ES2252263T3 - Bacteriofago que tiene una gama de hospedadores multiple. - Google Patents
Bacteriofago que tiene una gama de hospedadores multiple.Info
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende un fago que tiene especificidad de hospedadores múltiple basada en múltiples proteínas de la cola de diferentes hospedadores y un excipiente farmacéuticamente aceptable, teniendo dicho fago múltiples proteínas de la cola hidrolíticas diferentes.
Description
Bacteriófago que tiene una gama de hospedadores
múltiple.
La presente invención describe composiciones
farmacéuticas y usos de las mismas para la preparación de un
medicamento para la profilaxis y tratamiento de infecciones
bacterianas que implican el uso de un bacteriófago que tiene una
gama múltiple de hospedadores basada en múltiples proteínas
hidrolíticas de la cola diferentes.
Los polisacáridos capsulares de Escherichia
coli (antígenos K) se han asociado a menudo con el incremento de
la virulencia (17). El antígeno K1 en particular, incrementa la
invasividad de E. coli y estas cepas a menudo están
implicadas en casos de meningitis y septicemia (32). Estas cubiertas
de polisacáridos también actúan como sitios de reconocimiento para
bacteriófagos, que frecuentemente llevan espículas en la cola con
actividad de despolimerización de polisacáridos. Se han descrito
varios fagos específicos de K1 (10), uno de los cuales, \PhiK1E,
se encontró que posee N-acetilneuraminidasa
(endosialidasa) como parte de la proteína de las fibras de la cola
(37). Esta enzima cataliza la escisión de un polímero de
carbohidrato de ácido N-acetilneuramínico con
enlaces \alpha-2, 8 de la cápsula K1. Se ha
sugerido que la proteína de las fibras de la cola está implicada
tanto en la adsorción a la superficie de la célula como en la
penetración en la célula por degradación enzimática de la cápsula
polisacárida. Se ha clonado y secuenciado el gen de la endosialidasa
de \PhiK1E (20). Un gen similar se ha clonado y secuenciado a
partir de \PhiK1F (29).
\PhiK5 es un bacteriófago relacionado
específico de las cepas de E. coli que muestra el antígeno
K5, un polímero compuesto de una estructura repetitiva de
a-N-acetilglucosamina y ácido
\beta-glucurónico (N-acetil
heparina) con enlaces en posición 4. En este caso, \PhiK5 codifica
una proteína liasa específica de K5 asociada a la cola que también
es responsable de la unión a la superficie de la célula y de la
degradación de la cápsula de polisacárido K5 (12, 14). Se han
encontrado fagos que son específicos de otros antígenos
polisacáridos de E. coli que incluyen K3, K7, K12, K13 y K20
(26,27); todos poseen probablemente actividades de despolimerización
de polisacáridos específicos como parte de la partícula de fago.
Tanto \PhiK5 como \PhiK1E tienen un promotor
semejante al del fago SP6 de Salmonella por delante de sus
proteínas de la cola, así como una región de similitud de secuencia,
que está justo después del gen de la liasa de \PhiK5 y justo
antes del gen de endosialidasa de \PhiK1E (6). También son muy
similares las secuencias antes de los promotores de los genes de la
cola en \PhiK1E y \PhiK5. \PhiK5, \PhiK1E y SP6 comparten
una morfología y ciclo vital comunes, lo que sugiere que pueden
estar estrechamente relacionados.
Los antibióticos reemplazaron al uso potencial de
bacteriófagos en el tratamiento de infecciones. El amplio uso de
antibióticos ha dado lugar a patógenos bacterianos resistentes a
antibióticos. De este modo, los investigadores han vuelto a evaluar
la terapia y profilaxis con bacteriófagos. Sin embargo, un obstáculo
importante que surge frecuentemente con el uso de bacteriófagos es
su gama de hospedadores excesivamente limitada. Es necesario en
terapia y profilaxis usar bacteriófagos que tengan una gama múltiple
de hospedadores.
Se ha aislado un bacteriófago virulento de ADN de
cadena doble, \PhiK1-5, y se ha encontrado que es
capaz de infectar cepas de E. coli que poseen la cápsula
polisacárida K1 o K5. Las fotografías de microscopia electrónica
muestran que los viriones constan de una pequeña cabeza icosaédrica
con espículas cortas en la cola, semejante a los miembros de la
familia Podoviridae. El análisis de la secuencia de ADN de la
región que codifica la proteína de las fibras de la cola mostró dos
marcos de lectura abiertos que codifican proteínas hidrolíticas de
las fibras de la cola del fago previamente caracterizadas. El
primero es el gen de la proteína K5 liasa de \PhiK5, que permite a
este fago infectar específicamente cepas K5 de E. coli. Un
segundo marco de lectura abierto codifica una proteína casi idéntica
en su secuencia de aminoácidos a la proteína
N-acetilneuraminidasa (endosialidasa) de \PhiK1E,
que permite a este fago infectar específicamente cepas K1 de E.
coli. Proporcionamos evidencia experimental de que las
partículas del fago maduras contienen ambas proteínas de las fibras
de la cola y el análisis de mutaciones indica que cada proteína
puede inactivarse independientemente. Una comparación de las
regiones de los genes de la cola de \PhiK5, \PhiK1E, y
\PhiK1-5 muestra que los genes están ordenados en
una configuración modular o en casete. La demostración de que un
fago puede contener múltiples proteínas de la cola que amplían su
gama de hospedadores es útil en la generación de fagos con
propiedades antibacterianas de amplio espectro para terapia y
profilaxis de infecciones bacterianas.
Figura 1. Fotografía de microscopia electrónica
de \PhiK1-5 teñido negativamente con ácido
fosfotúngstico a una ampliación de X115.500. Morfológicamente este
fago puede clasificarse en la familia Podoviridae que incluye
a T7 y SP6.
Figura 2. Comparación de las regiones
codificadoras de las proteínas de la cola de
\PhiK1-5, \PhiK5, y \PhiK1E. Los tres fagos
comparten similitud de secuencia en la región anterior al extremo 5'
(que contiene un promotor SP6), así como una región intergénica de
85 bases. Inmediatamente después del promotor,
\PhiK1-5 y \PhiK5 codifican una proteína liasa y
\PhiK1E codifica ORF_{L}. Inmediatamente a continuación de los
codones de terminación de las liasas o de ORF_{L} está la región
intergénica que contiene una posible estructura en forma de
horquilla, la primera de las cuales podría ser un terminador de la
transcripción independiente de Rho. Inmediatamente a continuación de
esto, \PhiK1-5 y \PhiK1E codifican una
endosialidasa donde \PhiK5 codifica ORF_{P}. Ninguno de los tres
fagos tiene regiones codificadoras después del extremo
3' y en los tres casos, la molécula de ADN termina aquí. No existe similitud de secuencia en esta región terminal.
3' y en los tres casos, la molécula de ADN termina aquí. No existe similitud de secuencia en esta región terminal.
Figura 3. Dos posibles modelos para el
ordenamiento de las proteínas de la cola de la cápside del fago. (a)
Hay tres copias de cada cola formando un hexámero. (b) Hay seis
copias de cada cola. Una está unida a la cabeza y es parte del
"núcleo" de la cola. La otra se une a continuación a la primera
proteína de la cola, haciendo en realidad una fibra de la cola más
larga con dos actividades enzimáticas diferentes.
Figura 4. Comparación de las regiones
codificadoras de las proteínas de la cola de
\PhiK1-5, \PhiK5, \PhiK1E y SP6.
La ID SEC Nº 1 es la secuencia de ADN de la
región del gen de la cola de \PhiK1-5.
La ID SEC Nº 2 es la secuencia de ADN del gen de
la cola de \PhiSP6.
La ID SEC Nº 3 es la secuencia de ADN transcrita
de \PhiK1-5.
La ID SEC Nº 4 es la secuencia de ADN
complementaria de \PhiK1-5.
\PhiK1-5 se depositó en la
American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd.,
Manassas, VA 20110-2209, EE.UU., con el Nº de Acceso
de ATCC PTA-3495 el 2 de julio de 2001. Este
depósito se hizo bajo las disposiciones del Tratado de Budapest
sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes
y sujeto a las Regulaciones de éste (Tratado de Budapest). Esto
asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante
30 años desde la fecha del depósito. La ATCC pondrá a disposición el
depósito bajo los términos del Tratado de Budapest y sujeto a un
acuerdo entre el solicitante y la ATCC que asegura la disponibilidad
permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del
depósito al público tras la emisión de la patente de EE.UU.
pertinente o tras la exposición al público de cualquier solicitud de
patente de EE.UU. o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la
disponibilidad de la progenie a quien determine el Comisario de
Patentes y Marcas de EE.UU. que tiene derecho a ello, según el
título 35 del USC \NAK 122 y las normas del Comisario (incluyendo
el título 37 del CFR \NAK 1.14). La disponibilidad de la cepa
depositada no se interpreta como una licencia para poner en práctica
la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la
autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de
patentes.
Hemos descubierto que es posible expresar más de
una proteína de la cola específica de hospedador en una única cepa
de virus bacteriano y que la expresión de estas proteínas de la cola
permite al virus infectar múltiples hospedadores específicos. Este
descubrimiento facilita la manipulación genética de fagos con gamas
de hospedadores ampliadas. Por ejemplo, hay fagos que pueden
infectar cepas de E. coli que contienen el polisacárido K1 en
su cápsula externa. Estas cepas bacterianas de E. coli a
menudo están implicadas en la meningitis y en la septicemia, ya que
el polisacárido K1 aumenta la invasividad de la bacteria (32). Un
fago (\PhiK1E) posee una proteína de la cola con actividad
endosialidasa que puede infectar cepas de E. coli que
contienen el polisacárido K1. Esta endosialidasa permite al fago
\PhiK1E atacar y degradar específicamente el polisacárido K1 (37).
De forma similar, el fago \PhiK5 puede infectar las cepas K5 de
E. coli. Las cepas K5 de E. coli son frecuentemente
causa de infecciones del tracto urinario (11). El fago \PhiK5
contiene una proteína de la cola con actividad liasa que permite a
este fago atacar la cápsula K5 bacteriana (12, 14). Hemos demostrado
que es posible que un fago tenga las dos proteínas de la cola, la K1
endosialidasa y la K5 liasa. Este fago, que hemos denominado fago
\PhiK1-5, tiene una gama ampliada de hospedadores,
ya que puede infectar tanto E. coli K1 como E. coli
K5. Hemos demostrado que esta capacidad de gama ampliada de
hospedadores se debe a la capacidad de este fago
\PhiK1-5 para exponer ambas proteínas de la cola,
una K1 endosialidasa, así como una K5 liasa. Hemos demostrado a
través del análisis de secuencia de los genes de las proteínas de la
cola del fago \PhiK1-5 que éstos están ordenados
en una estructura modular o en casete, lo que indica que la gama de
hospedadores de los fagos puede ampliarse a otros antígenos K, e
incluso a otras especies de bacterias mediante técnicas de
recombinación. La demostración de que un fago puede contener
múltiples proteínas de la cola que amplíen su gama de hospedadores
se prevé que sea útil en la generación de fagos con propiedades
antibacterianas de amplio espectro para la terapia y profilaxis de
infecciones infecciosas. Recientemente ha habido un interés renovado
en el uso de fagos para tratar y prevenir infecciones bacterianas
(para una revisión, véase Barrow y Soothill, 1997, Trends
Microbiol. 5 (7), 268271). \PhiK1-5 es muy
lítico, no lisogénico, muy estable y mata a las bacterias
rápidamente, aspectos todos que hacen de él un buen candidato para
la terapia con fagos. El fago \PhiK1-5 tiene una
ventaja adicional porque reconoce y se une a la misma estructura (o
estructuras) que confieren virulencia a la bacteria. Además, las
bacterias que se hacen resistentes al fago han perdido generalmente
la cápsula polisacárida y ya no son virulentas. Dado estos
hallazgos, se prevé que se use el fago \PhiK1-5
como plataforma general para aplicaciones terapéuticas y
profilácticas en la que se alterará la especificidad del hospedador
mediante manipulación de los genes de las proteínas de la cola.
También se prevé que la capacidad para manipular la expresión de las
proteínas de la cola proporcione al fago la capacidad de transferir
genes a organismos que no son normalmente infectados por el fago.
Este objetivo se consigue mediante la expresión de una proteína de
un virus de mamífero en la cola del fago para permitir al fago
transferir su material genético dentro de la célula de mamífero. Los
fagos con esta capacidad se usarán en aplicaciones de terapia
génica.
Con respecto a la Figura 1,
\PhiK1-5 es un bacteriófago aislado que consta de
una cabeza icosaédrica con un pequeño penacho de fibras cortas de la
cola que es capaz de infectar y replicarse en cepas K1 o K5 de E.
coli. Parece que su capacidad para replicarse en estas cepas se
debe al hecho de que codifica dos proteínas de las fibras de la cola
hidrolíticas diferentes. Una es una proteína endosialidasa, casi
idéntica a la proteína similar de \PhiK1E, que le permite unirse y
degradar la cápsula de polisacárido K1. La otra es casi idéntica a
la proteína liasa que se ha demostrado que permite a \PhiK5 unirse
y degradar la cápsula de polisacárido K5. Este es el primer ejemplo
de un fago que tiene una especificidad de hospedador doble basada en
tener dos proteínas de la cola diferentes.
Con respecto a la Figura 2, estos tres fagos
comparten similitud de secuencia por delante de la región que
codifica las proteínas de la cola y todos tienen un promotor
semejante al de \PhiSP6 que probablemente dirige la transcripción
del gen (o genes) de la cola. En \PhiK1-5 y
\PhiK5, el primer gen después de este promotor es la proteína K5
liasa. \PhiK1E no codifica esta proteína y en su lugar tiene un
ORF de 111 aminoácidos (ORF_{L}) de función desconocida.
Inmediatamente después de las proteínas K5 liasas de
\PhiK1-5 y \PhiK5, y después del ORF_{L} en
\PhiK1E hay una región de 85 bases de similitud entre los tres
fagos. Esta región contiene dos elementos simétricos potentes que
pueden estar implicados en la terminación de la transcripción. Aún
más delante, los fagos \PhiK1-5 y \PhiK1E
codifican el gen de endosialidasa. \PhiK5 no codifica este gen,
sino que en su lugar codifica el ORF_{P} de 523 aminoácidos.
\PhiK1-5 es un bacteriófago que
se aisló de aguas residuales usando una cepa K5 de E. coli
como hospedador. Analizando la gama de hospedadores de
\PhiK1-5, encontramos que se puede replicar en las
cepas K1 o K5. El análisis de la secuencia de ADN de los genes de
las fibras de la cola reveló que codifica tanto una proteína K5
liasa similar a la de \PhiK5, como una proteína endosialidasa
similar a la de \PhiK1E. El ordenamiento de estos genes indica que
la gama de hospedadores del fago puede ampliarse o modificarse
mediante la adquisición de nuevos genes de la cola por recombinación
natural o tecnológicamente en el laboratorio.
\PhiK5 también es capaz de replicarse en las
cepas K95 de E. coli (28). Puesto que ORF_{P} está en una
posición análoga a la de la endosialidasa de
\PhiK1-5, también se prevé como una proteína de la
cola responsable del crecimiento en cepas K95. Otro fago específico
del antígeno K, \PhiK20, también es capaz de lisar dos tipos
diferentes de hospedadores E. coli, los que poseen el
antígeno K5 y los que poseen el polisacárido K20 (26). Prevemos que
\PhiK20 lleve una proteína K5 liasa similar a la proteína de
\PhiK5/\PhiK1-5 junto con una proteína
hidrolítica de la cola específica de K20. También se han aislado
fagos que son específicos de los antígenos capsulares K3, K7, K12 y
K13 de E. coli. Presumiblemente, estos fagos tienen las
correspondientes proteínas hidrolíticas de la cola específicas de K.
Prevemos otros fagos que tengan múltiples especificidades con otras
combinaciones de antígenos K.
La gama de hospedadores de un bacteriófago se
amplía más allá de E. coli expresando los genes que codifican
las múltiples proteínas de la cola diferentes, siendo una
restricción el conocimiento del mecanismo por el cual la proteína de
la cola se une a la estructura de la cápside de un fago. Se cree que
el extremo N-terminal de la proteína de la cola de
T7 está implicado en la unión (29). Ni la endosialidasa ni la K5
liasa tienen esta región o cualquier otra región similar a cualquier
otra proteína de la cola (o similar entre ellas). Morfológicamente,
\PhiK1E, \PhiK5 y \PhiK1-5 son similares al
fago P22 de Salmonella. La proteína de la cola de P22 se ha
estudiado ampliamente y es también una proteína hidrolítica
implicada en la degradación del antígeno O de Salmonella
typhimurium. Esta proteína es un homotrímero con seis copias por
fago (30). La fibra de la cola gp17 de T7 también es un trímero con
6 copias del trímero por partícula de fago (33). La endosialidasa de
\PhiK1E también es un trímero (20), pero aún tiene que demostrarse
que hay 6 copias del trímero por partícula de fago. El bacteriófago
63D recién caracterizado es otro fago que contiene sialidasa en el
que se ha demostrado mediante microscopía electrónica que la
sialidasa está presente con 6 copias por partícula (21). Este fago
es muy diferente morfológicamente de \PhiK1E, \PhiK5, y
\PhiK1-5 y tiene una cola larga similar a la del
bacteriófago lambda, con la sialidasa localizada en el extremo de la
cola. Seis copias de una proteína de la cola trimérica parecen ser
un motivo estructural general. Asumiendo que la endosialidasa y la
K5 liasa están también ordenadas en seis copias por virión, es
interesante especular cómo se ordenan las dos proteínas de la cola
en la estructura de la cabeza de \PhiK1E. Pueden ordenarse de
forma alterna, con tres copias de cada una (Figura 3a). En el caso
de P22, hay evidencias de que sólo son necesarias tres copias de la
cola para la infección (16), lo que sugiere que este modelo es
teóricamente posible. El hecho de que no haya similitudes de
secuencia comunes entre las dos proteínas de la cola contradice este
modelo, ya que se podría predecir un motivo común dentro de las
proteínas de la cola que se necesitan para unirse a regiones
similares de la estructura de la cabeza. Un modelo alternativo es
que puede haber 6 copias de cada proteína de la cola, unidas una a
la otra (Figura 3b). Puesto que se cree que el extremo
N-terminal de la proteína de la cola de T7 se cree
que está implicado en la unión de la proteína de la cola a la
estructura de la cabeza, esta región de la proteína y regiones
similares de otras proteínas de la cola (o regiones alternativas de
proteínas de la cola que median en la unión de la una a la otra), se
prevé que tengan una función de unión, de este modo, el conocimiento
del mecanismo ya no constituye una restricción.
Nuestros hallazgos indican que los fagos
\PhiK5, \PhiK1E y \PhiK1-5 también comparten
una región de similitud de secuencia antes del extremo 5' de las
proteínas de la cola. Esta región contiene un promotor del fago SP6
de Salmonella. La secuencia de ADN que rodea al promotor
descrita en Nam y col., Gene 1986,46: 57 coincide con la secuencia
análoga en \PhiK1-5. Según esta información,
diseñamos un cebador a partir de esta región para secuenciar después
de la región análoga en el fago \PhiSP6. En la secuenciación de
ADN se identificó un marco de lectura abierto que tiene un alto
grado de similitud de aminoácidos con la proteína de la cola del
fago P22. \PhiP22 es un fago de Salmonella bien
caracterizado que tiene una morfología similar a la de \PhiSP6,
pero que tiene un ciclo vital muy diferente. (\PhiP22 es un fago
lambda de E. coli de tipo lisogénico y \PhiSP6 es de T7 de
tipo lítico, o los tres fagos del antígeno K). La proteína de la
cola de P22 también tiene actividad de degradación de polisacáridos.
Inmediatamente después del gen de la cola de SP6 hay una región
intergénica de 85 pares de bases común para \PhiK5, \PhiK1E y
\PhiK1-5 y poco después el final de la molécula de
ADN. La Figura 4 compara las regiones que codifican las proteínas de
la cola en los cuatro fagos. La proteína de la cola de SP6 está en
la posición análoga a la proteína liasa de
\PhiK1-5 y \PhiK5, y ORF_{L} de \PhiK1E.
\PhiSP6 comparte la estructura en casete de los tres fagos K, lo
que indica que los cuatro están estrechamente relacionados y
difieren principalmente en las proteínas de la cola. Prevemos la
sustitución de la proteína liasa de \PhiK1-5 por
la cola de SP6 para crear un fago que pueda atacar Salmonella
y E. coli K1. Debería ser fácil construirlo mediante
recombinación homóloga con la secuencia común antes de las proteínas
de cola y la secuencia de 85 bases común entre las dos proteínas de
la cola. Una alternativa es crear un fago que pueda atacar
Salmonella, E. coli K2 y E. coli K5 diseñando
una construcción para codificar las tres proteínas. En el caso de
\PhiK1-5, tenemos evidencias de que se desarrolla
una amplia gama de hospedadores mediante la adquisición de una
segunda proteína de la cola específica. De este modo, prevemos
incrementar la gama de hospedadores bajo la teoría de la evolución
modular, en la que duplicaciones y reordenamientos de las regiones
dentro de los genes de las fibras de la cola de diferentes fagos
parecen mediar en los cambios de la especificidad de hospedador,
incluso además diseñar la adquisición de una tercera proteína de la
cola específica, una cuarta proteína de la cola específica y
múltiples proteínas de la cola específicas.
El término "aislado" requiere que un
material se retire de su entorno original (por ejemplo, del entorno
natural si aparecen de forma natural). Por ejemplo, un fago natural
presente en un sistema natural no está aislado, pero el mismo fago,
separado de algunos o de todos los materiales con los que coexiste
en el sistema natural, está aislado.
El término "purificado" no requiere pureza
absoluta; antes bien se pretende que sea una definición relativa con
respecto a la pureza del material en su estado natural. Se contempla
expresamente la purificación de material natural en al menos un
orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes de magnitud, y
más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud.
El término "enriquecido" significa que la
concentración del material es al menos aproximadamente 2, 5, 10, 100
ó 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), de forma
ventajosa, 0,01% en peso. También se contemplan preparaciones
enriquecidas de aproximadamente el 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% en
peso.
La terapia con fagos aprovecha la capacidad del
fago para lisar bacterias. Con el incremento de la incidencia de
bacterias resistentes a antibióticos, existe la necesidad de
contrarrestarlas. La presente invención afronta esa necesidad
superando la desventaja adicional con frecuencia provocada por el
uso de fagos, que es su gama de hospedadores excesivamente
limitada.
Un bacteriófago prototipo tiene una cabeza y una
cola. La cabeza es un icosaedro. La cola tiene un agujero central.
El aparato completo funciona como una jeringa para la inyección del
ADN del fago en el interior de una célula bacteriana. El ciclo vital
consiste en la expresión de los genes virales, el ensamblaje de los
viriones y la lisis celular que libera las partículas infecciosas al
medio. De esta manera, el bacteriófago mata al patógeno
hospedador.
Una forma de evadir una respuesta anticorpal del
hospedador es recubrir la propia bacteria con una cápsula. Una
cápsula es una red de polímeros que está compuesta normalmente de
polisacáridos, pero puede estar compuesta de proteínas o mezclas de
proteína-carbohidrato, y que se asemeja a los
polímeros del tejido del hospedador. En E. coli, actualmente
la Organización Mundial de la Salud reconoce aproximadamente 70
polisacáridos o antígenos de proteína K diferentes.
El bacteriófago tiene una proteína de la cola que
se une a la estructura superficial de una bacteria, mediante la cual
el genoma viral entra en la célula infectada. Algunos bacteriófagos
poseen una proteína de la cola que tiene actividad enzimática que
degrada la cápsula. Estas enzimas facilitan la penetración de la
cápsula de la pared celular por el bacteriófago. En el bacteriófago
específico de K1, la proteína de la cola es una neuraminidasa. En el
bacteriófago específico de K5, la proteína de la cola es una liasa.
En otros bacteriófagos específicos de K, la proteína de la cola es
otra proteína hidrolítica.
La clasificación filogenética indica que las
bacterias gram negativas forman un grupo de bacterias.
Escherichia, Shigella, Enterobacter y
Salmonella son géneros de bacterias que están estrechamente
relacionados los unos con los otros. Yersinia y Vibrio
son los siguientes géneros más estrechamente relacionados con el
grupo de E. coli. Serratia y Klebsiella son los
géneros siguientes más estrechamente relacionados con el grupo de
E. coli. Campylobacter es también un género del filum
Proteobacteria. Los géneros Legionella,
Pseudomonas y Neisseria están menos relacionados. Se
desconoce la relación con Bordetella. Helicobacter es
el género menos relacionado con el grupo de E. coli de
bacterias gram negativas. Las bacterias gram positivas forman otro
grupo, siendo Listeria la más relacionada con los cocos gram
positivos Staphylococcus y Streptococcus,
Enterococcus y Clostridium, que con otros bacilos gram
positivos. Corynebacterium es la más estrechamente
relacionada con Mycobacterium. Las espiroquetas
Treponema y Borrelia forman un tercer grupo
filogenético, mientras que Chlamydia está menos relacionada
con este grupo. A pesar de la diversidad genética representada por
las bacterias patogénicas, se han desarrollado estrategias similares
en tipos muy diferentes de bacterias para superar la defensa de
hospedadores. Nosotros contemplamos el uso de nuestra invención
frente, pero sin limitaciones, a las siguientes bacterias
patogénicas que se presentan en la siguiente tabla.
| Patógeno | Enfermedad | Fago |
| Escherichia | Colitis hemorrágica; Trombocitopenia, síndrome urémico hemolítico | +, ATCC |
| Shigella | Disentería | +, ATCC |
| Salmonella | Tifus | +, ATCC |
| Enterobacter | Infecciones del tracto urinario | +, ATCC |
| Yersinia | Plaga | +, ATCC |
| Vibrio | Cólera, diarrea aguda, rápida deshidratación | +, ATCC |
| Legionella | Enfermedad del legionario: malestar general, mialgia, fiebre, cefalea, | - |
| enfermedad respiratoria | ||
| Pseudomonas | Infecciones oportunistas | +, ATCC |
| Neisseria | Meningitis bacteriana | +, ATCC |
| Bordetella | Pertussis (tos ferina) | +, ref^{a} |
| Helicobacter | Gastritis, úlceras peptídicas, posiblemente cáncer de estómago | +, ref^{b} |
| Listeria | Listeriosis (meningitis) | +, ATCC |
| Staphylococcus | Abcesos, neumonía, endocarditis, choque tóxico | +, ATCC |
| Streptococcus | Fiebre escarlata, fiebre reumática, choque tóxico | +, ATCC |
| Enterococcus | Infecciones del tracto urinario | +, ATCC |
| Clostridium | Tétanos | +, ATCC |
| Corynebacterium | Difteria | +, ATCC |
| Mycobacterium | Tuberculosis: tos, pérdida de peso, lesiones pulmonares; la infección puede | +, ATCC |
| extenderse a otros órganos | ||
| Treponema | Sífilis | +, ref^{c} |
| Borrelia | Enfermedad de Lyme: erupción, fiebre, anomalías neurológicas y cardiacas, artritis | +, ref^{d} |
| Campylobacter | Enteritis por Campylobacter: dolor abdominal, diarrea, fiebre | +, ATCC |
| Chlamydia | Tracoma, infecciones genitales, conjuntivitis, neumonía en el bebé | +, ref^{e} |
| Haemophilus | Fiebre púrpura brasileña: conjuntivitis purulenta, fiebre, vómitos | +, ATCC |
| Serratia | Infección oportunista en neonatos | +, ATCC |
| Klebsiella | Neumonía | +, ATCC |
| \begin{minipage}[t]{155mm} Donde: "+, ATCC" indica la presencia del correspondiente bacteriófago (o bacteriófagos) en la ATCC; "+, ref" indica que la información existente sobre el correspondiente bacteriófago se puede encontrar en la siguiente literatura científica: ref^{a} - Holzmayer TA, y col. 1988 Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A] 269 (2): 147-55; Gol'tsmaier TA, y col. 1987 Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol 5:9-13;\end{minipage} | ||
| ref^{b} - Heintschel von Heinegg E, y col. 1993 J Med Microbiol 38 (4): 245-9; | ||
| ref^{c} - Ritchie AE, y col. 1978 Vet Rec 103 (2):34-5; | ||
| ref^{d} - Eggers CH, y col. 2000 J Mol Microbiol Biotechnol 2 (4):365-73; | ||
| ref^{e} - Hsia R, y col. 2000 Microbes Infect 2(7):761-72; Hsia RC, y col. 2000 Microbiology 146 (Pt 7):1651-60. |
En una realización de la presente invención, un
fago tiene una especificidad de hospedador doble basada en tener dos
proteínas de la cola diferentes. En otra realización, un fago tiene
una especificidad de hospedador triple basada en tener tres
proteínas de la cola diferentes. En una realización adicional, un
fago tiene una especificidad de hospedador cuádruple basada en tener
cuatro proteínas de la cola diferentes. Y así sucesivamente, de modo
que en una realización adicional, un fago tiene una especificidad de
hospedador múltiple según las múltiples proteínas de la cola de
hospedadores diferentes.
En otra realización de la presente invención, un
fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica tiene una
especificidad de hospedador doble basada en tener dos proteínas de
la cola hidrolíticas diferentes. En otra realización de la presente
invención, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica
tiene una especificidad de hospedador triple basada en tener tres
proteínas de la cola hidrolíticas diferentes. En una realización
adicional, un fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica
tiene una especificidad de hospedador cuádruple basada en tener las
cuatro proteínas de la cola hidrolíticas diferentes. Y así
sucesivamente, de modo que en una realización adicional, un fago
que tiene una proteína de la cola hidrolítica tiene una
especificidad de hospedador múltiple según las múltiples proteínas
de la cola hidrolíticas diferentes.
En otra realización de la presente invención, un
fago que tiene una proteína de la cola hidrolítica específica de K
tiene una especificidad de hospedador doble basada en tener dos
proteínas de la cola hidrolíticas específicas de K diferentes. En
otra realización, un fago que tiene una proteína de la cola
hidrolítica específica de K tiene una especificidad de hospedador
triple basada en tener las tres proteínas de la cola hidrolíticas
específicas de K diferentes. En una realización adicional, un fago
que tiene una proteína de la cola hidrolítica específica de K tiene
una especificidad de hospedador cuádruple basada en tener las cuatro
proteínas de la cola hidrolíticas específicas de K diferentes. Y así
sucesivamente, de modo que en una realización adicional, un fago que
tiene una proteína de la cola hidrolítica específica de K tiene una
especificidad de hospedador múltiple según las múltiples proteínas
de la cola hidrolíticas específicas de K diferentes.
Un primer ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador doble es \PhiK1-5. Un
ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador triple
es \PhiK1-5 con una tercera proteína de cola
diferente. Un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de
hospedador cuádruple es \PhiK1-5 con una tercera y
cuarta proteína de la cola diferente. Y así sucesivamente, de modo
que un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador
múltiple es \PhiK1-5 con múltiples proteínas de la
cola de hospedadores diferentes.
Un segundo ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador doble es \PhiK1E con una segunda
proteína de la cola diferente, como K1-5. Un ejemplo
de un fago que tiene una especificidad de hospedador triple es
\PhiK1E con una segunda y tercera proteína de la cola diferente.
Un ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador
cuádruple es \PhiK1E con una segunda, tercera y cuarta proteína de
la cola diferente. Y así sucesivamente, de modo que un ejemplo de un
fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple es \PhiK1E
con múltiples proteínas de la cola de hospedadores diferentes.
Un tercer ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador doble es \PhiK5 con una segunda
proteína de la cola diferente, como K1-5. Un ejemplo
de un fago que tiene una especificidad de hospedador triple es
\PhiK5 con una segunda y tercera proteína de la cola diferente. Un
ejemplo de un fago que tiene una especificidad de hospedador
cuádruple es \PhiK5 con una segunda, tercera y cuarta proteína de
la cola diferente. Y así sucesivamente, de modo que un ejemplo de un
fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple es \PhiK5
con múltiples proteínas de la cola de hospedadores diferentes.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Escherichia y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Shigella y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Salmonella y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Enterobacter y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Yersinia y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Vibrio y que además infecta a una bacteria seleccionada entre
el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Legionella y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Pseudomonas y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Neisseria y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple en función de las proteínas de
la cola de hospedadores diferentes que tiene es un fago que infecta
a Bordetella y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Helicobacter y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Listeria y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Staphylococcus y que además infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Enterobacter,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Enterococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema,
Borrelia, Campylobacter, Chlamydia,
Haemophilus, Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Streptococcus y que además infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Enterobacter,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Enterococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema,
Borrelia, Campylobacter, Chlamydia,
Haemophilus, Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Enterococcus y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Clostridium y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Corynebacterium y que además infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Enterobacter,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Enterococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema,
Borrelia, Campylobacter, Chlamydia,
Haemophilus, Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Mycobacterium y que además infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Enterobacter,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Enterococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema,
Borrelia, Campylobacter, Chlamydia,
Haemophilus, Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Treponema y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Borrelia y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Campylobacter y que además infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo compuesto por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Enterobacter,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Enterococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema,
Borrelia, Campylobacter, Chlamydia,
Haemophilus, Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Chlamydia y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Haemophilus y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Serratia y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
Otro ejemplo de un fago que tiene una
especificidad de hospedador múltiple basada en tener proteínas de la
cola de hospedadores diferentes es un fago que infecta a
Klebsiella y que además infecta a una bacteria seleccionada
entre el grupo compuesto por Escherichia, Shigella,
Salmonella, Enterobacter, Yersinia,
Vibrio, Legionella, Pseudomonas,
Neisseria, Bordetella, Helicobacter,
Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema, Borrelia,
Campylobacter, Chlamydia, Haemophilus,
Serratia y Klebsiella.
En otra realización de la presente invención, un
fago que tiene una especificidad de hospedador múltiple basada en
tener proteínas de la cola de hospedadores diferentes,
adicionalmente tiene un gen que codifica un cofactor que le permite
crecer en otros tipos de bacterias. Una vez que tiene las proteínas
de la cola apropiadas, es necesario que el fago infecte una cepa de
bacterias, como se ilustra mediante los presentes experimentos. Por
ejemplo, un fago que tiene proteínas de la cola de hospedadores
diferentes es capaz de infectar múltiples hospedadores, cuando el
hospedador expresa al menos una de estas proteínas de la cola del
hospedador. Sin embargo, pueden ser necesarios factores adicionales
para que un fago infecte otras cepas de bacterias. La presente
invención proporciona estos fagos cuando también pueden ser
necesarios cofactores para aumentar su gama de hospedadores.
Por ejemplo, el fago lambda de E. coli
generalmente no infecta a Salmonella. El fago lambda de E.
coli necesita un gen Nus A de E. coli funcional para que
lambda promueva la transcripción/anti-terminación
de ADN \rightarrow ARN que permite al virus replicarse y
funcionar. Como la bacteria Salmonella no tiene el gen Nus A
de E. coli, lambda no puede crecer en Salmonella.
Cuando el gen Nus A de E. coli se clona en el genoma de
lambda, este virus puede entonces infectar ciertas cepas de
Salmonella. En un experimento de confirmación, el genoma de
E. coli se cortó en fragmentos con enzimas de restricción y
se clonaron los fragmentos en una biblioteca de lambda. Cuando estos
fagos lambda se sembraron en placas sobre Salmonella, sólo
crecieron las que tenían el gen Nus A de E. coli. De este
modo, el lambda que porta el gen Nus A de E. coli proporciona
un ejemplo de cómo puede ampliarse la gama de hospedadores de un
fago.
En otro ejemplo de fago generalmente que no
infecta a otro tipo de bacterias, puede conocerse el gen que permite
al virus replicarse y funcionar en las bacterias. Si se conoce, el
gen puede clonarse en el genoma viral para que este virus pueda
entonces infectar otros tipos de bacterias. Si no se conoce, el gen
puede identificarse, por ejemplo, cortando el genoma bacteriano en
fragmentos con enzimas de restricción y posteriormente clonando los
fragmentos en una biblioteca de ese virus. Cuando estos fagos se
siembran en placas sobre las bacterias, sólo crecerán las que tienen
el gen. De este modo, se puede identificar el gen que permite al
virus replicarse y funcionar en las bacterias. Una vez conocido el
gen, el virus puede manipularse genéticamente para que lleve el gen.
De este modo, puede ampliarse la gama de hospedadores del fago,
incluso cuando son necesarios cofactores para crecer en otros tipos
de bacterias.
En otra realización de la presente invención, un
fago tiene especificidad por un hospedador mamífero según la
incorporación en el genoma del fago del gen de un ligando de un
receptor de la superficie celular, de modo que se exprese en la cola
del fago, facilitando de ese modo, la endocitosis mediada por
receptor. Poul y col., J Mol Biol 1999, 288:203 y Larocca y col.,
FASEB J 1999, 13:727 describen el suministro de genes a células de
mamíferos mediante bacteriófagos que expresan ligandos de un
receptor de la superficie celular como fusiones genéticas con las
proteínas de la cubierta del fago o que presentan sobre las
cubiertas del fago ligandos de un receptor de la superficie celular,
siendo el objetivo el desarrollo de vectores para terapia génica. La
presente invención prevé la sustitución de proteínas de la cola del
fago.
Un ligando de un receptor de la superficie
celular se fusiona genéticamente con una proteína de la cola del
fago o se presenta en las colas de los fagos de cualquier otra
forma. También pueden modificarse la secuencia nucleotídica que
codifica las fusiones de ligando-fago o de los
propios ligandos de receptor de la superficie celular, mediante
inserción de genes indicadores de mamífero, para comprobar la unión,
internalización y expresión. Finalmente, el gen indicador de
mamífero se sustituye por una secuencia nucleotídica
terapéutica.
La secuencia nucleotídica terapéutica codifica
factor que tiene un efecto terapéutico. En realizaciones
alternativas, un factor es una proteína citocida, antisentido,
ribozima, mutante negativa dominante o terapéutica (por ejemplo, un
factor de crecimiento, una hormona, una citoquina, un receptor o un
ligando). En el documento USP 6.054.312 de Larocca y col. se muestra
un ejemplo de suministro de gen mediado por receptor usando vectores
de despliegue en bacteriófagos de ligandos como fusiones genéticas
con proteínas de la cubierta del fago o presentando ligandos de un
receptor de la superficie celular en las cubiertas del fago.
En una realización diferente, la adquisición de
nuevos genes de la cola se produce mediante recombinación en la
naturaleza. En una realización alternativa, la adquisición de nuevos
genes de la cola se genera tecnológicamente en el laboratorio. De
este modo, el fago puede desarrollarse mediante selección o
manipulación génica.
Se pueden seleccionar fagos que tienen
especificidades múltiples mediante ensayos para determinar la gama
de hospedadores de los fagos, tal como ensayos de formación de
placas.
Alternativamente, los fagos que tienen
especificidades múltiples pueden manipularse genéticamente mediante
la clonación del gen de una proteína de la cola en un sistema de
vector plasmídico y, a continuación, incorporar esta configuración
en el fago de interés por un sistema de recombinación generalizado
in vivo en la bacteria hospedadora del fago de interés; o
mediante clonación del gen de una primera proteína de la cola en un
sistema de vector plasmídico y, posteriormente, clonar el gen de una
segunda proteína de la cola en este vector vehículo mediante la
fusión en marco en el extremo 3' o 5' del gen de la primera proteína
de la cola y, a continuación, incorporar esta configuración en el
fago de interés mediante un sistema de recombinación generalizada
in vivo en la bacteria hospedadora del fago de interés, o
mediante la clonación del gen de una primera proteína de la cola en
un sistema de vector plasmídico y, posteriormente, clonar el gen de
una segunda proteína de la cola en este vector vehículo mediante la
fusión en marco en el extremo 3' o 5' del gen de la primera proteína
y, a continuación, clonar el gen de una tercera proteína de la cola
en este vector vehículo mediante la fusión en marco en el extremo 3'
o 5' de los genes de la primera y segunda proteína de la cola, y así
sucesivamente, y, posteriormente, incorporar esta configuración en
el fago de interés mediante un sistema de recombinación generalizada
in vivo en la bacteria hospedadora del fago de interés.
La presente invención puede aplicarse a lo largo
del espectro de enfermedades bacterianas, seleccionando o
manipulando genéticamente fagos, de manera que se desarrollen fagos
que son específicos de más de una cepa bacteriana de interés. De ese
modo, se desarrolla una matriz completa de bacteriófagos
polivalentes para prácticamente todos los patógenos bacterianos del
hombre, sus mascotas, el ganado y los animales de zoológico (bien
mamíferos, aves o de piscicultura). Entonces, la terapia con fagos
estará disponible:
1) como un complemento o como una sustitución de
antibióticos y/o fármacos quimioterapéuticos que ya no funcionan
como bacteriostáticos o bactericidas debido al desarrollo de
resistencia múltiple a fármacos.
2) como un tratamiento para aquellos pacientes
que son alérgicos a los antibióticos y/o fármacos quimioterapéuticos
que, de otro modo, estarían indicados; y
3) como un tratamiento que tiene efectos
secundarios menores que muchos de los antibióticos y/o fármacos
quimioterapéuticos que, de otro modo, estaría indicado para una
infección determinada.
Otra realización de la presente invención es el
desarrollo de procedimientos para tratar infecciones bacterianas en
animales mediante terapia con fagos con los bacteriófagos
polivalentes descritos anteriormente. Se conocen en la técnica
cientos de bacteriófagos y las especies bacterianas que infectan. La
presente invención puede utilizarse para desarrollar bacteriófagos
polivalentes que pueden usarse para tratar cualquiera o todas las
infecciones causadas por sus bacterias hospedadoras.
Mientras se contempla que la presente invención
puede usarse para tratar cualquier infección bacteriana en un animal
y en un humano, se contempla especialmente que los procedimientos
descritos en este documento serán muy útiles como terapia
(complementaria o independiente) en infecciones causadas por
bacterias resistentes a fármacos. Los expertos informan (véase, por
ejemplo: Gibbons, A., "Exploring New Strategies to Fight
Drug-Resistant Microbes", Science, 21 Ago. 1993,
pág. 1036-38) que en el momento actual, las especies
y cepas bacterianas resistentes a fármacos enumeradas a
continuación, representan la mayor amenaza para la humanidad.
1. Todos los miembros de importancia clínica de
la familia Enterobacteriaceae, más en particular, pero sin
limitaciones, los siguientes:
a) Todas las cepas clínicamente importantes de
Escherichia, más en particular, E. coli. Uno entre
varios fagos de tipo silvestre candidatos frente a estos patógenos
en particular que podría usarse como punto de partida para la
manipulación genética de la presente invención sería
\PhiK1-5 que tiene el Nº de acceso de la ATCC
PTA-3495 (Nota: Con el fin de ser breve, en todos
los ejemplos siguientes de patógenos, el fago de tipo silvestre
correspondiente se indicará mediante la siguiente expresión:
"Ejemplo de fago correspondiente:______________________".)
b) Todas las cepas clínicamente importantes de
Klebsiella, más en particular, K. pneumoniae (Ejemplo
de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
23356-B1).
c) Todas las cepas clínicamente importantes de
Shigella, más en particular, S. dysenteriae (Ejemplo
de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
11456a-B1).
d) Todas las cepas clínicamente importantes de
Salmonella, más en particular, S.
abortus-equi (Ejemplo de fago correspondiente:
fago de la ATCC Nº 9842-B1), S. typhi
(Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
19937-B1), S. typhimurium (Ejemplo de fago
correspondiente: fago de la ATCC Nº 19585-B1), S.
newport (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
27869-B1), S. paratyphi-A
(Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
12176-B1), S. paratyphi-B
(Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
19940-B1), S. potsdam (Ejemplo de fago
correspondiente: fago de la ATCC Nº 25957-B2) y
S. pollurum (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC
Nº 19945-B1).
e) Todas las cepas clínicamente importantes de
Serratia, más en particular, S. marcescens (Ejemplo de
fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
14764-B1).
f) Todas las cepas clínicamente importantes de
Yersinia, más en particular, Y. pestis (Ejemplo de
fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
11953-B1).
g) Todas las cepas clínicamente importantes de
Enterobacter, más en particular, E. cloacae (Ejemplo
de fago correspondiente: fago de la ATCC Nº
23355-B1).
2. Todos los Enterococci de importancia
clínica, más en particular, E. faecalis (Ejemplo de fago
correspondiente: fago de la ATCC Nº 19948-B1) y
E. faecium (Ejemplo de fago correspondiente: fago de la ATCC
Nº 19953-B1).
3. Todas las cepas clínicamente importantes de
Haemophilus, más en particular, H. influenzae (la ATCC
no dispone de un fago correspondiente para este patógeno, pero
pueden obtenerse varios de la OMS o de otros laboratorios que los
ponen a disposición pública).
4. Todas las Mycobacteria de importancia
clínica, más en particular, M. tuberculosis (Ejemplo de fago
correspondiente: fago de la ATCC Nº 25618-B1), M.
avium-intracellulare, M. bovis y M.
leprae. (Los fagos correspondientes a estos patógenos están
disponibles en el mercado de la OMS; a través del Instituto Nacional
de Salud Pública y Protección del Medio Ambiente, Bilthoven, Países
Bajos):
5. Neisseria gonorrhoeae y N.
meningitidis (el fago correspondiente para ambas puede obtenerse
públicamente de la OMS o de otras fuentes).
6. Todas las Pseudomonas de importancia
clínica, más en particular, P. aeruginosa (Ejemplo de fago
correspondiente: fago de la ATCC Nº 14203-B1).
7. Todos los Staplylococci de importancia
clínica, más en particular, S. aureus (Ejemplo de fago
correspondiente: fago de la ATCC Nº 27690-B1) y
S. epidermidis (el fago correspondiente está a disposición
pública a través de la OMS, por medio del Instituto Colindale de
Londres).
8. Todos los Streptococci de importancia
clínica, más en particular S. pneumoniae (El fago
correspondiente puede obtenerse públicamente a partir de la OMS o de
otras fuentes).
9. Vibrio cholera (Ejemplo de fago
correspondiente: fago de la ATCC Nº 14100-B1).
Hay más patógenos bacterianos, demasiado
numerosos para mencionarse que, mientras que actualmente no están en
situación de crisis de resistencia a antibióticos, sin embargo son
candidatos excelentes para el tratamiento con bacteriófagos
polivalentes según la presente invención. De este modo, usando la
presente invención pueden tratarse todas las infecciones bacterianas
causadas por bacterias para las que hay un fago correspondiente.
Cualquier cepa de fago capaz de hacer un daño
directo o indirecto a una bacteria (u otro patógeno), se contempla
como útil en la presente invención. De este modo, serán útiles para
la presente invención los fagos que son líticos, los fagos que son
lisogénicos pero que posteriormente se convierten en líticos y los
fagos no líticos que puede suministrar un producto que será
perjudicial para las bacterias.
Los animales para ser tratados mediante los
procedimientos de la presente invención incluyen, pero sin
limitaciones, el hombre, sus mascotas domésticas, ganado,
piscicultivos y los animales de zoológicos y parques acuáticos.
Los bacteriófagos polivalentes de la presente
invención pueden usarse como terapia independiente o como una
terapia complementaria para el tratamiento de infecciones
bacterianas. Se conocen en la técnica numerosos agentes
antimicrobianos (incluyendo agentes antibióticos y
quimioterapéuticos), que serían útiles para el tratamiento de
infecciones bacterianas en combinación con bacteriófagos
polivalentes. A continuación se enumeran ejemplos de agentes
antimicrobianos adecuados y las infecciones bacterianas que pueden
tratarse con los agentes antimicrobianos especificados. Sin embargo,
la presente invención no se limita a los agentes antimicrobianos
enumerados a continuación, ya que un experto en la materia
fácilmente podría determinar otros agentes antimicrobianos útiles en
combinación con bacteriófagos polivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
| Patógeno | Agente antimicrobiano o grupo antimicrobiano |
| E. coli: | |
| Infección del tracto | trimetoprim-sulfametoxazol (abrev. TMO-SMO) o ampicilina; cefalosporinas de 1^{a} |
| urinario sin complicaciones | generación, ciprofloxacina |
| Infección sistémica | \begin{minipage}[t]{115mm} ampicilina, o una cefalosporina de 3^{a} generación; aminoglicósidos, aztreonam o una penicilina + un inhibidor de la penicilinasa\end{minipage} |
| Klebsiella pneumoniae | \begin{minipage}[t]{115mm} cefalosporinas de 1^{a} generación; cefalosporinas de 3^{a} generación, cefotaxima, moxalactama, amikacina, cloranfenicol\end{minipage} |
| Shigella (varias) | ciprofloxacina; TMO-SMO, ampicilina, cloranfenicol |
(Continuación)
| Patógeno | Agente antimicrobiano o grupo antimicrobiano |
| Salmonella: | |
| s. typhi | cloranfenicol; ampicilina o TMO-SMO |
| especies no typhi | ampicilina; cloranfenicol, TMO-SMO, ciprofloxacina |
| Yersinia pestis | estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol |
| Enterobacter cloacoe | \begin{minipage}[t]{115mm} cefalosporinas de 3^{a} generación, gentamicina o tobramicina; carbenicilina, amikacina, aztreonam, imipenem\end{minipage} |
| Hemophilus influenzae: | |
| Meningitis | cloranfenicol o cefalosporinas de 3^{a} generación; ampicilina |
| Otras infecciones por H. infl. | ampicilina; TMO-SMO, cefaclor, cefuroxima, ciprofloxacina |
| Mycobacterium tuberculosis | isoniazina (INH) + rifampina o rifabutina, dándose la última junto con pirazinami- |
| y M. avium-intracellulare | da +/o etambutol |
| Neisseria: | |
| N. meningitidis | penicilina G, cloranfenicol o una sulfonamida |
| N. gonorrhoeae: | |
| Sensible a la penicilina | penicilina G; espectinomicina; ceftriaxona |
| Resistente a la penicilina | Ceftriaxona; epectinomicina, cefuroxima o cefoxitina, ciprofloxacina |
| Pseudomonas aeruginosa | \begin{minipage}[t]{115mm} tobramicina o gentamicina (+/- carbenicilina, aminoglucósidos); amikacina, ceftazidima, aztreonam, imipenem\end{minipage} |
| Staph. aureus: | |
| no productoras de | penicilina G; cefalosporinas de 1^{a} generación, vancomicina, imipenem, eritromi- |
| penicilinasa | cina |
| Productoras de penicilinasa | \begin{minipage}[t]{115mm} una penicilina resistente a la penicilinasa; cefalosporinas de 1^{a} generación, vancomicina, imipenem, eritromicina\end{minipage} |
| Streptococcus pneumoniae | penicilina G; cefalosporinas de 1^{a} generación, eritromicina, cloranfenicol |
| Vibrio cholera | Tetraciclina; TMO-SMO |
En otra realización de la presente invención, la
bacteria polivalente de la invención se proporciona como
composiciones útiles para el tratamiento y prevención de diversas
infecciones bacterianas, tales como diarrea, disentería, síndrome
urémico hemolítico, infección de vejiga, infección de riñón,
infección del tracto urinario, septicemia, neumonía y meningitis y
otras enfermedades, síndromes y trastornos.
El bacteriófago polivalente de la invención puede
usarse para el tratamiento o prevención de Hemophilus influenzae,
Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus fasciae,
Streptococcus del grupo B, Listeria, Salmonella, E. coli,
Campylobacter, y otras bacterias, y cualquier combinación de las
mismas. Por ejemplo, si hay una infección bacteriana en el tracto
respiratorio superior, la infección puede ser tratada profiláctica o
terapéuticamente con una composición que comprenda al menos un
bacteriófago polivalente específico de esta bacteria y un vehículo
para el suministro del bacteriófago polivalente en la boca, garganta
o fosas nasales. Si un individuo ha estado expuesto a alguna persona
con trastorno respiratorio superior, el bacteriófago polivalente
residirá en la capa mucosa y prevendrá cualquier colonización de la
bacteria infectiva.
Dos ejemplos de bacterias que infectan el sistema
respiratorio superior son Streptococcus pneumoniae y
Hemophilus influenzae. En los últimos años, ha habido un
incremento en el número de personas, especialmente niños y
ancianos, que están infectados o son portadores de Streptococcus
pneumoniae y Hemophilus resistente a la penicilina.
Mientras que estas bacterias normalmente son residentes inocuos del
hospedador, hay organismos oportunistas que son capaces de causar
infecciones cuando está comprometida la resistencia del hospedador.
Eliminando o reduciendo el número de estos organismos en el tracto
respiratorio superior, habrá una reducción proporcional en el
número de infecciones debidas a estas bacterias.
La bacteria Hemophilus se infecta con el
bacteriófago HP1 (un miembro de la familia de fagos similares a P2
con fuertes similitudes con los colifagos P2 y 186, y algunas
similitudes con el retrófago Ec67), que produce una enzima lítica
capaz de lisar la bacteria. Streptococcus pneumoniae se
infecta con el bacteriófago Pa1, que produce una enzima lítica
identificada como una
N-acetil-muramoil-L-alanina
amidasa. La composición farmacéutica de la invención puede contener
un bacteriófago polivalente que reconoce a estas dos bacterias y
puede contener otro bacteriófago polivalente para otras bacterias.
La composición que puede usarse para el tratamiento profiláctico y
terapéutico de una infección por estreptococos, incluye el
bacteriófago polivalente y un medio de aplicación (tal como un
sistema de transporte o un modelo de suministro oral) a la capa
mucosa de la cavidad oral y nasal, de modo que el bacteriófago
polivalente se coloca en el sistema de transporte o en el modo de
suministro oral para que alcance la capa mucosa. Otra infección que
puede tratarse profilácticamente es la debida a Streptococcus
del grupo A, que pueden producir lo que normalmente se conoce como
"faringitis estreptocócica". Los Streptococcos del Grupo
A se infectan con un bacteriófago C1, que produce una enzima
específica para la lisis de Streptococcus del grupo A.
Otro uso de un bacteriófago polivalente de la
invención es para el tratamiento de infecciones bacterianas del
tracto digestivo. El procedimiento para el tratamiento de una
infección bacteriana del tracto digestivo comprende tratar la
infección bacteriana con una composición que comprende una cantidad
eficaz de al menos un bacteriófago polivalente específico para la
bacteria y un vehículo para suministrar dicho bacteriófago
polivalente al tracto digestivo. En una realización preferida de la
invención, las infecciones bacterianas que están siendo tratados
están causadas por bacterias gram negativas seleccionadas entre el
grupo compuesto por Listeria, Salmonella, E.
coli y Campylobacter. Sin embargo, este procedimiento y
composición tratará de forma eficaz otras bacterias, cuando se use
el bacteriófago polivalente apropiado.
Otra composición y uso del bacteriófago
polivalente de la invención es para el tratamiento terapéutico o
profiláctico de infecciones bacterianas de quemaduras y heridas de
la piel. La composición comprende una cantidad eficaz de al menos un
bacteriófago polivalente específico para la bacteria y un vehículo
para suministrar al menos un bacteriófago polivalente a piel dañada.
El bacteriófago polivalente puede aplicarse directamente en un
vendaje o en uno u otro vehículo. El vendaje puede ponerse húmedo o
seco, en donde el bacteriófago polivalente está en la venda en forma
liofilizada. Este procedimiento de aplicación es más eficaz para el
tratamiento de quemaduras. En algunas realizaciones de la invención,
puede incorporarse un bacteriófago polivalente para
Pseudomonas, Staphylococcus y Streptococcus,
conjunta o individualmente en uno u otro vehículo, o en un vendaje
para su uso en pacientes quemados.
Aun otro uso de los bacteriófagos polivalentes es
para las infecciones bacterianas causadas por cepas K1 y/o K5 de
E. coli. Estas bacterias están implicadas en una diversidad
de infecciones, siendo las más comunes las infecciones del tracto
urinario (ITU). El bacteriófago polivalente de la presente invención
se aplicaría directamente al sitio de infección; en el caso de ITU,
esto significaría suministrar el fago en la vejiga mediante un
catéter.
En el caso de septicemias causadas por E.
coli K1, el fago polivalente de la presente invención podría
inyectarse directamente en el sistema circulatorio o por vía
intraperitoneal.
En caso de meningitis causada por E. coli,
el fago polivalente de la presente invención se suministrará en el
líquido cefalorraquídeo o se aplicará directamente en el cerebro o
en las meninges.
Aún otro uso de los bacteriófagos polivalentes de
la invención es para el tratamiento terapéutico o profiláctico de
infecciones vaginales. Este tratamiento comprende tratar la
infección vaginal con una cantidad eficaz de al menos un
bacteriófago polivalente específico de esta bacteria, en el que este
bacteriófago polivalente se incorpora en un vehículo para colocarlo
en la vagina. El vehículo preferido es un tampón, o una ducha
vaginal. También puede usarse como vehículo una compresa, aunque no
es tan eficaz. Mientras que usando esta composición y procedimiento
puede tratarse cualquier número de bacterias, se cree que el uso más
óptimo de esta composición y procedimiento de tratamiento sería del
tratamiento de una infección por E. coli y Streptococcus
B. Las infecciones vaginales causadas por Streptococcus
del Grupo B pueden causar meningitis del neonato que tiene como
resultado un daño cerebral y muerte prematura. El bacteriófago
polivalente incorporado en tampones, específico para estreptococos
del grupo B, eliminaría los organismos del grupo B sin alterar la
flora normal, de modo que las mujeres no sufrirían infecciones por
levadura tras la terapia antibiótica. El uso del bacteriófago
polivalente en la vagina proporcionaría un efecto profiláctico
mejor, aunque su uso terapéutico también sería aconsejable.
Otro uso de la invención es para el tratamiento
profiláctico y terapéutico de infecciones oculares. El procedimiento
de tratamiento comprende administrar un colirio que contiene una
cantidad eficaz de al menos un bacteriófago polivalente específico
para la bacteria y un vehículo capaz de aplicarse de forma segura en
un ojo, con el vehículo que contiene el bacteriófago polivalente. En
algunas realizaciones de la invención, las bacterias tratadas son
Hemophilus o Staphylococcus. Los colirios están en
forma de una solución isotónica.
También puede usarse el bacteriófago polivalente
para luchar contra la caries dental. Específicamente, puede
incorporarse un bacteriófago polivalente específico para
Streptococcus mutans a una pasta dentífrica o colutorio. De
forma similar, este bacteriófago polivalente también puede
incorporarse a una goma de mascar o a una gragea. Puede usarse
cualquier otro vehículo que permita la exposición de la boca, encías
y dientes al bacteriófago polivalente.
Las vías de administración incluyen, pero sin
limitaciones, la vía oral, aerosol, intranasal, intravenosa,
intramuscular, intraperitoneal, intratecal, vaginal, rectal, tópica,
punción lumbar y aplicación directa en el cerebro o en las
meninges. Los excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden
usarse como vehículo para el suministro del fago serán aparentes
para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el fago libre podría
estar en forma liofilizada y disolverse justo antes de la
administración mediante inyección IV. Se contempla que la
dosificación de la administración esté comprendida en el intervalo
de aproximadamente 10^{6} a aproximadamente 10^{13} ufp/por
kg/por día y, preferiblemente, aproximadamente 10^{12} ufp/por
kg/por día. Los fagos se administran hasta que se logra la
eliminación con éxito de las bacterias.
Con respecto a la administración de un aerosol a
los pulmones, el bacteriófago polivalente se incorpora en una
formulación de aerosol diseñado específicamente para la
administración a los pulmones por inhalación. Muchos de estos
aerosoles son conocidos en la técnica, y la presente invención no se
limita a ninguna formulación en particular. Un ejemplo de este
aerosol es el inhalador Proventil^{TM} fabricado por
Schering-Plough, cuyo propulsor contiene
tricloromonofluorometano, diclorodifluorometano y ácido oleico. Las
concentraciones de los ingredientes del propulsor y emulsionantes se
ajustan, si es necesario, según el fago que se está usando en el
tratamiento. El número de fagos que se administran por tratamiento
con aerosol estará en el intervalo de 10^{6} a 10^{13} ufp, y
preferiblemente de 10^{12} ufp.
\PhiK1-5 se aisló usando como
hospedador E. coli ATCC 23506 (K5). Las fotografías de
microscopía electrónica muestran que \PhiK1-5 es
morfológicamente similar a la familia Podoviridae, que
incluye los colifagos T7, T3 y los fagos SP6 y P22 de
Salmonella. Las partículas de fago constan de una cabeza
icosaédrica de aproximadamente 60 nm de diámetro con un pequeño
penacho de fibras de la cola cortas (Figura 1).
\PhiK1-5 es muy lítico. Cuando se añadió el fago a
un cultivo logarítmico de un hospedador susceptible a una
multiplicidad de infección (mdi) de 1:1, se produjo la lisis en
15-20 minutos. El número de viriones producidos por
las células se determinó mediante una curva de crecimiento de una
etapa y se encontró que era de aproximadamente 110. Las placas de
\PhiK1-5 eran claras y grandes, de aproximadamente
4,0-5,0 mm de diámetro, con un halo de
aproximadamente 12,0-15,0 mm de diámetro en placas
de LB agar. Las placas alcanzaban un tamaño límite después de 24
horas. Por el contrario, las placas de T7 pueden continuar creciendo
durante varios días (38). Se aisló el ADN a partir de un gradiente
de densidad de cloruro de cesio del fago purificado por extracción
con fenol. La digestión del ADN con varias enzimas de restricción
indicaba que es de cadena doble, con un tamaño estimado de 40
kb.
La gama de hospedadores de
\PhiK1-5 se comparó con la de \PhiK1E
(específico del antígeno K1) y \PhiK5 (específico del antígeno
K5). Las cepas de E. coli, ATCC 23506 y ATCC 23508, poseen la
cápsula de polisacárido K5, y las cepas ATCC 23503 y ATCC 23511
poseen la capsula de K1. También se analizó un grupo de cepas K5
recogidas por Ian Roberts de la Universidad de Manchester y un
grupo de aislados K1 recogidos por Richard Silver de la Universidad
de Rochester (Tabla 1). \PhiK1-5 es capaz de
infectar y crecer en todas las cepas K1 y K5, \PhiK1E sólo crece
en las cepas K1 y \PhiK5 sólo crece en las cepas K5. Se analizó
también el crecimiento de \PhiK1E, \PhiK5 y
\PhiK1-5 en las siguientes cepas del ATCC: 23502
(K4), 23504 (K8), 23505 (K9), 23507 (K10), 23509 (K11), 23510 (K14),
23515 (K17), 23516 (K20), 23517 (K13), 23518 (K18), 19110 (K7),
19138 (K2) y 31616 (K35). En ninguna de estas cepas se observó
crecimiento de \PhiK1-5, \PhiK1E o \PhiK5.
| Gamas de hospedadores de los fagos \PhiK1E, \PhiK5, \PhiK1-5, \PhiK1-5_{(K1^{-})} y \PhiK1-5_{(K5^{-})}{}^{a} | ||||||
| Cepa de E. coli | Antígeno K | \PhiK1-5 | \PhiK1E | \PhiK5 | \PhiK1-5_{(K1^{-})} | \PhiK1-5_{(K5^{-})} |
| ATTC 23503 | K1 | + | + | - | - | + |
| ATCC 23511 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS164 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS166 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS167 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS168 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS176 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS179 | K1 | + | + | - | - | + |
| Gamas de hospedadores de los fagos \PhiK1E, \PhiK5, \PhiK1-5, \PhiK1-5_{(K1^{-})} y \PhiK1-5_{(K5^{-})}{}^{a} | ||||||
| Cepa de E. coli | Antígeno K | \PhiK1-5 | \PhiK1E | \PhiK5 | \PhiK1-5_{(K1^{-})} | \PhiK1-5_{(K5^{-})} |
| RS180 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS188 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS203 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS215 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS218 | K1 | + | + | - | - | + |
| RS228 | K1 | + | + | - | - | + |
| ATCC 23506 | K5 | + | - | + | + | - |
| ATCC 23508 | K5 | + | - | + | + | - |
| 20026 | K5 | + | - | + | + | - |
| 21195 | K5 | + | - | + | + | - |
| 21386 | K5 | + | - | + | + | - |
| 21786 | K5 | + | - | + | + | - |
| 21795 | K5 | + | - | + | + | - |
| 21831 | K5 | + | - | + | + | - |
| 21832 | K5 | + | - | + | + | - |
| 21834 | K5 | + | - | + | + | - |
| 21835 | K5 | + | - | + | + | - |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{158mm} Se hicieron ensayos de formación de placas para determinar la gama de hospedadores frente a una colección cepas K1 y K5 de E. coli. \Phi K1E sólo crece en cepas K1, \Phi K5 sólo crece en cepas K5 y \Phi K1\text{-}5 crecen en ambas. \Phi K1\text{-}5_{(K1^{-})} y \Phi K1\text{-}5_{(K5^{-})} son mutantes defectivas de \Phi K1\text{-}5 para el crecimiento en las cepas K1 y K5, respectivamente.\end{minipage} |
Debido a la similitud de la secuencia promotora
entre \PhiK1-5 y SP6, ensayamos si
\PhiK1-5 podía crecer en la cepa LT2 de
Salmonella typhimurium (el hospedador de SP6) y si SP6 podía
crecer en cualquiera de los aislados de E. coli sensibles a
\PhiK1-5. SP6 no crecía en ninguna de las cepas de
E. coli y, de igual modo, \PhiK1-5 no
crecía en Salmonella typhimurium.
\PhiK1E y \PhiK5 comparten una región de
similitud de secuencia por delante de las proteínas de la cola
(incluyendo el promotor similar a SP6, 3). Puesto que
\PhiK1-5 tienen similitudes estructurales,
biológicas y de hospedadores con estos dos fagos, supusimos que los
tres podrían estar estrechamente relacionados y compartir esta
similitud de secuencia por delante. Diseñamos un cebador basado en
la secuencia de esta región en \PhiK1E y \PhiK5 para determinar
la secuencia antes del extremo 5' del promotor. El cebador hibridaba
cuando se usaba el ADN de \PhiK1-5 como molde, y
fuimos capaces de generar la secuencia. Continuamos secuenciando
después del extremo 3' por desplazamiento del cebador. La secuencia
inmediatamente después del promotor era muy similar a la de
\PhiK5 y codificaba un marco de lectura abierto con un alto grado
de similitud de secuencia (>92% de identidad de aminoácidos) con
la de ésta proteína de la cola de \PhiK5. La secuenciación
continuada después del extremo 3' reveló un segundo marco de
lectura abierto que era prácticamente idéntico (>97% de
identidad de aminoácidos) a la proteína endosialidasa de \PhiK1E.
Entre el codon de terminación del gen de la liasa y el codon de
inicio del gen de la endosialidasa se encuentra una región
intergénica de 85 pares de bases. Esta región también está presente
en \PhiK5, inmediatamente después del gen K5 liasa y también en
\PhiK1E, inmediatamente antes del extremo 5' del gen de la
endosialidasa e inmediatamente después del extremo 3' de un marco
de lectura abierto de 111 aminoácidos (ORF_{L}, 6). No se encontró
ningún promotor reconocible en esta región, pero hay dos regiones
de potente simetría que pueden actuar como terminador
transcripcional independiente de Rho. Se determinó la secuencia de
598 pares de bases después del extremo 3' del codon de terminación
del gen de la endosialidasa, en cuyo punto se alcanzó el extremo de
la molécula de ADN. No se encontraron marcos de lectura abiertos en
esta área.
También se determinó en
\PhiK1-5 la secuencia de 500 pares de bases por
delante del gen K5 liasa. Al igual que en los otros fagos, aparece
un promotor similar a SP6 que probablemente, es necesario para la
transcripción de los genes de la cola. La secuencia antes del
extremo 5' comparte un elevado grado (> 90%) de identidad con la
de la región análoga en \PhiK5 y \PhiK1E.
También secuenciamos por detrás del gen de la
endosialidasa de \PhiK1E; 718 pares de bases después del extremo
3' desde el codon de terminación de la endosialidasa llegamos al
final de la molécula de ADN. Hay poca similitud de secuencia entre
esta región y la región análoga de \PhiK1-5.
Abordamos la cuestión de si las partículas
\PhiK1-5 contenían ambas proteínas de la fibra de
la cola o si tras la infección, se producían dos poblaciones de
partículas (una que contenía la K5 liasa y la otra que contenía la
endosialidasa). Hicimos una preparación de fagos usando como
hospedador ATCC 23506 (K5) y determinamos su valor sobre ATCC 23506
(K5) y ATCC 23503 (K1) (Tabla 2). A continuación se incubó una
muestra del fago con ATCC 23506 durante 5 min, que es tiempo
suficiente para que el fago se una y, posiblemente, inyecte el ADN,
pero no para la producción de nuevas partículas de fago. El MDI era
de 1/100 partículas de fago/bacteria. A continuación, la mezcla se
filtró rápidamente. Las partículas de fago que se habían unido a las
células se eliminarían con la filtración. Después, se valoró el
filtrado tanto en la cepa K1 como en K5. Si la preparación del fago
fuera inicialmente una mezcla de dos poblaciones, entonces sólo se
unirían y eliminarían los que expresaban la K5 liasa. El fago
restante principalmente sería el que contenía la endosialidasa
específica de K1, y por tanto, el valor sería más alto en las cepas
K1 de E. coli que en la cepa K5. Por otro lado, si cada una
de las partículas del fago contuviera ambas proteínas de la cola,
los valores del fago remanente en el filtrado sería el mismo en las
dos cepas, es decir, los niveles de los fagos que contienen la K5
liasa no se reducirían de forma selectiva. Encontramos que éste
último era el caso y concluimos que cada virión tenían tanto la K1
endosialidasa como la K5 liasa. Se vieron resultados similares en
los experimentos recíprocos en los que se realizó la incubación
durante 5 min usando la cepa K1 de E. coli (Tabla 2). Como
controles, realizamos los experimentos tanto con \PhiK1E como con
\PhiK5, usando ambas cepas para la incubación. Los valores de
\PhiK1E se redujeron el 99% por preincubación con la cepa K1, pero
no con la cepa K5, y los valores de \PhiK5 se redujeron de forma
similar tras la preincubación con la cepa K5, pero no con la cepa
K1.
| Experimentos de preincubación para demostrar que todas las partículas \PhiK1-5 | |
| contienen ambas proteínas de la cola^{a} | |
| Fago | Valor |
| \PhiK1-5 | |
| Preincubado con 23506 | 5,2 x 10^{8} |
| Valorado en 23506 tras la preincubación | 3,1 x 10^{6} |
| Valorado en 23503 tras la preincubación | 3,7 x 10^{6} |
| Preincubado con 23503 | 5,2 x 10^{8} |
| Valorado en 23506 tras la preincubación | 6,8 x 10^{6} |
| Valorado en 23503 tras la preincubación | 6,4 x 10^{6} |
| \PhiK5 | |
| Preincubado con 23506 | 4,0 x 10^{8} |
| Valorado en 23506 tras la preincubación | 8,5 x 10^{5} |
| Preincubado con 23503 | 4,0 x 10^{8} |
| Valorado en 23506 tras la preincubación | 3,3x 10^{8} |
| \PhiK1E | |
| Preincubado con 23506 | 7,7 x 10^{8} |
| Valorado en 23503 tras la preincubación | 6,8 x 10^{8} |
| Preincubado con 23503 | 7,7 x 10^{8} |
| Valorado en 23503 tras la preincubación | 3,0x 10^{6} |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{150mm} La preincubación de \PhiK1-5 con ATCC 23503 (K1) o ATCC 23506 (K5) durante 5 min dio lugar a una pérdida de aproximadamente 100 veces en las partículas del fago cuando se valoró cada cepa. Si la preparación del fago está compuesta de dos poblaciones que contienen cada una sólo una proteína de la cola, entonces, los valores tras la incubación se reducirían sólo en la cepa que se usa en la preincubación. Los valores de \PhiK5 se reducen mediante la preincubación con un hospedador permisivo (23506) pero no con un hospedador no permisivo (23503). Los valores de \PhiK1E también se reducen sólo mediante preincubación con un hospedador permisivo (23503) y no con un hospedador no permisivo (23506).\end{minipage} |
Se usó un césped mixto de cepas K1 y K5 de E.
coli para seleccionar mutantes \PhiK1-5 de
crecimiento defectuoso o en una u otra cepa hospedadora. Las formas
\PhiK1-5 aclaran las placas de césped mixto de K1
y K5 de E. coli; los mutantes en cada cola daría lugar a
placas turbias debido al crecimiento del hospedador no permisivo.
Los fagos se trataron con el mutágeno hidroxilamina y se sembraron
sobre placas en un césped doble. Las placas turbias se
identificaron, picaron y purificaron por aislamientos de placas
múltiples en el césped doble. A continuación, estos se
seleccionaron ensayando el crecimiento en cada cepa de forma
individual. De los ocho aislados purificados, tres eran incapaces
de formar placas en la cepa K5, pero pudieron formar placas en la
cepa K1. Uno de estos, \PhiK1-5_{(K5^{-})}, se
seleccionó por crecimiento frente a la colección completa de
hospedadores y se encontró que era incapaz de replicarse en
cualquiera de las cepas K5, pero era capaz de crecer en todas las
cepas K1 (Tabla 1). Cinco de los aislados podían seguir replicándose
tanto en las cepas K1 como en las K5, pero en las de las cepas K5
daba una morfología de placas turbias.
Ninguno de los mutantes aislados de esta forma
tenían crecimiento defectuoso en las cepas K1, de modo que ideamos
un esquema de selección/amplificación para enriquecer los que se
replican en hospedadores K5 pero no en K1. Se amplificaron aquellos
fagos mutagenizados en una cepa K5, se filtraron para retirar los
restos de bacterias y, a continuación, se usaron para infectar
durante 5 min una cepa K1 en crecimiento logarítmico. Esta mezcla
se filtró rápidamente antes de que tuviera lugar la lisis de la
célula que libera los fagos. El fago capaz de crecer en la cepa K1
se uniría a las células y se eliminaría por filtración. A
continuación, la muestra se reamplificó en la cepa K5 y se repitió
el ciclo ocho veces. Esto permite seleccionar totalmente fagos que
puede replicarse en hospedadores K5 pero no en hospedadores K1. Los
valores del filtrado eran 200 veces mayores en la cepa K5 que en la
cepa K1. Se picaron varios y se purificaron mediante rondas
múltiples de aislamiento de placa única. Un aislado,
\PhiK1-5_{(K1^{-})}, se caracterizó más en
profundidad y se encontró que era incapaz de crecer en ninguna de
las cepas K1 (Tabla 1).
Clarke y col. describieron una secuencia parcial
de un marco de lectura abierto (ORP_{p}) en \PhiK5
inmediatamente después de la región de 85 bases común a los tres
fagos (6). Continuamos secuenciando por delante y encontramos que
el marco de lectura abierto completo es de 523 aminoácidos. Una
búsqueda con BLAST reveló una región pequeña de similitud de
secuencia con el componente IIABC de la
N-acetilglucosamina-permeasa próxima
al extremo N-terminal. No tenía similitud de
secuencia significativa con ninguna otra entrada de la base de datos
o cualquier otra de las proteínas de la cola descritas aquí. Se
determinó la secuencia de 163 bases adicionales después del extremo
3', en cuyo punto se llegaba al final de la molécula de ADN.
En la Figura 2 se comparan las regiones que
codifican las proteínas de la cola en los tres fagos.
\PhiK1-5 tiene una proteína K5 liasa en la misma
posición que la de \PhiK5. \PhiK1E tiene en esta posición un
marco de lectura abierto de 111 aminoácidos (ORF_{L}) de función
desconocida. Inmediatamente después, los tres fagos tienen una
región intergénica de 85 bases que tiene dos ejes binarios de
simetría. Inmediatamente después del extremo 3' de esta región,
\PhiK1-5 codifica su proteína endosialidasa, que
está en la posición análoga a la endosialidasa de \PhiK1E.
\PhiK5 codifica en esta posición un marco de lectura abierto
(ORF_{P}) de 523 aminoácidos. Los tres fagos comparten similitud
de secuencia por delante de los genes de la cola. No se ha
apreciado similitud de secuencia por detrás y, en los tres fagos, la
molécula de ADN termina después del extremo 3'.
\PhiK1-5 se aisló de aguas
residuales sin procesar usando la técnica de formación de placas.
Brevemente, se centrifugó una muestra de 1 l de aguas residuales a
6000 rpm en un rotor GSA para retirar el material sólido y, a
continuación, se pasó a través de un filtro de nitrocelulosa de 0,45
micrómetros (Nalgene). Se añadieron 100 \mul del filtrado a 200
\mul de un cultivo de una noche de E. coli ATCC 23506 (K5)
cultivadas en medio LB. Se añadieron 3 ml de agar blando de
superficie atemperado y fundido (5 g/l de agar en LB) y la mezcla
se sembró sobre una placa de LB agar y se incubó a 37ºC durante una
noche. Al día siguiente, las placas se picaron y se volvieron a
sembrar 3 veces sobre placas para asegurar la pureza del cultivo.
Los aislados finales de la placa se almacenaron como un tapón de
agar a partir de una pipeta Pasteur, depositado en 1 ml de tampón
SM (MgSO_{4} 10 mM, NaCl 100 mM, gelatina al 0,01%, Tris 50 mM, pH
7,5).
Inicialmente, se seleccionó una gama de
hospedadores distribuyendo 10 \mul de tampón SM que contenían un
tapón sobre un césped de una cepa apropiada. La gama de
hospedadores de los fagos aislados de interés se confirmó
adicionalmente mediante el ensayo de formación de placas. Todas las
valoraciones del fago se hicieron mediante la técnica de ensayo de
formación de placas.
Los fagos se prepararon mediante el procedimiento
de gradiente de densidad de cloruro de cesio. Se creció 1 l de un
hospedador apropiado en medio de cultivo LB, hasta una D.O. 600 de
entre 0,4 a 0,6 a 37ºC con agitación a 200 rpm. Los fagos se
añadieron a una mdi de 1 fago/100 bacterias, y se dejó incubar el
cultivo durante un mínimo de 30 min hasta que se alcanzó la D.O. Se
añadieron 10 ml de cloroformo, se mantuvo la agitación durante 10
min y a continuación, se centrifugó durante 20 min a 6000 rpm en un
rotor GSA para retirar los restos de células. Se recogió el
sobrenadante y se añadió 1/10 del volumen de NaCl 5M y 1/10 p/v de
polietilénglicol para precipitar el fago; éste se mantuvo a 4ºC
durante una noche. A continuación, el fago se sedimentó por
centrifugación a 6000 rpm en un rotor GSA a 4ºC. El sedimento se
resuspendió en solución salina tamponada con fosfato y se añadió
CsCl a una densidad de 1,5 g/ml. La muestra se centrifugó en un
rotor Ti80 (Beckman) a 34.000 rpm durante una noche. La banda del
fago se extrajo con una jeringa y se dializó frente a solución
salina tamponada con fosfato (pH 7,4).
El ADN se aisló del fago purificado por CsCl
mediante la extracción con bifenol/cloroformo. El ADN del fago se
usó directamente como molde para secuenciar el ADN, lo que se llevó
a cabo en Commonwealth Biotechnologies en Richmond, VA. Se
secuenciaron ambas cadenas (de la región del gen de la cola de
\PhiK1-5). Las búsquedas en bases de datos de ADN
se hicieron mediante BLAST (1) y el alineamiento de secuencias se
realizó con el Paquete Wisconsin (9).
El fago purificado por cesio se mutagenizó con
luz U.V., usando un transiluminador chromatovue modelo TM 36 (UVP,
Inc.). Los fagos se expusieron típicamente durante
10-20 s, lo que reducía la viabilidad 1000 veces. A
continuación, los fagos mutagenizados se amplificaron en ATCC 23503
o en ATCC 23506 y se sometieron a una selección y amplificación
como se ha descrito anteriormente. Los fagos también se
mutagenizaron por incubación con hidroxilamina 400 mM hasta que el
valor del fago se redujo 100 veces. A continuación, se sembraron
sobre placas en un césped doble de ATCC 23503 y ATCC 23506. Se
picaron las placas turbias, se pusieron de nuevo sobre placas para
su aislamiento y se ensayó su crecimiento frente a una colección de
cepas de E. coli K1 y K5.
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<110> EL GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE
AMÉRICA REPRESENTADO POR LA SECRETARÍA DEL DEPARTAMENTO DE SALUD Y
SERVICIOS HUMANOS
\hskip0.98cmMERRIL, CARL L.
\hskip0.98cmADHYA, SANKAR L.
\hskip0.98cmSCHOLL, DEAN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> BACTERIÓFAGO QUE TIENE UNA GAMA DE
HOSPEDADORES MÚLTIPLE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NIH205.001VPC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US
60/220-987
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
25-07-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago K1-5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fago SP6 de Salmonella
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>div_características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(2211)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago K1-5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> div_características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(9643)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14226
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago K1-5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>div_características
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)…(14226)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
Claims (27)
1. Una composición farmacéutica que comprende un
fago que tiene especificidad de hospedadores múltiple basada en
múltiples proteínas de la cola de diferentes hospedadores y un
excipiente farmacéuticamente aceptable, teniendo dicho fago
múltiples proteínas de la cola hidrolíticas diferentes.
2. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, teniendo dicho fago múltiples proteínas de la
cola hidrolíticas diferentes específicas de K.
3. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, comprendiendo dicho fago el genoma de longitud
completa de \PhiK1E.
4. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, comprendiendo dicho fago el genoma de longitud
completa de \PhiK5.
5. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, comprendiendo dicho fago el genoma de longitud
completa de \PhiK20.
6. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Escherichia
y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
7. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Shigella y
adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
8. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Salmonella
y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
9. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Yersinia y
adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
10. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Vibrio y
adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
11. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Legionella
y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
12. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Pseudomonas
y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
13. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Neisseria y
adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
14. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Bordetella
y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
15. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Helicobacter
y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
16. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Listeria y
adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
17. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a
Staphylococcus y adicionalmente infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo formado por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio,
Legionella, Pseudomonas, Neisseria,
Bordetella, Helicobacter, Listeria,
Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y
Borrelia.
18. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a
Streptococcus y adicionalmente infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo formado por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio,
Legionella, Pseudomonas, Neisseria,
Bordetella, Helicobacter, Listeria,
Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y
Borrelia.
19. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Clostridium
y adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
20. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a
Corynebacterium y adicionalmente infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo formado por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio,
Legionella, Pseudomonas, Neisseria,
Bordetella, Helicobacter, Listeria,
Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y
Borrelia.
21. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a
Mycobacterium y adicionalmente infecta a una bacteria
seleccionada entre el grupo formado por Escherichia,
Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio,
Legionella, Pseudomonas, Neisseria,
Bordetella, Helicobacter, Listeria,
Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium,
Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema y
Borrelia.
22. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Treponema y
adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
23. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que dicho fago infecta a Borrelia y
adicionalmente infecta a una bacteria seleccionada entre el grupo
formado por Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia, Vibrio, Legionella,
Pseudomonas, Neisseria, Bordetella,
Helicobacter, Listeria, Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium,
Mycobacterium, Treponema y Borrelia.
24. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, teniendo dicho fago además un gen que codifica un
factor que permite a dicho fago replicarse y funcionar en otro tipo
de bacterias, generalmente no infectadas por dicho fago.
25. Un procedimiento para fabricar una
composición farmacéutica que comprende:
(a) aislar un fago según la reivindicación 1, en
el que la adquisición de nuevos genes de la cola se produce
mediante recombinación en la naturaleza; y
(b) combinar dicho fago con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
26. Un procedimiento para fabricar una
composición farmacéutica que comprende:
(a) generar un fago según la reivindicación 1, en
el que la adquisición de nuevos genes de la cola se genera
tecnológicamente en el laboratorio; y
(b) combinar dicho fago con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
27. Uso de la composición farmacéutica de
cualquiera de las reivindicaciones 1-26 para la
preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de
infección bacteriana.
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