KR102003773B1

KR102003773B1 - 신규한 비브리오균 특이 박테리오파지 vp4 및 이를 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR102003773B1
Application number: KR1020170170333A
Authority: KR
Inventors: 김영주; 이종석; 한범구; 김현일; 박철세
Original assignee: 주식회사 옵티팜
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2019-07-25
Also published as: KR20190069947A

Abstract

본 발명은 신규한 비브리오균 특이 박테리오파지 VP4에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 비브리오균 특이 박테리오파지 VP4를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 박테리오파지 VP4는 비브리오균에 대한 특이성이 매우 높고, 비브리오균에 감염하여 비브리오균 내에서 증식함으로써 용균 활성이 우수하며, 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 VP4는 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제 잔류문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는바, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

신규한 비브리오균 특이 박테리오파지 VP4 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel Vibrio specific bacteriophage VP4 and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 신규한 비브리오균 특이 박테리오파지 VP4에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 비브리오균 특이 박테리오파지 VP4를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)은 살모넬라균, 황색포도상구균과 함께 식중독을 일으킬 수 있는 3대 식중독균 가운데 하나로, 해수 또는 기수에서 서식한다. 야생종은 바닷물에 널리 분포하고 있으며, 사람이나 어류에서 병원성을 나타내며, 특히 해산물을 날 것이나 덜 익힌 상태로 섭취하였을 경우, 또는 장염비브리오균에 오염된 기구를 통해 조리되었거나 오염된 식품을 섭취하였을 경우 감염이 되어 장염을 일으킬 수 있다. 장염비브리오균은 사람에서 식중독을 유발할 뿐만 아니라, 항생제 내성 비브리오균의 출현으로 인해 어패류 양식 분야의 생산성 저하를 초래한다.

한편, 박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균을 감염시켜 감염된 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스를 의미한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다. 따라서 최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지의 활용이 크게 주목을 받고 있으며, 자연 친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다. 이러한 박테리오파지가 여러 세균성 질병을 대상으로 활발히 연구되고 있으며, 박테리오파지를 이용한 장염비브리오균의 제어는 안전한 수산물 생산과 장염비브리오에 의한 질병의 위험을 감소할 수 있는 방안이 될 수 있을 것으로 판단된다.

이에 본 발명자들은 박테리오파지를 기존 항생제의 대체 물질로 활용하기 위하여, 해수로부터 비브리오균 특이 박테리오파지를 분리하였고, 분리된 박테리오파지의 형태적 및 유전학적 특성 분석을 통해 장염비브리오균을 선택적으로 사멸시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 비브리오균(Vibrio)에 특이적인 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 VP4를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 항생용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 소독제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 세척제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 VP4를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비브리오균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비브리오균에 특이적인 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 VP4를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 항생용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 소독제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 세척제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비브리오균에 의한 감염섬 질병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 박테리오파지 VP4는 비브리오균에 대한 특이성이 매우 높고, 비브리오균에 감염하여 비브리오균 내에서 증식함으로써 용균 활성이 우수하며, 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 VP4는 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제 잔류문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는바, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 박테리오파지 VP4의 장염비브리오균에 대한 용균반 형성 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 전자 현미경을 통해 본 발명에 따른 박테리오파지 VP4의 형태학적 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 SDS-PAGE를 통해 본 발명에 따른 박테리오파지 VP4의 단백질 패턴을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 박테리오파지 VP4의 pH 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 박테리오파지 VP4의 열 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 박테리오파지 VP4의 염 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 비브리오균(Vibrio)에 특이적인 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 VP4를 제공한다.

본 발명에 있어서, “박테리오파지(bacteriophage)”는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.

본 발명의 박테리오파지 VP4는 28 내지 30 nm의 크기로, 정이십면체의 머리를 가지며 짧은 꼬리가 있는 형태인 포도비리대(Podoviridae)에 속함을 확인하였다.

본 발명의 박테리오파지 VP4의 단백질 패턴 분석 결과 70, 45, 및 30 kDa 크기의 단백질을 포함한다는 것을 확인하였으며, 상기 박테리오파지 VP4의 전체 염기서열 분석 결과, 전체 유전자 크기는 43,293 bp이고, GC 함량은 49%, 전체 ORFs의 수는 46개임을 확인하였다. 또한 상기 박테리오파지 VP4는 열, pH 및 염에 대한 안정성이 우수한 특성을 가지고 있다.

본 발명의 박테리오파지 VP4는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 전체유전자의 전체 또는 일부로서 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 박테리오파지 VP4는 해수로부터 시료를 채취하여 분리한 박테리오파지로서, 박테리오파지 VP4로 명명하고 2017년 9월 13일에 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KFCC11728P를 부여받았다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 박테리오파지 VP4는 비브리오균(Vibrio)에 우수한 용균활성을 나타내며, 상기 비브리오균의 예로는 콜레라균(V. cholerae), 장염비브리오균(V. parahaemolyticus), 비브리오 앵길라룸(V. anguillarum), 비브리오 피셰리(V. fischeri), 비브리오 코스티콜라(V. costicola) 및 비브리오 미미쿠스(V. mimicus) 등이 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 항생용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “항생용 조성물”은 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제, 항생제 및 항균제를 총칭하는 것이다.

본 발명의 박테리오파지 VP4는 기존 항생제에 비하여 비브리오균에 대한 특이성이 매우 높으므로, 유익균은 죽이지 않고, 특정 병원균만 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성 및 저항성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

축산, 수산업, 반려동물 산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 질병의 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 항생제 내성균 발생 가능성을 높이고, 동물에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있는 문제가 있다. 항생제가 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 초래할 수 있다. 또한 사료에 첨가되는 항생제의 종류가 많을 경우, 이는 다제내성균 발생 확률을 높인다는 문제가 있다. 따라서 종래 항생제 사용으로 발생한 문제를 해결할 새로운 사료 첨가용 항생물질로서, 본 발명의 박테리오파지 VP4를 이용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에 포함된 박테리오파지 VP4는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 박테리오파지 VP4의 건조 방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp .), 동물의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 포함될 수 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서는, 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공한다. 상기 사료는 박테리오파지 VP4를 사료 첨가제 형태로 제조하여 사료에 혼합하거나, 사료 제조 시 박테리오파지 VP4를 직접 첨가하여 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파지 VP4는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 상기 분말 형태의 박테리오파지 VP4는 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한 상기 사료는 본 발명의 박테리오파지 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명이 박테리오파지 VP4를 포함하는 사료는 식물성 사료 및 동물성사료인 것이 바람직하고, 구체적으로 상기 식물성 사료는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 및 곡물부산물류 등이 있고, 상기 동물성 사료는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류 및 남은 음식물 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 소독제를 제공한다.

본 발명의 박테리오파지 VP4를 포함하는 소독제는 비브리오균에 탁월한 용균활성을 나타내므로, 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 상기 소독제는 일반 생활 소독제, 식품, 조리 장소·설비의 소독제, 양계장 및 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독제로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 포함하는 세척제를 제공한다.

본 발명의 박테리오파지 VP4는 비브리오균에 특이적 사멸능을 가지므로, 상기 비브리오균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 동물의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 VP4를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비브리오균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, “개체”는 인간을 포함한 동물, 바람직하게는 인간, 가축류 또는 반려동물을 말하며, 가장 바람직하게는 인간, 개, 고양이, 말 또는 새를 말하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "가축류"는 인간에 의하여 순화, 개량되어 인간과 함께 공동생활을 하는 유용한 동물을 지칭하는 개념으로, 조류, 어류, 곤충류, 포유류를 모두 포함하는 개념이며, 상기 가축류는 돼지, 소, 닭, 말, 오리 및 개로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 비브리오균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료방법은 박테리오파지 VP4를 약학적 조성물의 형태로 개체에 직접 투여하거나, 개체의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 비브리오균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료방법에서 상기 박테리오파지 VP4의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 투여되는 상기 박테리오파지 VP4의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에서, 비브리오균에 의한 질병은 장염비브리오성 식중독, 콜레라, 비브리오 패혈증 및 어류 비브리오 감염증인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 신규한 박테리오파지의 분리 및 배양

1-1. 박테리오파지 스크리닝 및 단일 박테리오파지의 분리

장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)에 특이적인 박테리오파지를 스크리닝 및 분리하기 위해서 반점 용균반 분석을 수행하였다. 시료는 박테리오파지가 존재할 것으로 예상되는 전남 고흥 및 강진만 지역의 해수로부터 시료를 채취하였으며, 박테리오파지 분리에는 (주)옵티팜 사에 의해 2016년 8월 전남 고흥 지역의 해수에서 분리된 장염비브리오균을 사용하였다.

구체적으로, 채취한 시료를 균질화 한 후 장염비브리오균과 함께 35℃에서 하룻밤 동안 진탕배양 하였다. 상기 배양액을 4,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후, 상등액을 공극(pore) 크기가 0.2 μm인 필터를 이용하여 여과하여 시료 여과액을 얻었다.

전배양된 장염비브리오균 150 μL을 취해서 멸균된 튜브에 넣고, 3 mL의 2.5% 염화나트륨이 첨가된 트립틱 소이 탑 아가[(트립톤 17.0 g, 소이톤 3.0 g, 포도당 2.5 g, 염화나트륨 5.0 g, 인산수소칼륨 2.5 g) + 0.6% 아가]를 첨가하여 잘 혼합한 후 미리 만들어 둔 2.5% 염화나트륨이 첨가된 TSB 아가 플레이트에 중층하였다. 실온에서 30분간 방치한 후 준비된 샘플 여과액을 각각 10 μL씩 점적한 후 실온에서 30분 동안 방치하였고, 이를 35℃에서 하룻밤동안 배양한 후 박테리오파지의 유무를 확인하였다.

박테리오파지의 존재가 확인된 샘플에서 박테리오파지를 분리하기 위해서 소프트 아가 오버레이법을 이용하였다. 박테리오파지가 있다고 확인된 샘플을 식염수로 적절히 희석하여 각 희석단의 샘플 희석액 100 μL을 대상 세균(장염비브리오균) 배양액 150 μL와 혼합한 후 TSB 탑 아가(0.6% 아가 + TSB + 2.5% 염화나트륨) 3 mL 첨가하여 잘 혼합한 뒤, 미리 만들어 둔 TSB 아가 플레이트(2% 아가 + TSB + 2.5% 염화나트륨)에 중층하여 방치한 후 35℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 각 플레이트에서 형성된 용균반을 확인하였고, 확인된 용균반 중 하나를 선택하여 400 μL의 SM 완충액(NaCl 5.8 g/L; MgSO₄7H₂O 2 g/L; 1 M Tris-Cl (pH 7.5) 50 mL/L)에 현탁하고, 실온에서 4시간 동안 방치하였다. 상기 박테리오파지 반응액 100 μL를 채취하여 2.5%의 염화나트륨이 첨가된 트립틱 소이 탑 아가 (0.6% 아가 농도)와 장염비브리오균 배양액 500 μL와 혼합한 뒤 150 mm 지름의 TSB 플레이트(Tryptic soy agar + 2.5% NaCl)에 분주하여 중층하였고, 완전히 용균 될 때까지 35℃에서 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 TSB 플레이트에 SM 완충액 15 mL를 가하고 실온에서 4시간 동안 천천히 교반하여 박테리오파지 용액을 회수하였다. 회수된 박테리오파지 용액을 4,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액만 취했고, 0.2 μm 필터로 여과하여 최종 박테리오파지 용액을 회수하였다. 이렇게 얻어진 최종 박테리오파지의 용균반을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 4 내지 6 mm의 크기를 가지는 용균반을 형성하는 박테리오파지를 확인하였고, 상기 박테리오파지는 장염비브리오균에 특이적인 용균능을 갖는 박테리오파지임을 확인하였다.

1-2. 박테리오파지의 대량 배양 및 정제

상기 실시예 1-1에서 확인한 장염비브리오균 특이적 박테리오파지를 대량 배양하기 위하여, 실시예 1-1에서 회수한 최종 박테리오파지 배양액을 1.0x10⁷PFU/mL로 희석한 후 전배양된 장염비브리오균 1.0x10⁹CFU/mL과 혼합하여 MOI(Multiplicity of infection)가 0.01이 되도록 35℃에서 120 rpm으로 9시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후 배양액 전량을 6,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였고, 이를 0.2 μm 필터로 여과하여 최종 박테리오파지 배양액을 회수하였다. 분리된 박테리오파지를 "박테리오파지 VP4(Bacteriophage VP4)"로 명명하고, 2017년 9월 13일 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울, 한국)에 기탁하여 기탁번호 KFCC11728P를 부여받았다.

실시예 2. 박테리오파지 VP4의 전체 유전자 분석

박테리오파지 VP4의 전체 유전자를 분석하기 위해, 박테리오파지 VP4 배양액에 20 mM EDTA, 50 μg/mL의 프로테나아제 K, 0.5%(w/v) SDS를 가한 후, 50℃에서 1시간 동안 정치하였다. 동량의 페놀-클로로포름-이소프로필 알코올(25:24:1)과 혼합한 후 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액 회수하였다. 회수된 상등액을 동일 부피의 페놀-클로로포름-이소프로필 알코올(25:24:1)과 혼합하여 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액 회수하고, 상기 상등액에 3 M 소듐 아세테이트를 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가한 후 혼합하였다. 여기에 2배 부피의 차가운 95% 에탄올을 가하여 혼합한 뒤 20℃에서 1시간 동안 정치하였다. 반응이 끝난 후 0℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심분리하여 침전물 획득하였고, 차가운 70% 에탄올로 2회 세척한 뒤 에탄올을 완전히 제거하여 DNA 펠렛을 회수하였다. 회수한 펠렛을 최종 부피가 50 μL이 되도록 TE 완충액(Tris-EDTA, pH 8.0)에 용해시킨 후 DNA 농도를 측정하였다. 전체 유전자 분석을 위해 PacBioRSII(마크로젠, 한국)를 이용하여 유전자 시퀀싱을 시행하였다.

박테리오파지 VP4의 전체 유전자의 크기는 43,293 bp이며, GC 함량은 49%, 전체 ORFs의 수는 46개임을 확인하였다. 분석한 박테리오파지 VP4의 전체 유전자 서열을 서열번호 1로 나타내었다.

실시예 3. 박테리오파지 VP4의 형태학적 특성

박테리오파지 VP4의 형태학적 특성을 알아보기 위해, 박테리오파지 VP4의 순수배양액을 0.01% 젤라틴 용액에 희석하여 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 탄소-코팅 운모 플레이트(carbon-coated mica plate(ca. 2.5 x 2.5 mm))에 적가한 후, 10분간 적응시킨 후 멸균증류수로 세척하였다. 이를 구리 격자(copper grid)에 끼워 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)에서 30 내지 60초 동안 염색하고 건조시킨 후, 투과전자현미경(Tecnai G2 Spirit Twin, Bio-Transmission electron microscope, 120 kV, 120,000~400,000)으로 검경하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 VP4는 28 내지 30 nm의 크기로, 정이십면체의 머리를 가지며, 꼬리가 짧거나 없는 형태인 포도비리대(Podoviridae)에 속함을 확인하였다.

실시예 4. 박테리오파지 VP4의 단백질 패턴 분석

박테리오파지 VP4의 단백질 패턴을 분석하기 위해, 1.0x10¹⁰PFU/mL로 준비된 박테리오파지 VP4 40 μL를 10 μL의 5X 로딩 완충액과 혼합하고, 10분간 끓인 다음 12.5% SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE 수행 후 단백질 전기영동 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 VP4는 70, 45 및 30 kDa 크기의 단백질을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 5. 박테리오파지 VP4의 다양한 세균에 대한 감수성 및 감염성 조사

장염비브리오균에 대한 박테리오파지 VP4의 감수성을 확인하기 위하여, 경상남도 남해, 전라남도 고흥 및 강진만 지역의 해수에서 분리된 장염비브리오균을 대상으로 감수성을 확인하였다. 박테리오파지 VP4의 장염비브리오균에 대한 감수성 조사 결과는 표 1에 나타내었다.

대상 세균명	대상 세균수	용균 활성이 확인된 수	용균 활성이 확인되지 않은 수	감수성 비율
장염비브리오균	15 균주	13 균주	2 균주	86.7%

표 1에 나타낸 바와 같이, 경상남도 남해, 전라남도 고흥 및 강진만 지역의 해수에서 분리된 장염비브리오균 15 균주에 대한 박테리오파지 VP4의 용균활성을 확인한 결과, 13 균주에 대하여 감수성이 있는 것을 확인하였다.

또한 박테리오파지 VP4가 장염비브리오균 외의 비브리오 속 세균 및 어류 질병 원인 세균들에 대해 감염성을 나타내는지 확인하기 위하여, 한국미생물보존센터와 한국생명공학연구원 미생물자원센터로부터 분양받은 균주를 대상으로 소프트 아가 오버레이법을 통해 감염성을 확인하였다. 박테리오파지 VP4의 감염성 확인 결과는 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 VP4는 장염비브리오균에 용균활성을 나타내고, 장염비브리오균 외의 비브리오 속 세균 및 다른 종의 어류 질병 원인 세균에 대해서는 용균활성을 나타내지 않음을 확인하였다. 상기 감염성 확인 결과는 박테리오파지 VP4가 장염비브리오균에 특이적으로 용균활성을 나타낸다는 것을 의미한다.

실시예 6. 박테리오파지 VP4의 pH 안정성 조사

박테리오파지 VP4의 pH 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 pH 범위(pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11)에서 박테리오파지의 수를 측정하였다. 소듐 아세테이트 완충액, 소듐 포스페이트 완충액, Tris-HCl을 이용하여 각각의 pH에 맞게 조제한 후 990 μL씩 분주하여 준비하였다. 1.0x10⁸PFU/mL로 준비한 박테리오파지 VP4 배양액 10 μL을 상기 용액에 첨가하여 2시간 동안 상온에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계희석하여 소프트 아가 오버레이법에 의한 타이터(titer) 측정을 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 VP4는 pH 4 내지 10의 범위에서 2시간 동안 안정한 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 박테리오파지 VP4는 pH 4 내지 10의 범위에서 안정함을 확인하였으므로, 박테리오파지 VP4는 pH 안정성이 우수한 박테리오파지임을 알 수 있다.

실시예 7. 박테리오파지 VP4의 열 안정성 조사

박테리오파지 VP4의 열 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 온도 범위(40℃, 50℃, 60℃, 70℃)에서 박테리오파지의 수를 측정하였다. 박테리오파지 VP4 배양액 (1.0x10⁸PFU/mL) 5 mL을 멸균된 튜브에 분주한 후 2시간 동안 각 온도에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이법에 의한 타이터 측정을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 VP4는 40 내지 60℃에서 10분 동안 안정한 것을 확인하였고, 특히 50℃에서는 60분 후에도 안정하였다. 따라서 본 발명의 박테리오파지 VP4는 내열성이 우수한 박테리오파지임을 알 수 있다.

실시예 8. 박테리오파지 VP4의 염에 대한 안정성 조사

박테리오파지 VP4의 염에 대한 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 염 농도 범위(NaCl 3%, 2%, 1%)에서 시험하였다. 염화나트륨을 이용하여 각각의 농도에 맞게 염 용액을 조제한 후 990 μL로 준비하였다. 농도가 1.0x10⁸ PFU/mL인 박테리오파지 VP4 배양액 10 μL를 상기 염 용액에 첨가하여 24 시간동안 상온에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계희석하여 소프트 아가 오버레이법에 의한 역가 측정을 시행하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 VP4는 해수와 동일한 3% 염농도에서 안정한 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 박테리오파지 VP4는 내염성(salt tolerance)이 우수한 박테리오파지임을 알 수 있다.

종합적으로 본 발명자들은 박테리오파지 VP4가 장염비브리오균에 대한 특이성이 매우 높고, 장염비브리오균에 감염하여 장염비브리오균 내에서 증식함으로써 용균 활성이 우수하며, 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 박테리오파지 VP4는 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 박테리오파지 VP4는 항생용 조성물, 사료첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이하, 제제예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 제제예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 제제예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.

제제예 1. 사료 첨가용 조성물

박테리오파지 VP4 1x10⁷ PFU/mL

비타민 믹스 100 mg

미네랄 믹스 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 사료 첨가제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

제제예 2. 소독제 조성물

박테리오파지 VP4 1x10⁷ PFU/mL

에탄올 적량

멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 소독제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

제제예 3. 세척제 조성물

박테리오파지 VP4 1x10⁷ PFU/mL

에탄올 적량

효소 복합물 적량

멸균 증류수 적량

통상의 세척제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터

KFCC11728P

20170913

<110> Optipharm.CO.,LTD <120> Novel Vibrio specific bacteriophage VP4 and antibacterial composition comprising the same <130> 1-60P <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 43293 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacteriophage VP4 <400> 1 tttctttttt tttttttttt gagagatctc cccatccacg cgcgcgtttc ccccgtaggg 60 gtgcgtgtgt gtgcgctggc gtgcgtgcgc tcgcgtgtgc atgcatgggc tatccagcgt 120 gtgcgcgtgc gtgcgtgtgg ctatccgtgg gaaagcaggg gaaagcgact ggaaagcctt 180 gcggctgcgt gggcggcgcg gctgtgctct gcgcttgcct tttttgctca cctgttaact 240 cactggcttg tcgcctgtca gcgtgtggct atcgactggc tatccacttg ttagcatatg 300 acatctgcga tgtgatgcgc tactcacttg ctatccactt gttaacactt gctatcgtgc 360 tgctatccat atgctatcta gttgctatcc tattgatttg cgctttgtcg ctctcgcttc 420 gcttcgctcc gtcgctacaa tagggaatgc ttgctagtgt tagtcagtgg acatacggcg 480 acaggggaca cttcgctacg ctccgtgtcg gtcgcctact gtcagtgggc taaggtcatt 540 ataccggata gaacatcatg cgaataggtc attgcttgtg gataactcat tgttagacca 600 ctgtataacc actgtatata ccgcttttat tgtgatacgt ctcacatttc 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Claims

장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)에 특이적인 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 수탁번호 KFCC11728P인, 박테리오파지 VP4.
삭제
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제1항의 박테리오파지 VP4를 포함하는, 항생용 조성물.
제1항의 박테리오파지 VP4를 포함하는, 사료 첨가용 조성물.
제5항의 박테리오파지 VP4를 포함하는, 사료.
제1항의 박테리오파지 VP4를 포함하는, 소독제.
제1항의 박테리오파지 VP4를 포함하는, 세척제.
제1항의 박테리오파지 VP4를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 장염비브리오균(V. parahaemolyticus)에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료방법.
삭제
제9항에 있어서,
상기 장염비브리오균에 의한 감염성 질병은 장염 비브리오성 식중독, 콜레라, 비브리오 패혈증 및 어류 비브리오 감염증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인, 장염비브리오균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법.