KR101355158B1 - 조류 병원성 대장균의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 조류 병원성 대장균의 동정 방법 - Google Patents

조류 병원성 대장균의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 조류 병원성 대장균의 동정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA중합효소 베타 서브유닛 (rpoB) 유전자의 전체 염기서열을 이용하여 조류 대장균증의 주요 원인인 조류 병원성 대장균 (Avian Pathogenic Escherichia coli; APEC)의 유전형을 동정하는 기술에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 분석하여 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법, 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하기 위한 프라이머 및 염기서열을 결정하기 위한 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물 및 키트, 그리고 주요 조류 병원성 대장균의 유전형에 특이적인 rpoB 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 MLST (multilocus sequence typing) 를 이용한 조류 병원성 대장균 계통 분석을 대체할 수 있는 분자 동정법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

조류 병원성 대장균의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 조류 병원성 대장균의 동정 방법 {Primers for molecular identification of avian pathogenic Escherichia coli and method for identifying avian pathogenic Escherichia coli using the same}
본 발명은 RNA중합효소 베타 서브유닛 (rpoB) 유전자의 전체 염기서열을 이용하여 조류 대장균증의 주요 원인인 조류 병원성 대장균 (Avian Pathogenic Escherichia coli; APEC)의 유전형을 동정하는 기술에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 분석하여 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법, 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하기 위한 프라이머 및 염기서열을 결정하기 위한 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물 및 키트, 그리고 주요 조류 병원성 대장균의 유전형에 특이적인 rpoB 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 MLST (multilocus sequence typing) 를 이용한 조류 병원성 대장균 계통 분석을 대체할 수 있는 분자 동정법으로 유용하게 사용될 수 있다.
가금의 대장균증은 조류 병원성 대장균 (Avian Pathogenic Escherichia coli; APEC)에 의해 발생하는 중요 세균성 질병으로, 난각 오염에 의한 부화율 감소, 제대염, 기낭염, 두부 종창증 (swollen head syndrome), 봉와직염, 수란관염, 다발성 장막염, 간 포막염, 척추염 및 급성 패혈증 등 다양한 병증을 일으키며 피해의 정도에는 차이가 있으나 거의 모든 양계장에서 대장균증으로 인한 피해를 입고 있다. 대장균증의 발병은 양계장에서 항생제 사용의 주된 원인이 되고 있으며, 미국의 경우 대장균증에 의한 도계품의 품질 저하로 매년 18-20억불의 피해를 입는 것으로 보고되고 있다.
국내에서 조류 병원성 대장균의 발생 빈도 및 경제적 피해를 예측할 만한 근거가 부족하나 서울대학교 조류 질병학 교실에 의뢰된 병성감정 사례를 종합해보면, 2003년 94예 중 14예 (14.9%), 2004년 166예 중 22예(13.3%)에서 조류 병원성 대장균 (단독 또는 바이러스와의 혼합 감염)이 분리 및 동정되었다. 상당수의 대장균 사례가 현장 진단 만으로 항생제 처치가 이루어지는 점을 감안하면, 실제 발생 빈도는 월등히 높을 것으로 예상된다. 국내 육계 산업(약 6천억 원) 에서 5%의 생산성 저하를 초래하는 것으로 추정하여도 연간 약 300억 원의 손실이 발생되는 것으로 추정된다.
현재 가금의 대장균증 예방 백신으로서 허가를 받은 제품은 없는 실정이고, 대장균증의 피해를 본 농장에서 원인 대장균을 분리하여 백신을 제조하여 접종하는 자가 백신이 유일한 대안이지만 이는 사후 대책이므로 피해를 사전에 예방할 수 있도록 문제가 되고 있는 다양한 조류 병원성 대장균들을 대표할 수 있는 균주를 함유하는 안전하고 효과적인 백신의 개발이 요구되고 있지만 조류 병원성 대장균은 혈청형, 병원성, 항생제 내성, 계통 분류학적 특징 등이 다양하여 백신 균주 선발에 어려움이 있다.
현재 대장균은 계통 분석을 토대로 네 가지 (A, B1, B2, D) 계통군으로 분류된다 (Herzer et al., 1990, J Bacteriol 172, 6175-6181). 대장균의 대표적인 계통 분석 기술인 다좌위 서열 타이핑 (multi-locus sequence typing; MLST)은 6~8개 정도의 하우스키핑 유전자를 증폭하고, PCR 프라이머를 사용하여 증폭산물(amplicon)을 정제하고 염기서열을 분석 한 후, 분지도를 작성하여 근연 관계에 있는 균주를 분류하는 기술이다. 현재까지, 하우스키핑 유전자의 다양한 조합을 이용한 다양한 MLST 체계가 대장균 균주의 계통 분석에 적용되었다 (Adiri et al., 2003, FEMS Microbiol Lett 222, 199-203; Lecointre et al., 1998, Mol Biol Evol 15, 1685-1695; Wirth et al., 2006, Mol Microbiol 60, 1136-1151). 상기 계통 분석 기술에 의할 때, 요도감염대장균(uropathogenic E. coli) 및 신생아 뇌수막염 대장균(neonatal meningitis E. coli)과 같은 인간의 장외 병원성 대장균 (Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli; ExPEC) 의 경우 대부분 계통군 B2 또는 일부는 계통군 D로 분류되며 (Bingen et al., 1998, J Infect Dis 177, 642-650; Appl Environ Microbiol 74, 7043-7050; Russo and Johnson, 2000, J Infect Dis 181, 1753-1754; Zhao et al., 2009, Microbiology 155, 1634-1644), 비병원성의 공생균(commensal strain) 은 계통군 A 및 B1으로 분류된다 (Bingen et al., 1998, J Infect Dis 177, 642-650; Herzer et al., 1990, J Bacteriol 172, 6175-6181; Picard et al., 1999, Infect Immun 67, 546-553).
그러나, 인간의 병원성 대장균이 대부분 계통군 B2 또는 일부는 계통군 D 로 분류되는 것과는 달리, 조류 병원성 대장균의 경우 계통군 A, B1, B2 및 D 의 빈도는 각각 34.5%-71.0%, 4.1%-23.3%, 7.9%-44.5%, 및 12.0%-29.9% 로서, 계통군 A 가 가장 빈번한 것으로 보고되었다 (Dissanayake et al., 2008, Vet Microbiol 132, 355-363; Ewers et al., 2009, Appl Environ Microbiol 75, 184-192; Ghanbarpour et al., 2011, Trop Anim Health Prod 43, 153-157; Johnson et al., 2008, Microbes Infect 8, 1702-1713; Zhao et al., 2009, Microbiology 155, 1634-1644). 이와 같이 인간의 병원성 대장균과 조류 병원성 대장균에서 상대적으로 고빈도로 나타나는 계통군이 다른 것은, 인간 대장균 균주와 조류 병원성 대장균이 서로 다른 병원성 진화를 겪었음을 반영하는 것이다. 나아가, 조류 병원성 대장균에서는 계통군 분류와 임상적 심각성 간에 관련성이 없는 것으로 보고되었다 (Dissanayake et al., 2008, Vet Microbiol 132, 355-363; Ewers et al., 2009, Appl Environ Microbiol 75, 184-192; Ghanbarpour et al., 2011, Trop Anim Health Prod 43, 153-157; Johnson et al., 2008, Microbes Infect 8, 1702-1713; Zhao et al., 2009, Microbiology 155, 1634-1644).
따라서, MLST 등에 의한 네 가지 계통군의 분류 체계는 조류 병원성 대장균의 병원성이나 진화적 관련성을 이해하는 데 충분하지 않으며, 특히, MLST 기술은 근연 관계에 있는 균주의 분류만 가능하고 광범위한 적용이 어려운 문제가 있다. 또한, 하우스키핑 유전자들이 다양하게 조합될 수 있기 때문에 계통 분석 결과의 해석이 불명확할 수 있고, 다단계의 분석 과정이 필요한 번거로움이 있다 (Jaureguy et al., 2008, BMC Genomics 9, 560; Johnson et al., 2006, Microbes Infect 8, 1702-1713; Wirth et al., 2006, Mol Microbiol 60, 1136-1151). 따라서, 조류 병원성 대장균의 군집 구조 및 진화를 이해하기 위한, 보다 높은 식별력과 경제성을 지닌 새로운 계통 분석 기술 및 계통 분석 체계가 필요한 실정이다.
최근에는 대장균 및 시겔라(Shigella) 종 게놈을 비교 분석하여 pan- 및 core 게놈을 확인하고, 변이 유전자들의 계층적 클러스터링 (hierarchical clustering) 에 의해 대장균을 병원형 (pathotype) 및 임상적으로 연관된 혈청형 (serotype) 으로 구분한 연구 결과가 보고되었다 (Lukjancenko et al., 2010, Microb Ecol 60, 708-720). 그러나, 상기와 같이 전체 게놈의 염기서열을 분석하는 것은 시간과 비용이 많이 소모되는 문제가 있다.
또한, 최근 다른 박테리아의 계통 분석에 있어서, RNA 중합효소 베타 서브유닛 (RNA polymerase beta subunit)을 코딩하는 rpoB 유전자 내 리팜피신 내성을 유발하는 분절(rif)을 표적으로 하는 PCR 을 사용하여 다양한 병원균들을 동정 및 분류하는 기술이 사용되고 있다. 예를 들어, Mycobacterium (Kim 등, J Clin Microbiol 37:1714-1720, 1999), Borrelia (Lee 등, J Clin Microbiol 38:2557-2562, 2000), Bartonlla (Renesto 등, Research in Microbiology 151:831-836, 2000), Bacteroides (Ko, Kuwahara 등, Clin Microbiol Infect 13:48-54, 2007), 및 Legionella (Ko 등, J Clin Microbiol 40:2653-2658, 2002) 속 미생물의 분류와 동정에 rpoB 유전자가 사용된 바 있다. 상기 rpoB 유전자를 이용한 동정법의 경우 대부분 고변이 부분을 포함하는 부분 염기서열을 사용하였다. 그러나, rpoB 유전자를 조류 병원성 대장균의 군집 구조와 특정 클론의 진화 연구에 사용한 적은 없다.
이에, 본 발명자들은 대장균증에 걸린 닭에서 분리한 조류 병원성 대장균 78 주에 대하여 기존의 방법에 따라 계통군을 정하고, 이와는 별도로 각 균주들의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하고 이를 토대로 조류 병원성 대장균을 11개의 유전형(I-XI) 으로 분류함으로써, 조류 병원성 대장균의 군집 구조를 이해하기 위한 새로운 계통 분석법 및 계통 분석 체계를 확립하였다. 나아가 상기 계통 분석 기술이 기존의 MLST 를 대체 또는 보완할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 rpoB 유전자를 이용한 계통 분석을 위하여, 모든 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자 전체를 증폭할 수 있는 프라이머 및 상기 전체 유전자 염기서열을 결정할 수 있는 프라이머를 설계하였으며, 이 프라이머들을 사용하여 본 발명 계통 분석 체계에서 표준 균주로 사용할 수 있는 조류 병원성 대장균들의 rpoB 염기서열을 확보하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 RNA 중합효소 베타 서브유닛 (rpoB) 유전자의 전체 염기서열을 이용하여 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 기술을 제공한다. 또한, 본 발명은 조류 병원성 대장균의 전체 rpoB 유전자를 증폭 및 결정할 수 있는 프라이머, 그리고 상기 프라이머를 사용하여 확인된 표준 균주들의 rpoB 전체 염기서열 및 이의 염기서열 정보를 이용하여 효과적으로 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 기술을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 단계를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하기 위한 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하기 위한 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프라이머를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프라이머를 사용하여 확인된, 주요 조류 병원성 대장균의 rpoB 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 주요 조류 병원성 대장균의 rpoB 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 RNA 중합효소 베타 서브유닛 (rpoB) 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 단계를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법에 관한 것이다.
이를 위한 바람직한 양태로서, 본 발명은
(1) 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 단계;
(2) 상기 증폭된 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하는 단계; 및
(3) 상기 단계 (2)에서 얻어진 염기서열을 표준 균주의 rpoB 유전자의 염기서열과 비교하여 유전형을 결정하는 단계를 포함하는,
조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 단계 (1) 및 단계 (2) 는 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 염기서열(서열번호 11) 중에서 표 1에 기재된 보존 부분의 염기 서열에 상보적이며 7 내지 50 bp 의 연속된 염기서열을 가지는 프라이머를 사용하여 수행하는 것일 수 있다.
보존부분의 염기 위치
1-71 1114-1139 2107-2130 3128-3152
73-212 1190-1250 2137-2144 3154-3203
223-392 1252-1298 2152-2198 3211-3275
394-467 1300-1319 2200-2264 3295-3326
469-506 1339-1364 2266-2288 3328-3344
508-524 1372-1394 2296-2321 3352-3407
526-554 1417-1466 2338-2354 3409-3425
556-593 1468-1496 2507-2525 3427-3443
595-611 1498-1520 2584-2600 3445-3461
646-662 1522-1592 2632-2660 3463-3494
664-708 1609-1652 2662-2672 3496-3557
710-755 1654-1721 2702-2729 3574-3620
760-803 1738-1784 2731-2765 3622-3641
820-848 1786-1814 2767-2789 3649-3665
862-902 1816-1853 2791-2825 3667-3711
904-932 1868-1898 2827-2906 3713-3752
937-953 1906-1928 2908-2924 3754-3787
955-989 1954-2010 2926-2963 3789-3842
991-1013 2014-2060 2981-2999 3860-3899
1036-1073 2062-2081 3010-3068 3901-4029
1075-1103 2083-2105 3070-3126
또한 바람직하게, 상기 단계 (1) 은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 사용하여 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 것일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 단계 (2) 는 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 1종 이상의 프라이머를 사용하여 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하는 것일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 단계 (3) 에서 표준 균주의 rpoB 유전자의 염기서열은 서열번호 10 내지 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 염기서열 (서열번호 11)중에서 상기 표 1에 기재된 보존 부분의 염기 서열에 상보적이며 7 내지 50 bp 의 연속된 염기서열을 가지는 프라이머에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는, 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열 증폭용 프라이머 쌍에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는, 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열 결정용 프라이머에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 10 내지 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 조류 병원성 대장균의 rpoB 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 조류 병원성 대장균의 rpoB 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
조류 대장균증은 가금류에서 난각 오염에 의한 부화율 감소, 제대염, 기낭염, 두부 종창증, 봉와직염, 수란관염, 다발성 장막염, 간 포막염, 척추염 및 급성 패혈증 등 다양한 병증을 일으키는 세균성 질병을 말한다. 또한, 조류 병원성 대장균이란 조류 대장균증을 일으키는 원인이 되는 대장균을 말한다.
기존에 MLST (multilocus sequence typing) 가 대장균의 계통 분석 및 계통군 (A, B1, B2 및 D) 분류에 사용되어 왔으나, 하우스키핑 유전자의 재조합 및 다단계의 분석 과정으로 인해 적용 범위에 제한이 있고, 인간 대장균에 적용되던 네 가지 계통군의 분류 체계는 조류 병원성 대장균의 병원성이나 진화적 관련성을 이해하는 데 충분하지 않은 문제가 있었다. 이에, 본 발명에서는 조류 병원성 대장균 균주 78 주의 전체 rpoB 염기서열을 결정하고 이를 이용하여 새로운 계통 분석법을 확립하였다.
본 발명자들은 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 분석하여 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법을 확립하기 위하여, GenBank 및 EMBL 에 등록된 대장균의 rpoB 유전자 서열을 다중배열하여, 보존 부분을 토대로 하여 rpoB 의 완전한 코딩 영역을 증폭하기 위한 프라이머 (P1, P8R) 및 서열분석을 위한 7개 프라이머 (P2, P1R, P3, P4, P5, P6, P7)를 디자인하였다. 또한, 이 프라이머들을 이용하여, 1985년부터 2005년까지 대장균증에 걸린 국내 닭으로부터 분리한 조류 대장균 균주 78주, 그리고 기존에 알려진 다양한 인간 대장균 균주 및 대장균과 같은 종으로 보고된 시겔라 종 균주들의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 분석하여 데이터베이스를 구축하였다 (실시예의 표 2 참조). 또한, 동정하고자 하는 조류 병원성 균주의 rpoB 전체 염기서열을 증폭 및 결정하고 상기 데이터베이스의 염기서열과 비교 분석함으로써 조류 병원성 균주를 동정하는 새로운 방법을 개발하고, 아울러 상기 균주들 중 표준 균주 41주 (서열번호 10 내지 서열번호 50)를 선정 및 제공하게 되었다.
본 발명에 따르면, 조류 병원성 대장균을 11 개의 유전형(I-XI) 으로 분류할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 실험 대상 조류 병원성 대장균 균주의 60.8%(47/78)이 유전형 I 로 나타났다. 또한, 유전형 I, II, III, VI, VII 및 XI 는 비병원성 인간 공생 (commensal) 균주 또는 병원성(virulent) 균주와 클러스트를 형성하였으나, 유전형 IV, V, VIII, IX 및 X 는 인간 대장균과는 다른 조류 병원성 대장균 고유의 특성을 나타내었으므로, 대부분의 조류 병원성 대장균 균주들는 인간의 대장균과는 다른 유전적 배경을 가진다는 것을 알 수 있었다. 특히, 현재까지는 인간 병원성 대장균이 대부분 계통군 B2 로 보고되었으므로 조류 병원성 대장균의 계통군 B2 가 잠재적인 인수감염병 병원균으로 의심받아 왔으나, 본 발명의 유전형 동정 결과에 따르면 유전형 I, V, XI 등 다양한 그룹에 계통군 B2 가 포함되어 있으며, 오직 유전형 XI 가 조류 병원성 균주 및 인간 병원성 균주(ExPEC)로 구성되어 있으므로, 유전형 XI로 분류된 조류 병원성 대장균 균주가 가금 산업에서 인수공통 감염증의 잠재적 위험 인자로서 각별히 고려되어야 함을 알 수 있었다 (이상, 도 1 참조).
따라서, 본 발명의 계통 분석법 및 이에 의한 유전형 동정 체계를 이용하면, 조류 병원성 대장균의 진화적 관계를 정확하고 용이하게 파악할 수 있고, 이러한 정보들은 가금의 대장균증 백신 균주의 선발에 이용하거나, 인수공통전염병의 원인체를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 rpoB 트리의 클러스터링 패턴은 MLST 을 토대로 한 트리와 유사하였으며, rpoB 의 계통 분석은 MLST 법에 비하여 간단하므로, 본 발명의 계통 분석이 MLST 를 대체 또는 보조할 수 있음을 확인할 수 있다 (도 2 참조).
어떤 유전자가 세균의 계통적 관계를 잘 반영하는 연대기적 분자 표지가 되기 위해서는, 표적 유전자가 모든 세균에서 기능적으로 필수적이고 보존되어야 하고, 후천적 영향에 의한 균 종간 염기서열의 변이가 일어나지 않으며, 계통 관계를 나타내기에 적절한 종 간 다양성 (interspecies variation)과 같은 속 내의 균종 사이의 보존성 (intraspecies conservation)을 보여야 한다. rpoB 유전자의 경우 세균의 전사에 관여하는 필수 효소를 코딩하므로 모든 균주에 필수적이고 보존되어 있으며, 균 종간 염기서열의 변이가 잘 일어나지 않고, 다른 속 균주들에서 다양성과 보존성이 보고되어 있으므로 (Kim 등, J Clin Microbiol 37:1714-1720, 1999; Lee 등, J Clin Microbiol 38:2557-2562, 2000), 분자 표지로 적절하다. 그러나, rpoB 유전자를 조류 병원성 대장균의 군집구조와 특정 클론의 진화 연구에 사용한 적은 없다.
본 발명과 같이 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 분석하여 조류 병원성 대장균의 동정에 사용할 경우, 보존된 부분에서 유래된 프라이머를 사용하므로 지금까지 알려진 모든 조류 병원성 대장균들에 적용 가능하다. 또한, 조류 병원성 대장균을 11개의 유전형으로 분류함으로써 진화적 관계를 정확하고 용이하게 파악할 수 있고, 이러한 정보들은 가금의 대장균증 백신 균주의 선발이나 인수공통전염병 원인체의 검출 등에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭 또는 결정할 수 있는 프라이머를 제공한다.
본 발명에서 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭 또는 결정할 수 있는 프라이머는, 모든 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자 전체를 증폭 또는 결정할 수 있는 프라이머로서, 바람직하게는 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 염기서열 (서열번호 11)중에서 표 1에 기재된 보존 부분의 염기 서열에 상보적이며 7 내지 50 bp 의 연속된 염기서열을 가지는 프라이머일 수 있다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머는, 모든 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자 전체를 증폭시킬 수 있는 프라이머로서, 서열번호 1 및 서열번호 2 의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍일 수 있다.
또한, 보다 바람직하게, 본 발명에서 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하기 위한 프라이머는, 모든 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자 전체를 결정할 수 있는 프라이머로서, 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 1종 이상의 프라이머일 수 있다.
본 발명의 프라이머는 조류 병원성 대장균들의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하고 염기서열을 결정하기 위한 최초의 프라이머들로, GenBank 및 EMBL 에 등록된 대장균의 rpoB 게놈 서열을 다중배열하여 확인한 보존 부분을 토대로 하여 rpoB 전체 염기서열을 증폭 및 결정할 수 있도록 고도로 계산되어 제조된 프라이머이다. 즉, 본 발명에서는 조류 병원성 대장균 사이에서 rpoB 유전자의 보존된 부분을 최초로 확인하고 (표 1) 이를 토대로 하여 프라이머를 설계하였으며, 본 발명의 프라이머는 지금까지 알려진 모든 조류 병원성 대장균들에 적용할 수 있다.　
또한, 본 발명은 전세계적으로 빈발하는 조류 병원성 대장균의 유전형들에 특이적인 rpoB 의 전체 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.　
바람직하게, 본 발명에서 제공하는 rpoB 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 10 내지 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 rpoB 유전자의 증폭 및 결정용 프라이머들을 사용하여 확인된 것으로, 독자적인 조류 병원성 대장균 동정용 데이터베이스를 구축할 수 있다.
특히, 이 중에서 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 42의 염기서열은 Genbank 검색 상에서 새로운 염기서열로 밝혀졌다. 따라서, 보다 바람직하게, 본 발명에서 제공하는 rpoB 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 조류 병원성 대장균의 rpoB 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에서 분석된 서열번호 10 내지 50의 염기서열을 다중배열하여 서로의 염기서열을 비교해본 결과, 모두 다른 염기서열을 가지고 있어 종간 염기서열 다양성(interspecies variation)을 나타내었으며 (도 3 참조), 모두 다중배열 상에서 염기서열의 삽입이나 결실 없이 4029bp의 염기를 코딩하고 있었으므로, rpoB 의 전체 염기서열이 연대기적 분자 표지로 적합함을 확인할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드의 전체 염기서열 및 이를 포함하는 해당 균주의 유전형을 미리 알고 있으므로, 이 염기서열을 기준으로 하여 분석 대상 균주의 rpoB 염기서열과 비교함으로써 분석 대상 균주의 유전형을 결정하고 계통 관계를 분석하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 프라이머 및 rpoB 폴리뉴클레오티드 염기서열을 이용하여 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법은 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 상기 조류 병원성 대장균의 유전형을 동정하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(1) 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 단계;
(2) 상기 증폭된 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하는 단계;
(3) 상기 단계 (2)에서 얻어진 염기서열을 표준 균주의 rpoB 유전자의 염기서열과 비교하여 유전형을 결정하는 단계.
상기 단계 (1)은 동정하고자 하는 미지의 조류 병원성 대장균 균주, 즉 목적 균주의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 단계이다.
바람직하게, 상기 단계는 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머로서, 표 1에 기재된 rpoB 유전자 보존 부분의 염기 서열에 상보적이며 7 내지 50 bp 의 연속된 염기서열을 가지는 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의하여 수행할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 단계는 서열번호 1 및 서열번호 2 의 염기서열을 가지는 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭에 의하여 수행할 수 있다. PCR 증폭은 본 기술분야의 전문가에게 알려진 분석법을 모두 사용할 수 있다.
상기 단계 (2)는 상기 단계 (1) 에서 증폭된 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하기 위한 프라이머로서, 바람직하게는 표 1에 기재된 rpoB 유전자 보존 부분의 염기 서열에 상보적이며 7 내지 50 bp 의 연속된 염기서열을 가지는 프라이머를 사용하여 수행할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지는 1종 이상의 프라이머를 이용한 PCR 증폭산물 정제 키트 등에 의하여 수행할 수 있다.
상기 단계 (3)은 상기 단계 (2)에서 얻어진 염기서열을 표준 균주의 rpoB 유전자의 염기서열과 비교하여 유전형을 결정하는 단계로, 바람직하게, 상기 표준 균주의 rpoB 유전자의 염기서열은 서열번호 10 내지 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 서열번호 10 내지 서열번호 50의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 rpoB 유전자의 증폭 및 결정용 프라이머들을 사용하여 새로이 확인된 것으로, 그 전체 염기서열 및 해당 균주의 유전형을 미리 알고 있으므로, 상기 염기서열을 기준으로 하여 목적 균주의 rpoB 염기서열과 비교함으로써 목적 균주의 유전형을 결정하고 계통 관계를 분석할 수 있다. 표준 균주와 목적 균주의 rpoB 전체 염기서열의 차이를 이용한 분자 생물학적 방법은 모두 본 발명에 적용할 수 있다.
바람직한 일 예로, 목적 균주의 rpoB 염기서열을 분석한 후에 이를 표준 균주의 rpoB 염기서열과 비교하여 목적 균주의 유전형을 결정하기 위하여, 미리 구축된 표준 균주의 rpoB 염기서열이 정렬된 데이타베이스에 동정하고자 하는 균의 rpoB염기서열을 추가시키고, 다시 염기서열 정렬을 수행하여 계통도를 완성할 수 있다. 계통도가 완성되면 해당되는 균종에 근접하여 가지를 형성하게 되므로 계통도로 유전형을 결정할 수 있다. 상기 계통도를 완성하기 위하여, Mega 소프트웨어 등을 이용한 Neighbor-joining 방법을 사용할 수 있으며, 계통 가지의 지지도는 부트스트랩 분석(bootstrap replications)을 100회 내지 1000회 반복 시행하여 결정할 수 있다.
상기 혈청형 동정 방법에 의하여, 조류 대장균증에 걸린 가금류로부터 조류 병원성 대장균으로 의심되는 미지의 균이 분리되었을 때, 특이적 프라이머로 rpoB 전체 염기서열을 증폭 및 결정하고, 이를 이미 확보한 표준 균주들의 염기서열과 비교함으로써 유전형을 판별할 수 있으며, 종래의 계통 분석 방법에 비해 보다 정확하게 이루어지게 되어 조류 대장균증의 백신 균주 선발이 효과적으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 기술한 프라이머를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 염기서열 (서열번호 11)중에서 표 1에 기재된 보존 부분의 염기 서열에 상보적이며 7 내지 50 bp 의 연속된 염기서열을 가지는 프라이머를 포함하는, 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물을 제공한다.
또한 바람직하게, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는, 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열 증폭용 프라이머를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물을 제공한다. 보다 바람직하게, 상기 조성물은 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 rpoB 유전자의 전체 염기서열 결정용 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
또한 바람직하게, 본 발명은 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 rpoB 유전자의 전체 염기서열 결정용 프라이머를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 키트, allele-specific PCR 키트, 실시간 PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 서던 블랏팅 키트일 수 있다. 상기 키트는 상기 프라이머 외에도, DNA 중합효소, DNA 염색 시약 또는 적합한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 rpoB 증폭 및 염기서열 결정용 프라이머와 신규 APEC 특이 rpoB 염기 서열은 조류 병원성 대장균 분류 및 동정에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 계통 분석법 및 이에 의한 유전형 동정 체계를 이용하면, 조류 병원성 대장균의 진화적 관계를 정확하고 용이하게 파악할 수 있고, 이러한 정보들은 조류 대장균증 백신 균주의 선발에 이용하거나, 인수공통전염병의 원인체를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 대장균의 rpoB 염기서열을 사용하여 neighbor-joining 법으로 계통분석 하여 조류 병원성 대장균 균주들을 11개 유전형으로 분류한 결과를 나타낸다.
도 2는 MLST 체계에 기초한 대장균 표준 균주의 계통 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 제공하는 41주의 표준 균주의 rpoB 염기서열의 상동성 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 준비 및 프라이머의 제조
1-1. 균주의 준비
78주의 조류 병원성 대장균 (Avian Pathogenic Escherichia coli; 이하, "APEC") 균주들은 1985년부터 2005년까지 대장균증에 걸린 국내 닭으로부터 분리하였다 (표 2). 이들 APEC 균주들은 모두 VITEK® Gram-Negative Identification (GNI) Cards (bioMerieux Vitek, Hazelwood, MO) 를 사용하여 동정한 결과 모두 대장균으로 확인되었다. 분리된 균주들은 분석을 수행하기 전까지 20 % (v/v) 글리세롤을 함유하는 LB 브로쓰에서 -70 ℃ 에서 보존하였다. 본 연구에서 분석된 대장균 균주들의 병원형 및 혈청형을 도 1에 나타내었으며, 상기 혈청형은 이전의 연구에서 결정된 것이다 (Jeong 등, 2011, Pathotyping of Avian Pathogenic E. coli strains in Korea. Journal of Veterinary Science, In press).
균주 등록번호
(서열번호)		 균주 등록번호
(서열번호)		 균주 등록번호
(서열번호)		 균주 등록번호
(서열번호)
E3 (서열번호23) E65 E137 F11 AAJU02000047
(서열번호44)
E5 E66 (서열번호10) E138 FRIK2000 ACXO01000202
E10 E68 (서열번호19) E139 FRIK966 ACXN01000121
E11 E69 E140 FVEC1412 GG749233
E13 E70 E141 H10407 FN649414
E15 E80 (서열번호34) E147 HS CP000802
E17 E84 11368 AP010953 IAI1 CU928160
E18 E86 042 FN554766 IAI39 CU918264
(서열번호36)
E20 E89 (서열번호11) 101-1 AAMK02000037 IHE3034 CP001969
E21 E90 (서열번호29) 11128 A010960
(서열번호25)		 KO11 CP002516
E22 (서열번호49) E91 12009 AP010958 LF82 CU651637
(서열번호47)
E23 E95 536 CP000247
(서열번호45)		 MS196-1 ADUD01000221
(서열번호20)
E24 E101 (서열번호22) 53638 AAKB02000001 NA114 CP002797
E25 E102 55989 CU928145
(서열번호16)		 NRG_857C CP001855
(서열번호46)
E26 E103 ABU83972 CP001671 OP50 ADBT01000723
(서열번호31)
E27 E105 APEC O1 CP000468 S88 CU928161
E28 (서열번호26) E107 ATCC8739 CP000946 Sakai BA000007
(서열번호37)
E29 E109 B088 GG749152 SB Sb227 CP000036
E31 E110 B171 AAJX02000048
(서열번호14)		 SB CDC3083-94 CP001063
E32 E111 B185 GG749189
(서열번호28)		 SD Sd197 CP000034
E33 E112 B7A AAJT02000064 SD 1012 AAMJ01000024
E35 (서열번호21) E113 BL21 AM946981 SE11 AP009240
(서열번호13)
E36 E117 BW2952 CP001396 SE15 AP009378
(서열번호41)
E38 (서열번호33) E119 CB9615 CP001846 SF 2a2457T NC_004741
E39 (서열번호17) E120 CFT073 AE014075
(서열번호43)		 SF 2a 301 AE005674
E42 E124 (서열번호27) DH1(K12) CP001637 SF 5 8401 CP000266
E43 E125 E110019 AAJW02000004
(서열번호18)		 SMS-3-5 CP000970
(서열번호39)
E48 E126 (서열번호35) E22 AAJV02000051
(서열번호15)		 SS Ss046 CP000038
E49 E127 E2348/69 FM180568
(서열번호40)		 TB182A EU891633
E51 E129 (서열번호42) E24377A CP000800
(서열번호24)		 TW14359 C0001368
(서열번호38)
E52 E130 EC4042 ABHM0200001 UM146 CP002167
E53 E131 (서열번호32) EC4045 ABHL02000001 UMN026 CU928163
E55 E132 (서열번호12) EC4115 CP001164 UMNK88 CP002729
E59 E133 (서열번호30) EC4206 ABHK02000001 UTI89 CP000243
(서열번호50)
E61 E135 ED1a CP928162
(서열번호48)		 W CP002185
E64 E136 EDL933 AE005174 W3110(K12) AP009048
EF ATCC35469 CU928158
1-2. 프라이머의제조
EGenBank 및 EMBL 에 등록된 대장균의 rpoB 유전자를 Bioedit version 1 (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA) 프로그램을 사용하여 비교하여, 대장균 rpoB 유전자에서 보존된 부분과 변이 부분을 확인하였으며, 이를 표 1 및 표 3에 정리하였다. 변이 뉴클레오티드 위치의 수는 180개 (Shigella 분리주 포함하여 비교한 경우)였으며, 이 중 아미노산에 변화가 없는 뉴클레오티드 변이 (synonymous) 는 175개, 아미노산에 변화가 있는 뉴클레오티드 변이 (nonsynonymous) 는 5개였다. 분석에 사용된 APEC 균주들 중, E132 균주는 R994C 아미노산 변화를 나타내었고, GenBank 균주 ED1a, OP50, 536 및 LF82 균주는 각각 P288S, D711N, A1043S, 및 A1263E 의 단일 아미노산 변화를 나타내었다.
본 발명자들이 제공한 표 1 및 표 3의 정보를 토대로 하여, 상기 돌연변이 부분은 DNA 칩, allele-specific PCR, RFLP 및 서던 블랏팅 등을 이용한 대장균 동정에 유용하게 활용될 수 있고, 보존된 부분은 다양한 조류 병원성 균주의 염기서열 증폭과 염기서열 결정(sequencing)을 위한 새로운 프라이머 설계에 활용할 수 있다.
보존부분 a 염기서열 돌연변이 보존부분 a 염기서열 돌연변이
1-71 72R 2107-2130 2131R,2136R
73-212 213M 2137-2144 2145K,2151W
223-392 222Y 2152-2198 2199W
394-467 468Y 2200-2264 2265R
469-506 507R 2266-2288 2289Y,2295Y
508-524 525Y 2296-2321 2322K,2331W,2334R,2337H
526-554 555Y 2338-2354 2355Y,2370Y,2373Y,2487Y,2490Y,2496Y,2506Y
556-593 594Y 2507-2525 2526Y,2532R,2538K,2541R,2547R,2562Y,2568Y,2583K
595-611 612R,621M,633Y,645Y 2584-2600 2601R,2616Y,2631R
646-662 663Y 2632-2660 2661W
664-708 709Y 2662-2672 2673Y,2682R,2685R,2697R,2701Y
710-755 756Y,759Y 2702-2729 2730S
760-803 804Y,807Y,819Y 2731-2765 2766Y
820-848 849R,861Y 2767-2789 2790Y
862-902 903Y 2791-2825 2826Y
904-932 933Y,936W 2827-2906 2907D
937-953 954Y 2908-2924 2925Y
955-989 990Y 2926-2963 2964R,2974Y,2980Y
991-1013 1014M,1017Y,1020Y,1035R 2981-2999 3000R,3009M
1036-1073 1074Y 3010-3068 3069Y
1075-1103 1104Y,1113Y 3070-3126 3127K
1114-1139 1140W,1143K,1150Y,1155Y,1161Y,1173Y,1182Y,1189Y 3128-3152 3153R
1190-1250 1251Y 3154-3203 3204Y,3210Y
1252-1298 1299Y 3211-3275 3276K,3282R,3292Y,3294R
1300-1319 1320Y,1326Y,1335H,1338Y 3295-3326 3327Y
1339-1364 1365Y,1371Y 3328-3344 3345Y,3349Y,3351R
1372-1394 1395Y,1402Y,1407R,1416R 3352-3407 3408R
1417-1466 1467W 3409-3425 3426Y
1468-1496 1497Y 3427-3443 3444K
1498-1520 1521Y 3445-3461 3462Y
1522-1592 1593S,1596M,1599Y,1605R,1608Y 3463-3494 3495Y
1609-1652 1653Y 3496-3557 3558S,3573R
1654-1721 1722Y,1728Y,1731R,1737R 3574-3620 3621Y
1738-1784 1785Y 3622-3641 3642Y,3645Y,3648Y
1786-1814 1815Y 3649-3665 3666R
1816-1853 1854R,1867Y 3667-3711 3712Y
1868-1898 1899R,1905Y 3713-3752 3753Y
1906-1928 1929Y,1941Y1953Y 3754-3787 3788M
1954-2010 2011Y,2013K 3789-3842 3843Y,3859Y
2014-2060 2061Y 3860-3899 3900Y,3906Y
2062-2081 2082Y 3901-4029
2083-2105 22106K
a rpoB 코딩 영역의 뉴클레오티드는 개시 코돈부터 종결 코돈까지 번호를 부여하였다 (서열번호 11 기준).
1-3. 프라이머의 제조
본 발명에서는 GenBank 및 EMBL 에 등록된 대장균의 rpoB 유전자를 Bioedit version 5.0.9.1 (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA) 프로그램을 사용하여 비교하여, 대장균 rpoB 유전자에서 보존된 부분으로부터 rpoB 의 완전한 코딩 영역을 증폭하기 위한 프라이머 (P1, P8R) 및 서열분석을 위한 7개 프라이머 (P2, P1R, P3, P4, P5, P6, P7)를 디자인한 후 ㈜바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 각 프라이머의 염기서열과 위치를 아래 표 4에 표시하였다.
Primer Sequence (5' to 3') Locationa Usage 서열번호
P1 ATGGTTTACTCCTATACCGAGAA 1-23 PCR 1
P8R TTACTCGTCTTCCAGTTCGATGT 4029-4007 PCR 2
P2 CAGATCCTCGACCTGTTCTT 655-674 Sequencing 3
P1R CACTTTACCGTTAGCTTCGAT 783-763 Sequencing 4
P3 GAAGTTCAACCGTTCTCTGCT 1209-1229 Sequencing 5
P4 ATCGAAGAAGGCAACTACGTT 1825-1845 Sequencing 6
P5 CGAAGACTCCATCCTCGTAT 2436-2455 Sequencing 7
P6 AACAGCTGGCTGAGCAGTAT 3035-3054 Sequencing 8
P7 GAAGTTATGCGTCTGGCTGA 3502-3521 Sequencing 9
a rpoB 코딩 영역의 뉴클레오티드는 개시 코돈부터 종결 코돈까지 번호를 부여하였다.
실시예 2. APEC 균주들의 전체 rpoB 서열 분석
총 APEC DNA 는 G-스핀 게놈 DNA 추출 키트 (iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea) 를 사용하여 제조자의 지침서에 따라 추출하였다. PCR 용액은 10 x buffer (5 ㎕), dNTPs (2.5 mM, 1 ㎕), 전방향 및 역방향 프라이머 (서열번호 1 및 2) (10 pmol/㎕, 1 ㎕ each), Taq DNA 중합효소 (5 U/㎕; Macrogen, Seoul, Korea; 1 ㎕), 증류수 (40 ㎕), 및 주형 DNA (50 ng/㎕, 1 ㎕)로 구성하였다. PCR 조건은 94℃ 에서 3 분 수행 후, 94℃ 에서 30 초, 54℃ 에서 20 초, 및 72℃ 에서 4.5 분으로 40 사이클 수행하고, 최종 신장 단계로 72℃ 에서 7 분 수행하였다. 앰플리콘(amplicon) 은 1.0% 아가로스 젤에서 전기영동으로 분석하였고, 1 kb ladder (Macrogen)을 분자 사이즈 마커로 사용하였다. PCR 증폭산물은 PCRquick Spin Kit (iNtRON Biotechnology) 를 사용하여 제조자의 지침서에 따라 정제하였고, ABI3711 자동서열분석기 (Macrogen) 를 사용하여 서열 분석하였다.
그 결과, 대장균의 rpoB 의 전체 코딩 영역을 PCR 증폭용 프라이머 (서열번호 1, 2)를 사용하여 성공적으로 증폭하였고, 상기 서열 분석용 프라이머 세트 (서열번호 3 내지 9)는 전체 영역을 분석하는데 충분한 효과를 나타내었다. 대장균의 rpoB 전체 코딩 영역은 종결 코돈을 포함하어 4,029 뉴클레오티드로 구성되어 있었다. 대장균 균주들 간의 rpoB 뉴클레오티드 유사도는 98.4%-100% 였다. 본 실시예에서 분석된 대장균의 전체 rpoB 염기서열은 서열번호 10 내지 50에 나타내었다.
실시예 3. 인 실리코 ( in silico ) 계통군 분류
3-1. 인 실리코 계통군 분류
BLASTN suite 에서 chuA, yjaA 및 TspE4 의 전방향 및 역방향 프라이머의 쿼리 서열을 사용하여 GenBank 내 대장균 및 시겔라 균주의 인 실리코 (in silico) 계통군 분류를 수행하였다 (Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215, 403-410; Clermont et al., 2000, Appl Environ Microbiol 66, 4555-4558). 이전 연구에서 본 발명자들은 yjaA.1 (3' 말단으로부터 다섯번째 C→T), yjaA.2 (5' 말단으로부터 네번째 G→A), 및 TspE4.C2 (5' 말단으로부터 다섯번째 C→T 및 3' 말단으로부터 세번째 A→G) 프라이머 내 일부 돌연 변이를 규명하였으며, 상기 돌연변이 서열을 쿼리 분석하였다 (Jeong 등, 2011, Pathotyping of Avian Pathogenic E. coli strains in Korea. Journal of Veterinary Science, In press). 상기 쿼리 결과에 따라, 계통군을 결정하였다. 각 표준 균주의 계통군은 도 1에 나타내었다.
결정된 오버래핑 서열을 ChromasPro version 1.5 (Technelysium Pty Ltd., Brisbane, Australia)을 사용하여 하나의 완전한 서열로 조립하였다. GenBank 에서 이용가능한 모든 완전한 rpoB 서열은 K12 W3110 균주 (AP009048) (표 2)의 rpoB 서열의 전체 코딩 영역을 이용한 BLAST 검색에 의하여 수집하였다. 뉴클레오티드 유사도, 변이 뉴클레오티드 비교, 및 rpoB 뉴클레오티드의 번역에는 Bioedit version 5.0.9.1 (Ibis Biosciences) 을 이용하였다. 계통발생학적 분석은 MEGA5 프로그램의 neighbor-joining 법(Tamura-Nei distance, bootstrapping 500 repeats) 을 이용하였으며, 대장균의 등재 번호는 표 2에 기재되어 있다.
전체 rpoB 뉴클레오티드 서열의 계통 분석한 결과, 78 주의 APEC 균주들을 11개 유전형 (I-XI) 으로 분류되었으며 이 중 유전형 I은 60.8%(47/78)를 차지하여 가장 많았고, 유전형 I, II, III, VI, VII 및 XI은 사람의 대장균과 함께 클러스터를 형성하였으나, 유전형 IV, V, VIII, IX 및 X은 사람 대장균과는 다른 독특한 염기서열을 보였다. 특히 유전형 XI은 사람의 병원성 대장균 (ExPEC)과 매우 유사한 염기서열을 보여 인수공통전염병의 원인체인 것으로 확인되었다 (도 1 참조).
구체적으로, 유전형 I 은 APEC 균주 47 주 (47/78, 60.3%; E5, E11, E13, E17, E21, E24, E25, E27, E29, E31, E36, E42, E43, E48, E49, E51, E52, E53, E55, E61, E66, E69, E70, E84, E86, E89, E91, E95, E102, E103, E105, E107, E110, E111, E112, E113, E125, E127, E130, E132, E135, E136, E137, E138, E139, E140, E141), IAI1 (O8, B1), HS (O9:H4, A), 그리고 B088, KO11, W, SE11 (O152:H28, B1), 및 B7A (ETEC, O148:H8) 를 포함하였다. 유전형 I 균주 중에서 E66, E102 및 SE11 는 주요 균주와 하나의 뉴클레오티드가 다르며, E132 는 주요 균주와 두 개의 뉴클레오티드에 차이가 있었다.
유전형 II 는 E39 (APEC), B171 (EPEC, O111:NM), 55989 (EAEC, B1), E22 (EPEC, O103:H2), 및 11128 (EHEC, O111:H-) 를 포함하였다.
유전형 III 는 APEC 균주 12 주 (15.4%; E3, E10, E15, E18, E26, E32, E33, E35, E68, E101, E117, E147), 그리고 MS196-1, UMNK88, H10407 (ETEC, O78:H11:K80, A), 및 K12 균주 (BW2952, W3110 및 DH1) 를 포함하였다.
유전형 IV, V, VIII, IX 및 X 는 각각 2주 (E28 및 E109), 3주 (E119, E120 및E124), 3주 (E23, E38 및 E80), 및 1주 (E126), 1주 (E129) 의 APEC 균주를 포함하였다.
유전형 VI 은 APEC 균주 3 주 (E20, E90, 및 E133), 그리고 101-1, OP50, BL21 및 ATCC 8739 균주를 포함하였다.
유전형 VII 은 E131 (APEC), UMN026 (ExPEC, O17:H52:K1, D), 042 (EAEC, O44:H18), 및 FVEC1412 균주를 포함하였다.
유전형 XI 는 APEC 균주 4 주 (E22, E59, E64, E65) 및 인간 병원성 (virulent) B2 계통군 균주인, IHE3034 (ExPEC, O18:H7:K1, B2), S88 (ExPEC, O45:H1:K7, B2), APEC O1(APEC, O1:K1:H7, B2), UTI89 (UPEC, O18:H1:K7, B2), 및 UM146 (AIEC, B2) 를 포함하였다.
rpoB 트리에서 계통군 A, B1, B2 및 D 의 구분은 명확하지 않았다. APEC 균주의 계통군은 이전의 연구에서 결정된 것이다 (Jeong 등, 2011, Pathotyping of Avian Pathogenic E. coli strains in Korea. Journal of Veterinary Science, In press). 유전형 I 에 해당하는 APEC 균주는 다양한 계통군으로 구성되어 있으며, 계통군 A1, B1, B2, 및 D 에 해당하는 각각 16, 12, 10 및 3 주의 균주를 포함하였다. 유전형 III 및 VI 는 주로 계통군 A 로 구성되었으나, E35 및 E90 은 계통군 D로 분류되었다. 유전형 II 는 계통군 B1으로 구성되어 있었다. 유전형 V 및 XI, 및 IV 는 계통군 B2 를 포함하였으며, 유전형 VII, VIII, 및 IX 은 계통군 D 를 포함하였다.
3-2. MLST 와 비교
본 발명에 의한 rpoB 계통 분석과 MLST 를 비교하기 위하여, 8개의 하우스키핑 유전자, dinB (DNA polymerase), icdA (isocitrate dehydrogenase), pabB(p-aminobenzoate synthase), polB (polymerase PolII), putP (proline permease), trpA (tryptophan synthase subunit A), trpB (tryptophan synthase subunit B), 및 uidA (beta-glucuronidase) 을 GenBank와 EMBL에 등록된 대장균의 유전자 염기서열로부터 수집하여 이들 8개 유전자의 염기서열을 연결하여 연속된(concatenated) 염기서열로 계통분석하여 계통수를 작성하였다 (Jaureguy et al., 2008, BMC Genomics 9, 560).
rpoB 트리 내 대장균 표준 균주의 클러스터링 패턴은 MLST 의 연속 서열(concatenated sequence)에 의한 트리와 유사하였다 (도 2). K12 균주 및 B 균주는 다른 클러스터를 형성하였다. 병원성 O157:H7 및 O55:H7 균주는 하나의 클러스터를 형성하였으나, TW14359, EC4206, EC4045, EC4042, 및 EC4115 균주는 Sakai, FRIK966, FRIK2000, CB9615, EDL933 및 TB182A 균주와 각각 하나의 뉴클레오티드에 차이가 있었다. 시겔라 속의 rpoB 서열은 서로 다른 클러스터를 형성한 E. coli. S. boydii 및 S. flexneri 균주와 밀접한 관련이 있었으나, S. dysenteriae 균주 1012 및 Sd197 은 하나의 클러스터를 형성하지 않았다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

  1. (1) 조류 병원성 대장균 (Avian Pathogenic Escherichia coli; APEC)의 RNA 중합효소 베타 서브유닛 (rpoB) 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 단계;
    (2) 상기 증폭된 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하는 단계; 및
    (3) 상기 단계 (2)에서 얻어진 염기서열을 표준 균주의 rpoB 유전자의 염기서열과 비교하여 유전형을 결정하는 단계를 포함하는,
    조류 병원성 대장균의 유전형 동정 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1) 은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 사용하여 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 증폭하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2) 는 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진 1종 이상의 프라이머를 사용하여 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 결정하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (3) 에서 표준 균주의 rpoB 유전자의 염기서열은 서열번호 10 내지 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 (3) 은 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열을 표준 균주의 rpoB 유전자의 염기서열에 대입하여 다중배열한 후 계통도를 완성하여 결정하는 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진, 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열 증폭용 프라이머 쌍.
  9. 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진, 조류 병원성 대장균의 rpoB 유전자의 전체 염기서열 결정용 프라이머.
  10. 삭제
  11. 제8항의 프라이머 쌍을 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 서열번호 3 내지 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진 1종 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물.
  13. 제9항의 프라이머를 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 키트는 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 키트, allele-specific PCR 키트, 실시간 PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 서던 블랏팅 키트인 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 키트.
  16. 서열번호 10 내지 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진 조류 병원성 대장균의 rpoB 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조류 병원성 대장균의 유전형 동정용 조성물.
  17. 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진 조류 병원성 대장균의 rpoB 폴리뉴클레오티드.
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