DE60113851T2

DE60113851T2 - Bakteriophage mit breitem wirtsspektrum

Info

Publication number: DE60113851T2
Application number: DE60113851T
Authority: DE
Inventors: R. Carl MERRIL; Sankar Adhya; Deal Scholl
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2000-07-25
Filing date: 2001-07-25
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2021-07-26
Also published as: EP1305038A2; WO2002007742A9; ES2252263T3; EP1305038B1; ATE305793T1; US7163818B2; AU2001278003A1; DE60113851D1; CA2417188A1; US20030216338A1; WO2002007742A8; WO2002007742A3; WO2002007742A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfingung offenbart Arzneimittel und deren Verwendung für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung und Behandlung bakterieller Infektionen, umfassend die Verwendung eines Bakteriophagen mit breitem Wirtsspektrum, welches auf mehreren verschiedenen hydrolytischen Schwanzproteinen basiert.
Hintergrund der Erfindung
Die Kapsel-Polysaccharide (K-Antigene) von Escherichia coli gehen häufig mit erhöhter Virulenz einher (17). Besonders das K1-Antigen erhöht die Eindringfähigkeit von E. coli, und diese Stämme sind häufig an Fällen von Meningitis und Sepsis beteiligt (32). Diese Polysaccharidhüllen fungieren auch als Erkennungsstellen für Bakteriophagen, welche häufig Schwanzspitzen tragen, die Polysaccharid-Depolymerisierungsaktivität aufweisen. Mehrere K1-spezifische Phagen sind beschrieben worden (10), wobei man bei einem, ΦK1E, gefunden hat, dass dieser N-Acetylneuraminidase (Endosialidase) als Teil des Schwanzfaserproteins besitzt (37). Dieses Enzym katalysiert die Spaltung von α-2,8-verknüpftem poly-N-Acetylneuraminsäurezuckerpolymer der K1-Kapsel. Es ist vorgeschlagen worden, dass das Schwanzfaserprotein sowohl an der Adsorption an die Zelloberfläche als auch an der Penetration in die Zelle beteiligt ist, indem es die Polysaccharidkapsel enzymatisch abbaut. Das ΦK1E-Endosialidasegen ist cloniert und sequenziert worden (20). Ein ähnliches Gen wurde von ΦK1F cloniert und sequenziert (29).
ΦK5 ist ein verwandter Bakteriophage, der spezifisch für E. coli-Stämme ist, welche an ihrer Oberfläche das K5-Antigen tragen, ein Polymer, welches aus einer sich wiederholenden Struktur von an der Position 4 verknüpftem α-N-Acetylglucosamin und β-Glucuronsäure (N-Acetylheparosin) besteht. In diesem Fall codiert ΦK5 ein Schwanz-assoziiertes, K5-spezifisches Lyase-Protein, welches auch für die Bindung an die Zelloberfläche und den Abbau der K5-Polysaccharidkapsel verantwortlich ist (12, 14). Es sind auch Phagen gefunden worden, die spezifisch für andere Polysaccharid-Antigene von E. coli sind, wozu K3, K7, K12, K13 und K20 gehören (26, 27); diese besitzen wahrscheinlich alle spezifische Polysaccharid-Depolymerisierungsaktivität als Teil des Phagenpartikels.
Sowohl ΦK5 als auch ΦK1E haben stromaufwärts von ihren Schwanzproteinen einen Salmonella-Phage SP6-artigen Promoter sowie einen Bereich mit ähnlicher Sequenz, der direkt stromabwärts vom Lyase-Gen von ΦK5 und direkt stromaufwärts vom Endosialidase-Gen von ΦK1E liegt (6). Die Sequenzen stromaufwärts vom Schwanzgen-Promotor in ΦK1E und ΦK5 sind ebenfalls sehr ähnlich. ΦK5, ΦK1E und SP6 haben eine(n) gemeinsame(n) Morphologie und Lebenszyklus, was darauf hindeutet, dass sie möglicher Weise eng verwandt sind.
Antibiotika haben sich bei der Behandlung von Infektionen gegenüber der potenziellen Verwendung von Bakteriophagen durchgesetzt. Der extensive Gebrauch von Antibiotika hat dazu geführt, dass es Antibiotika-resistente bakterielle Pathogene gibt. Daher haben Forscher die Therapie und Prophylaxe mit Bakteriophagen wieder untersucht. Es gibt jedoch ein Haupthindernis, welches häufig gegen einen Einsatz von Bakteriophagen vorgebracht wird, nämlich deren überaus schmales Wirtsspektrum. Für therapeutische und prophylaktische Anwendungen werden Bakteriophagen benötigt, welche ein breites Wirtsspektrum aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein virulenter ΦK1-5-Bakteriophage mit einem doppelsträngigen DNA-Genom wurde isoliert, und man fand, dass dieser E. coli-Stämme infizieren kann, welche entweder die K1- oder die K5-Polysaccharidkapsel besitzen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass das Virion aus einem kleinen ikosaedrischen Kopf mit kurzen Schwanzspitzen besteht, ähnlich wie die Angehörigen der Familie Podoviridae. Eine Analyse der DNA-Sequenz, welche das Schwanzfaserprotein codiert, zeigt zwei offene Leseraster, die früher charakterisierte hydrolytische Phagen-Schwanzfaserproteine codieren. Das erste ist das Gen für das K5-Lyase-Protein von ΦK5, welches es dem Phagen erlaubt, spezifisch E. coli K5-Stämme zu infizieren. Ein zweites offenes Leseraster codiert ein Protein, dessen Aminosäuresequenz fast identisch zu der des N-Acetyl-Neuraminidase (Endosialidase)-Proteins von ΦK1E ist, das es diesem Phagen erlaubt, spezifisch E. coli-K1-Stämme zu infizieren. Wir liefern experimentelle Beweise dafür, dass reife Phagenpartikel beide Schwanzfaserproteine enthalten, und eine Mutationsanalyse zeigt, dass jedes der Proteine unabhängig voneinander inaktiviert werden kann. Ein Vergleich der Schwanzgenbereiche von ΦK5, ΦK1E und ΦK1-5 zeigt, dass die Gene in einer modularen bzw. Kassetten-Konfiguration angeordnet sind. Der Nachweis, dass ein Phage mehrere Schwanzproteine enthalten kann, die dessen Wirtsspektrum erweitern, ist nützlich für die Herstellung von Phagen mit Breitspektrum-antibakteriellen Eigenschaften für die Therapie und Prophylaxe bakterieller Infektionen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Elektronenmikroskopische Aufnahme von ΦK1-5 (Negativfärbung mit Phosphowolframsäure, bei einer Vergrößerung von 115.500×). Morphologisch kann dieser Phage in die Familie Podoviridae eingeordnet werden, welche T7 und SP6 umfasst.
2. Vergleich der codierenden Bereiche der Schwanzproteine von ΦK1-5, ΦK5 und ΦK1E. Alle drei Phagen haben ähnliche Sequenzen in dem stromaufwärts gelegenen Bereich (welcher einen SP6-Promotor enthält) sowie einen 85 Basen langen intergenischen Bereich. Direkt stromabwärts vom Promotor codieren ΦK1-5 und ΦK5 ein Lyase-Protein, und ΦK1E codiert ORF_L. Unmittelbar hinter den Stopcodons der Lyasen bzw. des ORF_L liegt der intergenische Bereich, welcher eine potenzielle Haarnadelstruktur enthält, wovon die erste ein Rho-unabhängiger Transkriptionsterminator sein könnte. Unmittelbar im Anschluss daran codieren ΦK1-5 und ΦK1E eine Endosialidase an der Stelle, an der ΦK5 ORF_P codiert. Keiner der drei Phagen besitzt irgendwelche codierenden Bereiche stromabwärts, und das DNA-Molekül endet in allen drei Fällen. In diesem terminalen Bereich gibt es keinerlei Sequenzähnlichkeit.
3. Zwei mögliche Modelle für die Anordnung der Schwanzproteine auf dem Phagencapsid. (a) Es gibt drei Kopien von jedem Schwanz, die ein Hexamer bilden. (b) Es gibt sechs Kopien von jedem Schwanz. Einer ist am Kopf angelagert und ist Teil des „Innenteils" des Schwanzes. Der andere ist dann an dem ersten Schwanzprotein angelagert, wodurch im Ergebnis eine längere Schwanzfaser mit zwei verschiedenen enzymatischen Aktivitäten entsteht.
4. Vergleich der codierenden Bereiche der Schwanzproteine von ΦK1-5, ΦK5, ΦK1E und SP6.
Kurze Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO: 1 ist die DNA-Sequenz des Schwanzgen-Bereichs von ΦK1-5.
SEQ ID NO: 2 ist die DNA-Sequenz des ΦSP6-Schwanzgens.
SEQ ID NO: 3 ist die DNA-Sequenz von ΦK1-5 in der Sense-Richtung.
SEQ ID NO: 4 ist die DNA-Sequenz von ΦK1-5 in der Antisense-Richtung.
Kurze Beschreibung der hinterlegten biologischen Materialien
ΦK1-5 wurde am 02. Juli 2001 unter der ATCC Hinterlegungs-Nr. PTA-3495 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA hinterlegt. Diese Hinterlegung erfolgte nach den Vorschriften des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und die darunter fallenden Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies gewährleistet die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur des hinterlegten Organismus für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegungen. Der hinterlegte Organismus wird von der ATCC zu den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt, vorbehaltlich einer Vereinbarung zwischen Antragsteller und ATCC, welche nach Erteilung des entsprechenden US Patents bzw. nach Offenlegung einer US- oder fremden Patentanmeldung – je nachdem, was eher eintritt – eine permanente, unbeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der hinterlegten Kultur gegenüber der Öffentlichkeit sicher stellt; dies garantiert die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für eine vom Präsidentien des US Patent- und Markenamtes gemäß 35 USC 122 sowie den entsprechenden Regeln des Präsidenten (einschließlich 37 CFR 1.14) als berechtigt befundene Person. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stamms ist nicht als Lizenz auszulegen, die Erfindung unter Zuwiderhandlung der in der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen gewährten Rechte zu nutzen.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Wir haben entdeckt, dass es möglich ist, mehr als ein Wirt-spezifisches Schwanzprotein in einem einzigen Bakterienstamm zu exprimieren, und dass die Expression dieser Schwanzproteine es dem Virus erlaubt, mehrere spezifische Wirte zu infizieren. Diese Entdeckung erleichtert die gentechnische Herstellung von Phagen mit verbreitertem Wirtsspektrum. Es gibt z.B. Phagen, die E. coli-Stämme infizieren können, welche das K1-Polysaccharid in ihrer äußeren Kapsel enthalten. Solche E. coli-Bakterienstämme sind häufig an Meningitis und Sepsis beteiligt, da K1-Polysaccharide die Eindringfähigkeit der Bakterien erhöhen (32). Ein Phage (ΦK1E) besitzt ein Schwanzprotein mit Endosialidase-Aktivität, welches E. coli- Stämme infizieren kann, welche das K1-Polysaccharid enthalten. Diese Endosialidase erlaubt es dem Phagen ΦK1E spezifisch zu binden und das K1-Polysaccharid abzubauen (37). In ähnlicher Weise, kann der Phage ΦK5 E. coli-K5-Stämme infizieren. Die E. coli-K5-Stämme verursachen üblicherweise Harnwegsinfektionen (11). Der Phage ΦK5 enthält ein Schwanzprotein, welches Lyase-Aktivität aufweist und es diesem Phagen erlaubt, die bakterielle K5-Kapsel anzugreifen (12, 14). Wir haben gezeigt, dass es für einen Phagen möglich ist, beide Schwanzproteine zu besitzen, sowohl die K1-Endosialidase als auch die K5-Lyase. Ein solcher Phage, den wir als Phage ΦK1-5 bezeichnet haben, verfügt über ein erweitertes Wirtsspektrum, da er sowohl E. coli-K1 als auch E. coli-K5 infizieren kann. Wir haben gezeigt, dass die Fähigkeit, das Wirtsspektrum zu erweitern auf die Eigenschaft dieses ΦK1-5-Phagen zurückzuführen ist, beide Schwanzproteine, die K1-Endosialidase als auch die K5-Lyase an seiner Oberfläche zu tragen. Wir haben durch Sequenzanalyse der Schwanzproteingene des ΦK1-5 Phagen gezeigt, dass diese in einer modularen bzw. Kassetten-Struktur angeordnet sind, was darauf hindeutet, dass das Wirtsspektrum des Phagen durch Rekombinationstechniken auch auf andere K-Antigene und sogar andere Bakterienarten erweitert werden kann. Der Nachweis, dass ein Phage mehrere Schwanzproteine enthalten kann, die sein Wirtsspektrum erweitern, wird als nützlich dafür angesehen, Phagen mit Breitspektrum-antibakteriellen Eigenschaften für die Therapie und Prophylaxe von Infektionskrankheiten herzustellen. Kürzlich hat es ein erneutes Interesse an der Verwendung von Phagen zur Behandlung und Vorbeugung bakterieller Infektionen gegeben (siehe den Übersichtsartikel von Barrow und Soothill, 1997, Trends Microbiol. 5(7), 268271). ΦK1-5 ist hochlytisch, nicht-lysogen, sehr stabil und tötet Bakterien schnell ab, allesamt Eigenschaften, die ihn zu einem guten Kandidaten für eine Phagentherapie machen. Der Phage ΦK1-5 hat einen zusätzlichen Vorteil, weil er die selbe(n) Struktur(en) erkennt und an diese bindet, welche den Bakterien die Virulenz verleihen. Hinzu kommt, dass Bakterien, welche resistent gegenüber dem Phagen werden, normaler Weise die Polysaccharidkapsel verloren haben und nicht mehr virulent sind. In Anbetracht dieser Ergebnisse stellt man sich vor, dass ΦK1-5 als genereller Plattform-Phage für therapeutische und prophylaktische Anwendungen verwendet wird, indem man die Wirtsspezifität durch technische Konstruktion der Schwanzproteingene verändert. Man stellt sich auch vor, dass man durch die Fähigkeit, die Expression der Schwanzproteine gentechnisch zu konstruieren, Phagen bereitstellen kann, welche Gene in Organismen übertragen können, die normalerweise nicht von Phagen infiziert werden. Ein solches Ziel ist dadurch zu erreichen, dass man ein virales Protein eines Säugetier-Virus am Schwanz des Phagen exprimiert, um einen solchen Phagen zu befähigen, sein genetisches Material in eine Säugerzelle zu übertragen. Ein Phage mit einer solchen Fähigkeit wird für gentherapeutische Anwendungen von Nutzen sein.
Bezug nehmend auf 1, ist ΦK1-5 ein isolierter Bakteriophage, welcher aus einem ikosaedrischen Kopf mit einem kleinen Büschel kurzer Schwanzfasern besteht, und welcher in der Lage ist, sowohl E. coli-K1- als auch -K5-Stämme zu infizieren und sich auf diesen fortzupflanzen. Es scheint, dass seine Fähigkeit, sich auf diesen Stämmen fortzupflanzen auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass er zwei verschiedene hydrolytische Schwanzfaserproteine codiert. Das Eine ist ein Endosialidase-Protein, das fast identisch mit einem ähnlichen Protein von ΦK1E ist, welches es ihm erlaubt, an die K1-Polysaccharidhülle zu binden und diese abzubauen. Das Andere ist fast identisch mit einem Lyase-Protein, von dem gezeigt wurde, dass es ΦK5 erlaubt, an die K5-Polysaccharidhülle zu binden und diese abzubauen. Dies ist das erste Beispiel für einen Phagen, welcher eine doppelte Wirtsspezifität besitzt, die auf dem Besitz von zwei verschiedenen Schwanzproteinen basiert.
Bezug nehmend auf 2, weisen alle drei dieser Phagen eine Sequenzähnlichkeit stromaufwärts von dem die Schwanzproteine codierenden Bereich auf und alle haben einen ΦSP6-artigen Promotor, der wahrscheinlich die Transkription des Schwanzgens bzw. der Schwanzgene reguliert. In ΦK1-5 und ΦK5 ist das erste Gen stromabwärts von diesem Promotor das K5-Lyase-Protein. ΦK1E codiert dieses Protein nicht und hat an Stelle dessen einen 111 Aminosäuren langen offenen Leserahmen (ORF_L) unbekannter Funktion. Unmittelbar stromabwärts der K5 Lyase-Proteine von ΦK1-5 und ΦK5, und stromabwärts vom ORF_L in ΦK1E ist ein 85 Basen langer Bereich, der in allen drei Phagen ähnlich ist. Dieser Bereich enthält zwei Elemente mit starker Symmetrie, welche an der Termination der Transkription beteiligt sein könnten. Weiter stromabwärts codieren die Phagen ΦK1-5 und ΦK1E das Endosialidase-Gen. ΦK5 codiert dieses Gen nicht, sondern codiert stattdessen den 523 Aminosäuren langen ORF_P.
ΦK1-5 ist ein Bakteriophage, welchen wir aus Abwasser isoliert haben, wobei wir einen E. coli-K5-Stamm als Wirt benutzten. Indem wir das Wirtsspektrum von ΦK1-5 untersuchten, fanden wir heraus, dass sich dieser sowohl auf K1- als auch auf K5-Stämmen fortpflanzen kann. Eine Untersuchung der DNA-Sequenz der Schwanzfasergene ergab, dass diese sowohl ein K5-Lyase-Protein, ähnlich dem von ΦK5, als auch ein Endosialidase-Protein, ähnlich dem von ΦK1E codieren. Die Anordnung dieser Gene weist darauf hin, dass das Wirtsspektrum von Phagen durch den Erwerb neuer Schwanzgene über natürliche Rekombination oder durch Labortechnologie erweitert oder verändert werden kann.
ΦK5 kann sich auch auf E. coli-K95-Stämmen fortpflanzen (28). Da ORF_P an einer Stelle liegt, welche analog zu der der Endosialidase von ΦK1-5 ist, nimmt man an, dass das Schwanzprotein verantwortlich für das Wachstum auf K95-Stämmen ist. Ein anderer K-Antigen-spezifischer Phage, ΦK20, kann ebenfalls zwei verschiedene E. coli-Wirte lysieren: jene, die das K5-Antigen besitzen und jene, die das K20-Polysaccharid besitzen (26). Wir stellen uns vor, dass ΦK20 ein K5-Lyase-Protein trägt, ähnlich dem ΦK5Φ/K1-5-Protein zusammen mit einem K20-spezifischen hydrolytischen Schwanzprotein. Es sind auch Phagen isoliert worden, die spezifisch für die E. coli-Kapselantigene K3, K7, K12 und K13 sind. Vermutlich haben diese Phagen entsprechende K-spezifische hydrolytische Schwanzproteine. Wir stellen uns vor, dass es Phagen mit anderen Kombinationen von K-Antigenen gibt, welche mehrere Spezifitäten aufweisen.
Das Wirtsspektrum eines Bakteriophagen wird über E. coli hinaus erweitert, indem man die Gene exprimiert, welche mehrere verschiedene Wirts-Schwanzproteine codieren, wobei eine Beschränkung darin liegt, den Mechanismus zu verstehen, mittels dessen das Schwanzprotein an der Capsidstruktur des Phagen befestigt ist. Man glaubt, dass das N-terminale Ende des T7-Schwanzproteins eine Rolle bei der Befestigung spielt (29). Weder die Endosialidase noch die K5-Lyase hat diesen Bereich, oder irgendeinen anderen Bereich, der ähnlich zu irgendeinem anderen Schwanzprotein (oder zueinander) ist. Morphologisch sind ΦK1E, ΦK5 und ΦK1-5 dem Salmonella-Phagen P22 ähnlich. Das Schwanzprotein von P22 ist sehr genau untersucht worden und ist auch ein hydrolytisches Protein, welches am Abbau des Salmonella typhimurium O-Antigens beteiligt ist. Dieses Protein ist ein Homotrimer mit sechs Kopien pro Phagen (30). Die gp17-Schwanzfaser von T7 ist auch ein Trimer mit 6 Kopien des Trimers pro Phagenpartikel (33). Die Endosialidase von ΦK1E ist ebenfalls ein Trimer (20), aber es muss noch gezeigt werden, dass es 6 Kopien des Trimers pro Phagenpartikel gibt. Der Bakteriophage 63D ist ein anderer, vor kurzem charakterisierter Phage, welcher eine Sialidase enthält, bei dem es durch Elektronenmikroskopie gezeigt worden ist, dass die Sialidase in sechs Kopien pro Partikel vorliegt (21). Dieser Phage unterscheidet sich morphologisch von ΦK1E, ΦK5 und ΦK1-5 und hat einen langen Schwanz, ähnlich dem des Bakteriophagen Lambda, wobei sich die Sialidase am Ende des Schwanzes befindet. Sechs Kopien eines trimerischen Schwanzproteins scheinen ein generelles Strukturmotiv zu sein. Wenn man annimmt, dass die Endosialidase und die K5-Lyase ebenfalls in sechs Kopien pro Virion angeordnet sind, ist es interessant zu spekulieren, wie die beiden Schwanzproteine auf der Kopfstruktur von ΦK1E angeordnet sind. Sie können alternierend angeordnet sein, wobei es jeweils drei Kopien davon gibt (3a). Im Fall von P22 gibt es Beweise dafür, dass nur drei Kopien des Schwanzes für eine Infektion benötigt werden (16), was darauf hindeutet, dass dieses Modell theoretisch möglich ist. Die Tatsache, dass es keine gemeinsamen Sequenzähnlichkeiten zwischen den beiden Schwanzproteinen gibt, spricht gegen dieses Modell, da man vorhersagen würde, dass es ein gemeinsames Motiv innerhalb der Schwanzproteine gibt, welches erforderlich ist, um an ähnliche Bereiche in der Kopfstruktur zu binden. Einem alternativen Modell zu Folge könnte es sechs Kopien von jedem Schwanzprotein geben, wobei eines am anderen befestigt ist (3b). Da man annimmt, dass das N-terminale Ende des T7 Schwanzproteins an der Befestigung des Schwanzproteins an der Kopfstruktur beteiligt ist, kann man sich vorstellen, dass dieser Bereich des Proteins und ähnliche Bereiche anderer Schwanzproteine (oder alternative Bereiche von Schwanzproteinen, welche die Befestigung aneinander vermitteln) funktionell der Befestigung dient, wodurch ein Verständnis des Mechanismus keine Beschränkung mehr darstellen würde.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Phagen ΦK5, ΦK1E, und ΦK1-5 alle einen Bereich mit ähnlicher Sequenz stromaufwärts der Schwanzproteine aufweisen. Dieser Bereich enthält einen Salmonella-Phagen-SP6-Promotor. Die DNA-Sequenz, welche den Promotor umgibt (beschrieben in Nam et al., Gene 1986, 46: 57), entspricht der analogen Sequenz in ΦK1-5. Auf der Grundlage dieser Information entwarfen wir einen Primer aus diesem Bereich, um stromabwärts von dem analogen Bereich im Phagen ΦSP6 zu sequenzieren. Die DNA-Sequenzierung identifizierte einen offenen Leserahmen, der ein hohes Maß von Aminosäurenähnlichkeit mit dem Schwanzprotein des Phagen P22 aufweist. ΦP22 ist ein gut characterisierter Salmonella-Phage, der eine ähnliche Morphologie wie ΦSP6, aber einen sehr unterschiedlichen Lebenszyklus hat. ΦP22 ist lysogen wie der E. coli-Phage Lambda, und ΦSP6 ist lytisch wie T7 oder die drei K-Antigen-Phagen. Das P22-Schwanzprotein hat ebenfalls eine Polysaccharidabbau-Aktivität. Unmittelbar stromabwärts vom SP6-Schwanzgen liegt der 85 Basen lange intergenische Bereich, welcher ΦK5, ΦK1E und ΦK1-5 gemeinsam ist, und kurz darauf endet das DNA-Molekül. 4 vergleicht die Bereiche, welche die Schwanzproteine in allen vier Phagen codieren. Das SP6-Schwanzprotein ist an der analogen Position wie das Lyase-Protein von ΦK1-5 und ΦK5 und ORF_L von ΦK1E. ΦSP6 hat dieselbe Kassettenstruktur wie die drei K-Phagen, was darauf hindeutet, dass alle vier eng verwandt sind und sich hauptsächlich in den Schwanzproteinen unterscheiden. Wir stellen uns vor, das Lyase-Protein von ΦK1-5 durch den SP6-Schwanz zu ersetzen, um einen Phagen herzustellen, welcher Salmonella und E. coli-K1 angreifen kann. Dieser sollte wegen der gemeinsamen Sequenz stromaufwärts der Schwanzproteine und der gemeinsamen 85 Basen langen Sequenz zwischen den zwei Schwanzproteinen einfach über homologe Rekombination zu konstruieren sein. Eine Alternative ist es, einen Phagen herzustellen, welcher Salmonella, E. coli-K1 und E. coli-K5 angreifen kann, indem man ein Konstrukt entwirft, welches alle drei Proteine enthält. Im Fall von ΦK1-5 haben wir Beweise dafür, dass durch den Erwerb eines zweiten spezifischen Schwanzproteins ein breites Wirtsspektrum entsteht. So stellen wir uns vor, dass wir, nach der Theorie der modularen Evolution, nach welcher Duplikationen und Neuanordnungen von Bereichen innerhalb der Schwanzfasergene verschiedener Phagen Veränderungen in der Wirtsspezifität hervorzurufen scheinen, das Wirtsspektrum noch weiter vergrößern können, indem wir den Erwerb eines dritten spezifischen Schwanzproteins, eines vierten spezifischen Schwanzproteins, und mehrerer spezifischer Schwanzproteine vorsehen.
Begriffserklärungen
Der Begriff "isoliert" setzt voraus, dass ein Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wird (z.B. aus der natürlichen Umgebung, falls es in der Natur vorkommt). Beispielsweise ist ein natürlich vorkommender Phage, welcher in einem natürlichen Umfeld vorliegt, nicht isoliert, wohingegen derselbe Phage, wenn er getrennt von einem Teil der oder von allen ko-existierenden Materialien vorliegt, isoliert ist.
Der Begriff "gereinigt" setzt nicht absolute Reinheit voraus; vielmehr ist er als relative Definition in Bezug auf die Reinheit des Materials in seinem natürlichen Zustand gedacht. Die Reinigung des natürlichen Materials um mindestens eine Größenordnung, bevorzugt zwei oder drei Größenordnungen, und noch bevorzugter vier oder fünf Größenordnungen, wird ausdrücklich in Erwägung gezogen.
Der Begriff "angereichert" bedeutet, dass die Konzentration des Materials mindestens etwa das 2-, 5-, 10-, 100-, oder 1000-fache seiner natürlichen Konzentration ist (als Beispiel), vorteilhafterweise 0,01% bezogen auf das Gewicht. Angereicherte Präparationen von etwa 0,5%, 1%, 5%, 10% und 20% bezogen auf das Gewicht werden ebenfalls in Erwägung gezogen.
Mehrere Wirtsspezifitäten auf der Grundlage mehrerer verschiedener Wirts-Schwanzproteine
Die Phagentherapie nutzt die Fähigkeit von Phagen aus, Bakterien zu lysieren. Angesichts der steigenden Häufigkeit von Antibiotika-resistenten Bakterien gibt es ein Bedürfnis, Gegenmaßnahmen zu ergreifen. Die vorliegende Erfindung kommt diesem Bedürfnis nach, indem sie den zusätzlichen Nachteil überwindet, der häufig gegenüber dem Einsatz von Phagen vorgebracht wird, nämlich deren überaus schmales Wirtsspektrum.
Der Prototyp eines Bakteriophagen hat einen Kopf und einen Schwanz. Der Kopf ist ein Ikosaeder. Der Schwanz besteht aus einem hohlen Innenteil. Der ganze Apparat funktioniert als eine Spritze für die Injektion der Phagen-DNA in das Innere einer Bakterienzelle. Der Lebenszyklus beinhaltet, dass virale Gene exprimiert werden, Virionen zusammengesetzt werden, und eine Lyse der Zelle infektiöse Partikel in das Medium freisetzt. Auf diese Art und Weise tötet der Bakteriophage das Wirtspathogen.
Ein Weg für ein Bakterium, die Antikörper-Antwort des Wirts zu umgehen, ist sich mit einer Kapsel zu umhüllen Eine Kapsel ist ein Netzwerk von Polymeren, welches gewöhnlich aus Polysacchariden zusammengesetzt ist, aber auch aus Proteinen oder einem Protein-Kohlenhydrat-Gemisch bestehen kann, und welches den Wirtsgewebe-Polymeren ähnelt. In E. coli sind derzeit über 70 verschiedene Polysaccharide oder K-Antigen-Proteine von der World Health Organization anerkannt.
Bakteriophagen tragen ein Schwanzprotein, welches an die Oberflächenstruktur eines Bakteriums bindet, wodurch das virale Genom in die infizierte Zelle eindringt. Einige Bakteriophagen besitzen ein Schwanzprotein, welches eine Kapsel-abbauende enzymatische Aktivität aufweist. Diese Enzyme erleichtern das Eindringen des Bakteriophagen in die Kapsel der Bakterienzelle. In K1-spezifischen Bakteriophagen ist das Schwanzprotein eine Neuraminidase. In K5-spezifischen Bakteriophagen ist das Schwanzprotein eine Lyase. In anderen K-spezifischen Bakteriophagen ist das Schwanzprotein ein anderes hydrolytisches Protein.
Die phylogenetische Klassifizierung besagt, dass gram-negative Bakterien eine Gruppe von Bakterien bilden. Escherichia, Shigella, Enterobacter und Salmonella sind Bakterien gattungen, die eng miteinander verwandt sind. Yersinia und Vibrio sind die Gattungen, die am nächst engsten mit der E. coli-Gruppe verwandt sind. Serratia und Klebsiella sind die Gattungen, die am nächst engsten mit der E. coli-Gruppe verwandt sind. Campylobacter gehört auch zu den Gattungen des Phylums Proteobacteria. Die Gattungen Legionella, Pseudomonas, und Neisseria sind entfernter verwandt. Die Verwandtschaftsbeziehung von Bordetella ist unbekannt. Helicobacter ist die am weitesten entfernte Gattung in der E. coli-Gruppe gram-negativer Bakterien. Die gram-positiven Bakterien bilden eine andere Gruppe, wobei Listeria mit den gram-positiven Kokken Staphylococcus und Streptococcus, Enterococcus und Clostridium enger verwandt ist als mit den anderen gram-positiven Stäbchen. Corynebacterium ist am engsten mit Mycobacterium verwandt. Die Spirochäten Treponema und Borrelia bilden eine dritte phylogenetische Gruppe, wobei Chlamydia mit dieser Gruppe entfernter verwandt ist. Trotz der genetischen Vielfalt von pathogenen Bakterien haben sich in verschiedenen Bakterientypen ähnliche Strategien entwickelt, die Wirtsabwehr zu überwinden. Wir ziehen in Erwägung, unsere Erfindung gegen folgende in der unten gezeigten Tabelle angegebenen Bakterien einzusetzen, wobei dies jedoch keine Einschränkung darstellt.
Wobei: „+, ATCC" gibt das Vorliegen des/der entsprechenden Bakteriophagen in der ATCC an; „+, ref" gibt an, dass Information über entsprechende existierende Bakteriophagen in der folgenden wissenschaftlichen Literatur gefunden werden kann: ref^a-Holzmayer TA, et al. 1988 Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A] 269(2): 147–55; Gol'tsmaier TA, et al. 1987 Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol 5: 9–13; ref^b Heintschel von Heinegg E, et al. 1993 J Med Microbiol 38(4): 245–9; ref^c-Ritchie AE, et al. 1978 Vet Rec 103(2): 345; ref^d Eggers CH, et al. 2000 J Mol Microbiol Biotechnol 2(4): 365–73; ref^e Hsia R, et al. 2000 Microbes Infect 2(7): 761–72; Hsia RC, et al. 2000 Microbiology 146(Pt 7): 1651–60.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat ein Phage eine doppelte Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er zwei verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist. In einer anderen Ausführungsform hat ein Phage eine dreifache Wirtsspezifität, was darauf basiert, dass er drei verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist. In einer weiteren Ausführungsform hat ein Phage eine vierfache Wirtsspezifität, was darauf basiert, dass er vier verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, und so weiter, so dass ein Phage in einer zusätzlichen Ausführungsform mehrere Wirtsspezifitäten aufweist, was darauf basiert, dass er mehrere verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat ein Phage mit einem hydrolytischen Schwanzprotein eine doppelte Wirtsspezifität, was darauf basiert, dass er zwei verschiedene hydrolytische Schwanzproteine aufweist. In einer anderen Ausfürungsform hat ein Phage eine dreifache Wirtsspezifität, was darauf basiert, dass er drei verschiedene hydrolytische Schwanzproteine aufweist. In einer weiteren Ausführungsform hat ein Phage eine vierfache Wirtsspezifität, was darauf basiert, dass er vier verschiedene hydrolytische Schwanzproteine aufweist, und so weiter, so dass ein Phage in einer zusätzlichen Ausführungsform mehrere Wirtsspezifitäten aufweist, was darauf basiert, dass er mehrere verschiedene hydrolytische Schwanzproteine aufweist.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat ein Phage mit einem K-spezifischen hydrolytischen Schwanzprotein eine doppelte Wirtsspezifität, was darauf basiert, dass er zwei verschiedene K-spezifische hydrolytische Schwanzproteine aufweist. In einer anderen Ausführungsform hat ein Phage eine dreifache Wirtsspezifität, was darauf basiert, dass er drei verschiedene K-spezifische hydrolytische Schwanzproteine aufweist. In einer weiteren Ausführungsform hat ein Phage eine vierfache Wirtsspezifität, was darauf basiert, dass er vier verschiedene K-spezifische hydrolytische Schwanzproteine aufweist, und so weiter, so dass ein Phage in einer zusätzlichen Ausführungsform mehrere Wirtsspezifitäten aufweist, was darauf basiert, dass er mehrere verschiedene K-spezifische hydrolytische Schwanzproteine aufweist.
Ein erstes Beispiel für einen Phagen mit einer doppelten Wirtsspezifität ist ΦK1-5. Ein Beispiel für einen Phagen mit einer dreifachen Wirtsspezifität ist ΦK1-5, welcher ein drittes unterschiedliches Schwanzprotein aufweist. Ein Beispiel für einen Phagen mit einer vierfachen Wirtsspezifität ist ΦK1-5, welcher ein drittes und ein viertes unterschiedliches Schwanzprotein aufweist und so weiter, so dass ein Beispiel für einen Phagen mit einer mehrfachen Wirtsspezifität ΦK1-5 ist, welcher mehrere unterschiedliche Schwanzproteine hat.
Ein zweites Beispiel für einen Phagen mit einer doppelten Wirtsspezifität ist ΦK1E, welcher wie K1-5 ein zweites verschiedenes Schwanzprotein aufweist. Ein Beispiel für einen Phagen mit einer dreifachen Wirtsspezifität ist ΦK1E, welcher ein zweites und ein drittes verschiedenes Schwanzprotein aufweist. Ein Beispiel für einen Phagen mit einer vierfachen Wirtsspezifität ist ΦK1E, welcher ein zweites, ein drittes und ein viertes verschiedenes Schwanzprotein aufweist und so weiter, so dass ein Beispiel für einen Phagen mit einer mehrfachen Wirtsspezifität ΦK1E ist, welcher mehrere unterschiedliche Wirts-Schwanzproteine hat.
Ein drittes Beispiel für einen Phagen mit einer doppelten Wirtsspezifität ist ΦK5, welcher wie K1-5 ein zweites verschiedenes Schwanzprotein aufweist. Ein Beispiel für einen Phagen mit einer dreifachen Wirtsspezifität ist ΦK5, welcher ein zweites und ein drittes verschiedenes Schwanzprotein aufweist. Ein Beispiel für einen Phagen mit einer vierfachen Wirtsspezifität ist ΦK5, welcher ein zweites, ein drittes und ein viertes verschiedenes Schwanzprotein aufweist und so weiter, so dass ein Beispiel für einen Phagen mit einer mehrfachen Wirtsspezifität ΦK5 ist, welcher mehrere unterschiedliche Wirts-Schwanzproteine hat.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Escherichia infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Shigella infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Salmonella infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Enterobacter infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Yersinia infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Vibrio infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Legionella infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Pseudomonas infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Neisseria infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Bordetella infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Helicobacter infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Listeria infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Entero coccus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Staphylococcus infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Streptococcus infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene. Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Enterococcus infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Clostridium infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Corynebacterium infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Mycobacterium infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Treponema infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Borrelia infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Campylobacter infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspeziftät, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Chlamydia infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Haemophilus infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella; Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspeziftät, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Serratia infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Ein weiteres Beispiel für einen Phagen mit mehrfacher Wirtsspezifität, die darauf basiert, dass er verschiedene Wirts-Schwanzproteine aufweist, ist ein Phage, der Klebsiella infiziert und zusätzlich ein Bakterium infiziert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus, Serratia und Klebsiella besteht.
Wirtsspektrum von Phagen, welches Bakterienzellen einschließt die Kofaktoren benötigen
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat ein Phage mit einer mehrfachen Wirtsspeziftät, die darauf basiert, dass er mehrere Wirts-Schwanzproteine aufweist, zusätzlich ein Gen, welches einen Kofaktor codiert, der es ihm erlaubt, auf anderen Bakterienarten zu wachsen. Wie in den vorliegenden Experimenten gezeigt, ist es für einen Phagen notwendig, die geeigneten Schwanzproteine aufzuweisen, um einen Bakterienstamm zu infizieren. Zum Beispiel ist ein Phage, der unterschiedliche Wirts-Schwanzproteine aufweist, in der Lage, mehrere Wirte zu infizieren, soweit der Wirt wenigstens eines dieser Wirts-Schwanzproteine exprimiert. Nichtsdestotrotz können weitere Faktoren notwendig sein, damit der Phage andere Bakterienstämme infizieren kann. Die vorliegende Erfindung stellt diese Phagen für Fälle bereit, in denen zudem Kofaktoren gebraucht werden können, um das Wirtsspektrum zu vergrößern.
Zum Beispiel infiziert der E. coli-Phage Lambda üblicherweise nicht Salmonella. Der E. coli-Phage Lambda benötigt ein funktionelles E. coli-Nus A-Gen für die durch Lambda vermittelte Transkription/Anti-Termination der DNA->RNA, um es dem Virus zu erlauben, sich fortzupflanzen und zu fuktionieren. Da die Salmonella-Bakterien kein E. coli-Nus A-Gen besitzen, kann Lambda auf Salmonella nicht wachsen. Wenn das E. coli-Nus A-Gen in das Lambda-Genom cloniert ist, kann dieses Virus dann bestimmte Salmonella-Stämme infizieren. In einem Bestätigungsexperiment wurde das E. coli-Genom mit Hilfe von Restriktionsenzymen in Fragmente geschnitten, und die Fragmente wurden in eine Lambda-Bibliothek cloniert. Wenn diese Lambda-Phagen auf Salmonella plattiert wurden, wuchsen nur diejenigen, welche ein E. coli-Nus A-Gen enthielten. So stellt Lambda, welcher ein E. coli-Nus A-Gen trägt, ein Beispiel dafür da, wie das Wirtsspektrum eines Phagen erweitert werden kann.
In einem anderen Beispiel für einen Phagen, der nicht üblicherweise eine andere Bakterienart infiziert, kann das Gen bekannt sein, welches es dem Virus erlaubt, sich in den Bakterienzellen fortzupflanzen und zu funktionieren. Falls das Gen bekannt ist, kann es in das virale Genom cloniert werden, so dass das Virus dann andere Bakterienarten infizieren kann. Falls das Gen unbekannt ist, kann es identifiziert werden, indem man z.B. das bakterielle Genom mit Hilfe von Restriktionsenzymen in Fragmente schneidet und diese Fragmente in eine Bibliothek dieses Virus cloniert. Wenn diese Phagen auf den Bakterien ausplattiert werden, werden nur diejenigen wachsen, welche das Gen enthalten. So kann das Gen, welches es dem Virus erlaubt, sich in den Bakterien fortzupflanzen und zu funktionieren identifiziert werden. Sobald das Gen bekannt ist, kann ein Virus konstruiert werden, welches dieses Gen trägt. So kann das Wirtsspektrum des Phagen erweitert werden, selbst wenn Kofaktoren notwendig dafür sind, um auf anderen Bakterienarten wachsen zu können.
Wirtsspektrum von Phagen, welches Säugerzellen einschließt
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat ein Phage eine Wirtsspezifität für Säugerzellen, was darauf basiert, dass ein Gen für einen Liganden für einen Zelloberflächenrezeptor in das Phagengenom eingebaut ist, so dass es am Schwanz des Phagen exprimiert wird und so die Rezeptor-vermittelte Endocytose erleichtert. Poul et al., J Mol Biol 1999, 288: 203 und Larocca et al., FASEB J 1999, 13: 727 beschreiben Gentransport in Säugerzellen durch Bakteriophagen, welche Liganden für Zelloberflächenrezeptoren exprimieren, die gentechnisch mit Phagen-Hüllproteinen fusioniert sind oder Liganden für Zelloberflächenrezeptoren auf den Phagenhüllen präsentieren, wobei das Ziel die Entwicklung von Vektoren für die Gentherapie ist. Die vorliegende Erfindung sieht vor, Phagen-Schwanzproteine zu ersetzen.
Ein Ligand für einen Zelloberflächenrezeptor ist gentechnisch mit einem Phagen-Schwanzprotein fusioniert oder wird anderweitig an den Schwänzen des Phagen präsentiert. Nucleotidsequenzen, welche Ligand-Phagen-Fusionen codieren, oder die Liganden für einen Zelloberflächenrezeptor selbst, können auch durch Insertion von Säugetier-Reportergenen modifiziert werden, um das Bindungsverhalten, die Internalisierung und die Expression zu testen. Schlussendlich wird das Säugetier-Reportergen durch eine therapeutische Nucleotidsequenz ersetzt.
Die therapeutische Nucleotidsequenz codiert einen Faktor, welcher eine therapeutische Wirkung hat. In alternativen Ausführungsformen ist ein Faktor ein Protein-Zellgift, ein Antisense, ein Ribozym, eine dominant-negative Mutante oder ein therapeutisches Protein (z.B. ein Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Cytokin, ein Rezeptor oder ein Ligand). Ein Beispiel für Rezeptor-vermittelten Gentransport unter Verwendung von Bakteriophagen-Vektoren, welche Liganden in Form von gentechnischen Fusionen mit Phagen-Hüllproteinen an der Oberfläche tragen oder Liganden für einen Zelloberflächenrezeptor auf den Phagenhüllen präsentieren, ist in USP 6,054,312 von Larocca et al. dargelegt.
Herstellungsmethoden
In einer unterschiedlichen Ausführungsform erfolgt der Erwerb von neuen Schwanzgenen durch natürliche Rekombination. In einer alternativen Ausführungsform wird der Erwerb neuer Schwanzgene durch Labortechnologie bewerkstelligt. So kann ein Phage durch Selektion oder durch technische Konstruktion entwickelt werden.
Phagen mit mehreren Spezifitäten können mit Hilfe von Prüfverfahren ausgewählt werden, welche das Wirtsspektrum von Phagen bestimmen, wie z.B. Plaque-Assays.
Alternativ können Phagen mit mehreren Spezifitäten gentechnisch hergestellt werden, indem man das Gen für ein Schwanzprotein in ein Plasmidvektor-System cloniert und diese Anordnung mit Hilfe eines allgemeinen in vivo-Rekombinationssystems in den Wirtsbakterien des Phagen von Interesse in diesen Phagen einbaut; oder indem man das Gen für ein erstes Schwanzprotein in ein Plasmidvektor-System cloniert und dann das Gen für ein zweites Schwanzprotein durch eine Fusion im Leserahmen am 3'- oder 5'-Ende des Gens für das erste Schwanzprotein in diesen Trägervektor cloniert, und dann diese Anordnung mit Hilfe eines allgemeinen in vivo-Rekombinationssystems in den Wirtssbakterien des Phagen von Interesse in diesen Phagen einbaut; oder indem man das Gen für ein erstes Schwanzprotein in ein Plasmidvektor-System cloniert, und dann das Gen für ein zweites Schwanzprotein durch eine Fusion im Leserahmen am 3'- oder 5'-Ende des Gens für das erste Schwanzprotein in diesen Trägervektor cloniert, und dann das Gen für ein drittes Schwanzprotein durch eine Fusion im Leserahmen am 3'- oder 5'-Ende der Gene für das erste und zweite Schwanzprotein in diesen Trägervektor cloniert, und so weiter, und dann diese Anordnung mit Hilfe eines allgemeinen in vivo-Rekombinationssystems in den Wirtssbakterien des Phagen von Interesse in diesen Phagen einbaut.
Methoden für den Gebrauch, Rezepturen und Verabreichung
Die vorliegende Erfindung kann für das ganze Spektrum bakterieller Krankheiten angewandt werden indem man Phagen auswählt oder konstruiert, so dass Phagen entwickelt werden, die für mehr als einen Bakterienstamm von Interesse spezifisch sind. Auf diese Weise wird eine ganze Reihe polyvalenter Bakteriophagen für so gut wie alle Bakterien entwickelt, die für den Menschen, seine Haustiere, Vieh und Zootiere (egal ob Säugetier-, Vogel-, oder Fischzucht) pathogen sind. Eine Phagentherapie wird dann verfügbar sein:

1) als Zusatz zu oder als Ersatz für diejenigen Antibiotika und/oder Chemotherapeutika, die auf Grund der Entwicklung von Mehrfachresistenzen nicht länger bakteriostatisch oder bakterizid wirken;
2) als eine Behandlung für solche Patienten, welche allergisch gegenüber Antibiotika und/oder Chemotherapeutika sind, die ansonsten angezeigt wären; und
3) als eine Behandlung, welche geringere Nebenwirkungen aufweist als viele der Antibiotika und/oder Chemotherapeutika, die sonst für eine gegebene Infektion angezeigt wären.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung von Methoden, um bakterielle Infektionen in Tieren durch Phagentherapie mit Hilfe der oben beschriebenen polyvalenten Bakteriophagen zu behandeln. Im Stand der Technik sind hunderte von Bakteriophagen und von Bakterienarten bekannt, die diese infizieren. Die vorliegende Erfindung kann dazu eingesetzt werden, um polyvalente Bakteriophagen zu entwickeln, welche verwendet werden können, um sämtliche Infektionen zu behandeln, welche von deren Wirtsbakterien verursacht wird.
Während es vorgesehen ist, dass die vorliegende Erfindung zur Behandlung jeglicher Infektionen in Tieren und Menschen verwendet werden kann, ist es besonders vorgesehen, dass die hierin beschriebenen Methoden sehr nützlich für eine Therapie (entweder als adjuvante oder als Einzeltherapie) bei Infektionen mit Arzneistoff-resistenten Bakterien sein kann. Fachleute berichten (siehe z.B. Gibbons, A., "Exploring New Strategies to Fight Drug-Resistant Microbes, Science, 21 Aug. 1993, pp. 1036–38), dass in der heutigen Zeit die im Folgenden aufgelisteten resistenten Bakterienarten und Stämme die größte Bedrohung für die Menschheit darstellen:

1. Alle klinisch relevanten Angehörigen der Familie Enterobacteriaceae, vor allem, jedoch nicht beschränkt auf diese, die folgenden:
a) Alle klinisch relevanten Stämme von Escherichia, vor allem E. coli. Einer von einer Anzahl von möglichen Wildtyp-Phagen gegen diese speziellen Pathogene, der als Ausgangspunkt für die gentechnische Konstruktion der vorliegenden Erfindung benutzt werden könnte, wäre ΦK1-5, welcher die ATCC Hinterlegungsnummer #PTA-3495 hat. (Anmerkung: um es kurz zu fassen, werden in allen der folgenden Beispiele von Pathogenen die entsprechenden Wildtyp-Phagen in der folgenden Ausdrucksweise angegeben: „Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ...".)
b) Alle klinisch relevanten Stämme von Klebsiella, vor allem K. pneumoniae (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #23356-B1).
c) Alle klinisch relevanten Stämme von Shigella, vor allem S. dysenteriae (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #11456a-B1).
d) Alle klinisch relevanten Stämme von Salmonella, including S. abortus-equi (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #9842-B1), S. typhi (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #19937-B1) S. typhimurium (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #19585-B1), S. newport (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #27869-B1), S. paratyphi-A (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #12176-B1), S. paratyphi-B (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #19940-B1), S. potsdam (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #25957-B2), und S. pollurum (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #19945-B1).
e) Alle klinisch relevanten Stämme von Serratia, vor allem S. marcescens (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #14764-B1).
f) Alle klinisch relevanten Stämme von Yersinia, vor allem Y. pestis (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #11953-B1).
g) Alle klinisch relevanten Stämme von Enterobacter, vor allem E. cloacae (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #23355-B1).
2. Alle klinisch relevanten Enterococci, vor allem E. faecalis (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #19948-B1) und E. faecium (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #19953-B1).
3. Alle klinisch relevanten Haemophilus-Stämme, vor allem H. influenzae (ein entsprechender Phage für dieses Pathogen ist nicht von der ATCC erhältlich, aber einige können von der WHO oder von anderen Laboratorien erhalten werden, welche diese öfffentlich zur Verfügung stellen).
4. Alle klinisch relevanten Mycobacteria, vor allem M. tuberculosis (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #25618-B1), M. avium-intracellulare, M. bovis, und M leprae. (Entsprechende Phagen für diese Pathogene sind im Handel von der WHO über „The National Institute of Public Healthy & Environmental Protection, Bilthoven, Niederlande" erhältlich).
5. Neisseria gonorrhoeae und N. meningitidis (Entsprechende Phagen für beide können öffentlich von der WHO oder anderen Quellen erhalten werden).
6. Alle klinisch relevanten Pseudomonaden, vor allem P. aeruginosa (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #14203-B1).
7. Alle klinisch relevanten Staphylococci, vor allem S. aureus (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #27690-B1) und S. epidermidis (Entsprechende Phagen sind durch die WHO über das Colindale Institute in London öffentlich zugänglich).
8. Alle klinisch relevanten Streptococci, vor allem S. pneumoniae (Entsprechende Phagen können öffentlich von der WHO oder anderen Quellen erhalten werden).
9. Vibrio cholera (Beispiel für einen entsprechenden Phagen: ATCC Phage #14100-B1).

Es gibt weitere bakterielle Pathogene, die zu zahlreich sind, sie alle zu erwähnen, die, obwohl sie derzeit nicht in einem Zustand einer Antibiotikaresistenz-Krise sind, dennoch hervorragende Kandidaten für eine Behandlung mit polyvalenten Bakteriophagen gemäß der vorliegenden Erfindung sind. So können alle bakteriellen Infektionen, welche von Bakterien verursacht werden, für die es einen entsprechenden Phagen gibt, behandelt werden, indem man die vorliegende Erfindung anwendet.
Jeder Phagenstamm, der fähig ist Bakterien (oder anderen Pathogenen) direkt oder indirekt Schaden zuzufügen, ist als für die vorliegende Erfindung nützlich anzusehen. So sind Phagen, die lytisch sind, Phagen, die lysogen sind, aber später lytisch werden können und nicht-lytische Phagen, die ein Produkt abgeben können, welches für die Bakterien schädlich sein wird, alle nützlich für die vorliegende Erfindung.
Die Tiere, welche mit den Methoden der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen den Menschen, seine Haustiere, Vieh, Fischkulturen und die Tiere in Zoos oder Wasserparks, wobei diese Aufzählung keine Beschränkung darstellt.

Die polyvalenten Bakteriophagen der vorliegenden Erfindung können als Einzeltherapie oder als adjuvante Therapie zur Behandlung bakterieller Infektionen eingesetzt werden. Im Stand der Technik sind eine Vielzahl von antimikrobiellen Wirkstoffen bekannt (einschließlich Antibiotika und chemotherapeutische Wirkstoffe), welche in Kombination mit polyvalenten Bakteriophagen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen nützlich wären. Beispiele für geeignete antimikrobielle Wirkstoffe und die bakteriellen Infektionen, welche mit den angegebenen antimikrobiellen Wirkstoffen behandelt werden können, sind unten aufgelistet. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf die unten angegebenen antimikrobiellen Wirkstoffe beschränkt, da der Fachmann leicht andere antimikrobielle Wirkstoffe bestimmen kann, welche in Kombination mit polyvalenten Bakteriophagen nützlich sind.

Pathogen	Antimikrobieller Wirkstoff oder Gruppe antimikrobieller Wirkstoffe
E. coli
Unkomplizierte Harnweginfektion	Trimethoprim-Sulfamethoxazol (abgek. TMO-SMO), oder Ampicillin; Cephalosporine der ersten Generation, Ciprofloxacin
Systemische Infektion	Ampicillin, oder ein Cephalosporin der dritten Generation; Aminoglycoside, Aztreonam, oder ein Penicillin + ein Penicillinase-Inhibitor
Klebsiella pneumoniae	Cephalosporine der ersten Generation; Cephalosporine der dritten Generation, Cefotaxim, Moxalactam, Amikacin, Chloramphenicol

Shigella (verschiedene)	Ciprofloxacin; TMO-SMO, Ampicillin, Chloramphenicol
Salmonella:
S. typhi	Chloramphenicol; Ampicillin oder TMO-SMO
Non-typhi-Arten	Ampicillin; Chloramphenicol, TMO-SMO, Ciprofloxacin
Yersinia pestis	Streptomycin; Tetracyclin, Chloramphenicol
Enterobacter cloacae	Cephalosporine der dritten Generation, Gentamicin, oder Tobramycin; Carbenicillin, Amikacin, Aztreonam, Imipenem
Hemophilus infuenzae:
Meningitis	Chloramphenicol oder Cephalosporine der dritten Generation; Ampicillin
Andere H. infl. Infektionen	Ampicillin; TMO-SMO, Cefaclor, Cefuroxime, Ciprofloxacin
Mycobacterium tuberculosis und M. avium-intracellulare	Isoniazid (INH) + Rifampin oder Rifabutin, die oben angegebenen werden zusammen mit Pyrazinamid +/oder Ethambutol gegeben
Neisseria:
N. meningitidis	Penicillin G; Chloramphenicol oder ein Sulfonamid
N. gonorrhoeae:
Penicillin-sensitiv Penicilin-resistent	Penicillin G; Spectinomycin, Ceftriaxone Ceftriaxone; Spectinomycin, Cefuroxime oder Cefoxitin, Ciprofloxacin
Pseudomonas aeruginosa	Tobramycin oder Gentamycin (+/– Carbenicillin, Aminoglycoside); Amikacin, Ceftazidime, Aztreonam, Imipenem
Staph aureus
non-Penicillinase produzierend	Penicillin G; Cephalosporine der ersten Generation, Vancomycin, Imipenem, Erythromycin
Penicillinase produzierend	ein Penicillinase-resistentes Penicillin; Cephalosporine der ersten Generation, Vancomycin, Imipenem, Erythromycin
Streptococcus pneumoniae Penicillin G; Cephalosporine der ersten Generation,	Penicillin G; Cephalosporine der ersten Generation, Erythromycin, Chloramphenicol
Vibrio cholera Tetracyclin; TMO-SMO	Tetracyclin; TMO-SMO

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die polyvalenten Bakteriophagen der Erfindung als Arzneimittel bereitgestellt, welche nützlich für die Behandlung und die Vorbeugung verschiedener bakterieller Infektionen sind, wie z.B. Durchfall, Ruhr, Hämolytisch-urämisches Syndrom, Blaseninfektion, Niereninfektion, Harnweginfektion, Sepsis, Lungenentzündung und Meningitis, und verschiedene andere Krankheiten, Syndrome und Funktionsstörungen.
Die erfindungsgemäßen polyvalenten Bakteriophagen können für die Behandlung oder die Vorbeugung von Hemophilus influenza, Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus fasciae, Streptococcus Gruppe B, Listeria, Salmonella, E. coli, Campylobacter, und anderen Bakterien, und beliebiger Kombinationen hiervon eingesetzt werden. Wenn z.B. eine Infektion der oberen Atemwege vorliegt, kann die Infektion prophylaktisch oder therapeutisch mit einer Zusammensetzung behandelt werden, umfassend mindestens einen polyvalenten Bakteriophagen, welcher spezifisch für diese Bakterien ist, sowie einem Träger, der den polyvalenten Bakteriophagen in den Mund, den Hals, oder in die Nasenwege abgibt. Wenn eine Person jemandem mit einer Infektion der oberen Atemwege ausgesetzt war, bleiben die polyvalenten Bakteriophagen in der Schleimhautschicht und verhindern jegliche Kolonisierung der infizierenden Bakterien.
Zwei Beispiele für Bakterien, welche die oberen Atemwege infizieren, sind Streptococcus pneumoniae und Hemophilus influenzae. In den letzten Jahren gab es einen Anstieg in der Zahl der Leute, besonders Kinder und ältere Leute, die mit Penicillin-resistenten Streptococcus pneumoniae und Hemophilus infiziert oder Träger dieser Bakterien sind. Während diese Bakterien normalerweise harmlose Bewohner des Wirts sind, sind sie opportunistische Organismen, welche Infektionen verursachen können, wenn die Widerstandskraft des Wirts beeinträchtigt ist. Wenn man diese Organismen im oberen Atemtrakt eliminiert oder ihre Zahl vermindert, wird es eine entsprechende Verminderung in der Anzahl der Infektionen durch diese Bakterien geben.
Die Hemophilus-Bakterien werden vom Bakteriophagen HP1 (ein Mitglied der P2-artigen Phagenfamilie mit großen Ähnlichkeiten mit den Coli-Phagen P2 und 186, und einer gewissen Ähnlichkeit mit dem Retron-Phagen Ec67) infiziert, welcher ein lytisches Enzym produziert, das in der Lage ist, die Bakterien zu lysieren. Streptococcus pneumoniae ist mit dem Pal-Bakteriophagen infiziert, der ein lytisches Enzym produziert, welches als N-Acetylmuramoyl-L-alanin-amidase identifiziert wurde. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann einen der beiden polyvalenten Bakteriophagen enthalten, welcher diese zwei Bakterien erkennt, und es kann andere polyvalente Bakteriophagen für andere Bakterien enthalten. Die Zusammensetzung, welche für die Prophylaxe und die therapeutische Behandlung einer Streptomyces- oder Streptokokken-Infektion eingesetzt werden kann, schließt einen polyvalenten Bakteriophagen und eine Darreichungsform für die Schleimhautschicht der Mund- und Nasenhöhle ein, (wie z.B. ein Trägersystem oder eine orale Form der Abgabe), so dass der polyvalente Bakteriophage in einem Trägersystem einer oralen Form der Abgabe dargeboten wird, um die Schleimhautschicht zu erreichen. Eine andere Infektion, welche prophylaktisch behandelt werden kann ist eine Infektion mit Streptococcus Gruppe A, welche eine Krankheit hervorrufen kann, die üblicherweise als bakterielle Halsentzündung („strep throat") bekannt ist. Gruppe A-Streptococci sind mit einem C1-Bakteriophagen infiziert, welcher ein lysierendes Protein produziert, das spezifisch für die Lyse von Gruppe A-Streptococcus ist.
Eine andere Verwendung für einen erfindungsgemäßen polyvalenten Bakteriophagen ist die Behandlung von bakteriellen Infektionen des Verdauungstrakts. Die Behandlungsmethode für eine bakterielle Infektion des Verdauungstrakts umfasst die Behandlung der bakteriellen Infektion mit einer Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge von mindestens einem polyvalenten Bakteriophagen, welcher spezifisch für die Bakterien ist, und einen Träger, um diesen polyvalenten Bakteriophagen in den Verdauungstrakt abzugeben. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die behandelten bakteriellen Infektionen durch gram-negative Bakterien hervorgerufen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Listeria, Salmonella, E. coli und Campylobacter. Jedoch werden diese Methode und Zusammensetzung eine wirksame Behandlung anderer Bakterien ermöglichen, sofern der passende polyvalente Bakteriophage eingesetzt wird.
Eine andere Zusammensetzung und Verwendung der erfindungsgemäßen polyvalenten Bakteriophagen ist für die therapeutische und prophylaktische Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Verbrennungen und Hautwunden. Die Zusammensetzung umfasst eine wirksame Menge von mindestens einem polyvalenten Bakteriophagen, welcher spezifisch für die Bakterien ist, und einen Träger, um mindestens einen polyvalenten Bakteriophagen in die verletzte Haut abzugeben. Der polyvalente Bakteriophage kann mit Hilfe eines Verbands entweder direkt oder mit Hilfe des einen oder anderen Trägers verabreicht werden. Die Verbände können feucht oder trocken verkauft werden, wobei der polyvalente Bakteriophage in lyophilisierter Form auf dem Verband aufgebracht ist. Diese Verabreichungsmethode ist am wirksamsten für die Behandlung von Verbrennungen. In einigen der erfindungsgemäßen Ausführungsformen können polyvalente Bakteriophagen für Pseudomonas, Staphylococcus und Streptococcus, zusammen oder einzeln, in den einen oder anderen Träger oder in einen Verband, welcher für Patienten mit Verbrennungen eingesetzt wird, eingelagert werden.
Noch eine andere Verwendung von polyvalenten Bakteriophagen ist für bakterielle
Infektionen, welche durch K1- und/oder K5-Stämme von E. coli verursacht werden. Diese Bakterien sind an einer Reihe verschiedener Infektionen beteiligt, wobei die häufigsten Harnweginfektionen (HWI) sind. Die polyvalenten Bakteriophagen der vorliegenden Erfindung würden direkt an der infizierten Stelle verabreicht werden, im Falle einer HWI würde dies bedeuten, den Phagen durch einen Katheter in die Blase einzubringen.
Im Fall von einer durch E coli-K1 verursachten Sepsis, könnte der polyvalente Phage der vorliegenden Erfindung direkt in den Blutkreislauf oder intraperitoneal injiziert werden.
Im Fall von einer durch E. coli verursachten Meningitis wird der polyvalente Phage der vorliegenden Erfindung in den Liquor abgegeben oder direkt in das Hirn oder die Hirnhaut verabreicht.
Noch eine andere Verwendung der erfindungsgemäßen polyvalenten Bakteriophagen ist für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung vaginaler Infektionen. Diese Behandlungsmethode umfasst die Behandlung der vaginalen Infektion mit einer wirksamen Menge von mindestens einem polyvalenten Bakteriophagen, welcher spezifisch für diese Bakterien ist, wobei der polyvalente Bakteriophage in einem Träger eingelagert ist, der in die Vagina eingebracht werden soll. Der bevorzugte Träger ist ein Tampon, oder eine Vaginaldusche. Eine Binde kann ebenfalls als Träger eingesetzt werden, auch wenn diese nicht so wirksam ist. Obwohl beliebig viele Bakterien mit dieser Zusammensetzung und Methode behandelt werden könnten, glauben wir, dass der allergrößte Nutzen dieser Behandlungsmittel und -methode in der Behandlung einer Infektion mit E. coli und Streptococcus B liegen würde. Vaginale Infektionen, welche durch Gruppe B-Streptococcus hervorgerufen werden, können Neugeborenen-Meningitis verursachen, wobei dies zu Hirnschäden und vorzeitigem Tod führen kann. Für Gruppe B-Streptokokken bzw. Streptomyceten spezifische polyvalente Bakteriophagen, welche in Tampons eingelagert sind, würden die Gruppe B-Organismen eliminieren ohne die normale Flora zu beeinträchtigen, so dass die Frauen nicht nach einer Therapie mit Antibiotika Hefe-Infektionen durchmachen müssten. Die Verwendung von polyvalenten Bakteriophagen in der Vagina würde am besten eine prophylaktische Wirkung haben, obwohl eine therapeutische Verwendung ebenfalls angebracht wäre.
Eine andere Verwendung der Erfindung ist für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von Augeninfektionen. Die Behandlungsmethode umfasst die Verabreichung von Augentropfen, enthaltend eine wirksame Menge von mindestens einem polyvalenten Bakteriophagen, welcher spezifisch für die Bakterien ist, und einen Träger, welcher sicher am Auge angewandt werden kann, wobei der Träger die polyvalenten Bakteriophagen enthält. In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die behandelten Bakterien Haemophilus oder Staphylococcus. Die Augentropfen werden in Form einer isotonischen Lösung dargereicht.
Polyvalente Bakteriophagen können auch verwendet werden, um dentale Karies zu bekämpfen. Insbesondere kann ein polyvalenter Bakteriophage, der spezifisch für Streptococcus mutans ist, in Zahnpasta oder in Mundduschen enthalten sein. In ähnlicher Weise kann dieser polyvalente Bakteriophage auch in Kaugummi oder Lutschbonbons enthalten sein. Es können beliebige andere Träger verwendet werden, durch die der Mund, das Zahnfleisch und die Zähne den polyvalenten Bakteriophagen ausgesetzt werden.
Die Verabreichungswege umfassen, ohne hierdurch beschränkt zu sein, orale, arosole, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrathekale, vaginale, rektale, topische Verabreichungsformen, Lumbalpunktionen und direkte Verabreichung in das Hirn oder die Hirnhaut. Pharmazeutisch verträgliche Träger, die als Vehikel für die Abgabe des Phagen eingesetzt werden können, werden den Fachleuten ersichtlich sein. Zum Beispiel können freie Phagen in lyophilisierter Form vorliegen und direkt vor der Verabreichung per intravenöser Injektion aufgelöst werden. Es ist dabei vorgesehen, dass die Dosierung der Verabreichung in einem Bereich von etwa 10⁶ bis etwa 10¹³ pfu pro kg und Tag liegt, und bevorzugt etwa 10¹² pfu pro kg und Tag. Die Phagen werden verabreicht, bis eine erfolgreiche Beseitigung der pathogenen Bakterien erreicht ist.
Für eine Verabreichung in die Lunge über ein Aerosol wird der polyvalente Bakteriophage in einer Aerosol-haltigen Rezeptur eingelagert, welche spezifisch für eine Verabreichung in die Lunge per Inhalation entworfen ist. Viele solcher Aerosole sind im Stand der Technik bekannt, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf irgendeine spezielle Rezeptur beschränkt. Ein Beispiel für ein solches Aerosol ist der Proventil^TM-Inhalator, welcher von Schering-Plough hergestellt wird, dessen Treibmittel Trichlormonofluormethan, Dichlor difluormethan und Ölsäure enthält. Die Konzentrationen der Bestandteile des Treibmittels und der Emulgatoren werden, falls notwendig, je nach dem für die Behandlung verwendeten Phagen angepasst. Die Zahl der Phagen, welche pro Aerosol-Behandlung verabreicht wird, wird im Bereich von 10⁶ bis 10¹³ pfu, und bevorzugt bei 10¹² pfu liegen.
Isolierung und Charakterisierung von ΦK1-5
ΦKI-5 wurde unter Verwendung von E. coli ATCC 23506 (K5) als Wirt isoliert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass ΦKI-5 morphologische Ähnlichkeiten mit der Familie Podoviridae hat, welche die Coliphagen T7, T3, und die Salmonella-Phagen SP6 und P22 einschließt. Das Phagenpartikel besteht aus einem ikosaedrischen Kopf von etwa 60 nm im Durchmesser mit einem kleinen Büschel kurzer Schwanzfasern (1). ΦK1-5 ist hochlytisch. Wenn Phagen in einer Infektionsmultiplizität (moi) von 1:1 zu einer logarithmisch wachsenden Kultur eines empfänglichen Wirts gegeben werden, erfolgt eine Lyse in 15–20 Minuten. Die Menge der freigesetzten Partikel pro infizierte Zelle wurde durch eine Ein-Schritt-Wachstumskurve bestimmt. Es wurde gefunden, dass diese bei etwa 110 lag. Die Plaques von ΦK1-5 sind klar und groß, auf LB-Agar-Platten etwa 4.0–5.0 mm im Durchmesser mit einem Hof von etwa 12.0–15.0 mm Durchmesser. Die Plaques erreichten ihre maximale Größe nach 24 Stunden. Im Gegensatz dazu können Plaques von T7 mehrere Tage weiter wachsen (38). DNA wurde von einem über einen Cäsiumchlorid-Dichtegradienten gereinigten Phagen durch Phenolextraktion isoliert. Ein Verdau der DNA mit mehreren Restriktionsenzymen zeigte, dass diese doppelsträngig ist und eine Größe von schätzungsweise 40 kb aufweist.
Erweitertes Wirtsspektrum von ΦK1-5
Das Wirtsspektrum von ΦK1-5 wurde mit dem von ΦK1E (spezifisch für K1-Antigene) und dem von ΦK5 (spezifisch für K5-Antigene) verglichen. Die E. coli-Stämme ATCC 23506 und ATCC23508 besitzen die K5-Polysaccharidkapsel, und die Stämme ATCC 23503 und ATCC 23511 besitzen die K1-Kapsel. Ebenfalls getestet wurde eine Reihe von K5-Stämmen, welche von Ian Roberts von der University of Manchester gesammelt worden sind und eine Reihe von K1-Isolaten, welche von Richard Silver von der University of Rochester gesammelt worden sind (Tabelle 1). ΦK1-5 kann alle K1- und K5-Stämme infizieren und auf diesen wachsen, ΦK1E wächst nur auf den K1-Stämmen und ΦK5 wächst nur auf den K5-Stämmen. ΦK1E, ΦK5, und ΦKI-5 wurden auch auf Wachstum auf den folgenden ATCC-Stämmen getestet: 23502 (K4), 23504 (K8), 23505 (K9), 23507 (K10), 23509 (K11), 23510 (K14), 23515 (K17), 23516 (K20), 23517 (K13), 23518 (K18), 19110 (K7), 19138 (K2) und 31616 (K35). Kein Phagenwachstum von ΦK1-5, ΦK1E oder ΦK5 wurde auf irgendeinem dieser Stämme beobachtet. TABELLE 1. Wirtsspektren der Phagen ΦK1E, ΦK5, ΦK1-5, ΦK1-5_(K1¯), und ΦK1-5_(K5¯) ^a

^aPlaque-Assays wurden durchgeführt, um das Wirtsspektrum der Phagen auf einer Sammlung von E. coli-K1- und K5-Stämmen zu bestimmen. ΦK1E wächst nur auf K1-Stämmen, ΦK5 nur auf ΦK5-Stämmen und ΦK1-5 wächst auf beiden Stämmen. ΦK1-5_(K1¯) und ΦK1-5_(K5¯) sind Mutanten von ΦK1-5, deren Wachstum auf K1- bzw. K5-Stämmen gestört ist.

Wegen der Ähnlichkeit der Promotorsequenz zwischen ΦK1-5 und SP6 testeten wir, ob ΦK1-5 auf dem Salmonella typhimurium-Stamm LT2 (dem Wirt für SP6) wachsen kann und ob SP6 auf irgendeinem der E. coli-Isolate wachsen kann, die sensitiv gegenüber ΦK1-5 sind. SP6 wuchs auf keinem der E. coli-Stämme, und genauso wuchs ΦK1-5 nicht auf Salmonella typhymurium.
ΦK1-5 codiert zwei Schwanzgene
ΦK1E und ΦK5 haben beide einen Bereich mit ähnlicher Sequenz stromaufwärts von den Schwanzproteinen (einschließlich dem SP6-artigen Promotor, 3). Da ΦK1-5 strukturelle und biologische Ähnlichkeiten sowie Ähnlichkeiten im Wirtsspektrum mit diesen beiden Phagen aufweist, spekulierten wir, dass alle drei eng miteinander verwandt sein könnten und alle eine ähnliche Sequenz stromaufwärts haben könnten. Basierend auf der Sequenz dieses Bereiches in ΦK1E und ΦK5 konstruierten wir Primer, um die Sequenz stromabwärts vom Promotor zu bestimmen. Wenn die ΦK1-5-DNA als Matrize benutzt wurde, hybridisierte der Primer in der Tat, und wir waren in der Lage, eine Sequenz zu generieren. Wir setzten die Sequenzierung stromabwärts mittels „Primer walking" fort. Die Sequenz unmittelbar stromabwärts von dem Promotor war der von ΦK5 sehr ähnlich, und codierte einen offenen Leserahmen mit einem hohen Maß von Sequenzähnlichkeit (> 92% Identität auf der Aminosäure-Ebene) mit dem Schwanzprotein von ΦK5. Fortgesetzte Sequenzierung stromabwärts enthüllte einen zweiten offenen Leserahmen, der fast identisch (> 97% Identität auf der Aminosäuren-Ebene) mit dem Endosialidase-Protein von ΦK1E war. Ein intergenischer Bereich mit einer Länge von 85 Basenpaaren liegt zwischen dem Stopcodon des Lyase-Gens und dem Stopcodon des Endosialidase-Gens. Dieser Bereich kommt auch in ΦK5 vor, wo dieser unmittelbar dem K5-Lyase-Gen folgt, und auch in ΦK1E, wo dieser unmittelbar stromaufwärts von dem Endosialidase-Gen und unmittelbar stromabwärts von einem offenen Leserahmen mit einer Länge von 111 Aminosäuren (ORF_L, 6) liegt. In diesem Bereich wurde kein erkennbarer Promotor gefunden, aber es gibt zwei Bereiche mit starker Symmetrie, welche vielleicht als Rho-unabhängige Transkriptions-Terminatoren fungieren. Die Sequenz wurde 598 Basenpaare stromabwärts von dem Stopcodon des Endosialidase-Gens bestimmt, an diesem Punkt war das Ende des DNA-Moleküls erreicht. In diesem Gebiet wurden keine offenen Leserahmen gefunden.
Auch die Sequenz 500 Basenpaare stromaufwärts vom K5-Lyase-Gen in ΦK1-5 wurde bestimmt. Wie in den anderen Phagen gibt es einen SP6-artigen Promotor, der wahrscheinlich für die Transkription der Schwanzgene erforderlich ist. Die Sequenz stromaufwärts weist ein hohes Maß (> 90%) an Identität mit der des analogen Bereichs in ΦK5 und ΦK1E auf.
Wir sequenzierten auch stromabwärts vom Endosialidase-Gen von ΦK1E; 718 Basenpaare stromabwärts vom Stopcodon des Endosialidase-Gens erreichten wir das Ende des DNA-Moleküls. Es gibt nur geringe Sequenzähnlichkeit zwischen diesem Bereich und dem analogen Bereich in ΦK1-5.
Jedes ΦK1-5-Virion enthält beide Schwanzproteine
Wir gingen der Frage nach, ob ΦK1-5 Partikel beide Schwanzfaserproteine enthalten, oder ob nach der Infektion zwei Populationen von Partikeln (wovon das eine die K5-Lyase und das andere die Endosialidase enthält) produziert werden. Wir stellten eine Phagenpräparation her, indem wir ATCC 23506 (K5) als Wirt verwendeten und bestimmten deren Titer auf ATCC 23506 (K5) und ATCC 23503 (K1) (Tabelle 2). Eine Probe des Phagen wurde dann für 5 Min. mit ATCC 23506 inkubiert, was lang genug ist, dass der Phage binden und möglicherweise die DNA injizieren kann, jedoch nicht lang genug für die Produktion neuer Phagenpartikel. Die MOI war 1/100 Phagenpartikel/Bakterium. Das Gemisch wurde darauf rasch filtriert. Phagenpartikel, welche an die Zellen gebunden hatten, würden aus dem Filtrat entfernt werden. Das Filtrat wurde sodann sowohl auf K1- als auch K5-Stämmen titriert. Falls die Phagenpräparation ursprünglich ein Gemisch von zwei Populationen war, dann würden nur die, welche die K5-Lyase auf ihrer Oberfläche tragen, gebunden und entfernt. Die übrig bleibenden Phagen wären hauptsächlich solche, die die K1-spezifische Endosialidase enthalten, und deshalb wäre der Titer auf E. coli-K1-Stämmen höher als auf dem K5-Stamm. Andererseits, falls jedes der Phagenpartikel beide Schwanzproteine enthalten würde, dann wären die Titer der im Filtrat verbleibenden Phagen auf den zwei Stämmen dieselben, d.h. die Mengen der Phagen, welche K5-Lyase enthalten, wären nicht selektiv vermindert. Wir fanden, dass das Letztere der Fall war und schlossen daraus, dass jedes Virion sowohl die K1-Endosialidase als auch die K5-Lyase besitzt. Ähnliche Ergebnisse wurden in dem umgekehrten Experiment erhalten, in welchem die 5-minütige Inkubation mit dem E. coli-K1-Stamm durchgeführt wurde (Tabelle 2). Zur Kontrolle führten wir die Experimente sowohl mit ΦK1E als auch mit ΦK5 durch, wobei wir beide Stämme für die Inkubation einsetzten. Die Titer von ΦK1E waren um 99% vermindert, wenn eine Vorinkubation mit dem K1-Stamm, jedoch nicht mit dem K5-Stamm durchgeführt wurde, und die Titer von ΦK5 waren ähnlich vermindert, wenn die Vorinkubation mit dem K5-Stamm, jedoch nicht mit dem K1-Stamm durchgeführt wurde. TABELLE 2. Vorinkubationsexperimente zeigen, dass alle ΦK1-5-Partikel beide Schwanzproteine enthalten^a

^aEine Vorinkubation für 5 Min. von ΦK1-5 mit entweder ATCC 23503 (K1) oder ATCC 23506 (K5) ergibt einen ungefähr 100-fachen Verlust an Phagenpartikeln, wenn die Titerbestimmung auf den beiden jeweiligen Stämmen durchgeführt wird. Falls die Phagenpräparation aus zwei Populationen besteht, von denen jede nur ein Schwanzprotein enthält, dann würden die Titer nach der Inkubation nur auf dem Stamm vermindert sein, der in der Vorinkubation eingesetzt wurde. Die Titer von ΦK5 werden durch Vorinkubation mit einem permissiven Wirt (23506) reduziert, jedoch nicht mit einem non-permissiven Wirt (23503). Die Titer von ΦK1E werden ebenfalls nur durch Vorinkubation auf einem permissiven Wirt (23503) vermindert und nicht durch Vorinkubation auf einem non-permissiven Wirt (23506).

ΦK1-5 Mutanten, deren Wachstum sowohl auf E. coli-K1 als auch -K5 gestört ist
Ein Mischrasen von E. coli-K1 und -K5 Stämmen wurde verwendet, um nach ΦK1-5-Mutanten zu suchen, deren Wachstum auf dem einen oder dem anderen Wirtstamm gestört war. ΦKI-5 bildet klare Plaques auf einem Mischrasen von E. coli-K1 und -K5; Mutanten in jedem der beiden Schwänze würden auf Grund des Wachstums des non-permissiven Wirts trübe Plaques ergeben. Die Phagen wurden mit dem Mutagen Hydroxylamin behandelt und auf einem Doppelrasen ausplattiert. Trübe Plaques wurden identifiziert, gepickt, und durch mehrere Plaque-Isolierungen auf dem Doppelrasen aufgereinigt. Diese wurden dann durchgemustert, indem diese separat auf jedem Stamm auf Wachstum getestet wurden. Von acht gereinigten Isolaten waren drei unfähig, Plaques auf dem K5-Stamm zu bilden, konnten aber auf dem K1-Stamm Plaques bilden. Eines davon, ΦK1-5_(K5¯), wurde auf Wachstum gegen die gesamte Sammlung von Wirten durchgemustert und es wurde herausgefunden, dass dieser unfähig war, sich auf irgendeinem der K5-Stämme fortzupflanzen, jedoch auf allen der K1-Stämme wachsen konnte (Tabelle 1). Fünf der Isolate konnten sich immer noch sowohl auf K1- als auch K5-Stämme fortpflanzen, gaben jedoch eine trübe Plaque-Morphologie auf den K5-Stämmen.
Keine der auf diese Art und Weise isolierten Mutanten hatte ein gestörtes Wachstum auf K1-Stämmen, daher haben wir uns ein Selektions-/Amplifikations-Schema ausgedacht, um solche anzureichern, die sich auf K5- aber nicht auf K1-Wirten fortpflanzen können. Mutagenisierte Phagen wurden auf einem K5-Stamm vermehrt, gefiltert, um bakterielle Trümmer zu entfernen, und dann eingesetzt, um einen logarhitmisch wachsenden K1-Stamm für 5 Minuten zu infizieren. Dieses Gemisch wurde rasch filtriert, bevor es zur Freisetzung neuer Phagenpartikel kommen konnte. Phagen, die fähig sind, auf dem K1-Stamm zu wachsen, hatten an die Zellen gebunden und wurden aus dem Filtrat entfernt. Die Probe wurde dann wieder auf dem K5-Stamm vermehrt, und der Zyklus wurde acht Mal wiederholt. Dieses Vorgehen selektiert stark für Phagen, welche sich auf K5-Wirten, jedoch nicht auf K1-Wirten fortpflanzen können. Die Titer der Filtrate waren 200-fach höher auf dem K5-Stamm als auf dem K1-Stamm. Mehrere wurden gepickt und über mehrere Runden von Einzelplaque-Isolationen aufgereinigt. Ein Isolat, ΦK1-5_(K1¯), wurde weiter charakterisiert und es wurde gefunden, dass es unfähig war, auf irgendeinem der K1-Stämme zu wachsen (Tabelle 1).
DNA Sequenz eines mutmaßlichen ΦK5-Schwanzgens
Clarke et. al. beschrieben eine Teilsequenz eines offenen Leserahmens (ORF_P) in ΦK5 unmittelbar stromabwärts von dem 85 Basen langen Bereich, welcher allen drei Phagen gemeinsam ist (6). Wir fuhren fort, stromabwärts zu sequenzieren und fanden, dass der komplette offene Leserahmen 523 Aminosäuren codiert. Eine BLAST-Suche offenbarte einen kleinen Bereich in der Nähe des N-terminalen Endes mit Sequenzähnlichkeit zu der N-Acetylglucosamin-permease IIABC-Komponente. Dieser Bereich hat keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit irgendeinem anderen Eintrag in der Datenbank oder mit irgendeinem der hier beschriebenen Schwanzproteine. Die Sequenz von 163 zusätzlichen Basen stromabwärts wurde bestimmt. An diesem Punkt war das Ende des DNA-Moleküls erreicht.
2 vergleicht die die Schwanzproteine codierenden Bereiche in allen drei Phagen. ΦK1-5 hat ein K5 Lyase-Protein an derselben Position wie das von ΦK5. ΦK1E hat an dieser Stelle einen offenen Leserahmen von 111 Aminosäuren (ORF_L) mit unbekannter Funktion. Unmittelbar stromabwärts haben alle drei Phagen einen intergenischen Bereich von 85 Basen, der zwei zweizählige Symmetrieachsen aufweist. Unmittelbar stromabwärts von diesem Bereich ist das Endosialidase-Protein von ΦKI-5 codiert, welches sich an der analogen Position befindet wie die Endosialidase von ΦK1E. ΦK5 codiert an dieser Stelle einen 523 Aminosäuren langen offenen Leserahmen (ORF_P). Die drei Phagen weisen eine ähnliche Sequenz stromaufwärts von den Schwanzgenen auf. Stromabwärts wurde keine Sequenzähnlichkeit festgestellt, und in allen drei Phagen endet das DNA-Molekül stromabwärts.
BEISPIEL 1
Isolierung von ΦK1-5
ΦK1-5 wurde mit Hilfe der Plaque-Technik aus unbehandeltem Abwasser isoliert. In Kürze, eine 1 L-Abwasserprobe wurde bei 6000 Umdrehungen pro Minute in einem GSA-Rotor zentrifugiert, um Feststoffe zu entfernen und wurde sodann durch einen 0.45 Mikrometer-Nitrocellulose-Filter (Nalgene) passiert. 100 μl des Filtrats wurden zu 200 μl einer Übernachtkultur von E. coli ATCC 23506 (K5) gegeben, welche in LB-Medium aufgezogen wurde. 3 ml geschmolzener, temperierter Top-Agar (5 g/L Agar in LB) wurde zugegeben, und das Gemisch auf eine LB-Agarplatte ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am folgenden Tag wurden Plaques gepickt. Der Prozess wurde drei Mal wiederholt, um sicher zu stellen, dass man eine reine Kultur erhielt. Die endgültigen Plaque-Isolate wurden in Form von Agarpfropfen aus einer Pasteurpipette aufbewahrt, welche in 1 ml SM-Puffer (10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 0.01% Gelatine, 50 mM Tris pH 7.5) gelagert waren.
Das Wirtsspektrum wurde anfänglich durchgemustert, indem 10 μl-Tropfen von SM-Puffer, der einen Plaquepfropfen enthielt, auf den Rasen eines geeigneten Stamms platziert wurden. Das Wirtsspektrum der interessierenden Phagenisolate wurde weiter mit Hilfe des Plaque-Assays bestätigt. Alle Phagentitrationen wurden mit der Plaque-Assay-Technik durchgeführt.
Aufreinigung im großen Maßstab
Phagen wurden mit Hilfe der Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Methode produziert. 1 L eines geeigneten Wirts wurde bei 37°C und 200 Umdrehungen pro Minute in LB-Nährlösung bis zu einer OD₆₀₀ von 0.4 bis 0.6 wachsen gelassen. Phagen wurden mit einer MOI von 1 Phage/100 Bakterien zugegeben, und man ließ die Kultur inkubieren, bis die OD für 30 Min. ein Minimum erreichte. 10 ml Chloroform wurden zugegeben, das Ganze wurde 10 Min. schütteln gelassen und dann 20 Min. bei 6000 Umdrehungen pro Minute in einem GSA-Rotor zentrifugiert, um die zellulären Trümmer zu entfernen. Der Überstand wurde entnommen und 1/10 Volumen 5M NaCl und 1/10 w/v Polyethylenglycol zugegeben, um den Phagen zu fällen, das Ganze wurde über Nacht bei 4°C gehalten. Die Phagen wurden dann durch Zentrifugation bei 4°C und 6000 Umdrehungen pro Minute in einem GSA-Rotor pelletiert. Das Pellet wurde in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und CsCl wurde bis zu einer Dichte von 1.5 g/ml zugegeben. Die Probe wurde in einem Ti80 Rotor (Beckman) bei 34,000 Umdrehungen pro Minute über Nacht zentrifugiert. Die Phagenbande wurde mit einer Spritze entnommen und gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7.4) dialysiert.
DNA-Isolierung und Sequenzierung
DNA wurde aus CsCl-gereinigten Phagen durch Phenol/Chloroform-Extraktion isoliert. Die Phagen-DNA wurde direkt als Matrize für die DNA-Sequenzierung eingesetzt, die bei Commonwealth Biotechnologies in Richmond, VA durchgeführt wurde. Beide Stränge (der Schwanzgenregion von ΦK1-5) wurden sequenziert. DNA-Datenbankrecherchen wurden mit BLAST (1), und Sequenzalignments mit dem Wisconsin Package (9) durchgeführt.
Mutagenese
Cäsium-gereinigte Phagen wurden mit UV-Licht unter Verwendung eines TM 36 Chromatovue-Transilluminators (UVP, Inc.) mutagenisiert. Die Phagen wurden typischerweise 10–20 sec exponiert, was die Lebensfähigkeit 1000-fach verminderte. Die mutagenisierten Phagen wurden dann auf ATCC 23503 oder ATCC 23506 vermehrt und wie oben beschrieben selektiert und amplifiziert. Die Phagen wurden auch durch Inkubation mit 400 mM Hydroxylamin mutagenisiert bis der Phagentiter 100-fach vermindert war. Sie wurden dann auf einem Doppelrasen von ATCC 23503 und ATCC 23506 plattiert. Trübe Plaques wurden gepickt, für die Isolierung nochmals per Plaque-Assay aufgereinigt, und mit einer Sammlung von E. coli-K1- und -KS-Stämmen auf Wachstum getestet.
LITERATUR

1. Altschul, S. F., W., Gish, W., Miller, E. W., Myers, D. J., and Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215(3): 403–410.
2. Botstein, D. 1980. A theory of modular evolution for bacteriophages. Ann. NY Acad. Sci. 354: 484–490.
3. Brown, J. E., J. F. Klement, and W. T. McAllister. 1986. Sequences of three promoters for the bacteriophage SP6 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. (14)8: 3521–3526.
4. Campbell, A., and D. Botstein. 1983. Evolution of the lambdoid phages. In Lambda II. Cold Spring Harbor Laboratory. 365–380.
5. Chandry, P. S., S. C. Moore, J. D. Boyce, B. E. Davidson, and A. J. Hillier. 1997. Analysis of the DNA sequence, gene expression, origin of replication, and modular structure of the Lactococcus lactis lytic bacteriophage skl. Mol. Microbiol. 26(1): 49–64.
6. Clarke, B. R., F. Esumeh, and I. S. Roberts. 2000. Cloning, expression, and purification of the K5 capsular polysaccharide lyase (KflA) from coliphage K5A: evidence for two distinct K5 lyase enzymes. J. Bacteriol. 182(13): 3761–3766.
7. Crawford, J. T. and E. B. Goldberg. 1980. The function of the tail fibers in triggering baseplate expansion of bacteriophage T4. J. Mol. Biol. 139: 679–690.
8. Desiere, F., S. Lucchini, and H. Brussow. 1998. Evolution of Streptococcus thermophilus bacteriophage genomes by modular exchanges followed by point mutations and small deletions and insertions. Virology. 241(2): 345–356.
9. Devereux, J., P. Haeberli, and O. Smithies. 1984. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res. 12(1): 387–395.
10. Gross, R. J., T. Cheasty, and B. Rowe. 1977. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of E. coli. J. Clin. Microbiol. 6(6): 548–550.
11. Gupta, D. S., B. Jann, G. Schmidt, J. R. Golecki, I. Ørskov, F. Ørskov, and K. Jann. 1982. Coliphage K5, specific for E. coli exhibiting the capsular K5 antigen. FEMS Microbiol. Lett. 14: 75–78.
12. Gupta, D. S., B. Jann, and K. Jann. 1983. Enzymatic degradation of the capsular K antigen of E. coli by coliphage K5. FEMS Microbiol. Lett. 16: 13–17.
13. Haggåard-Ljungquist, E., C. Halling, and R. Calendar. 1992. DNA sequences of the tail fiber genes of bacteriophage P2: evidence for horizontal transfer of the tail fiber genes among unrelated bacteriophages. J. Bacteriol. 174(5): 1462–1477.
14. Hanfling, P., A. S. Shashkov, B. Jann, and K. Jann. 1996. Analysis of the enzymatic cleavage (beta elimination) of the capsular K5 polysaccharide of E. coli by the K5-specific coliphage: a reexamination. J. Bacteriol. 178(15): 4747–4750.
15. Hendrix, R. W., M. C. M. Smith, R. N. Burns, M. E. Ford, and G. F. Hatfull. 1999. Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: All the world's a phage. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 96: 2192–2197.
16. Israel, V. 1978. A model for the adsorption of phage P22 to Salmonella typhimurium. J. Gen. Virol. 40: 669–673.
17. Jann, K., and B. Jann. 1987. Polysacharide antigens of E. coli. Rev. Infect. Dis. 9(5): S517–S526.
18. Jeng S. T., S. H. Lay, and H. M. Lai. 1997. Transcription termination by bacteriophage T3 and SP6 RNA polymerases at Rho-independent terminators. Can J. Microbiol. 43(12): 1147–1156.
19. Juhala R. J., M. E. Ford, R. L. Duda, A. Youlton, G. F. Hatfull, and R. W. Hendrix. 2000. Genomic sequences of bacteriophages HK97 and HK022. Pervasive genetic mosaicism in the lambdoid bacteriophages. J. Mol. Biol. 299(1): 27–51.
20. Long, G. S., J. M. Bryant, P. W. Taylor, and J. P. Luzio. 1995. Complete nucleotide sequence of the gene encoding bacteriophage E endosialidase: implications for K1E endosialidase structure and function. Biochem. J. 309: 543–550.
21. Machida, Y., K. Miyake, K. Hattori, S. Yamamoto, M. Kawase, and S. Iijima. 2000. Structure and function of a novel coliphage-associated sialidase. FEMS Microbiol. Lett. 182(2): 333–337.
22. Monod, C., M. Repoila, F. Kutateladze, F. Tetart, and H. M. Krisch. 1997. The genome of the Pseudo T-even bacteriophages, a diverse group that resembles T4. J. Mol. Biol. 267: 237–249.
23. Montag, D., H. Schwarz, and U. Henning. 1989. A component of the side tail fiber of Escherichia coli bacteriophage X can functionally replace the receptor recognizing part of a long tail fiber protein of unrelated bacteriophage T4. J. Bacteriol. 171(8): 4378–4384.
24. Montag, D., S. Hashemolhosseini, and U. Henning. 1990. Receptor recognizing proteins of T-even type bacteriophages. The receptor recognizing area of proteins 37 of phages T4 and TuIa and TuIb.
25. Neve, H., K.1. Zenz, F. Desiere, A. Koch, K. J. Heller and H. Brussow. 1998. Comparison of the lysogeny modules from the temperate Streptococcus thermophilus bacteriophages TP-J34 and Sfi21: implications for the modular theory of phage evolution. Virology, 241(1): 61–72
26. Nimmich, W., G. Schmidt, and U. Krallmann-Wenzel. 1991. Two different E. coli capsular polysaccharide depolymerases each associated with one of the coliphage ΦK5 and ΦK20. FEMS Microbiol. Lett. 82: 137–142.
27. Nimmich, W., U. Krallman-Wenzel, B. Muller, and G. Schmidt. 1992. Isolation and characterization of bacteriophages specific for capsular antigens K3, K7, K12, and K13 of E. coli. Int. J. Med. Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis. 276(2): 213–220.
28. Nimmich, W. 1994. Detection of E. coli K95 strains by bacteriophages. J. Clin. Microbiol. 32(11): 2843–2845.
29. Petter, J. G., and E. R. Vimr. 1993. Complete nucleotide sequence of the bacteriophage K1F tail gene encoding Endo-N-Acylneuraminidase (Endo-N) and comparison to an endo-N homolog in bacteriophage PK1E. J. Bacteriol. 175(14): 4354–4363.
30. Seckler, R. 1998. Folding and function of repetitive structure in the homotrimeric phage P22 tailspike protein. J. Struct. Biol. 122: 216–222.
31. Schicklmaier, P., and H. Schmeiger. 1997. Sequence comparison of the genes for immunity, DNA replication, and cell lysis of the P22-related Salmonella phages ES 18 and L. Gene. 195: 93–100.
32. Silver, R. P., and E. R. Vimr. 1990. Polysialic acid capsule of E. coli K1. in The Bacteria, vol. 11. Molecular basis of bacterial pathogenesis. Pp 39–60. Academic Press, Inc., New York.
33. Steven, A. C., B. L. Trus, J. V. Maizel, M. Unser, D. A. D. Parry, J. S. Wall, J. F. Hainfield, and W. F. Studier. 1988. Molecular substructure of a viral receptor recognition protein. J. Mol. Biol. 200(2): 351–365.
34. Szybalski, W., and E. H. Szybalski. 1974. Visualization of the evolution of viral genomes. In Viruses, evolution and cancer. Pp. 563–582. Academic Press, New York.
35. Tetart, F., F. Repoila, C. Monod, and H. M. Krisch. 1996. Bacteriophage T4 host range is expanded by duplications of a small domain of the tail fiber adhesion. J. Mol. Biol. 258(5): 726–731.
36. Tetart, F., C. Desplats, and H. M Krisch. 1998 Genome plasticity in the distal tail fiber locus of the T-even bacteriophage: recombination between conserved motifs swaps adhesion specificity. J. Mol. Biol. 282(3): 543–556.
37. Tomlinson, S., and P. W. Taylor. 1985. Neuraminidase asssociated with coliphage E that specifically depolymerizes the E. coli K1 capsular polysaccharide. J. Virol. 55(2): 374–378.
38. Yin, J. 1993. Evolution of bacteriophage T7 in a growing plaque. J. Bacteriol. 175(5): 1272.

SEQUENCE LISTING

Claims

Arzneimittel, umfassend einen Phagen mit breiter Wirtsspezifität, die auf mehreren unterschiedlichen Wirts-Schwanzproteinen basiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei der Phage mehrere unterschiedliche hydrolytische Schwanzproteine besitzt.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage mehrere unterschiedliche K-spezifische hydrolytische Schwanzproteine besitzt.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage das Voll-Längen-Genom von ΦK1E umfasst.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage das Voll-Längen-Genom von ΦK5 umfasst.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage das Voll-Längen-Genom von ΦK20 umfasst.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Escherichia und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Shigella und zusätzlich ein Bakteriumin infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Salmonella und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Yersinia und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacteriumn, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Vibrio und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Legionella und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Pseudomonas und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Neisseria und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Bordetella und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Helicobacter und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Listeria und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Staphylococcus und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Streptococcus und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Clostridium und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Corynebacterium und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Mycobacterium und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Treptonema und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage Borrelia und zusätzlich ein Bakterium infiziert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema und Borrelia.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Phage weiterhin ein Gen hat, welches einen Faktor codiert, der es dem Phagen erlaubt, zu replizieren und in einem anderen Typ von Bakterium, das normalerweise nicht von dem Phagen infiziert wird, zu funktionieren.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend: (a) Isolieren eines Phagens nach Anspruch 1, wobei sich der Erwerb von neuen Schwanzproteinen durch natürliche Rekombination ereignet; und (b) Kombinieren des Phagen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend: (a) Herstellen eines Phagens nach Anspruch 1, wobei der Erwerb von neuen Schwanzproteinen durch Labortechnologie herbeigeführt wird; und (b) Kombinieren des Phagen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 26 für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung von bakterieller Infektion.