ES2788923T3 - Nuevo bacteriófago y composición que comprende al mismo - Google Patents
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Abstract
Un bacteriófago ΦCJ24 (KCCM11462P) que tiene una capacidad específica para eliminar la Escherichia coli patogénica aviar.
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevo bacteriófago y composición que comprende al mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo bacteriófago que tiene la capacidad específica de eliminar la Escherichia coli patogénica aviar (APEC) de serotipos O-1 u O-78, a una composición que incluye a la misma y al bacteriófago para su uso en la prevención de la colibacilosis aviar causada por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
Antecedentes de la técnica
Escherichia coli (en adelante también denominada E. coli) es una bacteria Gram-negativa, con forma de bastón corto del género Escherichia, de la familia Enterobacteriaceae, y una de las bacterias de la flora normal que se encuentra en los intestinos de varios animales, incluidos los mamíferos. La mayoría de las cepas de Escherichia coli no son patógenas y pueden causar infecciones oportunistas, pero algunas cepas altamente patógenas causan varias enfermedades intestinales y sepsis en animales, incluidos los humanos.
Entre estas cepas de Escherichia coli, la E. coli patogénica aviar (APEC) causa infección a través del tracto respiratorio de aves tales como gallinas, gansos, pavos y similares, y se sabe que pasa al cuerpo de las aves a través de la membrana mucosa respiratoria. Con respecto a las enfermedades respiratorias de las aves, la E. coli patogénica aviar causa enfermedades principalmente en las aves de corral, lo que conduce a un enorme daño económico en la industria de aves de corral.
Un bacteriófago se refiere a un virus específico de bacterias que previene e inhibe el crecimiento de una bacteria infectada con un bacteriófago específico. La aplicación de los bacteriófagos ha despertado un gran interés, dado que los bacteriófagos tienen una especificidad de hospedador más marcada que los antibióticos y la reciente aparición de bacterias resistentes a antibióticos y a antibióticos residuales en animales es un problema creciente.
Se han realizado activamente estudios sobre los bacteriófagos en muchos países, y ha habido una tendencia creciente a obtener la aprobación de la Agencia de Medicamentos y Alimentos (FDA) para composiciones que utilizan bacteriófagos además de las solicitudes de patente para los bacteriófagos. Por ejemplo, la solicitud de patente KR101381793 desvela al bacteriófago OCJ23 activo frente a la E. coli,patogénica, serotipo O-78. OCJ23 es ácido-resistente, resistente al calor y tiene una excelente resistencia a la sequía.
Sin embargo, las tecnologías relacionadas con los bacteriófagos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades infecciosas, que son un aspecto importante en la industria avícola, incluida la avicultura de aves de corral, debido a la Escherichia coli patogénica aviar son todavía insuficientes y, por lo tanto, existe la necesidad de tales bacteriófagos y del desarrollo de las tecnologías pertinentes.
Problema técnico
Como resultado de una profunda investigación dirigida a sobreponerse ante la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos y a los antibióticos residuales en animales y a prevenir y tratar eficazmente las enfermedades infecciosas de aves, los presentes inventores aislaron un nuevo bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) que tiene la capacidad específica de eliminar la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 que causan enfermedades respiratorias en las aves de corral, a partir de fuentes naturales.
Además, los presentes inventores identificaron propiedades morfológicas, bioquímicas y genéticas del nuevo bacteriófago, confirmaron que el bacteriófago tiene una excelente resistencia a ácido, resistencia al calor y resistencia a desecación, y desarrollaron antibióticos, desinfectantes, aditivos para piensos y otras composiciones que utilizan el bacteriófago, una composición para prevenir las enfermedades infecciosas causadas por E. coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 en aves, y proporcionan el nuevo bacteriófago para su uso en la prevención de la colibacilosis aviar causada por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) que tiene la capacidad específica de eliminar la Escherichia coli patógena aviar de los serotipos O-1 u O-78.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78, que incluye el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) como ingrediente activo.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar antibióticos, aditivos para piensos, aditivos para agua potable, piensos, agua potable, desinfectantes o detergentes, que incluye el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) como ingrediente activo.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) como ingrediente activo para su uso en la prevención de la colibacilosis aviar causada por la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
Solución técnica
Un aspecto de la presente invención proporciona un nuevo bacteriófago OCJ24 KCCM11462P que tiene una capacidad específica para eliminar Escherichia coli patógena aviar de los serotipos O-1 u O-78.
Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78, que incluye el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) como ingrediente activo.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona antibióticos, aditivos para piensos, aditivos para agua potable, piensos, agua potable, desinfectantes o detergentes, que incluye el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) como ingrediente activo.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) como ingrediente activo para su uso en la prevención de la colibacilosis aviar causada por la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
Efectos ventajosos
De acuerdo con la presente invención, el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) tiene el efecto de tener una capacidad específica para eliminar la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
Además, de acuerdo con la presente invención, el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) tiene una excelente resistencia a ácido, resistencia al calor y resistencia a desecación y, por lo tanto, puede emplearse no solo como agente para prevenir enfermedades infecciosas causadas por la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 a distintos intervalos de temperatura, pH y condiciones secas, sino también como antibióticos, aditivos para piensos, aditivos para agua potable, piensos, agua potable, desinfectantes, detergentes y similares, que incluye el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) como ingrediente activo.
Además, la presente invención proporciona el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) o antibióticos que incluyen el mismo como ingrediente activo, y los antibióticos tienen efectos ya que dichos antibióticos tienen especificidad por la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 en comparación con los antibióticos precedentes y, por lo tanto, eliminan selectivamente bacterias patógenas específicas sin eliminar bacterias beneficiosas; y ya que los antibióticos no inducen resistencia a los antibióticos, obteniéndose como resultado la extensión de la vida útil de los productos en comparación con los antibióticos precedentes.
Además, la presente invención proporciona el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) como ingrediente activo para su uso en la prevención de la colibacilosis aviar causada por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
Descripción de los dibujos
La figura 1 es una imagen de microscopio electrónico de un nuevo bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) (en adelante denominado OCJ24').
La figura 2 muestra los resultados de la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) de un nuevo bacteriófago OCJ24.
La figura 3 muestra los resultados de la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) de un nuevo bacteriófago OCJ24.
La figura 4 es un gráfico que muestra los resultados del experimento de resistencia a ácido de un nuevo bacteriófago OCJ24.
La figura 5 es un gráfico que representa los resultados del experimento de resistencia al calor de un nuevo bacteriófago OCJ24.
La figura 6 es un gráfico que muestra los resultados del experimento de resistencia a desecación de un nuevo bacteriófago OCJ24.
Mejor modo
En lo sucesivo en el presente documento, las realizaciones de la presente invención se describirán con más detalle. La descripción de los detalles discernibles para una persona que tiene conocimiento ordinario en la técnica se omitirá en el presente documento.
Una realización de la presente invención proporciona un nuevo bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) (de aquí en adelante denominado 'OCJ24') que tiene una capacidad específica para eliminar la Escherichia coli patogénica aviar (APEC) de serotipos O-1 u O-78.
La Escherichia coli patogénica aviar se refiere a la Escherichia coli que se transmite a través del tracto respiratorios de aves tales como las gallinas, gansos, pavos y similares, y que puede causar enfermedades infecciosas en aves, específicamente la colibacilosis aviar. Específicamente, la Escherichia coli patogénica aviar penetra en el cuerpo de las aves a través de la membrana mucosa del tracto respiratorio y causa varias enfermedades tales como la sepsis, granuloma, saculitis aérea, salpingitis, artritis y similares. La Escherichia coli patogénica aviar es un bacilo Gramnegativo como la Escherichia coli corriente, tiene flagelos perítricos para la motilidad, y es una bacteria anaeróbica o aeróbica facultativa que descompone lactosa y fructosa para generar ácidos y gases.
La Escherichia coli patogénica aviar crece bien en medios comunes y es capaz de crecer a una temperatura de aproximadamente 7 °C a aproximadamente 48 °C, con una temperatura de crecimiento ideal que oscila entre aproximadamente 35 °C y aproximadamente 37 °C. Específicamente, a aproximadamente 42 °C, cerca de la temperatura corporal de las aves, se realiza de manera eficaz la expresión de factores patogénicos. Además, la Escherichia coli patogénica aviar puede crecer en un intervalo de pH que varía de 4,5 a 9,0.
Un bacteriófago es un virus específico de bacterias capaz de infectar una bacteria específica e inhibir el crecimiento de la misma, y es un virus que incluye ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) de cadena sencilla o doble como material genético.
Específicamente, el bacteriófago OCJ24 de acuerdo con la realización de la presente invención es un bacteriófago que tiene la especificidad de especie de infectar selectivamente a la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 y que morfológicamente pertenece al morfotipo B1 Siphoviridae que tiene una cápside icosaédrica y una larga cola no contráctil (véase la figura 1). Se comparó la homología entre una secuencia de nucleótidos del bacteriófago OCJ24 y las secuencias de nucleótidos decodificadas de otros bacteriófagos y los resultados se muestran en la tabla 1. El bacteriófago OCJ24 muestra una resistencia a ácido estable a un pH de 3,5 a 11,0 sin perder actividad (figura 4), y en términos de resistencia al calor, el bacteriófago OCJ24 muestra una disminución de la actividad de aproximadamente 1 log o menos cuando se expone a 50 °C o más durante dos horas (figura 5). En términos de resistencia a desecación, el bacteriófago OCJ24 muestra una disminución de la actividad de aproximadamente 1 log cuando se seca a 60 °C durante dos horas (figura 6). Las secuencias parciales de nucleótidos de ADN del bacteriófago OCJ24 se establecen en las SEQ ID NO: 1 y 2 del listado de secuencias. El bacteriófago OCJ24 es un nuevo bacteriófago aislado por el presente inventor, y se depositó en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea (KCCM) (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea) el 25 de octubre de 2013 con el número de acceso KCc M 11462P.
Otra realización de la presente invención proporciona una composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78, que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo.
Dado que el bacteriófago OCJ24 exhibe una actividad antibacteriana capaz de eliminar específicamente la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78, el bacteriófago OCJ24 puede utilizarse en la prevención de enfermedades causadas por la infección con Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78. Los ejemplos de enfermedades infecciosas causadas por la Escherichia coli patogénica aviar incluyen la colibacilosis aviar, sin limitarse a la misma.
En el presente documento, el término "colibacilosis aviar" se refiere a una enfermedad que se produce en el tracto respiratorio de las aves debido a la infección con Escherichia coli patogénica, y sus síntomas incluyen la saculitis aérea, perihepatitis, peritonitis, pericarditis, salpingitis, onfalitis, osteomielitis o septicemia, causando así un retraso en el crecimiento y la mortalidad de las aves infectadas.
En el presente documento, el término "prevenir" o "prevención" se refiere a todas las acciones para inhibir o retrasar la aparición de las enfermedades correspondientes, administrando el bacteriófago OCJ24 y/o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo a un animal.
La composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 de acuerdo con la presente realización puede incluir al bacteriófago OCJ24 en cantidades de 5x102 ufp/ml a 5 x1012 ufp/ml, de manera específica, de 1x106ufp/ml a 1x1010 ufp/ml.
La composición para prevenir enfermedades infecciosas causadas por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78, de acuerdo con esta realización, puede incluir además vehículos farmacéuticamente aceptables, y puede formularse con los vehículos para proporcionar piensos, medicinas, aditivos para los piensos o aditivos para el agua potable, y similares. En el presente documento, la expresión "vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a los vehículos o diluyentes que no estimulan un organismo y no inhiben la actividad biológica y las
propiedades de los compuestos administrados.
Los tipos de vehículos aplicables a esta realización no están particularmente limitados y se puede utilizar cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable que se utilice comúnmente en la técnica. Los ejemplos de vehículos pueden incluir solución salina, agua destilada, solución de Ringer, solución salina tamponada, una solución de albúmina para inyección, una solución de dextrosa, una solución de maltodextrina, glicerol y etanol, sin limitarse a estos. Pueden utilizarse por separado o en una combinación de los mismos.
Además, a la composición de acuerdo con la presente invención se le pueden añadir, cuando sea necesario, otros aditivos comunes tales como antioxidantes, soluciones tamponadoras y/o citostáticos, y a la composición de acuerdo con la presente invención se le pueden añadir además diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y/o lubricantes para formular formulaciones inyectables tales como soluciones acuosas, suspensiones y emulsiones, píldoras, cápsulas, gránulos y comprimidos estériles.
Los métodos de administración de la composición para la prevención de enfermedades infecciosas causadas por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 no están particularmente limitados, y se puede utilizar cualquier método de uso común en la técnica relacionada. Un ejemplo del método de administración puede incluir la administración oral o la administración parenteral.
Los ejemplos de formas de dosificación para administración oral pueden incluir píldoras, pastillas, comprimidos, suspensiones solubles en agua, suspensiones a base de aceite, formulaciones en polvo, gránulos, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas blandas, jarabes o elixires, y similares.
Para formular la composición de acuerdo con esta realización en formas de dosificación tales como comprimidos o cápsulas, se pueden incluir además aglutinantes tales como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, amilopectina, celulosa y gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; disgregantes tales como el almidón de maíz y el almidón de batata; lubricantes tales como estearato de magnesio, estearato de calcio, estearil fumarato de sodio y ceras de polietilenglicol y, para la formulación de cápsulas, además de las sustancias mencionadas, se pueden incluir otros vehículos líquidos, como los aceites grasos.
Los métodos de administración parenteral de la composición de esta realización pueden incluir, por ejemplo, inyección intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración subcutánea, y administración tópica, y un método de aplicación o pulverización de la composición de acuerdo con la presente invención a una región afectada, sin limitarse a estos.
Para formular formas de dosificación parenteral, por ejemplo, la composición de esta realización puede formularse en formas de dosificación para inyección, tales como inyección subcutánea, inyección intravenosa e inyección intramuscular; supositorios; o formas de dosificación para pulverización, tales como los aerosoles, para permitir la inhalación a través de inhaladores, sin limitarse a estos. Para formular formas de dosificación para inyección, la composición de esta realización puede mezclarse con estabilizadores o agentes tamponadores en agua para preparar soluciones o suspensiones, que se formulan en formas de dosificación para su administración en unidades tales como ampollas o viales. Cuando la composición se formula en formas de dosificación para pulverización tales como aerosoles, la composición puede formularse con propelentes y similares junto con aditivos de manera que un concentrado dispersado en agua o polvo mojado se disemina en el mismo.
Las cantidades adecuadas de aplicación, pulverización o administración de la composición para la prevención de enfermedades infecciosas causadas por Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 de acuerdo con esta realización pueden diferir según factores tales como la edad, el peso corporal y el sexo de los animales, el grado de los síntomas de la enfermedad, piensos ingeridos, tasa de excreción, y similares, además del método para formular la composición, el método de administración, tiempo de administración y/o vías de administración, y un veterinario generalmente capacitado puede determinar y prescribir fácilmente las cantidades de dosis eficaces para el tratamiento previsto.
Una realización adicional de la presente invención proporciona antibióticos que incluyen el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo.
En el presente documento, el término "antibióticos" se refiere a una preparación que se administra a los animales, incluyendo los seres humanos, en forma de medicinas y que muestra eficacia en la esterilización frente bacterias, y se utiliza de manera general en antisépticos, germicidas y agentes antibacterianos.
Los antibióticos de esta realización que incluyen el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo, tienen efectos ya que dichos antibióticos tienen especificidad por la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 en comparación con los antibióticos corrientes y, por lo tanto, eliminan bacterias patógenas específicas, pero no bacterias beneficiosas; y ya que dichos antibióticos no inducen resistencia a los medicamentos, causando una extensión de la vida útil de los productos en comparación con los antibióticos típicos.
Otra realización más de la presente invención proporciona un aditivo para los piensos o el agua potable de aves, que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo.
Las aves como sujeto al que se le aplican los aditivos para los piensos de las aves o los aditivos para el agua potable de las aves no están particularmente limitados, pero las aves en esta realización son particularmente aves de corral.
En el presente documento, aves de corral es un nombre genérico para los animales pertenecientes a las aves de granja. Las aves de corral no están particularmente limitadas, y pueden comprender al menos una seleccionada del grupo que consiste en gallinas, gansos, pavos, y similares.
Los aditivos para piensos para aves o los aditivos para agua potable para aves pueden utilizarse preparando por separado los aditivos para piensos o los aditivos para agua potable para aves utilizando el bacteriófago OCJ24 o la composición que lo incluye y mezclando los piensos o el agua potable con los aditivos, o añadiendo directamente el bacteriófago ÓCJ24 o la composición que lo incluye en el proceso de preparación de los piensos o el agua potable. El bacteriófago OCJ24 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo utilizado en forma de aditivos para piensos o aditivos para agua potable de acuerdo con esta realización puede ser una forma líquida o una forma seca, por ejemplo, una forma de polvo seco.
Por ejemplo, el bacteriófago OCJ24 de acuerdo con la presente invención se mezcla en forma de polvo en cantidades del 0,05 % en peso al 10 % en peso, específicamente del 0,1 % en peso al 2 % en peso, en base al peso de los aditivos para piensos.
Los métodos para desecar los aditivos para piensos o los aditivos para el agua potable de acuerdo con esta realización para obtener polvo seco no están particularmente limitados, y se puede utilizar cualquier método que se use normalmente en la técnica relacionada. Los ejemplos del método de desecado pueden incluir el desecado al aire, desecado natural, desecado por aspersión y liofilización, sin limitarse a estos. Estos métodos pueden utilizarse por separado o en una combinación de los mismos.
Los aditivos para piensos o los aditivos para el agua potable de acuerdo con esta realización pueden incluir además otros microorganismos no patógenos. Los microorganismos pueden seleccionarse del grupo que consiste en Bacillus sp. tales como Bacillus subtilis capaz de producir proteasas, lipasas y/o glicosiltransferasas; bacterias del ácido láctico tales como Lactobacillus sp. que tienen actividad fisiológica y capacidad de descomposición de material orgánico en condiciones anaeróbicas tales como las del estómago del ganado; bacterias filamentosas tales como Aspergillus oryzae que tienen efectos de ganancia de peso en los animales, aumento de la producción de leche, y aumento de la tasa de digestión-absorción de piensos; y levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y similares. Estos microorganismos pueden utilizarse por separado o en una combinación de los mismos.
Los aditivos para piensos o los aditivos para agua potable de acuerdo con esta realización, que incluyen el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo, pueden incluir además otros aditivos según sea necesario. Los ejemplos de aditivos utilizables pueden incluir aglutinantes, emulsionantes y conservantes añadidos para prevenir el deterioro de la calidad de los piensos o del agua potable; aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, compuestos de nitrógeno no proteínicos, silicato, agentes tamponadores, agentes colorantes, agentes de extracción u oligosacáridos que se añaden para aumentar la utilidad de los piensos o del agua potable; y otros suplementos alimentarios, y similares. Estos aditivos pueden utilizarse por separado o en una combinación de los mismos.
Los aditivos para piensos de acuerdo con la presente invención pueden estar presentes en cantidades de 0,05 partes en peso a 10 partes en peso, específicamente de 0,1 partes en peso a 2 partes en peso, en base a 100 partes en peso de piensos. Los aditivos para agua potable de acuerdo con la presente invención pueden estar presentes en cantidades de 0,0001 partes en peso a 0,01 partes en peso, específicamente de 0,001 partes en peso a 0,005 partes en peso, en base a 100 partes en peso de agua potable. Dentro de estos intervalos, los aditivos permiten que se muestre suficientemente la actividad del bacteriófago OCJ24 contra la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
Otra realización más de la presente invención proporciona piensos o agua potable preparada añadiendo los aditivos para piensos o aditivos para agua potable que incluyen el bacteriófago OCJ24 como un ingrediente activo para piensos o agua potable, o directamente añadiendo el bacteriófago OCJ24 a los mismos.
Los piensos utilizados en esta realización no están particularmente limitados, y se puede utilizar cualquier pienso de uso común en la técnica relacionado. Los ejemplos de piensos pueden incluir piensos vegetales, tales como granos, vegetales de raíz, subproductos del procesamiento de piensos, algas, fibras, subproductos farmacéuticos, aceites y grasas, almidones, residuos o subproductos de grano, y similares; y piensos para animales tales como proteínas, sustancias inorgánicas, aceites y grasas, minerales, proteínas unicelulares, y plancton o piensos de origen animal. Estos piensos se utilizan por separado o en una combinación de los mismos.
El agua potable utilizada en esta realización no está particularmente limitada, y se puede utilizar cualquier agua potable utilizada normalmente en la técnica relacionada.
Otra realización más de la presente invención proporciona desinfectantes o detergentes que incluyen el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo. Las formas de dosificación de los desinfectantes o detergentes no están particularmente limitadas, y se puede utilizar cualquier forma de dosificación utilizada normalmente en la técnica relacionada.
Para eliminar la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78, los desinfectantes pueden pulverizarse en los hábitats de las aves, mataderos, zonas muertas, cocinas y equipo de cocina, sin limitarse a estos.
Los detergentes se pueden utilizar para lavar una superficie de la dermis o partes del cuerpo de las aves que están expuestas o pueden estar expuestas a la Escherichia coli, patogénica aviar, sin limitarse a estos.
Otra realización más de la presente invención proporciona el bacteriófago OCJ24 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo para su uso en la prevención de la colibacilosis aviar causada por la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
El bacteriófago OCJ24 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones es para administración en aves que están expuestas o pueden estar expuestas a Escherichia coli. patogénica aviar. Las cantidades totales por día adecuadas del bacteriófago OCJ24 o de la composición que incluye el mismo pueden determinarse por un médico en el ámbito de un juicio médico apropiado, como es evidente para los expertos en la materia.
Se puede determinar una cantidad farmacéuticamente eficaz concreta del bacteriófago OCJ24 o de la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo para ciertas aves, teniendo en cuenta los tipos y el grado de reacción a lograr, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo o la dieta de los individuos correspondientes, el tiempo de administración y las vías de administración del bacteriófago OCJ24 o de una composición que incluye el mismo, y la tasa de secreción de la composición, el período de tratamiento y similares, y pueden diferir dependiendo de diversos factores y factores similares muy conocidos en el campo de la medicina incluyendo los ingredientes de las medicinas que se utilizan simultáneamente o en momentos diferentes.
El bacteriófago OCJ24 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo son para su administración en forma de una preparación farmacéutica para aves mediante pulverización intranasal, o se añaden directamente a los piensos o al agua de potable para aves para su digestión, y pueden mezclarse con piensos o agua potable en forma de aditivos para piensos o aditivos para el agua potable.
Las vías y métodos de administración del bacteriófago OCJ24 o de la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo no están particularmente limitadas, y la administración puede realizarse por cualquier vía y método siempre que la administración permita que el bacteriófago OCJ24 o la composición que incluye el mismo llegue a los tejidos deseados. Concretamente, el bacteriófago OCJ24 o la composición que incluye el bacteriófago OCJ24 como ingrediente activo son para su administración por diversas vías orales o parenterales, y los ejemplos de administración pueden incluir administración oral, rectal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdérmica, intranasal, e inhalación, sin limitarse a estos.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a un ejemplo preferente. Debe entenderse que estos ejemplos no deben interpretarse en modo alguno como limitantes de la presente invención.
[Ejemplo 1] - Aislamiento de un bacteriófago que infecta a la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78
<Ejemplo 1-1>
Detección de bacteriófagos y aislamiento de bacteriófagos individuales
Se centrifugaron 50 ml de una muestra obtenida de heces de gallina recogidas alrededor de una granja de aves de corral en Chengwon-gun, provincia de Chungcheong, a 4000 rpm durante 10 minutos, y el sobrenadante resultante se filtró a través de un filtro de 0,45 pm para preparar una muestra líquida, que a su vez se utilizó para realizar un método de superposición con agar blando. El método de superposición con agar blando se refiere a un método de observación de la lisis de los bacteriófagos utilizando una célula hospedadora que crece en la parte superior del agar (adherida a un medio sólido con un 0,7% de agar).
Específicamente, 150 pl de una solución de cultivo en agitación (DO600 = 2) de Escherichia coli patogénica aviar (E10-4) obtenida del Departamento de Medicina Veterinaria de la Universidad de Konkuk y 2 ml de medio 10xLB (10
g/l de triptófano; 5 g/l de extracto de levadura; 10 g/l de NaCI) se mezclaron con 18 ml de la muestra líquida filtrada, seguido de un cultivo a 30 °C durante 18 horas, y la solución cultivada resultante se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos, y el sobrenadante resultante se filtró a través de un filtro de 0,45 |jm. Posteriormente, se vertió y solidificó una solución mixta que consistía en 3 ml de agar al 0,7% (p/v) y 150 j l de una solución de cultivo en agitación (DO 600 = 2) de Escherichia coli patogénica aviar (E10-4) en una placa con medio LB, a la que se le añadieron 10 j l de la muestra líquida gota a gota, seguido de un cultivo a 30 °C durante 18 horas, identificando así la formación de placas.
Dado que se sabe que hay un tipo de bacteriófago por placa, los inventores trataron de aislar bacteriófagos individuales de las placas formadas. Específicamente, se añadieron 400 j l de solución SM (5,8 g/l de NaCl; 2 g/l de MgSO47H2O2; 50 ml de Tris-HCl 1 M (pH 7,5)) a las placas y se dejaron a temperatura ambiente durante 4 horas, obteniendo así una solución bacteriofágica.
Posteriormente, se mezclaron 100 j l de la solución bacteriofágica con 12 ml de agar al 0,7% (p/v) y 500 j l de una solución de cultivo en agitación (DO600 = 2) de Escherichia coli patogénica aviar (E10-4), que se utilizó para realizar un método de superposición con agar blando utilizando una placa con medio LB de 150 mm de diámetro en la que se realizó el cultivo hasta que el bacteriófago quedó completamente lisado. Después de completar el cultivo, se añadieron 15 ml de solución SM a la placa con medio LB y se dejó a temperatura ambiente durante 4 horas, obteniendo así una solución bacteriofágica.
A la solución obtenida, se le añadió cloroformo al 1% (v/v) y se mezcló durante 10 minutos, seguido de una centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos, obteniendo así un sobrenadante, que a su vez se filtró a través de un filtro de 0,45 jm, obteniendo así una muestra final.
<Ejemplo 1-2>
Cultivo y purificación de bacteriófagos a gran escala
El bacteriófago obtenido en el ejemplo 1-1 se cultivó a gran escala utilizando Escherichia coli patogénica aviar (E10-4), y luego el bacteriófago se purificó a partir de la misma.
Específicamente, Se cultivó Escherichia coli patogénica aviar (E10-4) en agitación, y se inoculó a 1,0x1010 ufc, seguido de una centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos, y una nueva suspensión en 4 ml de solución SM. A esto se le añadió el bacteriófago a 1,0x 106 ufp con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,0001, y luego se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
A continuación, se inocularon 150 ml de medio LB y se cultivaron a 30 °C durante 6 horas. Después de completar el cultivo, se añadió cloroformo a un volumen del 1 % (v/v) del volumen final, seguido de agitación durante 20 minutos, al que se añadieron DNasa I y RNasa A como enzimas de restricción en una concentración final de 1 jg/ml, respectivamente, y se dejó a 30 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió cloruro de sodio y polietilenglicol a una concentración final de 1 M y 10 % (p/v), respectivamente, y se dejó a 4 °C durante 3 horas, seguido de una centrifugación a 4 °C y 12000 rpm durante 20 minutos, obteniendo así un precipitado.
El precipitado obtenido se suspendió en 5 ml de solución de SM y luego se dejó a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadieron 4 ml de cloroformo con agitación, seguido de una centrifugación a 4 °C con 4000 rpm durante 20 minutos, obteniendo así un sobrenadante. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 jm , seguido de ultracentrifugación (35000 rpm, 1 hora, 4 °C) utilizando un método de gradiente de densidad de glicerol (densidad: 40 %, 5 % de glicerol), purificando así un bacteriófago.
Los presentes inventores aislaron un bacteriófago con una capacidad específica para eliminar la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78 a partir de muestras recogidas de heces de gallina en granjas, que se designó como "Bacteriófago OCJ24" y se depositó en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea (KCCM) (361-221 Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea) el 25 de octubre de 2013 con el número de acceso KCCM 11462P.
<Ejemplo 2>
Observación morfológica de QCJ24
El bacteriófago OCJ24 purificado en el ejemplo 1 se diluyó en una solución de gelatina al 0,01% y luego se fijó con una solución de glutaraldehído al 2,5%. El bacteriófago resultante se añadió gota a gota a una placa de mica recubierta de carbono (aproximadamente 2,5 mmx2,5 mm), se aclimató durante 10 minutos y luego se lavó con agua destilada.
Posteriormente, la película de carbono se montó en una rejilla de cobre y se tiñó con acetato de uranilo al 4% durante 60 segundos, se secó y se examinó bajo un microscopio electrónico de transmisión (JEM-1011, 80 kV,
aumento de x200.000) (figura 1).
La figura 1 es una imagen de microscopio electrónico de transmisión de un bacteriófago OCJ24, en la que el bacteriófago OCJ24 tenía las características morfológicas de una cápsula icosaédrica con una larga cola no contráctil, indicando que el bacteriófago pertenece al morfotipo B1 Siphoviridae.
<Ejemplo 3>
Análisis del tamaño del ADN genómico total de QCJ24
Se extrajo ADN genómico del bacteriófago OCJ24 purificado en el ejemplo 1.
Específicamente, se añadieron 50 pg/ml de proteasa K, 0,5 % (p/v) de dodecil sulfato de sodio (SDS) y 20 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una solución cultivada del bacteriófago OCJ24 purificado y se dejaron a 50 °C durante una hora, a la que se añadió una cantidad igual de fenol (pH 8,0) con agitación, seguido de una centrifugación a temperatura ambiente y 12000 rpm durante 10 minutos, obteniendo así un sobrenadante.
El sobrenadante se mezcló con una cantidad igual de PC (fenol:cloroformo = 1:1), seguido de una centrifugación a temperatura ambiente y 12000 rpm durante 10 minutos, obteniendo así un sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con una cantidad igual de cloroformo, seguido de una centrifugación a temperatura ambiente y 12000 rpm durante 10 minutos, obteniendo así un sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con un 10% (v/v) de acetato de sodio 3 M en base al volumen total, seguido de la adición de 2 volúmenes de etanol frío al 95%, mezcla y reposo a -20 °C durante 1 hora.
Posteriormente, la sustancia resultante se centrifugó a 0 °C y 12000 rpm durante 10 minutos, de la que se extrajo un sobrenadante para obtener un precipitado, que se disolvió en 50 pl de solución tamponada de TE (Tris-EDTA, pH 8,0). El ADN extraído se diluyó 10 veces y luego se determinó la concentración de ADN midiendo la absorbancia a DO260.
A continuación, se cargó 1 pg de ADN en un gel de agarosa PFGE (electroforesis en gel de campo pulsado) al 1 % y se reveló usando el BIOrAd PFGE SYSTEM NO.7 PROGRAM (el tamaño varía entre 25 kb y 100 kb; rampa de tiempos de cambio de 0,4 segundos a 2,0 segundos, forma lineal; voltaje directo, 180 V; voltaje inverso, 120 V) a temperatura ambiente durante 20 horas (figura 2).
La figura 2 es una fotografía de un gel de electroforesis del ADN genómico del bacteriófago OCJ24, y se pudo observar que el tamaño del ADN genómico del bacteriófago OCJ24 era de unos 53 kpb.
<Ejemplo 4>
Análisis del patrón proteico de QCJ24
Se mezclaron 15 pl de solución del bacteriófago OCJ24 purificada (1011 ufp/ml título) con 3 pl de solución de muestra 5xSDS, y luego se hirvió durante 5 minutos para realizar la SDS-PAGE 12 % (figura 3).
La figura 3 es una fotografía de electroforesis de los resultados de SDS-PAGE realizada en el bacteriófago OCJ24, y se pudo observar que las proteínas principales tenían un tamaño de aproximadamente 10,3 kDa, aproximadamente 12,5 kDa, aproximadamente 15,1 kDa, aproximadamente 43 kDa, aproximadamente 49,3 kDa, aproximadamente 60,4 kDa y aproximadamente 94,9 kDa.
<Ejemplo 5>
Análisis de las propiedades genéticas de QCJ24
Para determinar las propiedades genéticas del bacteriófago OCJ24 purificado en el ejemplo 1, se analizó el ADN del bacteriófago OCJ24 utilizando un secuenciador FLX Titanium Sequencer (Roche) como analizador de genes. Los genes se recombinaron usando GS y el software de ensamblaje de novo (Roche) de Macrogen Inc. El marco de lectura abierto se identificó usando Gene-Mark. hmm, Glimmer v3.02 y el software FGENESB. El marco de lectura abierto se anotó utilizando el programa BLASTP e InterProScan.
La secuencia de nucleótidos del bacteriófago OCJ24 mostró similitudes con la secuencia de nucleótidos de los bacteriófagos previamente reportados (fago phiEB49 de Escherichia, fago KBNP21 de Escherichia), pero se pudo ver que no había bacteriófagos en los que todos los fragmentos coincidieran al 100%. Por consiguiente, se pudo ver que el bacteriófago era un nuevo bacteriófago aislado.
La tabla 1 muestra a continuación los resultados de la comparación entre la secuencia de nucleótidos del bacteriófago OCJ24 y la secuencia de nucleótidos decodificada del bacteriófago reportado anteriormente en la
técnica.
TABLA 1
El ADN del bacteriófago OCJ24 preparado se analizó utilizando un secuenciador de ADN y los resultados parciales de la secuencia de nucleótidos que se analizaron se exponen en las SEQ ID NO: 1 y 2.
<Ejemplo 6>
Estabilidad frente al pH de QCJ24
Para identificar si el bacteriófago OCJ24 puede mantener la estabilidad a un bajo pH como el de las condiciones estomacales, se examinó la estabilidad del bacteriófago OCJ24 a varios pH (pH 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,5, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0).
Para el experimento, se prepararon varias soluciones de pH (soluciones tampón de acetato de sodio (pH 4,0, pH 4,5, pH 5,0, pH 5,5), soluciones tampón de citrato de sodio (pH 2,5, pH 3,0 y pH 3,5), soluciones tampón de fosfato de sodio (pH 6,5 y pH 7,0), y soluciones Tris-HCl (pH 8,0, pH 9,0, pH 10,0 y pH 11,0) a una concentración de 0,2 M. Se mezclaron 180 pl de cada solución de pH con 20 pl de una solución bacteriofágica con un título de 2,0X1011 UFP/ml para garantizar que cada solución de pH tuviera una concentración de 1 M, y luego la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas. Para un grupo de control, se mezclaron 20 pl de una solución bacteriofágica con un título de 2,0X1011 UFP/ml con 180 pl de solución SM por el mismo método, y la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, las soluciones se diluyeron en serie y se cultivaron 10 pl de cada una de las soluciones en cada paso de dilución por el método de superposición con agar blando a 30 °C durante 18 horas para determinar el título de bacteriófago en función de si el bacteriófago estaba lisado (figura 4).
En la figura 4 se muestran los resultados experimentales de la resistencia a ácido del bacteriófago OCJ24. En la figura 4, se pudo ver que el bacteriófago OCJ24 no perdió su actividad y mantuvo la estabilidad desde el pH 3,5 hasta el pH 11,0, en comparación con el grupo de control.
<Ejemplo 7>
Estabilidad térmica del bacteriófago QCJ24
Si entre las formas de dosificación los bacteriófagos estos se formulan como aditivos para piensos, se puede generar calor durante los procedimientos de formulación y, por lo tanto, se realizó el siguiente experimento para determinar la estabilidad térmica de los bacteriófagos.
Específicamente, una solución de 100 pl de bacteriófago OCJ24 con 1,65X 1011 UFP/ml se dejó a 37 °C, 45 °C, 53 °C y 60 °C durante 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, respectivamente. Posteriormente, la solución del cultivo experimental resultante se diluyó en serie, se cultivaron 10 pl de cada una de las soluciones en cada paso de dilución por el método de superposición con agar blando a 30 °C durante 18 horas para determinar el título de bacteriófago en función de si el bacteriófago estaba lisado (figura 5).
En la figura 5 se muestran los resultados experimentales de la resistencia al calor del bacteriófago OCJ24. Como se muestra en la figura 5, se pudo observar que el bacteriófago OCJ24 mostró una pérdida de actividad de aproximadamente 1 log o menos hasta que el bacteriófago OCJ24 se expuso a 53 °C durante 120 minutos, y se observó una disminución de la actividad a medida que pasaba el tiempo cuando el bacteriófago OCJ24 se expuso a 60 °C.
<Ejemplo 8>
Estabilidad ante desecación del bacteriófago QCJ24
Si entre las formas de dosificación los bacteriófagos estos se formulan como aditivos para piensos, los bacteriófagos pueden desecarse durante los procedimientos de formulación y, por lo tanto, se realizó el siguiente experimento para
determinar la estabilidad de los bacteriófagos frente a condiciones de desecación.
El experimento de desecación se realizó con un concentrador SpeedVac, en base a los resultados del experimento de resistencia al calor. Se desecaron 200 j l de solución bacteriofágica OCJ24 con 2,5X1010 UFP/ml a 60 °C al vacío durante 2 horas, y los gránulos resultantes se introdujeron en 200 j l de solución SM, seguido de una completa resuspensión a 4 °C durante un día, midiendo así los títulos (figura 6).
Como se muestra en la figura 6, se pudo ver que después de la desecación, en comparación con los títulos iniciales y la estabilidad relativa, cuando el bacteriófago OCJ24 se desecó a 60 °C durante 2 horas, el bacteriófago OCJ24 mostró una pérdida de actividad de aproximadamente 1 log.
<Ejemplo 9>
Estudio de la infección del bacteriófago QCJ24 en una cepa aislada de tipo salvaje, de Escherichia coli patogénica aviar
La actividad lítica del bacteriófago OCJ24 se ensayó para 46 cepas de Escherichia coli patogénica aviar de tipo salvaje, aisladas por el Colegio de Medicina Veterinaria, de la Universidad de Konkuk (KU), 10 cepas de Escherichia coli patogénica aviar aisladas por el Organismo de Cuarentena Animal y Vegetal de Corea (KAPQA), 7 cepas de Escherichia coli patogénica aviar aisladas por el Colegio de Medicina Veterinaria, de la Universidad Nacional de Chonbuk (CNU) y 26 cepas de Escherichia coli patogénica aviar diagnosticada como enfermedad, aisladas por la granja Komipharm (KF), además de la Escherichia coli patogénica aviar (E10-4) utilizada en el presente experimento.
Específicamente, se mezclaron 150 j l de una solución de cultivo en agitación de cada cepa (DO600 = 2), y se depositaron 10 j l de solución bacteriofágica OCJ24 con un título de 109 ufp/ml y se cultivaron por el método de superposición de agar blando a 30 °C durante 18 horas, y luego se examinó la formación de las placas (tabla 2). Los resultados se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2
continuación
Como se muestra en la tabla 2, el bacteriófago OCJ24 exhibe la capacidad de infectar a Escherichia coli patogénica aviar, específicamente de serotipos O-1 u O-78, que son las principales bacterias causantes de la colibacilosis aviar en las granjas de aves de corral en general.
Se sabe que el serotipo O-78 es generalmente la cepa más dominante entre las Escherichia coli patogénicas aviares aisladas de las granjas de aves de corral.
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION
<120> Nuevo bacteriófago y composición que comprende al mismo
<130> P14-5113
<150> KR 10-2014-0044994
<151> 2014-04-15
<160>2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 50547
<212> ADN
<213> una parte del ADN del nuevo bacteriófago CJ 24
<400> 1
ctcgtacact cggattgatt caagctgcgc accttccttg attggtgatg tcaggagtcg 60 gttgtcacgg acgacggcga cgatggcgga accaccataa agccgctccc atgagaacgc 120 ctcgacgatc tgcttattca gtttcatgcc atcccaaagt gatttgaatg ctttctcatc 180 cttcacgccg tcaaggccga atccagggaa aaccatttct tctggaatca catcgacaat 240 tttcttagcc ataggatcat caatgtaaaa ctgcgtcacg tacatctgat cgtatagcga 300 tgcaagcgcg ccgcctgccg taccttcacc cttaaacgtc ttgttgtaag agtctgtctt 360 aacgcttttt ttactcatct gtttttctcc caataaaaaa ggctaggttg ttagcctagc 420 cattatacat tatttgactt ccgacttacc atgattttca tgatagccca aagcgaactc 480 cgcagacttc cttgcgcaaa ctgcatcgaa ccaatcagag tagtatccca atgacttcct 540 ctctcctttc cctgagttac ctatgaaagc ccaccacttg gatcttgaat cataccagta 600 aacacctaca cacccgcttt tattccttac tgacttcttt gtgtttctac cgttatcctt 660 atgggtaaca acccttaaat tctccctcct attgtcgttc cttatgtgat ttttgtgatc 720 tatctgcatc ccatcaggga tatctccatt atcgaattcc catgcgaatc tgtgagcaag 780 aagcgatacg ccacctatcg ttatcctcac ataaccatca gcatcaagtg ttcccgctat 840 gtcaccaggg tagaatttac tctttttaat cttgatcatc cacctaacat aaactccatc 900 atacgttaga taattcttgg ctatgtcata aatatcgctt cttgcattct gcattacacc 960 cccctactta atccggctaa acgtttcatt ctagacactg gatcatccag catgttcatc 1020 tcaaagttta cagcatcaaa tacgttatcg caaatgtcat catgaggaga tgaatcatca 1080 aacgtaaatg acaccaattc aatctccatg tcagaaagca tctcatgaga ttcagggaat 1140 acacaacgcc cagccttcat gattggtgct gcgtccattg cgcgagttac cttatccgta 1200 tttcgctgaa ctggcgtgat gtcaatcggg agcttcttgt tgattgactg gatcaggcca 1260 gtgccgctcg ccttgtcttc aatgtaaacc ttgcgcagtg aagtcttgtt ctccttcgcc 1320
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<211> 8358
<212> ADN
<213> una parte del ADN del nuevo bacteriófago CJ 24
<400> 2
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Claims (10)
1. Un bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) que tiene una capacidad específica para eliminar la Escherichia coli patogénica aviar.
2. Una composición que comprende el bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) de la reivindicación 1 como ingrediente activo.
3. El bacteriófago OCJ24 (KCCM11462P) de la reivindicación 1 para su uso en la prevención de la colibacilosis aviar causada por la Escherichia coli patogénica aviar de los serotipos O-1 u O-78.
4. Un aditivo para piensos de aves que comprende la composición de la reivindicación 2.
5. Un aditivo para piensos de aves que comprende el aditivo para piensos de aves de la reivindicación 4.
6. Un aditivo para agua potable de aves que comprende la composición de la reivindicación 2.
7. Agua potable de aves que comprende el aditivo para el agua potable de aves de la reivindicación 6.
8. Un desinfectante que comprende la composición de la reivindicación 2.
9. Un detergente que comprende la composición de la reivindicación 2 como ingrediente activo.
10. La composición de la reivindicación 2 para su uso en la prevención de la colibacilosis aviar causada por la Escherichia coli patogénica aviar de serotipos O-1 u O-78.
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