚(pH 8.0)，接着在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。
将上清液与相等量的PC(苯酚∶氯仿＝1∶1)混合，随后在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。将上清液与等量的氯仿混合，随后在室温和12,000rpm下离心10分钟，由此获得上清液。将上清液与以总体积计10％(v/v)的3M乙酸钠(sodium acetate)混合，随后添加2体积的95％冷乙醇，混合，并在-20℃下放置1小时。
随后，将所得的物质在0℃和12,000rpm下离心10分钟，去除上清液而获得沉淀物，将沉淀物溶解于50μl TE缓冲液(Tris-EDTA，pH 8.0)中。将所提取的DNA稀释10倍，然后通过测量在OD260下的吸光度来确定DNA的浓度。
接着，将1μg DNA装载于1％PFGE(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶上，并且使用伯瑞(BIORAD)PFGE系统程序7(尺寸范围：25kb至100kb；切换时间斜坡(switch time ramp)0.4秒至2.0秒，线性形状(linear shape)；正向电压(forward voltage)180V；反向电压(reverse voltage)120V)在室温下进行电泳20小时(图2)。
图2是噬菌体ΦCJ24的基因组DNA的电泳凝胶照片，且可以看出噬菌体ΦCJ24的基因组DNA的尺寸约为53kbp。
<实例4>
ΦCJ24的蛋白质图谱分析
将15μl经纯化的1011pfu/ml效价(titer)的噬菌体ΦCJ24溶液与3μl5×SDS样品溶液混合，然后沸腾5分钟以进行12％SDS-PAGE(图3)。
图3是对噬菌体ΦCJ24进行SDS-PAGE的结果的电泳照片，且可以看出主要蛋白质的尺寸为约10.3kDa、12.5kDa、15.1kDa、43kDa、49.3kDa、60.4kDa以及94.9kDa。
<实例5>
ΦCJ24的遗传特性分析
为了确认实例1中经纯化的噬菌体ΦCJ24的遗传特性，使用FLX钛测序器(titanium sequencer)(罗氏公司)作为基因分析装置来分析噬菌体ΦCJ24的DNA。基因由(株)千年基因公司(Macrogen Inc.)使用GS和从头组装软件(de novo assemblersoftware)(罗氏公司)重组。使用GeneMArk.hmm，Glimmer v3.02和FGENESB软件识别开放阅读框(open reading frame)。使用BLASTP和蛋白质扫描(InterProScan)程序注释(annotation)开放阅读框。
核苷酸序列与先前报导的噬菌体(大肠杆菌噬菌体phiEB49，大肠杆菌噬菌体KBN21)的核苷酸序列具有相似性，但是可以看出并不存在所有片段100％一致的噬菌体。因此，可以看出所述噬菌体是新分离的噬菌体。
下表1示出噬菌体ΦCJ24的核苷酸序列与所述领域中先前报导的噬菌体的解码核苷酸序列之间的比较结果。
表1
[表1]
使用测序器分析所制备的噬菌体ΦCJ24的DNA，分析所得的核苷酸序列的部分结果在序列编号1和2中列出。
<实例6>
ΦCJ24的pH稳定性
为了确认噬菌体ΦCJ24是否能够在像胃部条件的低pH下维持稳定性，在各种pH(pH 2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0以及11.0)下检测稳定性。
关于所述实验，制备0.2M浓度的各种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH 4.0、pH 4.5、pH5.0、pH 5.5)、柠檬酸钠缓冲液(pH 2.5、pH 3.0和pH 3.5)、磷酸钠缓冲剂(pH 6.5和pH7.0)以及Tris-HCl溶液(pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0以及pH 11.0))。
将180μl的每一种pH溶液与20μl的具有2.0×1011PFU/ml效价的噬菌体溶液混合，使得每一pH溶液的浓度为1M，然后将所得的溶液在室温下放置2小时。对于控制组，通过相同的方法将20μl的具有2.0×1011PFU/ml效价的噬菌体溶液与180μl SM溶液混合，并将所得的溶液在室温下放置2小时。之后，连续稀释溶液，并将10μl每一稀释步骤中的每一溶液通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，以基于噬菌体是否溶解来确定噬菌体效价(图4)。
图4示出了噬菌体ΦCJ24的耐酸性的实验结果。在图4中，可以看出与控制组相比，噬菌体ΦCJ24在pH 3.5到pH 11.0下并未丧失其活性并且保持稳定性。
<实例7>
噬菌体ΦCJ24的热稳定性
如果将噬菌体配制成各种噬菌体剂型的饲料添加剂，在配制过程中可能产生热，且因此，进行以下实验来确认噬菌体的热稳定性。
具体来说，将100μl 1.65×1011PFU/ml的噬菌体ΦCJ24溶液分别在37℃、45℃、53℃和60℃下放置10分钟、30分钟、60分钟以及120分钟。接着，连续稀释所得到的实验培养溶液，将10μl每一稀释步骤中的每一溶液通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，以基于噬菌体是否溶解来确定噬菌体效价(图5)。
图5示出了噬菌体ΦCJ24的耐热性的实验结果。如图5中所示，可以看出直到噬菌体ΦCJ24暴露在53℃下120分钟时才显示出约1对数(log)或更小的活性丧失，并且当暴露在60℃下时随时间过去观察到活性降低。
<实例8>
噬菌体ΦCJ24的耐干燥稳定性
如果将噬菌体ΦCJ24配制成各种噬菌体剂型的饲料添加剂，在配制过程中可对噬菌体进行干燥，因此进行以下试验来确认噬菌体抵抗干燥条件的稳定性。
基于来自耐热实验的结果，干燥实验使用浓缩器(Speed Vac concentrator)进行。将200μl2.5×1010PFU/ml的噬菌体ΦCJ24溶液在60℃和真空下干燥2小时，并将所获得的丸粒(pellet)置于200μl SM溶液中，随后在4℃下完全重悬浮一天，由此测量效价(图6)。
如图6中所示，可以看出在干燥后，与初始效价和相对稳定性相比，当噬菌体在60℃下干燥2小时后，显示出约1对数(log)的活性丧失。
<实例9>
检测噬菌体ΦCJ24对禽致病性大肠杆菌野生型分离菌株的感染范围
除本实验中使用的禽致病性大肠杆菌(E10-4)外，对由韩国建国大学的兽医学院分离的46株野生型禽致病性大肠杆菌、由韩国动植物检验局分离的10株禽致病性大肠杆菌、由韩国全北国立大学的兽医学院分离的7株禽致病性大肠杆菌以及由科微范分离的26株经疾病诊断的禽致病性大肠杆菌进行噬菌体ΦCJ24溶解活性测试。
具体来说，将150μl每一菌株的振荡培养溶液(OD600＝2)混合，向其中滴加10μl具有109pfu/ml效价的噬菌体ΦCJ24溶液，并且通过软琼脂覆盖法在30℃下培养18小时，接着检测噬菌斑的形成(表2)。
结果在表2中示出。
表2
[表2]
如表2中所示，噬菌体ΦCJ24展现出对禽致病性大肠杆菌(包括O-1、O-78血清型)的感染能力，后者是普通家禽农场中禽大肠杆菌病的主要致病菌。
已知O-78血清型一般来说是从家禽农场中分离的禽致病性大肠杆菌中最主要的菌株。
自由文本
附上序列表提交。
<110> CJ 第一制糖株式会社
<120> 新颖噬菌体和包括其的组合物
<130> P14-5113
<150> KR 10-2014-0044994
<151> 2014-04-15
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 50547
<212> DNA
<213> 新颖噬菌体CJ24的DNA部分
<400> 1
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cgcaaacttt ttctacgccg tgagacttaa tgccggagtg cacgttatcg ccatagtcac 6240
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caaaggccgc agtgatgcgg tgcaatccaa tgtagcgcaa aaattcttcc ttgataatcg 6360
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ttcggagttt ctgccgagat ggtgtcagtt acgactttgt gaccatcaac aacctttccg 47520
gtagggtcga gggcgactac cacgccagcc ttaatttctt tagccgctgc acaagcgcca 47580
tcaacgttgt agagagaagt gtcagccagc aggcctgcat atgcttttga acggttaacc 47640
gtataagatg ctttgattag tgccatgata tttttccttt ttcacttaga tactaagcgg 47700
cctttagacc gccattttat tacttacgga agcgagcctg tggatcagga atcgcgtcat 47760
tatctttgtc gccctgagcg ccgtcggctt tgtcgccgtg cactttaatg cgttgagcag 47820
ccatcttatc agaatcgcgc gcgatttcat aagactgatt gatgtatgcg tcggattttt 47880
ctttagcgtc aatgccgaga acttcgtcaa taactgccag cttgatagct ttctcatcca 47940
ggccgtcgca cttgatgcca aggccggaag cgaaagtgag aacagcgccc agcgcgtcag 48000
ctttttcttt tgcatctgcc agagcggctt caatctgtgc cggaatgccg tcaacctttg 48060
cttgcagcgc gtcgcgctca gcttgcaggc catcgacttt agcgccagct tgttctgctg 48120
cgttttgcag tttgccgatg tggtcagcta cgtctttgga cacttccact tctgcggaat 48180
caattttgat ttttacggtc atgttacttt cctcattggt taattgaaca tgctcatcat 48240
atttaatttc ttctgagccg tcaaggttta atctggcaat acctgcgcgc cctttactca 48300
ctagcgctac gtgattaacc cttattttag tttgtaggac atcaaactca acccagtcat 48360
ctggaatggt tatgtcaggc tccatatcct ctttaagaat atattgacct gaaacattcg 48420
atccccaacc ctccttatga atctcaataa ccgtataacc tactgacaac tcccttgcct 48480
caccgctctc agctgcagca atcgcagcag agtccattat agtgatcggg cacatcacct 48540
tcccctcgct tctgtcagcg aaagcctctc cggagcagtt gccaacaaca acatcttttg 48600
cattatctgg cgttaccgtt acgtgaccaa gcgtgacagg ctttcctctg tagctagcca 48660
gtgaaacgaa atcaaaaact tcactttctg gcctaaattc cctctgaatt gccccgtcag 48720
ctagcgtgta ctcctgcaaa ccgacccttg caaccactgg tacgtcaaca agaaatccat 48780
tttcatcctt tttcgccttg aataataggt aatcaaatct ttgctttgcc ttcatacact 48840
aaccctctcc aaatccagtt aatttaaaca tcccaatttt cctcattaat catgatattt 48900
ccccatttgc tgttgtgaag tccggaactg cccaacaacg gcatccgtaa ggttccccag 48960
ggaaagggtg atcacttgag atctcaatac gtttaccttc ccattttacg tgctgcaatc 49020
gctcgcgctc gtccagttta ccatgccaga aatagtgagt tactccagca tcatccaggc 49080
gctggcgcat cagtacgctg ttccatgtgg acacgattcc acgtgagcga ttcacggtcc 49140
agccagtata caccttgtag cgctgcttta aaacttcatc aatctgctga ctggttttat 49200
tgcgcacgtt ttcgacgcgt aggttttgcg accagtcaga gatgatgtcg ttcgatagct 49260
ttagaatact cacctcagcc gaaccgcgcc attgcgatga cttctcgcga taccatgact 49320
cattggtatt cgccccaagc gcgccaagca agatcacaga ctgatttttt ccgccaccag 49380
cctttttcgc cacgttgagg aattgccttg agttaaactt gtagatagtc agagccagcg 49440
ccggaagtgt ggcaacaatc gccgcgataa gtcctgctgc gtattcctca agctcacttt 49500
ctgcatcatt gatttcttcg tccgaagcgt caaacctcat tcctcccgta agcgatctgg 49560
ctttctttgc catctcgcct gcgaaggttg acaatgagcg gctaagctgc cgctcgcttg 49620
cttcgggata actccattga tttacaatgc cgttaacctt catgatcatt cctcgttgct 49680
cacctgcggg ttaattggtt cgacttcaag ctcaggcgct ggtccttgaa tcttgataaa 49740
gtctgcgatc gcctcaagtg tatcacgcgc ctcatcgcgg tcaataatct gatccgcaat 49800
cagctttgag attgactcaa cgttattctt caaagtctcg gattgctctt tctcgcttgg 49860
cattgatagc ggctcaaagc ggattgacca ttcatcttcc tgaataatca taggaaccag 49920
ccactcaaga agaggcctgt aatactcgtt acgcttgcga tcaatcatct tatagaaagt 49980
ctcaagcgcc gtattctggc tcgctgacac gcctcctacg ttcttattct tgaggataat 50040
ctcatgaatc tgtgagtagt tcacgatgcg gtccatcttc ttatcaagga aagcatcaac 50100
gccgccaatg tcagagttaa gaacgtcgta ttcttcgtcg gttgcatcaa tgccgatcgt 50160
ccggcctacg ccgctattgt catcaacctg cgctaatcgc agtcgcgccg cgtaacgccc 50220
ttcgtcatcg tcgcacaaat ccgccagacc tttagctttc catacgcctt gctgcttacg 50280
gcgcaatagc tgagtcgcca gttcctcaca gtagttgtag tcaagaatgg catcaatcaa 50340
gcccttactc agtacagatg ctccccaatc gttattctgc gcgcgaagtg agccagggac 50400
acgctcgcct ccgttaacat agattcgcgt gtagtgaacg tcgtattccg gtacgctgcc 50460
gccagggtta atggtgtaaa tcttcggcat accatagcga gggttgcgtg cgttcttctc 50520
gcggtccttg atgcggatct gctcttt 50547
<210> 2
<211> 8358
<212> DNA
<213> 穝縪窘颠蔨CJ24DNA场だ
<400> 2
caccattggc agcgtatcta gaatagcact tccggcaact ggattttaac tcgttacacc 60
ccaaatctgg taggggcgtc cagcaagtct catctggtac ttacgccgtc gtatggttac 120
gacttacccc cataatcttt ctaattcaaa gtagcactgc tccatgtttg gcctttgaac 180
tccgggatcg gattagtgca atgctacttt gaattggtta ccagtgaggg attcgaaccc 240
ccggttggag tctatagctt accgcagcag ctctccaatc tagcggtgtc acacttagtc 300
caaacttgaa catatcaagc catctcgtgc aactgataat tggttccggc gtctggactc 360
gaaccagaac acttatgccg tgcacgacac tagtacctac accggaatta attgccaggg 420
attccacctg gctccatctg ctttttatag tcactcagat atcgtctgga ctgtaggcat 480
gggtgggaat cgaacccaca aaccattcag cactgtagcc tcacgctcta cctatttgag 540
ctatcacaca ccattgatta actccccgtt tctaatacac ggacgaggac actccatggt 600
cgtttgataa tcaggacgac tcactcccga ctgacgcttg gcttattagg ctgccatcag 660
aacaacatca tcgtttgcat ttatgttatt ggttcgtttc taaaaaaccg cataatcgct 720
tacgaaaact atcaaagagt acactaagca caggtagcta ccctgccgtc ttctccacct 780
acaccagcta tagtgtaaac ctccgcacgt tagcttaatg tactcattga taggatgtca 840
gtaggtcggg ggctggattc gaaccagcga gagaagtagc gaccatctgc acatgcctac 900
gtgctacctc gaccattata ataggaggga ggggacgagt cctcccttta taccctatat 960
tgcatgtaag acctaacaat tcgatgctgt aggtagctat gctatccgac atttaaccca 1020
gcccatatag gggcttatgt gattaaaatg ctcaacattg agaggttagt ttgataaggg 1080
atctgaagcc ttatcccaaa gatactaacc tttgggatat agcctatcat tcagaaatgg 1140
cccctatagg gagaggccat tgattaaccc gaatgttgct ttacattttc tgtgataacc 1200
cattcttaaa atagtctacc tgacggatgg gcataaaccc tagcgtcagt gccatacggc 1260
aaagattaag ataagaaagg ttatgatagg agttcctatc tcaaaggatt ctaacagaac 1320
ccttcacgat attaactact cttttttaat gcttctactt caccttcttt ataccaagca 1380
tacggtacta agattttgca tccttccgat tcaatgtgaa atgctttctt tccttcaacg 1440
ggttctccac ccatgaaaga actaaccttt ccattgagcc agtgaatagt aaatttgttc 1500
atattagcct cagttgaacc aatgcacagg ggagagtatt cctgcacact ggttcggttg 1560
ttgttactct ggcggcttgt caccaccgtg tttaccactg catttccaca ggataatgac 1620
agtgatgata aaagctatgt atggagccga cacgtctata atcctgacca gtagtagcat 1680
caggactata aacactacca cacctagcag cagcttctga gccacctacc agattaacta 1740
cgtttaaggc cagcgaacag tgaaggctta gtagcaggtt tctctgctgg ttcttcagcc 1800
ttagcctctt cctgcacaac ttcttcttgt gcttctggtt cagatactgc ttcttcttca 1860
ggttccggcg tagaactctc gttctgacca ccagtagagg tctgggtttc ttctaccttt 1920
acctcttcaa ctacttcttc cggctctggt tctaccggac gatgtttagc ttcctgtggg 1980
ttcttacgag aacgacgagt tttcttctct actcccacgg gtggagtatc ttcatgaacc 2040
tcttcgttga taccaacgga agctgtaccg tctgcattga tgacaatatt gatgtcacca 2100
gcaagattga tttgatcatc gacataagcc tgtacagcag cttctacttc ggactggttc 2160
agaatgattt gcatgttatg cctttattaa attaaggagg ttttggaaag ctgggagatt 2220
tacaccagca tggattgcac cgattgcatc agctaagtgc tcattcttat tcagaagttt 2280
gcccttctta tctgtgagcc agttggcttc aggatagatg gcatgagcag cacgaatcat 2340
cgtgtcctta gatgcagttt tatcaccgac cagtgcaagt ttgttttcaa ttggggatac 2400
ttcaaagatt ggacaaccca atgcacgaaa tgcacctatt aatcctacgc atacgccata 2460
ggatttcata ccgttagcag actgagagcc tactggtact tctacgaata ctgctttagc 2520
agaccgtaac cattcctcac aaccaagaaa caaatcgtga gcggcttgta tatctttgga 2580
gttggttcga acttgtttgt tgtggtcaac ttcagtttga accagtttaa gttcgacctg 2640
ctcgaagacg ccggactcaa tgtccagcat cccacgagct aaaaccccaa ttgcggagac 2700
taatgtctgc accgacaatt gggattttca ttaacgttta ccaaacagtg atttaccacc 2760
agcaggagca gtacccgtgc cagcacctgc acctggtttt aggaggcaag ccacctttac 2820
cattaccacc agcagaactc ttagtcttgt cacgagtttt gcctttgttc ttttccagcc 2880
atgctgcata gaatacagcc agttctgggg ttagttcttt ttcagccttc tctgcttcct 2940
gagcctcgac gactgtgacc agcagttccg ggtgaaacac tttctgaatc tcgtttactt 3000
cacgagtttc gtcagagtct acataaccgt tgtcgccttt aacctgcttg ttttccagaa 3060
ctttttccag agcgaaggta acagtctggc ctaccaggtc aactggaacc atgacagatt 3120
tattaacttc tgctttagcg tcgtagtcgt agactttaac aatcttctct tcgaagtctg 3180
cttcaggcag ttcagtacca gtagccatca gcatcatgtc gttaatgaca gtgtagccag 3240
gcaggaagta ctctttacca tttttctcgt aagtcggctt gttgccttta gcattaccag 3300
aagtgaagta cacctgagca cggaactcgc cagcaggcac gccatcagag tttttcaggt 3360
cttcaataat taactgtatc cagtctgcac cagaatcagc tttgcctacg taagctactt 3420
ttacagtatc ggtgtagata tcggtttctt ttgcaccgaa gccaccgcca cccagagagt 3480
ctttagcagc ttcaacgttt ttggtttttt ctttcagatt actgaacaat gacatatgat 3540
tttcctaata agtgattaac aaccagacaa acgcttaagc gtagtattca gccaggtggt 3600
ctaagagttt ctgggcatcg ttatcaatgt aagtctcgga cttatcgaac atacccatag 3660
gagaacgaag tcgtttacca acagacttct tggttggacg ggtctggaat acatgtttat 3720
agcctaaatc acgttcttcc tccgtaattt caagcatctt gtttccatac ttctccagtt 3780
ctttaatgtc tacacgttct gcgtaaacca ctgtagagaa gtaggcttca agcccgttat 3840
tcttcagaga gcctttcact gggatgaacg ttttcatcac accagcagct tcatccagtt 3900
cgtctttagc atgagcagta atgattactg gcttaccaaa cttaacgact ttttgttgca 3960
gcagtatctt aaagaactgt gcaaaatccc cccatgcctt ttgcgtgttt gcagaaggca 4020
gaacatactg ggattccagc atatccatca taaaagttgc tgagtcaatg atgataccat 4080
caacatcatc tgccatttct ccaccagaag atgcaacatc aaatgcttcc cagatttggt 4140
atgggtcttc gatgttgtag gtattgaact tgttacggaa aggtagacgt ttacctgcct 4200
cagtgttcag atagagccag cgttcctggt tcctgatgtt acgcagtgat gctgatttac 4260
cactcgctga gaatcctgca atcaggatta gctgagtgtt catatcattg ggaattactt 4320
cggacattat ttttcctcat ttaatttagg agtccttcaa accaaagaaa gactcctgtt 4380
tgcttatttg ccagcgaagc gtttagccac ggtgaccatt acggttgcat tcaattcatc 4440
atctggtaat ggattagcca gtttcttatt gaatgagtgg acggcttgct gtacttgggc 4500
aaaatcccaa ccactgtcaa ccaatgccag tgcgtactta atcatttgat tattacgatt 4560
accggtagca atacgactag cgaaccaacg ctccagatta tccaacgact gtacttcctt 4620
catctggttc tggaactgct cgttcttact agtacgagga ataaagtcac gcacgtccaa 4680
cagatttgct tcaagattgt aatgatagga accagtctca caggacatcc atttcttggc 4740
tcgctggtta gcagattcat ccgtttcgaa cggtagccaa gacataacgt tattcataaa 4800
ctctttgtat tcctcagtgt cgaggtgtaa ctcatagttc attggaataa tcagtcggaa 4860
gcggttctct tcatcagaat gacgtttagt ggtataggtc atgaacttat attccttcat 4920
cagttcatgg cacgtatgca gtggtactcc accatcacag tcaataacaa tcatgttaaa 4980
tcctggaata acgttctctt cggaacgatg cccgttcttc atgtgatggt ttacccagtg 5040
cataccggga gcttgggtta atacatgcaa ctggtcgaac ggtacacgtt caccaatgta 5100
gtcataagca aagctatcac tataggccac tatcatctca ttgatgtcag tctctttcag 5160
agtctctcca cggaagaact caataccttc attaaaagtt ttcttaatga tgatgtgctg 5220
tttgtatccc catgctgtag caagagtcat catctcatta cgagctgcat tgccactctt 5280
atagaacggc aacgactcca gtaagtcagc atgagtcact tctttaccta cagaagcgat 5340
atacttagcc agcttcacat aggctttctc acgattgaga ataccctgga atgctgcccc 5400
ggattcttct acaagcaaga ttgcttgttt aagatgagac atttcaatga atgaactttg 5460
gtcaacaaat gccagtgctc cagccagctt aagagcttta aagtaacggt gggagatttc 5520
agccttacga atttcttcgt ggtcagccat agcttctgct tgtttctcac aatcgatctt 5580
gtaagtaatc agagcaatac ccacagcatc ttctacaacc atcttaaagc cgaacaagtt 5640
tggatcagcc agactgtgga agtgattagc ccacttaccc agagactgta cgttatcctg 5700
cttaatcagg ttacggtaga tttcttctgg ggacattgtt gcatgtgctc gtttatctaa 5760
atgcccaatg gcaaataagc aacgacgtgc ataccctgta tccagaaagt catagaactg 5820
gtcttcggtc tgaccaccat ctagtagctt acttggcgtg ccaaacagca acaggttagc 5880
tggagtctta ccatccagtt cttcaccacg aacactttca gcagtgttct tggttaactt 5940
ctgtttaacc ttaccctggt catataattc caggaacaga gttaatacat ccgtgttagc 6000
caacaggttt gaaccaattt catcaatctg taggttgatt gaaccacacc cagccattaa 6060
cagcttatgt cgtagctgtt taactgctgg tggagtacca gagtcaaacg taaacggata 6120
tgctccagca cgtttatact ctgcttcgac tttatcaaac tcatcattct ggtctgtacc 6180
ttgtcgagca gcacgttcgt tagcaatctt ccataaacgg tcatttgcaa tgacgggcat 6240
ggtgtcttcc ataaaacgtt tacggaagcc agtcatgaag ccgtcttcaa taatatttac 6300
cgagtgacct ttaccgaagc cagacgttgc taatgccata gcgtaaatgt tgactggtaa 6360
gtcaccacgg tctttagtga caatggttgc acccatgcag gatgccattt tagccaggaa 6420
gtaggctact tcgacacgga agaatcctct gtcgttgttt tgtgtcttgt tacacagcac 6480
gtctacaatt tcttcaattg cagggtggtg agtgactccg gtcaggtcaa tactcatgat 6540
ggaaaatatc tctctctttg tttgcaaatg gacgcgacag ggcagtatag acaacgctta 6600
acctgcccct ccacgacctt gatagcaccc ttgccacctt tttcagccat gaagatacga 6660
gcagatgcca tatcgtcaaa ttttttggta cttctggctc caggtacatc taccttagaa 6720
gcatcagaga agtatttgaa ctgtggctct gttcgccaca actcctcatc agtacattca 6780
ggaatttcct cttcaggtgc attccagtac ttttcaatga ggtgaatctt ctcttctacc 6840
caacgttcag ttttctcgac agatagcaac ggaatatcct tatgcataat acgattagca 6900
ggatagttcg gattgctatt agccatgtgt ttcatgaagt cagtgaagat gtagttaata 6960
cggattacat cttcggtaat gatgtcgttg tgaatccaac gatacaagct gccttgcatc 7020
ttatgttcat catcacggga accagcaacc caggaatagg ttgaggtaga cttaaagtcc 7080
tgcaacagac cttctgttac gatgtcgaac ttaccaccga tagtccaacc cttaactatc 7140
ctggttccac gctgttcaac gtagattggg ataaggtcag ggttagcatc aaagtctgct 7200
ttggttgggt taatgactac tgcatcaatt actcgttgag gataacccaa ctttttcaat 7260
gcagtcttat gacccagctt ccaggccttc tcgatagaat catgtaaacc agtacccatt 7320
gatgtggaga cgaaatccat aacatcaatt gactggtcac taagatctac acgatgcttc 7380
atgactattt gcttaatggg cttaagcaag gtagtaacag acagatactt aggattgtct 7440
acataatcat aatcatccgt tacaagccat acagctagtg caagactaac gtcgtgtttg 7500
ttggtaagtt tcataacagt cccaattgct tattagtttt agcaaactca ccataatgag 7560
ttatagcagc ttcatcatag agaacagcag cttctcttgg gtcatctgta aaacctaatg 7620
taattggttt actgttaacc caaatagttg ctctgtattt acctaaattc tttgaaaagg 7680
ataccccctt aaatccagat gtgtttgttt tagataaaac agcactctgg ttattctgct 7740
tgtgggtcgc ttctctgagg ttatctatcc agttgtgatg gcgaatattg tccttatggt 7800
caattctatc cgtaggccat acaccgtgca catagaacca tgcaaggata tgcccatagt 7860
acaacacact atccacacgg agttgaacgt aaccactctt cattaggtaa ccagatacct 7920
ttccggtatt cctacgagta aaaatcccgg aaatagggtc ataactaaca agctgtaaaa 7980
gcctgtcatg ggcaatcctc tgtttcataa ttagttactc gtcatgcaat agccatacag 8040
ccagagccag tgagacatca tgattgttgg ttatcttcat tagtaagtaa tcctgtatct 8100
gtgaacccag ttccacttaa tttcacttag ctgattgaag ttatacgagc aaatttcatc 8160
tcgtttatct ttataaacaa tctcaatgaa tgaaaattct ttagtgaaat gaggtttacc 8220
attgtttgta tggtgccaat aactaccaac ggtatttaca ttcgtagcag gatccggaaa 8280
taactcacta gctaacttct ccttagcaag aatacgatta gcataatgaa ccagcttctc 8340
tgcatcgtaa acagcagt 8358
PCT/RO/134表

Claims (12)

1.一种噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)，具有杀死禽致病性大肠杆菌(Avian PathogenicEscherichia coli)的特异性能力。
2.一种组合物，用于预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病，所述组合物包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述感染性疾病是禽大肠杆菌病。
4.一种抗生素，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分。
5.一种禽饲料添加剂，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分。
6.一种禽饲料，包含根据权利要求5所述的禽饲料添加剂。
7.一种禽饮用水添加剂，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分。
8.一种禽饮用水，包含根据权利要求7所述的禽饮用水添加剂。
9.一种消毒剂，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分。
10.一种清洗剂，包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)作为活性成分。
11.一种预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，包括：
向鸟类投予根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ24(KCCM11462P)或根据权利要求2所述的组合物。
12.根据权利要求11所述的预防或治疗由禽致病性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，其中所述感染性疾病是禽大肠杆菌病。
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