KR102203679B1 - 신규한 엔테로코커스 패시움 균 특이 박테리오파지 ef44 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엔테로코커스 패시움 균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 EF44, 상기 박테리오파지를 포함하는 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 박테리오파지 EF44는 기존의 항생제 등의 화학물질에 비해 엔테로코커스 패시움 균에 대한 특이성이 매우 높고, 엔테로코커스 패시움 균에 감염하여 탁월한 용균 활성을 나타내고 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 EF44는 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있으며, 반코마이신에 내성이 있는 엔테로코커스 패시움 균을 사멸시킬 수 있어, 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균 또는 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균의 감염성 질환을 해결할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지 EF44는 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제, 또는 세척제 분야에서 다양하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 엔테로코커스 패시움 균 특이 박테리오파지 EF44 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel Enterococcus faecium specific bacteriophage EF44 and antibacterial composition comprising the same}

본 발명은 엔테로코커스 패시움 균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 EF44, 상기 박테리오파지를 포함하는 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제 및 상기 박테리오파지를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)은 장구균으로 Enterococcus 속의 그람 양성 세균을 말한다. 사람이나 온혈 동물의 장관 내에서 상재하며 분변을 통해 배출된다. 사람 간의 접촉이나 오염된 표면 또는 환경 노출에 의해 전파되며 식품에 의해 전파되기도 한다. 엔테로코커스 패시움 균은 건조한 표면에서 4개월까지 생존이 가능하여 내인성 감염뿐만 아니라 의료기기, 손 등을 통한 병원 내 감염의 원인균으로 빈도가 증가하고 있다. 장구균은 면역결핍환자나 중환자의 병원 내 감염의 중요 원인균으로, 원인균주의 10% 이상을 차지하며 균혈증, 수술부위 감염, 심내막염, 요로감염 등의 기회감염증을 유발한다.

세균 감염증 치료에 항생제가 널리 사용되고 있고 이에 따라 다양한 항생제에 내성을 나타내는 내성세균이 출현하고 있다. 항생제 내성이 특히 문제가 되고 있는 주요 병원균으로는 반코마이신 내성 엔테로코커스(Vancomycin-resistant Enterococci, VRE), 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA), Extended spectrum ß-lactamase(ESBL) 생성 그람 음성균, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니(Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB), 카바페넴 내성 슈도모나스 애루지노사(Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa)가 알려져 있다.

인체에서 검출되는 Enterococci는 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis), 엔테로코커스 패시움(E. faecium) 순으로 검출되나 엔테로코커스 패시움 균이 항생제 내성률이 높아 병원감염병 측면에서 중요한 세균이다. 엔테로코커스 패시움 균은 staphylococci 및 streptococci를 포함하는 다른 속의 균과도 플라스미드 전이가 발생할 수 있다. 광범위한 숙주 범위의 플라스미드를 얻을 수 있기 때문에 약제 내성이 넓고 쉽게 퍼질 수 있다.

특히 반코마이신 내성 균주는 기존에 사용되고 있는 항생제 중 치료할 수 있는 적절한 약제가 없는 상황이다. 또한 엔테로코커스 패시움 균이 가진 Enterococcal Surface Protein(ESP)이 세균을 응집하게 해 카테터 및 튜빙 등에 바이오필름을 형성한다. 바이오필름으로 증식하는 미생물은 동일 미생물의 플랑크톤 형태보다 항생제와 숙주방어에 대한 저항성이 높다. 대부분 바이오필름 감염을 해소하는데 많은 어려움이 있으며, 만성 또는 재발성 감염이 흔히 일어나기 때문에 효과적인 치료제 개발이 요구되고 있다.

한편, 박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균을 감염시켜 감염된 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스를 의미한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다. 따라서 최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 자연 친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다.

이에 본 발명자들은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 균에 특이적인 용균활성을 갖는 박테리오파지를 분리하고 분리된 박테리오파지의 형태적 및 유전적 특성을 분석하여 상기 박테리오파지가 엔테로코커스 패시움 균, 특히 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균을 선택적으로 사멸할 수 있음을 확인하였으며, 상기 박테리오파지의 pH 안정성과 온도 안정성을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 엔테로코커스 패시움 균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 EF44를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 EF44를 포함하는, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제 또는 세척제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지 EF44를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엔테로코커스 패시움 균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 EF44를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 포함하는, 항생용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 포함하는, 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 포함하는, 소독제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 포함하는, 세척제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 박테리오파지 EF44는 기존의 항생제 등의 화학물질에 비해 엔테로코커스 패시움 균에 대한 특이성이 매우 높고, 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균에 대해서도 사멸능을 가지므로, 항생제 내성균 문제를 해소할 수 있다. 또한 본 발명의 박테리오파지 EF44는 물리화학적 자극에 강하다는 장점을 가지고 있으며, 사람, 동물, 식물 등 세균 외의 다른 숙주에는 감염되지 않으므로, 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제의 잔류 문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지 EF44는 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료, 항생용 조성물, 사료 첨가용 조성물, 사료, 소독제, 또는 세척제 분야에서 다양하게 사용될 수 있다.

도 1은 박테리오파지 EF44의 엔테로코커스 패시움 균에 대한 용균반 형성 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 박테리오파지 EF44의 전체 유전자를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 전자 현미경을 통해 박테리오파지 EF44의 형태학적 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 박테리오파지 EF44의 단백질 패턴을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 박테리오파지 EF44의 pH 안정성 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 박테리오파지 EF44의 온도 안정성 실험 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 엔테로코커스 패시움 균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 박테리오파지 EF44를 제공한다.

본 발명에서, 용어 박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.

본 발명의 박테리오파지 EF44는 엔테로코커스 패시움 균에 대해 용균활성이 탁월하다. 상기 박테리오파지 EF44는 260 nm 내지 280 nm의 크기를 가지는 정이십면체의 머리와 수축성의 꼬리가 있는 형태인 마이오비리대(Myoviridae)에 속하며, 머리의 크기는 120 nm 내지 130 nm이며, 꼬리의 길이는 140 nm 내지 150 nm인 것을 확인하였다.

본 발명의 박테리오파지 EF44는 단백질 패턴 분석 결과 67 kDa, 48 kDa, 42 kDa, 37 kDa 그리고 16 kDa 크기의 주요 단백질을 포함함을 확인하였다.

박테리오파지 EF44는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 전체 유전자의 전체 또는 일부로서 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 박테리오파지 EF44는 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 및 상기 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란 염기서열의 변형, 치환의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다.

상기와 같은 엔테로코커스 패시움 균 특이적 용균활성 또는 엔테로코커스 패시움 균에 특이적인 사멸능은 본 발명의 박테리오파지 EF44를 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 박테리오파지 EF44를 유효 성분으로 포함하는 다양한 제품에 적용을 가능하게 한다.

본 발명의 박테리오파지 EF44는 상기 박테리오파지가 존재할 것으로 예상되는 충북 지역의 하수처리장에서 시료를 채취하여 분리한 박테리오파지로서, 본 발명자는 이를 박테리오파지 EF44로 명명하고 2018년 08월 14일에 한국미생물보존센터에 수탁번호 KFCC11784P로 기탁하였다.

본 발명에서 pH 안정성은 다양한 pH 범위에서 박테리오파지 EF44의 역가가 안정적으로 유지되는 것을 의미하며, 본 발명의 박테리오파지 EF44는 산성 내지 염기성의 넓은 pH범위에서 장기간 동안 안정한 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 pH3 내지 pH11범위에서, 더욱 바람직하게는 pH5 내지 pH9범위에서 안정한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 온도 안정성은 다양한 온도 범위에서 박테리오파지 EF44의 역가가 안정적으로 유지되는 것을 의미하며, 본 발명의 박테리오파지 EF44은 넓은 온도 범위에서 역가가 장기간 동안 안정한 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 40℃ 내지 60℃범위에서, 더욱 바람직하게는 40℃ 내지 50℃범위에서 안정한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 엔테로코커스 패시움 균 특이적 사멸능은 박테리오파지 EF44이 엔테로코커스 패시움 균 이외의 다른 균을 사멸시키지 않으면서, 특이적으로 엔테로코커스 패시움 균만 사멸시키는 능력을 의미하며, 특히 반코마이신(vancomycin) 내성 엔테로코커스 패시움 균을 특이적으로 사멸시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44을 포함하는, 항생용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 항생용 조성물은 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제, 항생제 및 항균제를 총칭하는 것이다.

본 발명의 박테리오파지 EF44는 기존 항생제에 비하여 엔테로코커스 패시움 균에 대한 특이성이 매우 높고, 유익균은 죽이지 않으면서 엔테로코커스 패시움 균만 사멸시킬 수 있다. 아울러, 약물 내성 내지 저항성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다는 이점이 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 포함하는, 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 질병의 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이고 가축에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있어서 문제이다. 항생제가 육류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 또한, 사료에 섞어 먹이는 항생제의 종류가 많고 이는 다제 내성균 발생 확률이 높아지는 문제점이 있기 때문에 좀 더 자연 친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결할 새로운 사료 첨가용 항생물질로서 본 발명의 상기 박테리오파지 EF44를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공할 수 있으며, 본 발명의 사료는 박테리오파지를 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파지는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 사료는 본 발명의 박테리오파지 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 EF44를 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근괴류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 포함될 수 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 박테리오파지 EF44를 포함하는, 음용수 첨가제를 제공한다.

본 발명의 음용수 첨가제는 상기 박테리오파지 EF44 또는 이를 포함하는 조성물을 음용수 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료 또는 음용수에 혼합하는 방식으로 사용되거나, 음용수 제조 시 직접 첨가하는 방식으로 사용할 수 있다. 상기와 같이 음용수에 혼합하여 공급함으로써 지속적으로 엔테로코커스 패시움 균의 숫자를 감소시킬 수 있는 효과가 있다.

본 발명에서 음용수는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 음용수를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 포함하는, 소독제를 제공한다.

엔테로코커스 패시움 균에 특이적 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지 EF44를 포함하는 소독제는 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 양계장, 축사 등의 건물, 축체, 음수, 깔짚, 난좌, 운반차량, 식기 등의 각종 생육 용품의 소독 등에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 포함하는, 세척제를 제공한다.

본 발명의 박테리오파지 EF44는 엔테로코커스 패시움 균에 특이적 사멸능을 가지므로, 엔테로코커스 패시움 균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 개체의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EF44를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

엔테로코커스 패시움 균은 감염 위치에 따라 다양한 질병을 일으킨다. 엔테로코커스 패시움 혈류 감염증, 엔테로코커스 패시움 요로 감염증, 엔테로코커스 패시움 창상 감염증 등이 주로 발생하는 감염증이며, 카테터 및 수술과 관련된 엔테로코커스 패시움 창상 감염증은 상처 부위의 통증과 부종, 발적, 발열, 유체 누출(fluid leakage)를 유발할 수 있으며, 엔테로코커스 패시움 요로감염증은 소변을 보는 중에 강한 통증을 일으키거나 하복부 쪽에 통증을 일으킬 수 있다. 엔테로코커스 패시움 혈류 감염은 발열, 오한, 통증, 오심과 구토, 설사를 일으킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병은 통상 페니실린, 암피실린, 반코마이신과 같은 항생제를 투여하여 치료한다.

반코마이신은 토양균의 일종인 스트렙토미세스 오리엔탈리스에서 얻을 수 있는 항생물질로써, 그람 양성균에 효과가 있다. 항생제 내성이란 세균이 스스로 항생제에 대항하여 생존능력을 갖는 상태를 말하는데,　한국의 경우 특히 항생제 오용 및 남용이 심각하여 내성 비율이 높은 것으로 알려졌다.

본 발명에서 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균은 반코마이신에 감수성이 없는 엔테로코커스 패시움 균으로써, 반코마이신에 사멸이 잘 되지 않는다.

본 발명에서 엔테로코커스 패시움 균, 특히 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병은 박테리오파지 EF44에 의해 엔테로코커스 패시움 균, 특히 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균이 사멸됨으로써 예방 또는 치료되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 용어 "개체"는 엔테로코커스 패시움 균에 의한 감염성 질병이 발병될 수 있는 모든 개체를 의미하는 것으로 인간을 포함한 포유동물, 가축류 또는 가금류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 "가축류"는 인간에 의하여 순화, 개량되어 사람과 함께 공동생활을 하는 유용한 동물을 지칭하는 개념으로, 예를 들어, 돼지, 소, 닭, 말, 오리 또는 개 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 "가금류"는, 가축 중 조류에 속하는 동물을 총칭하여 이르는 개념으로, 예를 들어, 닭, 오리, 꿩, 메추리, 타조, 거위 또는 칠면조 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서 상기 박테리오파지 EF44 또는 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에서 상기 박테리오파지 EF44 또는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 투여되는 상기 박테리오파지 EF44의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예, 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제제예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신규한 박테리오파지의 분리 및 배양

1.1 박테리오파지의 스크리닝 및 분리

대상세균인 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움은 당사에서 아시아태평양 감염연구소에서 분양 받은 것을 사용하였다. 충북 지역의 하수처리장에서 채취한 시료를 대상세균과 함께 35℃에서 하룻밤 동안 진탕배양 하였다. 배양액을 4,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 공극 크기가 0.2 μm인 필터를 이용하여 여과한 후, 이렇게 얻어진 여과액을 이용하여 용균반 분석을 통해 엔테로코커스 패시움 균에 특이적인 박테리오파지를 선별하였다.

박테리오파지를 스크리닝 하기 위해서 구체적으로 전배양된 대상세균 150 μL를 취해서 멸균된 튜브에 넣고 3 mL의 BHI 탑 아가[뇌심장침출액(뇌 침출 솔리드(solids) 12.5 g, 소 심장 침출 솔리드 5.0 g, 프로테오스펩톤 10.0 g, 글루코스 2.0 g, 소듐클로라이드 5 g, 인산나트륨 2.5 g/L) + 0.6% 아가]를 첨가하여 잘 혼합한 후 미리 만들어 둔 2% BHI 아가 플레이트에 중층하였다. 실온에서 30분간 방치한 후 준비된 샘플 여과액을 각각 10 μL씩 점적한 후 실온에서 30분간 방치 후 35℃에서 24시간 배양하여 박테리오파지의 유무를 확인하였다. 박테리오파지의 존재를 확인한 샘플로부터 파지를 순수 분리하기 위해서 소프트 아가 오버레이법을 이용하였다. 박테리오파지가 있다고 확인된 샘플을 식염수로 적절히 희석하여 각 희석단의 샘플 희석액 100 μL를 취하여 대상 세균 배양액 150 μL에 혼합한 후 0.6% BHI 탑 아가를 3 mL 첨가하여 잘 혼합한 뒤, 미리 만들어 둔 2% BHI 아가 플레이트에 중층하여 방치한 후 35℃에서 24시간 배양하였다. 배양한 각 플레이트에서 형성된 용균반을 확인한 후 선택하여 400 μL의 SM 완충액(NaCl 5.8 g/L; MgSO47H2O 2 g/L; 1M Tris-HCl(pH7.5) 50 mL)에 현탁하고, 실온에서 4시간동안 방치하였다. 이 박테리오파지 액을 100 μL를 0.6% BHI 탑 아가와 세균배양액 500 μL와 혼합한 뒤 150 mm 지름의 BHI 플레이트에 분주하여 중층한 후 완전히 용균이 일어날 때까지 35℃에서 배양하였다. 배양이 종료된 후, BHI 플레이트에 15 mL의 SM 완충액을 가하고 실온에서 4시간동안 천천히 교반하면서 박테리오파지 용액을 회수한 후 4,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액만 취하고 이를 0.2 μm 필터로 여과하여 최종 박테리오파지 용액을 회수하였다. 이렇게 얻어진 최종 박테리오파지의 용균반을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 1 mm 내지 2 mm의 크기를 가지는 용균반을 형성하는 박테리오파지로 확인되었다.

1.2 박테리오파지의 대량 배양 및 정제

박테리오파지를 대량 배양하기 위하여, 1.1에서 회수한 최종 박테리오파지 배양액(1.0x10⁸ PFU/mL)을 전배양된 세균배양액(1.0x10⁹ CFU/mL)과 혼합하여 MOI(Multiplicity of infection)를 0.1이 되도록 하여 35℃에서 100 rpm으로 18시간 배양하였다. 배양이 종료된 후 전량의 배양액을 6,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였고, 이를 0.2 μm 필터로 여과하여 최종 박테리오파지 배양액을 회수하였다.

분리된 파지를 박테리오파지 EF44로 명명하고, 2018년 8월 14일 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울, 한국)에 기탁하여 기탁번호 KFCC11784P를 부여 받았다.

실시예 2. 박테리오파지 EF44의 전체 유전자 분석

파지 배양액에 20 mM EDTA, 50 μg/mL의 Proteinase K, 0.5%(w/v) SDS 가한 후, 50℃에서 1시간 동안 정치하였다. 동량의 Phenol-Chloroform-Isopropyl alcohol(25:24:1)과 혼합한 후 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 동일 부피의 Phenol-Chloroform-Isopropyl alcohol(25:24:1)과 혼합하여 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 회수하고, 상등액에 3M sodium acetate를 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가한 후 혼합하였다. 여기에 2배 부피의 차가운 95% 에탄올을 가하여 혼합한 뒤 -20℃에서 1시간 동안 정치하였고, 반응이 끝난 후 0℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심분리한 후 침전물을 획득하였다. 이 후 차가운 70% 에탄올로 2회 세척한 뒤 에탄올을 완전히 제거하여 DNA pellet을 회수하였고 이를 최종 50 μL TE buffer(Tris-EDTA, pH8.0)에 용해시킨 후 DNA 농도를 측정하였다. 전체 유전자 분석을 위해 HiSeq 2500(Illumina)을 이용하여 유전자 시퀀싱을 시행하였다(마크로젠, 한국). 시퀀싱 결과로 얻은 박테리오파지 EF44의 유전자 맵은 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 박테리오파지 EF44의 전체 유전자의 크기는 17,834 bp이며, GC함량이 34.5%, 전체 유전자의 수는 26개임을 확인하였다. 분석한 박테리오파지 EF44의 전체 유전자 서열을 서열번호 1로 나타내었다.

실시예 3. 박테리오파지 EF44의 형태학적 특성

분리된 박테리오파지의 형태학적 특성을 알아보기 위해, 박테리오파지 EF44를 0.01% 젤라틴 용액에 희석하여 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 carbon-coated mica plate(ca. 2.5 x 2.5 mm)에 적가한 후, 10분간 적응시켜 멸균증류수로 세척하였다. 이를 구리 격자(copper grid)에 끼워 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)에서 30-60초간 염색하고 건조시킨 후, 투과전자현미경(Tecnai G2 Spirit Twin, Bio-Transmission electron microscope, 120 kV, 120,000~400,000)으로 검경한 박테리오파지 EF44의 전자현미경 사진을 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 EF44는 260 nm 내지 280 nm의 크기를 가지는 정이십면체의 머리와 수축성의 꼬리가 있는 형태인 마이오비리대(Myoviridae)에 속함을 알 수 있었다. 머리의 크기는 120 nm 내지 130 nm이며, 꼬리의 길이는 140 nm 내지 150 nm로 확인되었다.

실시예 4. 박테리오파지 EF44의 단백질 패턴 분석

1.0x10¹⁰ PFU/mL로 준비된 박테리오파지 EF44 40 μL와 10 μL의 5X loading buffer를 혼합하고, 10분간 끓인 다음 12.5% SDS-PAGE를 수행한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 EF44의 단백질 전기영동 결과를 나타낸 것으로, 67 kDa, 48 kDa, 42 kDa, 37 kDa 그리고 16 kDa 크기의 주요 단백질을 확인하였다.

실시예 5. 박테리오파지 EF44의 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균에 대한 특이적 사멸능의 확인

분리된 박테리오파지 EF44가 여러 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균(VRE Enterococcus faecium)에 대해서 용균활성을 나타내는지 확인하기 위하여 아시아태평양 감염연구소에서 분양 받은 균주를 대상으로 감염성을 확인하였다. 소프트 아가 오버레이법을 통해 확인한 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

표 1에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 EF44는 9종의 엔테로코커스 패시움 균 중 9종에 용균활성을 보여 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균에 대해서 용균활성이 탁월함을 확인하였다.

또한, 다양한 세균에 대해서 용균활성을 나타내는지 확인하기 위하여 ㈜옵티팜에서 분리하여 보유하고 있는 균주와 미생물 자원센터 등에서 분양 받은 균주를 대상으로 소프트 아가 오버레이법을 이용하여 감수성을 확인한 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

표 2에 나타난 바와 같이, 다른 미생물을 대상으로 감수성 검사를 진행한 결과, 대장균이나 Salmonella 종, Bacillus 종 등 다른 세균에 대해서는 용균활성이 없는 것을 확인하여, 박테리오파지 EF44의 엔테로코커스 패시움 균에 대한 특이적인 사멸능을 확인하였다.

실시예 6. 박테리오파지 EF44의 pH 안정성 조사

박테리오파지 EF44의 pH 안정성을 확인하기 위하여 다양한 pH 범위(pH2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11)에서 시험을 진행하였다. Sodium acetate buffer, sodium phosphate buffer, Tris-HCl을 이용하여 각각의 pH에 맞게 조제한 후 990 uL로 분주하여 준비한 후, 1.0x10⁹ PFU/mL로 준비한 박테리오파지 EF44 배양액 10 uL을 첨가하여 2시간동안 상온에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계희석하여 소프트 아가 오버레이법에 의한 역가 측정을 시행한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 EF44는 pH3 내지 pH11의 범위에서는 2시간동안 안정한 것을 확인하였으며, 산성 내지 염기성의 넓은 pH범위, 특히 pH5 내지 pH9의 범위에서 2시간 동안 안정한 것을 확인하였다.

실시예 7. 박테리오파지 EF44의 온도 안정성 조사

박테리오파지 EF44의 온도 안정성을 확인하기 위하여 다양한 온도 범위(40℃, 50℃, 60℃ 그리고 70℃)에서 시험하였다. 박테리오파지 EF44 배양액(5.0x10⁷ PFU/mL) 1 mL를 멸균된 튜브에 분주한 후 10분, 30분 및 60분 동안 각 온도에서 방치하였다. 방치 후 각 반응액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이법으로 역가 측정을 시행한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 EF44는 40℃ 내지 60℃의 범위에서 60분 동안 모두 안정한 것을 확인하였으며, 특히 40℃ 내지 50℃의 범위에서 60분 동안 안정한 것을 확인하였다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

이하 본 발명의 박테리오파지 EF44를 포함하는 엔테로코커스 패시움 균의 감염성 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아니고 단지 이를 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 사료 첨가용 조성물

박테리오파지 EF44 1x10⁹ PFU/mL

비타민 믹스 100 mg

미네랄 믹스 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 사료 첨가제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

제제예 2. 소독제 조성물

박테리오파지 EF44 1x10⁹ PFU/mL

에탄올 적량

멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 소독제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

제제예 3. 세척제 조성물

박테리오파지 EF44 1x10⁹ PFU/mL

에탄올 적량

효소 복합물 적량

멸균 증류수 적량

통상의 세척제 제조방법에 따라 상기의 성분들을 혼합하여 제조한다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11784P 20180814

<110> Optipharm.CO.,LTD <120> Novel Enterococcus faecium specific bacteriophage EF44 and antibacterial composition comprising the same <130> 1-81P <150> KR 10-2018-0169830 <151> 2018-12-26 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17834 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> bacteriophage EF44 <400> 1 agaatattat cttttttttg caacacactt gtaaatgacc ccaaactaca tttgtatgaa 60 tttaattgtt gacaaatatg aacatgcatg atataatata gatgtaataa agaaaggatg 120 ataaaaacga tcaagcaaat cattaaaata aatgaattaa atgattgaca tatatgtaca 180 tccatgatat aatatagatg taataaagaa aggatgataa acatgaatga accgatcgtt 240 tatacagaaa tatatagaaa tacagttatg aaaatgaagc tgtttagaga tgaggataaa 300 ctcactaaat tcatctattc acagtttgat gatgatgatg ctaaaaagtt attagaaagc 360 gaaagacttg tatttcccga ccattggggt tactcaatag actatccaga atattaattt 420 aatacaatgc taccaatctc gttcgattgg tggtatcaat atcaaattaa tataaaggag 480 tgtttcacat gaaactatat aaaaataacg attattacac aaatacgcta cacatcgtag 540 aggtaagaag agtgaataat gatatttacg gaaatcctct ctatagagtt taccctattt 600 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gtttgatttt ttgactcatc acgattcgct ttgatgtttg tatcaatctc 8220 atttaacaat ttctgtttct catcaatggt atagtccata tcatcaaaaa tcggaaactc 8280 ttcaagattt gataggaaca tcttattcca atagggcatg tttagattta aatattcgtc 8340 aagattaaac ttaaatgatc ccatcgtttc tgatcctatc tctctcaagt aaaagtgatt 8400 gataaatttt gtttcaaatt ctgctcgttt tgtttcgtca taaaatggat aatcaaaatc 8460 aaacaattgt tttctgccaa cttcaatacg ttcttttcga gataattcag gttggtaata 8520 agtgaaactt tcaatataac gtttaagtag cactaggcaa ccctccactc atctgatctt 8580 ttttcgattg acctgccgct agttgtaatt gtcgcaccgc gtccgttcta aacttcacgt 8640 caatctttcc gtcaagttca tcgccaaaga cacgatttac acgatcacaa aactcttttc 8700 ttgattttaa caagatgttt cctgagcttt caatctgttc gttgttagat aagacttctg 8760 atgtttgtac acgtgctgtc ttatctacgt tcgcattatt gatacctaga aaagttaaga 8820 cttcattcca tacttcgttc aattctgatc ttagtttatc cactacatat ggtgcatttg 8880 tttgccacac attaaaagct tggtcaaact ccatatcttt atccacaaaa actgcctgat 8940 tattttcgtc aatttgatta taagcttgta gcaacgagaa atatttcttt tcatctgttt 9000 gaataattac aggtgttttt tgggctcttc gattcactcg tgatatctgg tttatgtctg 9060 ccatatccaa agcaaaacga tgaagacttg gcaacgtagg aactttcaag tcattgttat 9120 acaacatgat acattttgat ttatcatcat catcatcata tcttaaaaca gggtatctct 9180 tgtgatacat tgcttcgttt gctgtaaaga aaatcgggtt atgataatga tcgatttgac 9240 cgtcttctgc tcctgcacaa accatgaagc caagtgtagg atctttaaag aaaccaagat 9300 aaccattggt gtgtaaagca atttctaaat aacgagggtc aattgatttt ggcaagtttt 9360 cccactcaaa caactgaaac gtaaggagcg tgagttgtct gcgataatgt tcatagtagc 9420 taatctcttc tacatcactt gaatagggtt catttggata aggtctgctt tttgctgtat 9480 aacggttatt tctagcaagt cctgcacctt ttcgtctact catcttattc ctccttccta 9540 cacatctccg ttgtcttggt tataatttaa aacctcgttc gtatgccaaa gcgtaacgcc 9600 tgcactaaaa atttgtttga cacgtgttaa cacatcgtta ctcattgtgc ctacaatatt 9660 tggttctttt aatttaatga aattccatgc ttttcttgtt tgtaagtttg gtgtagctac 9720 tcgattgctc tttgtaccgt acattgagaa gtaacgatca agtcttgtag cgtactcata 9780 tttaatttgt ttgaatcgca attgataata gttttgaaag tttcccattg tgaaagataa 9840 atttgatcca agttgtgtca cattatctgg gatattttcg atatctgcca ctttacctgc 9900 taagagattc aaaccatttt ctttttccgc aacatagttg tttacttgtt gtcctgctcc 9960 catgatgtta gtcaaaccaa caaaagggtt gttacttgct aaagcggaaa agatcgcccc 10020 tcctgtactc attgcactgt ttcccatacc atgtctgaac gtattgcgaa tgttttgctc 10080 ttgagcaatc aaggagtttt tgtttccttg catgaatgct gaagcataat cagatttaac 10140 ccctacatcg ttaggatcat tatcaattaa catcttgtca cttaaattgg ttataatgcc 10200 tgagttactt acatcataat caatcggttc gatcatcact ttattagaaa tacctaacga 10260 accttttaca aatatactca atttaccccc tgtaagatat tcgggtctga tagtcattac 10320 atgtcctttt gtatctgtaa tttctattaa acaataggga tacataaata gttttgattc 10380 cttaacatta aatggaaaag cttctctaaa gtagttatac acatttccta ccagatcaat 10440 tctttttggc acgaatgttc ttgcttcttt tacgcaaaag aaagcgaatg ttttcattgt 10500 tcctgttgga tcactagcat aagttggaag tgtgatctta tatgaccctc ctgcattata 10560 ccttaccgtt ttattcgcat gatccacaat gaatggtata cctgtataag acgttacata 10620 catcccgaca atcttattta aaaaaggttc tttcgttgta agaaacgcca tgtactcccc 10680 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tggagctgat 11520 gaaacaactt ctccttgttg atttgtagct tcggctggtg taaaggtaat attcacatct 11580 ttagatgaac ctttaacaac gctagttgtt gcacttgcaa aagcaacttt tgtaactggt 11640 ttagtagctg tttttacaaa agcaacggca ttaccaaatt gagaagtaga atataattgg 11700 tggtggtgta accaataatt ccaatatagc ccttctggat tatatagact tgttgttttg 11760 tacaatttgt catagatcat aaaccattca gaatctacga taaccgcaac gatattagac 11820 gattcttcgc cttctttttt aggaaactca tcaataacga ttttgtgtcc tacaaagtca 11880 gttttactca tattgaatgc tgctgctaaa acgtcaacgt caatggttgc gtcagtgtca 11940 gcgtcaataa taacatattg gtcagatttt gaggtagatg ttttaacgcc ttgtgcgttg 12000 taagcggaac tcataaattc taatttatta gaggttgatt tgatcttacg aataaattct 12060 tttgcatttg tttcagtaat ttcgccaatt tcgatctctt tgaatagctc tttttcttgg 12120 tagtttgcta ttaataattt cgtgtattca aattcgctta cttcgtcgcc tgtgtataaa 12180 gcgttcatta caccagcaac aaaactattg aaattatccc atgaagtaaa tgctttttct 12240 aaccatgctt cttggatcgt ttgtttgtag taaccttcac gattaatttc gtggaacaat 12300 gtttttacat cgggaacttc ctgtttaaat acacctgtaa cagactcgtc agggttgaac 12360 ttatgttcct gtgcaatgtc aacaaaaatt tcttcaatcg ttcgacctaa aggcatgttt 12420 ccttttttaa acatttttaa agggttacgc caagatttgt atcggataac tactttacca 12480 atacgatcaa ctaaagttga aataaattcg ttttttacta cgtctaaacg tgtgatccca 12540 gcaccaaccg cttcgatgtt atctgcattt ggcataggca cgttcgcctg aaaaagagat 12600 gatgaactat tataaatagc cgtcattaat tgtactggtg tttctacatt tgtggcacga 12660 agaacatctt gttctgtgat tttgtcagcc atgttttttc ctccttaaat tcctaaatca 12720 tctagtgtaa tattctggtc tgtttctggt tcgttatttt ctggttgttc tacgatcgct 12780 cgttctcgga acaattttga gtttgaaata accaacgctt cgttatcttt ctttagctta 12840 tcaagtgtgc tattcgctgt tgtcaaagct tctgttgttg ctccgtagtc ttctcgcaat 12900 gcttcaagat gttctacaat ctttgatctt gcttccccgt ctgtgacact ttcaagaata 12960 ccatttagaa ttgcttcatg ttctttaatt tccataatct ccacctcctt ttgattctat 13020 tataccataa aaactgtttc acgtgaaaca taaatctgtg aaacacaaaa aagagtagcc 13080 gcatttaagg gctactccta aaaggttttt gcgattggtt aacggtcaaa acgtttatgt 13140 gtccataact taacgggagc gcacgatctc tcacgtgtac attcgcccaa tctcgccaaa 13200 tttgactctt gttaactatc acaagaatat tttaccatac tttgcaaagg atgtaaataa 13260 tttatttttt gaaatttcct gtttttacta atgttattgc ttcaatttca cgtgtttctt 13320 ttccgtagat ttcttcaaag tcatgcaaag aaatatctac aaagtgttcg gtagcgtaac 13380 cgtcaatcgt tccttcatca cgtacaataa acattgcttt atataggtcc attattagtc 13440 ctccttattt gattgtaaac attgtgtcta ctaataccac gccaccttgt gttcttttcg 13500 gtagcaactt tccatagctt gaaaaaccaa cttcaaaatt gtcaaaagtt acaagctctt 13560 ttattcgatc tggcatacca gcacacttta catttaattc gccgtcaatt tcttctacgt 13620 atgttttctg acgaatgaat tttgctcgtt gaaatgtgct ttcatgcccc caataaccaa 13680 gttttttagg atcaaccaag tgatcgattg cttctggaac ttctgttcct actagatgaa 13740 tgctatctgt atcacaataa ataatgcgat caaaacattt ttgagcagtt gtaatggtag 13800 tatacctacc ccaagccgtc acaaaactag caagcggaac ataaacagga tctcttaatt 13860 cttcttctcc caatgtcaat cgaacaatgc cgtcctcgcc catgtaaggc acttttcctg 13920 taatatcagg gtttgttccg aactttccat acaagctatt taacatacct tttgcattcg 13980 cttttctagc tccttcagtg gtgttcttta cttcgatcca tttatcgatc cagcctttga 14040 acatatcaca agaagatttg aacatatatc cgtaggtgta atgtatctct aaaatgtcgt 14100 aatgttcaaa gaacaattca agatcaacgt ttgtaagtgt aagatcaatt aattcatcga 14160 ctccaagttt gtttacgctc gaatcaagat attcgttttg aataaataat gagctttgct 14220 taacttgaat ggttggaata taaccctcct ttaaacggaa tcttactttg atattttgaa 14280 tgtaaagtgg atagtcgttg ttcggtttgt attctccctc atagaataga ggtgttccat 14340 atggtaaagg tcttacgtac atctgagagg gatacaaaga gttaacatca aagacaatgc 14400 cgtcacctat ttctttccct tgaaaaactt tgtttaccca agtgaagccg cctttgtatg 14460 ctttacgtaa gtctttatca aatcctaaag acaaaatagg aaaccattgt ttgaaagttg 14520 attttccatg tgtagctttt agccaatctt ggtaatcgcc taaagcgtcg cttcctctag 14580 tcattcgagt tagtccttga tcgaattgaa tttttaatgc catcgccata atctgaatgt 14640 cgttctttaa atactcccac tcatcttttg ttggtttgta accaataggt ctttcttttg 14700 tataatctat ttcgcctttt tttataggaa aattaaaagc ttctgcaatt tgtttcactg 14760 gaaaaggata ttttttaagg ctatcataaa ttattgttcg agatttctct tttttcgttt 14820 tacctgattt tgttgttgtg taattaactt cccaacaaat ttccaaagca taccattgac 14880 ccatatttga gatgagtgtg gagaatgttc gatcttcttt tgcttcttta caccatttga 14940 aaccattttt gaataaccat gaaagcataa actctccatc gaacttttcg ttgtgaaaat 15000 aaatatcaac actaccttga ttttcacacc agtcaaaaaa agaatcgatt tctaaaccga 15060 acgttatatt gtcaacattg tctatatcgc atacgcccca cgaccataca cgacaatcgt 15120 tgagatcagt tgttgtttca aagtcacctg tatatttctt tatcataatt cttctcctgt 15180 ttccgaatta attgtgatgt tcttcgtggg gttatatgag gggacttctc cacctgtttc 15240 agattcgatc acttttgcaa tcttactgta aacttgttct tttttctgtt gtacttctgc 15300 ttcatcataa atgtagtcaa ggttcatgtc caagaagttg gtaacatagg ttttcataaa 15360 taggtcaagc cccatggaat caagtaaacg aacaatgtcg tcagcgtctg aattgaaaat 15420 agtaaacatc gcttgtctga aattgtcata ataaagctga tccctttcat caaaatattg 15480 ttcgtcttgt tttcctatat tttctaaata agactgaact ccttctggag aagtaaaaga 15540 atcaatgtta aaatctggta ttgcttgaaa aggtaagtcc gcacctaact ctgttaaaat 15600 cgttggtgtg acaattgtgt tttctgttgg cttcttaatc tgaagttcgt taagctcttt 15660 gtagtgttct tcttttgctt tttgagcttg ctctgtttta atttgcgctt ctttgatttg 15720 cgctcttgag atagcaacat ttcgcttgtt gatctcaaaa atgtaattct cgttgtaagg 15780 ttgtgcaaag tctaccaact catctaacaa cttgttaaaa tcactacgac tcatatttgt 15840 tgattttacg tagtcaataa gtcttttctt tgatgttgga acagttggta gttgcctttc 15900 ctcaactcct ttttgtctta aacggttgta ctttttacga gctttgttag actttccata 15960 gattttctct aacttcgctc tatcgttctt tgatattctt actgtcaatt ctacacacct 16020 caatgtagaa acataataaa aaccacctag cgagattcgc taagtggctt actagattcc 16080 tgtattttta tgctacagtg aaaccacttg tagatttaca aatttttgtc caccgtttga 16140 ttttccttca acaaaagaaa tttttggttt gatgttaggg ttagcactca tcatatcaat 16200 taggttttta gctgactttg ttgctaccgc tgatacacca gcataagttt taccatcttc 16260 tgtgaagaaa gcgactagct ctgcttgtga tggttcggct ccaccaaaac cagaaacttc 16320 gtctgagtaa actagaatgt ctttcaattc tagtacttcg ccaattgcgt tacgtaacgg 16380 aattgaagcc ccgtttgtgg cattgaatac ttgtaacatt ccttctggtg tttgtgtgtc 16440 aaatgtactt tttacgattt ccatgattgt aatctcctct gttttgtttt 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Claims (11)

1. 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 균에 특이적인 사멸능을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 수탁번호KFCC11784P인, 박테리오파지 EF44.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패시움 균은 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움 균인 것을 특징으로 하는, 박테리오파지 EF44.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 EF44는 pH3 내지 pH11의 범위에서 안정한 것을 특징으로 하는 박테리오파지 EF44.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 EF44는 40℃ 내지 60℃의 범위에서 안정한 것을 특징으로 하는 박테리오파지 EF44.
   
6. 제1항의 박테리오파지 EF44를 포함하는, 항생용 조성물.
   
7. 제1항의 박테리오파지 EF44를 포함하는, 사료 첨가용 조성물.
   
8. 제7항의 사료 첨가용 조성물을 포함하는, 사료.
   
9. 제1항의 박테리오파지 EF44를 포함하는, 소독제.
   
10. 제1항의 박테리오파지 EF44를 포함하는, 세척제.
    
11. 삭제

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