WO2018155812A1 - 신규한 엔테로코쿠스 패슘 박테리오파지 Ent-FAP-4 및 이의 엔테로코쿠스 패슘 증식 억제 용도 - Google Patents

신규한 엔테로코쿠스 패슘 박테리오파지 Ent-FAP-4 및 이의 엔테로코쿠스 패슘 증식 억제 용도 Download PDF

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WO2018155812A1
WO2018155812A1 PCT/KR2018/000509 KR2018000509W WO2018155812A1 WO 2018155812 A1 WO2018155812 A1 WO 2018155812A1 KR 2018000509 W KR2018000509 W KR 2018000509W WO 2018155812 A1 WO2018155812 A1 WO 2018155812A1
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enterococcus
bacteriophage
fap
ent
bacteriophages
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윤성준
전수연
백형록
손지수
강상현
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주식회사 인트론바이오테크놀로지
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    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the present invention relates to a bacteriophage isolated from nature capable of killing Enterococcus fasium by infection with Enterococcus fascium and a method for preventing or treating Enterococcus fasci infection using a composition comprising the same as an active ingredient.
  • Sypovirida bacteriophage Ent-FAP-4 accesion No. KCTC 12854BP
  • the bacteriophage isolated from nature which have the ability to kill enterococcus fascia and have a genome represented by SEQ ID NO: 1 It relates to a method for preventing or post-infection treatment of enterococcus plaque with a composition comprising a as an active ingredient.
  • Enterococcus is an anaerobic gram-positive bacterium that resides in the gastrointestinal tract and urogenital system. Genus includes Enterococcus faecalis and Enterococcus. About 19 Species have been reported, including faecium , Enterococcus durans and Enterococcus casseliflavus . Among them , Enterococcus durans and Enterococcus casseliflavus have been reported. Cocus facalis and Enterococcus fascia can be presented. Infections with Enterococcus faecalis have been very common in the past, but infection with Enterococcus fascimus has been relatively increasing in recent years.
  • Enterococci are relatively toxic and do not cause disease in normal people, but they cause opportunistic infections such as urinary tract infections, wound infections, bacteremia, and endocarditis in elderly, immunocompromised patients, patients with chronic underlying diseases, or in hospitals.
  • enterobacteriaceae may induce infectious diseases by obtaining virulence factors through genetic hybridization from the outside.
  • Urinary tract infections are the most frequent infections caused by enterococci, followed by wound infections.
  • Other major infections by enterococci can suggest endocarditis, where 5-20% of bacterial endocarditis is caused by enterococci.
  • enterococci have a multidrug resistance against various antibiotics such as penicillin and cephalosporin. Enterococci are known to obtain new DNA (plasmids, Transposons) or to obtain antibiotic resistance using mutations. In particular, if enterococci obtained resistance to aminoglycosides cause endocarditis or severe infection, the enterococci cannot be sterilized, so treatment is difficult. It has been reported that mortality rates of 67% have been associated with vancomycin-resistance enterococci (VRE).
  • VRE vancomycin-resistance enterococci
  • Enterococcus pasceum among enterococci is known to have a relatively high antibiotic resistance rate compared to other species belonging to enterococci, and its importance is clinically important. Accordingly, there is an urgent need for the development of drugs that can be used for the prevention or treatment of antibiotic-resistant Enterococcus plaque infection.
  • Bacteriophages are tiny microorganisms that infect bacteria, often called phage. Bacteriophages have the ability to proliferate inside the cells of a bacterium after infection (infection), and to destroy the bacteria by destroying the cell wall of the host bacterium when progeny bacteriophages come out of the bacterium.
  • the bacterial infection of bacteriophages is very specific, and the types of bacteriophages that can infect specific bacteria are limited.
  • certain bacteriophages can infect only a certain category of bacteria, and thus, certain bacteriophages can provide an antimicrobial effect only to certain bacteria, thereby killing only certain bacteria and not affecting other bacteria.
  • the bacterial specificity of these bacteriophages provides antimicrobial effects only to the target bacteria and does not affect the flora or flora in the animal.
  • Conventional antibiotics which are commonly used to treat bacteria, have simultaneously affected several types of bacteria. This caused problems such as environmental pollution and disturbance of the normal flora of animals.
  • bacteriophage only works for certain bacteria, so the bacteriophage disruption does not occur in the body. Therefore, the use of bacteriophage is very safe compared to the use of antibiotics, and the likelihood of side effects caused by the use is relatively low.
  • the bacteriophage was discovered in 1915 by a British bacteriologist Twort, who studied the phenomenon of colonization of the micrococcus colony transparently by something.
  • French bacteriologist d'Herelle discovered that some of the filtrates of ill feces dissolve Shigella dysenteriae and found that they independently discovered bacteriophages. In the sense, they named it bacteriophage. Since then, bacteriophages have been found for several pathogenic bacteria such as dysentery, typhoid, and cholera.
  • bacteriophages Because of its special ability to kill bacteria, bacteriophages have been expected to be an effective response to bacterial infections since their discovery. However, after the discovery of penicillin by Flemming, the prevalence of antibiotics has led to studies of bacteriophages only limited to some Eastern European countries and the former Soviet Union. However, since 2000, due to the increase of antibiotic-resistant bacteria, the limit of the existing antibiotics appeared, and as the possibility of developing an alternative to the existing antibiotics is highlighted, bacteriophages are attracting attention as anti-bacterial agents.
  • bacteriophages have a very high specificity for bacteria. Due to this specificity, bacteriophages often exert an antimicrobial effect on only some strains of bacteria belonging to the same species. In addition, the antibacterial activity of the bacteriophages may be different depending on the target bacterial strain itself. For this reason, it is necessary to secure various kinds of useful bacteriophages in order to secure effective control methods for specific kinds of bacteria. In order to develop effective bacteriophage in response to Enterococcus fascia, of course, it is necessary to secure various kinds of bacteriophages that can provide antibacterial effect against Enterococcus fascia. It is also necessary to select and use the bacteriophage which is comparatively superior in terms of strength and antimicrobial range.
  • the present inventors have developed a pharmaceutical composition that can be used to prevent or treat infection of Enterococcus fascium by using bacteriophages isolated from nature capable of killing Enterococcus fascia.
  • the genes of the genome can be isolated so that the bacteriophage suitable for this is separated from nature, and the separated bacteriophages can be distinguished from other bacteriophages.
  • the present invention was completed by developing a pharmaceutical composition using the bacteriophage as an active ingredient, and then confirming that the pharmaceutical composition can be effectively used for preventing or treating infection with enterococcus.
  • an object of the present invention is Siphoviridae bacteriophage Ent-FAP-4 (accession number), characterized in that it has a genome represented by SEQ ID NO: 1 having the ability to kill enterococcus fascia . KCTC 12854BP).
  • Another object of the present invention is to prevent the infection of Enterococcus fascus comprising an isolated bacteriophage Ent-FAP-4 which can kill Enterococcus fasium by killing Enterococcus fasium as an active ingredient. It is to provide a possible pharmaceutical composition.
  • Still another object of the present invention is a pharmaceutical which can be used to prevent infection of enterococcus fasculium containing an isolated bacteriophage Ent-FAP-4 capable of killing enterococcus fasium by infecting enterococcus fasium. It is to provide a method for preventing the infection of Enterococcus plaque using the host composition.
  • Still another object of the present invention is a pharmaceutical which can be used to treat infection with enterococcus fasculium comprising an isolated bacteriophage Ent-FAP-4 capable of killing enterococcus fasium by infecting enterococcus fasium.
  • enterococcus fasculium comprising an isolated bacteriophage Ent-FAP-4 capable of killing enterococcus fasium by infecting enterococcus fasium.
  • Still another object of the present invention is a pharmaceutical which can be used to treat infection with enterococcus fasculium comprising an isolated bacteriophage Ent-FAP-4 capable of killing enterococcus fasium by infecting enterococcus fasium. It is to provide a method for treating infection of Enterococcus fascia using the red composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a disinfectant comprising an isolated bacteriophage Ent-FAP-4 as an active ingredient capable of infecting enterococcus fasium and killing enterococcus fascia. This disinfectant is particularly effective in preventing hospital infections.
  • Another object of the present invention is to provide an antibiotic comprising an isolated bacteriophage Ent-FAP-4 capable of killing enterococcus fasium by infecting enterococcus fasium.
  • the present invention is Sypovirida bacteriophage Ent-FAP-4 (Accession No. KCTC 12854BP) isolated from nature, which has a genome represented by SEQ ID NO: 1 having the ability to kill enterococcus fascia (Accession No. KCTC 12854BP), which is effective.
  • a pharmaceutical composition comprising as an ingredient, and a method for preventing or post-infection treatment of enterococcus fasium using the pharmaceutical composition are provided.
  • Bacteriophage Ent-FAP-4 was isolated by the inventors and deposited in the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center on June 23, 2015 (Accession No. KCTC 12854BP).
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising bacteriophage Ent-FAP-4 as an active ingredient, which can be used to prevent or treat infection of Enterococcus sp.
  • examples of the pharmaceutical composition may provide an antiseptic or antibiotic, but are not limited thereto.
  • Bacteriophage Ent-FAP-4 contained in the pharmaceutical composition of the present invention effectively kills enterococcus fasium, thus preventing diseases such as urinary tract infection, wound infection, bacteremia, endocarditis and the like caused by enterococcus fascia (infection prevention) Or effective in treatment (infection treatment). Therefore, the composition of the present invention can be used for the purpose of preventing or treating diseases caused by enterococcus plaque. Diseases caused by Enterococcus fascia herein are termed urinary tract infections, wound infections, bacteremia, endocarditis and the like.
  • Enterococcus pasium herein may be sensitive to or resistant to existing antibiotics. That is, it does not matter whether or not resistance to existing antibiotics is obtained.
  • prevention refers to (i) prevention of enterococcus plaque infection; And (ii) inhibiting the development into a disease caused by Enterococcus plaque infection.
  • treatment refers to (i) inhibition of a disease caused by enterococcus fascia; And (ii) all acts of alleviating the morbidity of a disease caused by Enterococcus fascia.
  • the term “separation”, “separation”, or “separation” refers to the separation of bacteriophages from a natural state by using various experimental techniques and to distinguish the bacteriophages of the present invention from other bacteriophages.
  • the present invention also includes the propagation of the bacteriophage of the present invention to industrial use by biotechnology.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a method of spraying or spraying on a diseased site, and can also be administered by oral or parenteral administration.
  • parenteral administration intravenous administration, intraperitoneal administration, muscle Administration may also be by intra-, subcutaneous or topical administration.
  • Suitable applications, sprays, and dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated by the method of formulation, mode of administration, age, weight, sex, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and Depending on factors such as response responsiveness, usually an experienced physician or veterinarian can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes bacteriophage Ent-FAP-4 as an active ingredient.
  • the bacteriophage Ent-FAP-4 included at this time is included in the range of 1 ⁇ 10 1 pfu / ml to 1 ⁇ 10 30 pfu / ml or 1 ⁇ 10 1 pfu / g to 1 ⁇ 10 30 pfu / g, preferably 1 ⁇ . 10 4 pfu / ml to 1 ⁇ 10 15 pfu / ml or 1 ⁇ 10 4 pfu / g to 1 ⁇ 10 15 pfu / g.
  • compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulations here may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media or in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be embodied as a disinfectant or an antibiotic, depending on the mode of application, but not limited thereto.
  • the term 'antibiotic' generically refers to preservatives, fungicides and antibacterial agents.
  • Bacteriophages that can provide antimicrobial activity against other bacterial species can be added to the pharmaceutical composition of the present invention in order to increase the efficiency in this application.
  • other types of bacteriophages having antibacterial activity against enterococcus fascia may be added. Even bacteriophages having antimicrobial activity against Enterococcus fascium are different from each other in terms of strength and antimicrobial range of antimicrobial activity, so a proper combination thereof can maximize the effect.
  • the method for preventing or treating infection with enterococcus using the pharmaceutical composition comprising bacteriophage Ent-FAP-4 of the present invention as an active ingredient has a very specificity for enterococcus pas as compared to the antibiotic-based method. High can provide an advantage. This means that it can be used for the purpose of preventing or treating infection of Enterococcus spp. Without affecting other useful floras, which means that the side effects of its use are very small. In general, when antibiotics are used, the common flora is also damaged, resulting in various side effects.
  • the antimicrobial activity of the bacteriophage against individual bacterial strains in terms of the strength of the antimicrobial activity and the antimicrobial range [strains belonging to Enterococcus fascium]. This range is exerted.
  • bacteriophages can exert antimicrobial activity against some strains belonging to the same bacterial species. That is, even if they belong to the same bacterial species, there may be a difference in susceptibility to bacteriophages according to individual bacterial strains].
  • the present invention provides a differential antimicrobial effect compared to other bacteriophages having antibacterial activity against enterococcus pasceum. Can provide. This makes a big difference in the effectiveness of industrial sites.
  • 1 is an electron micrograph of the bacteriophage Ent-FAP-4.
  • the transparent part is a lytic plaque formed by lysis of bacteria.
  • enterococcus pasium used for bacteriophage separation was previously identified by the present inventors and identified as enterococcus pasium.
  • Enterobacter nose kusu paesyum a TSB T ryptic S oy roth B inoculated with 1/1000 ratio medium (Casein Digest, 17 g / L; Soy bean Digest, 3 g / L; Dextrose , 2.5 g / L; NaCl, 5 g / L; dipotassium phosphate, 2.5 g / L) were added together and then shaken at 37 ° C. for 3-4 hours. After incubation, the supernatant was recovered by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes.
  • 1/1000 ratio medium Casein Digest, 17 g / L; Soy bean Digest, 3 g / L; Dextrose , 2.5 g / L; NaCl, 5 g / L; dipotassium phosphate, 2.5 g / L
  • the recovered supernatant was inoculated with enterococcus fasium at a rate of 1/1000 and then shaken again at 37 ° C. for 3-4 hours.
  • this process was repeated five times in order to sufficiently increase the number of bacteriophages (Titer).
  • the culture was centrifuged at 8,000 rpm for 20 minutes. After centrifugation, the recovered supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter.
  • the conventional spot assay using the filtrate thus obtained examined whether bacteriophages capable of killing enterococcus were.
  • the drip experiment was conducted as follows. Enterococcus potassium was inoculated in TSB medium at a rate of 1/1000 and then shaken at 37 ° C. for one night.
  • the plated flat medium was left in a clean bench for about 30 minutes to allow the smear to dry.
  • the filtrate in which the transparent ring is formed contains bacteriophages capable of killing enterococcus fascia. Through this investigation, it was possible to secure a filtrate including bacteriophages having an ability to kill enterococcus pasceum.
  • Separation of pure bacteriophages was carried out using a filtrate in which the presence of bacteriophages with killing ability to enterococcus was confirmed. Separation of pure bacteriophage was carried out using a conventional Plaque assay. To explain this in detail, one of the lysates formed in the lytic plaque assay was recovered using a sterile tip and then added to the enterococcus culture medium, followed by incubation at 37 ° C. for 4-5 hours. After incubation, the supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. Enterococcus culture medium was added to the obtained supernatant at a volume of 50/50 and then incubated at 37 ° C for 4-5 hours.
  • this procedure was performed at least five times, and finally, the supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. Using the obtained supernatant, lysis plate analysis was performed again. Since the separation of the pure bacteriophage is usually not achieved only once in the above process, the previous step was repeated again using the lysate formed. This process was repeated at least five times to obtain a solution containing pure bacteriophage. Typically, the separation of the pure bacteriophage was repeated until both the size and shape of the lysate formed were similar. Finally, electron microscopic analysis confirmed the pure separation of bacteriophages. The procedure described above was repeated until pure separation was confirmed by electron microscopy analysis.
  • Electron microscopic analysis was performed according to a conventional method. This is briefly described as follows. The solution containing the pure bacteriophage was buried in a copper grid and subjected to reverse staining and drying with 2% uranyl acetate and observed through a transmission electron microscope. Electron micrographs of purely isolated bacteriophages are shown in FIG. 1. Judging from the morphological features, the newly acquired bacteriophage belonged to Siphoviridae bacteriophage.
  • the solution containing pure bacteriophage identified in this way was subjected to the following purification process.
  • the solution containing the pure bacteriophage was added to enterococcus culture medium in a volume of 1/50 of the total volume of the solution and then incubated again for 4-5 hours. After incubation, the supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. This procedure was repeated a total of five times to obtain a solution containing a sufficient number of bacteriophages.
  • the supernatant obtained by the final centrifugation was filtered using a 0.45 ⁇ m filter, followed by a conventional polyethylene glycol (PEG) precipitation process.
  • PEG polyethylene glycol
  • bacteriophage precipitate was suspended in 5 ml of buffer (Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO 4 , 0.1% Gelatin, pH 8.0). This is called bacteriophage suspension or bacteriophage solution.
  • bacteriophage Purified pure bacteriophage was obtained through the above procedure, and the bacteriophage was named as bacteriophage Ent-FAP-4 and deposited on June 23, 2015 at the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center (Accession No. KCTC 12854BP). ).
  • the genome of the bacteriophage Ent-FAP-4 was isolated as follows. Bacteriophage suspension obtained in the same manner as in Example 1 was used for dielectric separation. First, in order to remove DNA and RNA of enterococcus pasceum which may be contained in the suspension, 200 U of DNase I and RNase A were added to 10 ml of bacteriophage suspension, and then left at 37 ° C. for 30 minutes. In order to remove the activity of DNase I and RNase A after 30 minutes of standing, 500 ⁇ l of 0.5 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was added and allowed to stand for another 10 minutes. The mixture was allowed to stand at 65 ° C.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Ratio of isopropyl alcohol was added thereto, and then centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. The dielectric was precipitated. After the precipitate was recovered, 70% ethanol (Ethanol) was added to the precipitate, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes to wash the precipitate. The washed precipitate was recovered, dried in vacuo and dissolved in 100 ⁇ l of water. By repeating the above process, a large amount of the genome of bacteriophage Ent-FAP-4 was obtained.
  • the genome thus obtained was subjected to next generation sequencing analysis using an illumina Mi-Seq instrument at the National Instrumentation Center for Environmental Management, Seoul National University. Genomic sequence information was obtained.
  • the bacteriophage Ent-FAP-4 genome finally analyzed has a size of 42,407 bp and the entire genome sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the bacteriophage Ent-FAP-4 is a novel bacteriophage different from the previously reported bacteriophages. With this fact, it is judged that Bacteriophage Ent-FAP-4 can provide different antibacterial effects from other bacteriophages that have been reported from the fact that different kinds of bacteriophages have different strengths and ranges of antibacterial activity.
  • Bacteriophage Ent-FAP-4 The killing ability of the bacteriophage Ent-FAP-4 against Enterococcus fascia was investigated. The killing ability was investigated in a manner to investigate the formation of transparent rings through the drip experiment shown in Example 1. Enterococcus pasiums used for killing capacity investigation were separated by the inventors and identified as enterococcus pasceum for a total of 10 weeks. Bacteriophage Ent-FAP-4 had killing ability in 9 out of 10 strains of Enterococcus faeces. Representative experimental results are shown in FIG. 2. Bacteriophage Ent-FAP-4 is Staphylococcus aureus and Pasteurella multocida.
  • bacteriophage Ent-FAP-4 has an excellent killing ability against enterococci pasceum, it was confirmed that it can exert an antimicrobial effect against a number of enterococcus. This means that bacteriophage Ent-FAP-4 can be utilized as an active ingredient of a composition for the purpose of preventing or treating infection with enterococci.
  • Example 4 bacteriophage Ent - FAP -4 Enterococcus Pasce Experimental Example for Infection Prevention
  • bacteriophage Ent-FAP-4 of the present invention not only inhibits the growth of enterococcus fascium but also kills the bacteriophage Ent-FAP-4. It could be concluded that it can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for the purpose of preventing the disease.
  • Example 5 bacteriophage Ent - FAP With -4 Enterococcus Pasce Infectious disease treatment example 1
  • the treatment effect of bacteriophage Ent-FAP-4 in diseases caused by Enterococcus fascium was investigated. Two 40-day-old chicks were divided into two groups, and then separated and bred for 14 days. Feed containing Enterococcus bacterium at a level of 1 ⁇ 10 7 cfu / g for 3 days from the 5th day from the start of the experiment was fed in a conventional feeding manner. Enterococcus bacterium was identified in both groups in feces from the last day of feed containing the bacterium Enterococcus.
  • the feed containing 4 was fed according to a conventional feed feeding method.
  • the chicks of the control group non-bacterial phage administration group
  • Enterococcus agar plate (MB cell) was used to prevent interference by other contaminating bacteria. Samples were plated in selective medium and incubated at 37 ° C. for 18-24 hours. The colony (colony), which is considered to be enterococcus fascium, was selected from the cultured selective medium and purified after separation, followed by polymerase chain reaction (PCR) to identify enterococcus fascidium (polymerase chain reaction).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Enterococcus bacterium bacteria measurement result date D9 D10 D11 D12 D13 D14 Control group (not administered bacteriophage) 1.0 1.0 1.1 1.2 1.1 1.3 Experimental group (bacteriophage administration) 0.2 0.1 0.1 0 0 0
  • the bacteriophage Ent-FAP-4 of the present invention is very effective for the treatment of diseases caused by Enterococcus bacterium.
  • Example 6 bacteriophage Ent - FAP With -4 Enterococcus Pasce Infectious disease treatment example 2
  • mice in each group were experimented for 7 days while breeding 5 rats in the experimental mouse cage.
  • all mice received an intraperitoneal injection of 0.1 ml of Enterococcus pausium suspension.
  • the administered enterococcus plaque suspension was prepared as follows. Enterococcus bacterium was cultured at 37 ° C. for 18 hours using TSB medium, and only the cells were recovered. The recovered cells were suspended in saline (pH 7.2) to 5 ⁇ 10 9 cfu / ml.
  • mice in the experimental group Two hours after Enterococcus bacterium administration, 10 9 pfu of bacteriophage Ent-FAP-4 was administered to the mice in the experimental group (the bacteriophage solution group) by intraperitoneal injection.
  • mice of the control group non-administered group of bacteriophage solution
  • Feed and negative feeds were the same in both control and experimental groups.
  • the survival of the mice was examined every day from the administration of Enterococcus bacterium to the end of the test. The results were shown in Table 3.
  • the bacteriophage Ent-FAP-4 of the present invention is very effective for the treatment of diseases caused by Enterococcus bacterium.

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Abstract

본 발명은 엔테로코쿠스 패슘을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP), 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및 이 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 엔테로코쿠스 패슘 박테리오파지 Ent-FAP-4 및 이의 엔테로코쿠스 패슘 증식 억제 용도
본 발명은 엔테로코쿠스 패슘에 감염하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘 감염을 예방 또는 처치하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 감염 후 처치 방법에 관한 것이다.
장알균(Enterococcus)은 위장관과 비뇨생식계에 상재하는 통성혐기성 그람양성 알균이다. 장알균 속(Genus)에는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스 두란스(Enterococcus durans), 엔테로코쿠스 카쎄리프라부스(Enterococcus casseliflavus)를 포함하여 약 19가지 종(Species)이 보고되고 있으며, 이 중에 실제 감염을 일으키는 주요 균종으로는 엔테로코쿠스 패칼리스와 엔테로코쿠스 패슘을 제시할 수 있다. 과거에는 엔테로코쿠스 패칼리스에 의한 감염이 매우 흔하였지만 최근에는 엔테로코쿠스 패슘에 의한 감염이 상대적으로 늘고 있다.
장알균은 비교적 독성이 약하여 정상인에서는 질병을 일으키지 않으나 노인이나 면역저하 환자, 만성 기저질환자 또는 병원에 입원중인 환자에서는 요로감염, 창상감염, 균혈증, 심내막염 등의 각종 기회감염증을 유발한다. 또한, 장알균은 외부로부터 유전자 교잡을 통하여 병독인자(Virulence factor)를 획득하여 감염성 질환(Infectious disease)을 유발할 수도 있다. 장알균에 의한 감염증 중에는 요로감염이 가장 빈번하며, 그 다음으로 창상감염이 흔하다. 장알균에 의한 그 밖의 주요감염으로 심내막염을 제시할 수 있는데, 세균성 심내막염의 5-20%가 장알균에 의한 것이다.
한편, 장알균은 페니실린과 세파로스포린계 등 여러 항생제에 대하여 다제내성을 나타내고 있어 그 문제가 더욱 심각하다. 장알균은 새로운 DNA(플라스미드, Transposons)를 얻거나, 돌연변이를 이용하여 항생제 내성을 획득한다고 알려져 있다. 특히 아미노글리코사이드에 대한 내성을 획득한 장알균이 심내막염이나 중증 감염을 일으킨 경우에는 이 장알균을 살균할 수 없기 때문에 치료에 성공하기가 어렵다. 반코마이신 내성 장알균(Vancomycin-resistance enterococci, VRE)에 의한 균혈증이 있는 경우는 사망률이 67%에 달하는 것으로 보고되고 있다.
장알균 중에 엔테로코쿠스 패슘의 경우는 장알균 속에 속하는 다른 균종들에 비하여 상대적으로 높은 항생제 내성률을 가진다고 알려지면서 임상적으로 그 중요성이 부각되고 있다. 이에 따라 항생제 내성 엔테로코쿠스 패슘 감염 예방 또는 치료에 활용할 수 있는 약제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후에 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있으며 이로 인하여 특정 세균만을 사멸시키고 다른 세균에는 영향을 주지 않는다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성은 목적으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에게는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 세균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
세균을 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후 세균 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-세균제로 주목을 받고 있다.
앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 엔테로코쿠스 패슘에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.
이에, 본 발명자들은 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 약학적 조성물을 개발하고, 또 이 약학적 조성물을 이용하여 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방 또는 처치하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정지을 수 있도록 유전체(Genome)의 유전자 서열을 확보한 후 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 약학적 조성물을 개발한 다음에 이 약학적 조성물이 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 처치에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코쿠스 패슘에 감염하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Ent-FAP-4를 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방하는 데에 활용 가능한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코쿠스 패슘에 감염하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Ent-FAP-4를 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방하는 데에 활용 가능한 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코쿠스 패슘에 감염하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Ent-FAP-4를 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코쿠스 패슘에 감염하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Ent-FAP-4를 유효성분으로 포함하는 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코쿠스 패슘에 감염하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Ent-FAP-4를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공하는 것이다. 이 소독제는 특히 병원감염 예방에 효과적이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코쿠스 패슘에 감염하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Ent-FAP-4를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.
본 발명은 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP), 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및 이 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 감염 후 처치 방법을 제공한다.
박테리오파지 Ent-FAP-4는 본 발명자들에 의해 분리된 후 2015년 6월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 12854BP).
또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Ent-FAP-4를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물의 예로는 소독제나 항생제를 제시할 수 있으나 이에 국한되지 않음은 자명하다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 박테리오파지 Ent-FAP-4는 엔테로코쿠스 패슘을 효과적으로 사멸시키므로 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 요로감염, 창상감염, 균혈증, 심내막염 등의 질병의 예방(감염 방지) 또는 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있다. 본 명세서에서의 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환은 요로감염, 창상감염, 균혈증, 심내막염 등을 총칭한다.
본 명세서에서의 엔테로코쿠스 패슘은 기존 항생제에 대하여 민감하든지 또는 기존 항생제에 대하여 내성을 가질 수 있다. 즉, 기존 항생제에 대한 내성 획득 여부는 상관이 없다.
본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”이라는 용어는 (i) 엔테로코쿠스 패슘 감염의 방지; 및 (ii) 엔테로코쿠스 패슘 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (i) 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ii) 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 본 발명의 박테리오파지를 특정지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 본 발명의 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에는 박테리오파지 Ent-FAP-4가 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Ent-FAP-4는 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1 × 1030 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만, 소독제나 항생제로 구현될 수 있다. 본 명세서에 있어서, '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.
이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 약학적 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 Ent-FAP-4를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 처치 방법은 기존의 항생제 등에 기반을 둔 방식에 비하여 엔테로코쿠스 패슘에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[엔테로코쿠스 패슘에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 엔테로코쿠스 패슘에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.
도 1은 박테리오파지 Ent-FAP-4의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Ent-FAP-4의 엔테로코쿠스 패슘에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 투명한 부분은 세균이 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리
엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 선별에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 엔테로코쿠스 패슘은 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 엔테로코쿠스 패슘으로 동정(Identification)된 것이다.
박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 엔테로코쿠스 패슘을 1/1000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음에 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 엔테로코쿠스 패슘을 1/1000 비율로 접종한 다음에 37℃에서 3-4시간동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.
상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 엔테로코쿠스 패슘을 1/1000 비율로 접종한 다음에 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 엔테로코쿠스 패슘의 배양액 3 ml(OD600이 1.5)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후에 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 엔테로코쿠스 패슘이 도말된 평판배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판배지를 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음에 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 엔테로코쿠스 패슘을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 엔테로코쿠스 패슘에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.
엔테로코쿠스 패슘에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 엔테로코쿠스 패슘 배양액에 첨가해 주어 4-5 시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 엔테로코쿠스 패슘 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 37℃에서 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때 신규 확보된 박테리오파지는 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.
이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 엔테로코쿠스 패슘 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5 시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ml에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.
상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Ent-FAP-4로 명명한 뒤, 2015년 6월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12854BP).
실시예 2: 박테리오파지 Ent - FAP -4의 유전체 분리 및 서열 분석
박테리오파지 Ent-FAP-4의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 엔테로코쿠스 패슘의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ml에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/ml) 100 μl를 첨가한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ml를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Ent-FAP-4의 유전체를 다량 확보하였다.
이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행하여 박테리오파지 Ent-FAP-4의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Ent-FAP-4 유전체는 42,407 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 Ent-FAP-4의 유전체 서열을 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 박테리오파지 Ent-FAP-4의 유전체 서열과 50% 이상의 상동성을 가진 박테리오파지의 유전체 서열은 없었다.
이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 Ent-FAP-4는 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 Ent-FAP-4는 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단하였다.
실시예 3: 박테리오파지 Ent - FAP -4의 엔테로코쿠스 패슘에 대한 사멸능 조사
분리된 박테리오파지 Ent-FAP-4의 엔테로코쿠스 패슘에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 엔테로코쿠스 패슘들은 본 발명자들에 의해 분리되어 엔테로코쿠스 패슘으로 동정된 것들로 총 10주이었다. 박테리오파지 Ent-FAP-4는 실험에 대상이 된 엔테로코쿠스 패슘 10주 중 9주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Ent-FAP-4는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis) 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Ent-FAP-4는 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.
이상의 결과로 박테리오파지 Ent-FAP-4는 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 우수한 사멸능을 가지며, 다수의 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Ent-FAP-4가 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.
실시예 4: 박테리오파지 Ent - FAP -4의 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방에 대한 실험예
9 ml의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 109 pfu/ml 수준의 박테리오파지 Ent-FAP-4 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ml의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 엔테로코쿠스 패슘의 배양액을 넣어 주었다. 엔테로코쿠스 패슘을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 배양기에 옮겨 진탕배양 하면서 엔테로코쿠스 패슘의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Ent-FAP-4 액을 첨가해 준 튜브에서는 엔테로코쿠스 패슘의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 엔테로코쿠스 패슘의 성장 억제가 관찰되지 않았다.
엔테로코쿠스 패슘의 성장 억제
구분 OD600 흡광도 값
배양 0분 배양후 60분 배양후 120분
박테리오파지 액 미첨가 0.5 0.9 1.6
박테리오파지 액 첨가 0.5 0.4 0.3
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Ent-FAP-4가 엔테로코쿠스 패슘의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Ent-FAP-4가 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방하는 목적의 약학적 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예 5: 박테리오파지 Ent - FAP -4를 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염 질환 처치예 1
박테리오파지 Ent-FAP-4의 엔테로코쿠스 패슘에 의한 질환이 유발된 동물에서의 처치 효과를 조사하였다. 2일령 병아리 40마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 실험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 107 cfu/g 수준으로 엔테로코쿠스 패슘 균을 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 엔테로코쿠스 패슘 균을 포함하고 있는 사료 급이 마지막 날부터 분변에서 엔테로코쿠스 패슘 균이 두 그룹 모두에서 확인되었다. 3일간의 엔테로코쿠스 패슘 균을 포함하고 있는 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 실험군(박테리오파지 투여군)의 병아리들에게는 1× 108 pfu/g의 박테리오파지 Ent-FAP-4를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 병아리들에게는 박테리오파지 Ent-FAP-4가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험 개시일로부터 9일째가 되는 날부터는 시험동물들을 대상으로 분변에서의 엔테로코쿠스 패슘 균수를 측정하였다. 본 실시예의 엔테로코쿠스 패슘 균수 측정에서는 타 오염 세균에 의한 간섭을 막기 위해 엔테로코쿠스 균 선택배지(Pfizer Selective Enterococcus agar plate; MB cell)를 사용하였다. 시료를 선택배지에 도말한 후에 37℃에서 18~24시간 배양하였다. 배양한 선택배지로부터 엔테로코쿠스 패슘으로 추정되는 콜로니(colony)를 선별하여 순수분리한 후 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction: PCR)을 통해 엔테로코쿠스 패슘을 확인하는 방식(중합효소연쇄반응을 통해 엔테로코쿠스 패슘으로 확인된 콜로니의 수가 102 cfu/ml 이상일 경우: 2, 중합효소연쇄반응을 통해 엔테로코쿠스 패슘으로 확인된 콜로니의 수가 101~102 cfu/ml 이상일 경우: 1, 중합효소연쇄반응을 통해 엔테로코쿠스 패슘으로 확인된 콜로니의 수가 100~101 cfu/ml 이상일 경우:0)으로 실시하였다. 그 결과를 제시하면 표 2와 같았다.
엔테로코쿠스 패슘 균 수 측정 결과 (평균치)
날짜 D9 D10 D11 D12 D13 D14
대조군(박테리오파지 미투여) 1.0 1.0 1.1 1.2 1.1 1.3
실험군(박테리오파지 투여) 0.2 0.1 0.1 0 0 0
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Ent-FAP-4가 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 박테리오파지 Ent - FAP -4를 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염 질환 처치예 2
엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발된 질환에 대한 박테리오파지 Ent-FAP-4의 치료 효과를 다음과 같이 조사하였다. 생후 8주령의 생쥐 40마리를 한 그룹 당 20마리씩 총 2개 그룹으로 나눈 후 각 그룹의 생쥐들은 5마리씩 실험용 생쥐 케이지에 분리 사육하면서 7일간 실험을 실시하였다. 실험 개시 2일째 되는 날에 모든 생쥐들에게 엔테로코쿠스 패슘 부유액 0.1 ml을 복강 주사로 투여하였다. 투여한 엔테로코쿠스 패슘 부유액은 다음과 같이 준비하였다. 엔테로코쿠스 패슘 균을 TSB 배지를 이용하여 37℃에서 18시간 배양한 후 균체만을 회수하였다. 회수한 균체를 5× 109 cfu/ml이 되게끔 생리식염수(pH 7.2)에 부유시켰다. 엔테로코쿠스 패슘 균 투여 후 2시간 경과 시점에 실험군(박테리오파지 액 투여군)의 생쥐들에게 109 pfu의 박테리오파지 Ent-FAP-4를 복강 주사로 투여하였다. 대조군(박테리오파지 액의 미 투여군)의 생쥐들은 0.1 ml의 생리식염수를 복강 주사로 투여하였다. 사료와 음수는 대조군과 실험군 모두 동일하게 급이하였다. 엔테로코쿠스 패슘 균 투여 후부터 시험 종료일까지 매일 생쥐들의 생존 여부를 조사하였다. 그 결과는 표 3과 같았다.
생존율(%) 측정 결과
균 투여 후 경과 일 D0 D1 D2 D3 D4 D5
대조군(박테리오파지 액 미 투여) 100 75 30 10 10 10
실험군(박테리오파지 액 복강 주사 투여) 100 95 95 95 95 95
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Ent-FAP-4가 엔테로코쿠스 패슘 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명: KCTC
수탁번호: KCTC 12854BP
수탁일자: 20150623
Figure PCTKR2018000509-appb-I000001

Claims (5)

  1. 엔테로코쿠스 패슘을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 시포비리대 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP).
  2. 제1항의 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP)를 유효성분으로 포함하는, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 소독제와 항생제를 포함한 약학적 조성물 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 의한 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 소독제와 항생제를 포함한 약학적 조성물 형태로 사람을 제외한 동물에 투여되는 것을 특징으로 하는, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
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