CN112143747B - 一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种噬菌体裂解酶及其基因重组表达载体与应用，其中，所述噬菌体裂解酶表达基因为SEQ ID NO：1的核苷酸序列，所述核苷酸序列可通过构建重组载体并在宿主细胞中表达噬菌体裂解酶，纯化得到的噬菌体裂解酶具有较强的体内外杀菌活性，其作用迅速，对机体安全无害，所述噬菌体裂解酶可以很好的对治多重耐药性志贺氏菌感染，同时对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等病原菌也有一定的抑制作用；所述噬菌体裂解酶在28‑42℃范围内具有良好的裂解菌体活性，这些特性使得所述噬菌体裂解酶在制备耐药感染性疾病药剂方面具有广阔的前景，可成为常规抗生素的替代品或补充品。

Description

一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用

技术领域

本发明涉及噬菌体应用技术领域，尤其涉及一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用。

背景技术

自二十世纪四十年代在临床实践中引入抗生素以来，其在治疗人类和动物细菌感染等方面发挥了巨大作用。但随着抗生素的滥用，导致几乎所有细菌病原体中不受控制的耐药性决定簇快速出现和扩散，当前很多细菌感染对绝大多数传统抗生素来说都变得高度难治。

细菌耐药性是指细菌对各种抗菌药物的不敏感性，即对外来抗菌药物产生的抵抗力，使其疗效变差甚至失去作用。细菌耐药性主要分为两种类型：一种是由基因遗传介导的，称为内在抗性或先天抗性，它取决于细菌的结构或化学成分；另一种则相反，它来自于后天与抗菌药物之间的相互作用，从而改变了自身的新陈代谢或靶向位点而出现的耐药性，这种细菌的自我保护机制也称为获得性耐药。通常，对抗菌药物敏感的细菌数量远大于耐药细菌的数量，但是由于滥用抗生素杀死大量非耐药菌株，这为耐药细菌的扩散提供了前提条件。同时，细菌的耐药性不仅仅是对单一药物的抗性，而是随着耐药性的发展和传播，多重耐药性逐渐出现，从而使得预防和对治耐药性细菌感染越来越困难。

在当前各种耐药菌株，甚至“超级细菌”不断出现的严峻背景下，探索并开发可以替代或补充抗生素的新型安全抗菌剂就显得尤为重要和迫切。研发抗生素替代技术及相关产品是无抗养殖时代最迫切的需求，也是未来细菌感染性疾病预防和治疗的重要发展方向。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用，旨在解决现有技术缺乏有效预防和对治耐药性细菌感染的问题。

本发明的技术方案如下：

一种噬菌体裂解酶基因，其中，所述噬菌体裂解酶表达基因为SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

所述噬菌体裂解酶表达基因，其中，所述噬菌体裂解酶表达基因从长尾科噬菌体PDS9中分离得到。

一种基因重组表达载体，其包括本发明所述的噬菌体裂解酶表达基因。

一种宿主细胞，其包括本发明所述的重组表达载体。

一种噬菌体裂解酶，其中，所述噬菌体裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的多肽。

一种噬菌体裂解酶的应用，其中，将本发明所述的噬菌体裂解酶用于制备杀灭耐药性志贺氏菌的药剂。

所述噬菌体裂解酶的应用，其中，所述药剂为液剂。

所述噬菌体裂解酶的应用，其中，所述药剂中噬菌体裂解酶的含量不低于10μg/mL。

有益效果：本发明提供了一种来源于长尾科噬菌体PDS9且能杀灭耐药性志贺氏菌的裂解酶和编码此酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过构建重组载体并在基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)中表达，纯化得到的噬菌体裂解酶可以很好的对治多重耐药性志贺氏菌感染，同时对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等病原菌也有一定的抑制作用；所述噬菌体裂解酶在28-42℃范围内具有良好的裂解菌体活性，具有潜在的临床应用价值。

附图说明

图1是本发明噬菌体裂解酶P9ly基因PCR产物电泳示意图，其中M代表Marker，泳道1为阴性对照，泳道2为基因P9ly PCR产物，其大小为489bp。

图2是本发明中重组质粒pET28a-P9ly双酶切图谱示意图，其中M代表Marker，泳道1为重组质粒pET28a-P9ly未经双酶切产生的条带，泳道2为重组质粒pET28a-P9ly双酶切后产生的两个条带。

图3为利用本发明的噬菌体裂解酶P9ly基因构建的大肠杆菌重组表达载体pET28a-P9ly图谱,该重组载体经双酶切和测序验证，连接正确。

图4是本发明中噬菌体裂解酶P9ly的蛋白诱导表达及纯化检测电泳图，其中泳道1为蛋白Marker，泳道2为未诱导表达菌株超声破碎液，泳道3为诱导后表达菌株超声破碎液，泳道4为诱导后表达菌株超声破碎后的上清液；泳道5为纯化后的蛋白；纯化得到的目的裂解酶约为18kDa。

图5是本发明中温度对噬菌体裂解酶P9ly活性的影响分析图。

图6是本发明中不同pH值对噬菌体裂解酶P9ly活性的影响分析图。

图7是本发明中裂解酶P9ly在不同浓度、不同作用时间对其宿主－多重耐药性志贺氏菌BDS9的杀菌活性验证图。

图8是本发明中裂解酶P9ly对多重耐药性志贺氏菌BDS9、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、副溶血弧菌(ATCC7587)、大肠杆菌(CMCC(B)44102)等菌株生长的抑制效果图；其中1为0.1mg/mL Kan⁺，2为PBS，3为0.056mg/mL裂解酶P9ly，4为0.112mg/mL裂解酶P9ly。。

具体实施方式

本发明提供一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

噬菌体(Bacteriophages或Phages)是一类能特异性识别并感染细菌的病毒，其专一性地以细菌为宿主进行复制和繁殖，对人和动物无害。噬菌体裂解酶(Phage lyticenzymes，PLEs)是双链DNA噬菌体感染后期编码的、依靠宿主菌合成的一类蛋白类水解酶，它们可以快速水解细菌细胞壁肽聚糖，导致菌体裂解并释放出子代噬菌体。由于噬菌体裂解酶不同于抗生素类药物(主要靶向细菌的合成通路)，而是降解、消化细菌的细胞壁，所以具有安全高效，制备容易，并且不会产生像抗生素一样严重耐药性等特点。

噬菌体裂解酶在结构上具有相似性和一定的保守性，大部分噬菌体裂解酶含有2个结构域：N端结构域具有催化活性，能特异地切断肽聚糖中的化学键；C端结构域具有结合细菌细胞壁的功能，能与细菌细胞壁上肽聚糖底物特异性结合；N端与C端通过一段小肽连接起来。噬菌体在与宿主菌共同进化的成千上万年里，随着宿主菌的进化，噬菌体也会不断进行相应的进化，而其裂解酶为噬菌体裂解宿主菌并释放子代噬菌体所必需，故产生噬菌体裂解酶耐药的可能性极小，这与裂解酶主要靶向宿主菌细胞壁肽聚糖即细菌结构组成所必需有关。目前没有证据证明使用裂解酶能导致细菌产生抗性，喷雾、口服、注射等动物模型试验也显示裂解酶没有明显对机体产生损害。

基于当前各种耐药菌株不断出现和使用抗生素预防、治疗细菌性感染变得越来越困难的严峻背景，本发明提供了噬菌体裂解酶基因，其从长尾科噬菌体PDS9中分离得到，所述噬菌体裂解酶表达基因为SEQ ID NO：1的核苷酸序列，所述核苷酸序列长度为489bp(碱基)；进一步地，本发明还提供了该表达基因编码后的噬菌体裂解酶，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的多肽。

本发明提供的所述噬菌体裂解酶具有较强的体内外杀菌活性，其作用迅速，对机体安全无害，所述噬菌体裂解酶可以很好的对治多重耐药性志贺氏菌感染，同时对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等病原菌也有一定的抑制作用。所述噬菌体裂解酶在28-42℃范围内具有良好的裂解菌体活性，这些特性使得所述噬菌体裂解酶在制备耐药感染性疾病药剂方面具有广阔的前景，可成为常规抗生素的替代品或补充品。

在一些实施方式中，本发明还提供了一种表达载体，其是将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列直接与质粒、病毒或运载体连接所构建的重组载体。

在一些实施方式中，本发明还提供一种宿主细胞，其含有本发明所述含有该噬菌体裂解酶P9ly基因的重组表达载体。作为举例，所述宿主细胞可以为大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)。

在一些实施方式中，还提供一种噬菌体裂解酶的应用，其将本发明所述的噬菌体裂解酶用于制备杀灭耐药性志贺氏菌的药剂。

在一些具体的实施方式中，将所述噬菌体裂解酶用于制备杀灭耐药性志贺氏菌的液剂，所述药剂中噬菌体裂解酶的含量不低于10μg/mL。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中所用方法如无特殊说明均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明均采用常规试剂或为按常规方法配置的试剂。

实施例1

噬菌体裂解酶P9ly基因的克隆

1、裂解酶基因的扩增，(以Shigella BDS9对应的裂解性噬菌体PDS9基因组DNA为模板)。

(1)噬菌体PDS9裂解酶基因P9ly的扩增所用引物序列包括SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4，其中，SEQ ID NO：3为正向引物：5'-CATGCCATGGCAATGGATATTTTTGATATGTTACG-3'；SEQID NO：4为反向引物：5'-CGGAATTCTCTATAAGCAGCCCATGTGC-3'。其中，正向引物和反向引物下划线部分分别代表NcoI、EcoRI酶切位点。

(2)扩增反应体系如下：

表1 PCR扩增反应体系组分

(3)扩增条件如下：

将反应体系混匀，先在94℃预变性10min，然后在94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃延伸10min。反应完后取产物10μL，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析(见图1)，裂解酶基因PCR产物大小为489bp。

2、裂解酶基因P9ly PCR产物的胶回收纯化

(1)在电泳仪中灌制1.0％琼脂糖凝胶；

(2)将待分离纯化的PCR产物点样电泳，于适当位置停止电泳；

(3)在紫外灯下切下含该目的片断的凝胶，转移到1.5mL的Ep管中；

(4)用Star Prep快速DNA胶回收试剂盒进行目的片段的回收。

实施例2

重组表达载体pET28a-P9ly的构建

为了把目的基因片断连接到表达载体pET28a，需要使目的片断带有粘性末端的片断，即带有酶切位点。

1、带有粘性末端线性载体pET28a的制备

为了将目的基因片断连接到表达载体pET28a上，就需要使目的片断带有粘性末端的片断，即带有酶切位点。同样，为了使目的片断能插入载体中，也需要使载体带有粘性末端，并且使它们的酶切位点相同。

(1)质粒抽提：用质粒提取试剂盒(百泰克)，操作步骤如下：

①菌种活化：无菌接种环蘸取-80℃冻存的菌种保存液，平板划线法接种于Kan⁺LB平板，37℃过夜培养；

②增菌并收集菌体：取Kan⁺5μL(终浓度100μg/mL)加入5mL LB培养基中；用接种环挑取阳性克隆，接种于Kan⁺-LB培养基中；然后放入37℃培养箱中，摇床培养，过夜；去3mL培养的菌液，5000rpm，室温离心5min，使菌体沉淀，弃上清液；

③用250μL溶液P1(含RNA酶)重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮；

④加250μL的溶液P2，温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮；

⑤加400μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-10次，室温放置5分钟，室温13,000rpm离心10分钟，小心取上清；

⑥将吸附柱安置于收集管上，将上一步所得上清液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中，溶液太多分可分两次加入)，13000rpm离心1分钟，弃滤液；

⑦加入500μL去蛋白液PE，13,000rpm离心60秒，弃滤液；

⑧加入500μL漂洗液WB，13,000rpm离心60秒，弃滤液；

⑨重复步骤⑧一次，13,000rpm离心60秒，弃滤液，空柱13000rpm离心2分钟，室温放置3-5分钟，除去残留乙醇；

⑩取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB(60℃预热)，室温放置1分钟，13000rpm离心1分钟洗脱质粒。

(2)裂解酶P9ly基因片段的双酶切

①酶切体系如下：

表2酶切反应体系组分

②酶切条件：37℃金属浴酶切1h，回收酶切后的目的基因片段和pET28a质粒。

(3)载体连接、转化和阳性克隆挑选以及双酶切验证

将前面实验得到的带有粘性末端的线性载体pET28a和P9ly裂解酶基因片段，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定(见图2)及测序验证，即可得到重组表达载体，如图3所示。

实施例3

裂解酶P9ly重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达和酶活测定

将构建好的重组表达载体pET28a-P9ly转化大肠杆菌BL21(DE3)，含重组质粒的菌株经培养过夜，菌液按1％比例接种到Kan⁺(终浓度50μg/mL)的LB液体培养基，37℃摇床培养至其OD值0.6-0.8；取出4mL菌液用作对照实验；向余下的菌液中加入乳糖(终浓度为1mg/mL)，置于37℃，150rpm摇床诱导培养10小时，取样5mL。

1、裂解酶P9ly蛋白SDS-PAGE检测

将取出的5mL菌液，9000rpm，离心10min，弃上清，加入终浓度为30mM咪唑溶液悬浮菌体，超声波破碎菌体(功率36％，打3s，停4s，共5min)，取破碎液13000rpm，离心10min，上清即为目的蛋白；配制SDS-PAGE胶，浓缩胶5％，分离胶15％；按照顺序上样进行电泳(浓缩胶80V，40min；分离胶120V，80min)，电泳结束进行染色，之后将SDS-PAGE胶取出，加入R250考马斯亮蓝染色液，振荡过夜进行脱色并拍照分析(见图4)。

2、裂解酶P9ly重组蛋白的纯化

利用上述方法大量诱导含重组质粒pET28a-P9ly的BL21(DE3)菌株，菌液经离心收集大肠杆菌菌体(4℃，9,000g，10min)。用30mM咪唑溶液悬浮菌体后进行超声波破碎，4℃，10,000g离心10min，上清用镍柱进行手动纯化，先用10倍柱体积ddH₂O清洗柱子，再用10倍柱体积30mM咪唑平衡柱子，样品上柱，用10倍柱体积30mM咪唑洗脱柱子，再用10倍柱体积50mM咪唑洗脱柱子，用10倍柱体积ddH₂O清洗柱子，最后用20％无水乙醇填充柱子，用超滤离心管透析酶液，加12mL pH为7.4的磷酸缓冲液于超滤管内管预清洗(4℃，6,000g，离心30min)，上样(4℃，6,000g，离心30min)，加12mL pH为7.4的磷酸缓冲液进行超滤(4℃，6,000g，离心30min)，重复3次，内管无液体后，加适量pH为7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打吸出，加入2％的NaOH于内管中浸泡一段时间，用于溶解半透明上的蛋白，最后加入20％无水乙醇保护超滤离心管。纯化的重组蛋白组分进行SDS-PAGE检测(见图4)。

3、裂解酶P9ly的浓度及活性测定

(1)BCA蛋白质定量试剂盒测定裂解酶P9ly重组蛋白的浓度

BCA(Bicinchoninic Acid)测定方法的原理是利用Cu²⁺在碱性条件下，可被蛋白质还原成Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂结合形成紫色络合物，通过测定样品在562nm波长下的吸光值同蛋白标准曲线对比，即可算出待测样品蛋白浓度。

取96孔板，按顺序标号，分别加入标准蛋白溶液(0.5mg/mL的标准蛋白BSA溶液)、待测样品、空白对照，向各孔加入200μL BCA工作液，混匀。用酶标仪测590nm波长(或540-590nm)下的吸光度值。以蛋白浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。计算公式：待测样品蛋白浓度(mg/mL)＝测定样品的OD₅₉₀值/标准蛋白的OD₅₉₀值x标准蛋白的浓度x稀释倍数得标准曲线方程为：y＝1.1246x+0.0078(R²＝0.9956)，将纯化后得裂解酶P9ly测其590nm波长下吸光度值，测得OD值为0.134，计算得到蛋白浓度为0.112mg/mL。

(2)Folin酚法测定裂解酶P9ly对酪蛋白水解活性

①标准曲线制备

取干净的50mL离心管，按顺序标号，空白、标1、标2、标3、标4、标5，将100ug/mL酪氨酸(mL)标准液与不同体积的ddH₂O配成不同标准浓度，总体积为10mL。分别吸取上述不同浓度的酪氨酸溶液1mL，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，再加入购买的福林试剂1mL；摇匀后放置于40℃水浴锅中，保温发色20min，测量OD₆₈₀值并记录：得到标准曲线方程y＝0.0034x+0.0061(R²＝0.9936)。

酶活计算公式Y＝(A×N)/(v×t)，其中：Y：样品的酶活力，单位U/mL；A：样品测得的OD值，代入标准曲线后计算得到的酪氨酸含量；N：样品的稀释倍数；v：反应试剂的总体积，mL；t：反应时间，以l min计；酶活单位定义：在一定温度和pH条件下，1mL酶液在1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活单位，以U/mL表示。

②酶活测定

吸取样品稀释液1mL，置于40℃水浴锅中预热2min，然后加入经同样预热的2％酪蛋白1mL，精确保温5min，时间到后，立即加入0.4mol/L的三氯乙酸2mL，以终止反应，继续置于水浴锅中保温20min，使得残余蛋白质沉淀。注射器吸取含有沉淀的溶液，将溶液使用0.45μm滤膜过滤，然后吸取滤液1mL，再加入0.4mol/L碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂l mL混匀，40℃保温发色20min后进行光密度(OD)测定。测定结果：OD₆₈₀值为0.587，代入标准曲线方程y＝0.0034x+0.0061(R²＝0.9936)计算得到酪氨酸含量170.85μg，将所得酪氨酸含量值代入公式Y＝(A×N)/(v×t)计算得到酶活为8.54U/mL。

实施例4

噬菌体裂解酶P9ly基本酶学性质及杀菌活性实验

1、裂解酶P9ly最适作用温度、pH值及金属离子对P9ly的影响

为研究最适作用温度，pH值及金属离子对P9ly的影响，采用培养至对数期的噬菌体PDS9宿主菌-志贺氏菌BDS9的菌液，洗涤3次后收集菌体进行超声波破碎，破碎后制备获得志贺氏菌BDS9的细胞壁，以其细胞壁碎片作为P9ly的反应底物，研究其最适催化温度、pH以及金属离子对其活性的影响。

(1)裂解酶P9ly的最适催化温度

将纯化的裂解酶P9ly加入制备好的志贺氏菌BDS9细胞壁底物中，分别置于4℃、15℃、28℃、37℃、42℃、50℃反应30min，根据反应前后OD600的变化量计算相对活性，确定其最适催化温度，如图5所示，其催化温度范围为28-42℃，在37℃催化活性最高。

(2)裂解酶P9ly的最适催化pH

将纯化的裂解酶P9ly加入制备好的志贺氏菌BDS9底物中，分别在不同pH值的磷酸盐缓冲液中，相同温度(最适作用温度)下，作用时间30min，根据反应前后OD600的变化量计算相对活性，确定其最适pH，如图6所示，其最适催化pH为7.0-8.5。

(3)常见金属离子对裂解酶P9ly的影响

将纯化的裂解酶P9ly加入制备好的噬菌体PDS9宿主菌-志贺氏菌BDS9底物中，混合液中加入不同金属离子K⁺、Na⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺，并保持离子浓度为0.01mol/L，相同温度(最适作用温度)，作用时间30min，根据反应前后OD600的变化量确定金属离子对其的影响，结果所示K⁺、Na⁺对P9ly活力有促进作用，Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺具有明显抑制作用。

表3金属离子对裂解酶P9ly活性的影响

离子	对照	K<sup>+</sup>	Na<sup>+</sup>	Mg<sup>2+</sup>	Zn<sup>2+</sup>	Mn<sup>2+</sup>	Ca<sup>2+</sup>
								OD600	0.372	0.387	0.413	0.357	0.439	0.478	0.569
△OD600	0.014	0.031	0.050	-0.014	0.011	-0.066	-0.073

2、裂解酶P9ly对多重耐药性志贺氏菌BDS9及其他菌株生长的影响

(1)将志贺氏菌BDS9培养到OD≈0.6，收集菌体。首先进行多重耐药性分析，结果如表4所示。然后进行超声波破碎，破碎后制备获得细菌志贺氏菌BDS9的细胞壁碎片作为P9ly的反应底物，将反应底物与不同浓度的裂解酶P9ly混匀后吸取200μL于96孔板中，放入37℃恒温摇床培养，在0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min时测OD600值(见图7)，以反应底物与PBS的混合液作为阴性对照。结果表明反应10min后便达到较好的裂解效果，P9ly浓度为50μg/mL时OD600读值由0.591下降到0.362，浓度为30μg/mL时OD600读值由0.589下降到0.382，浓度为10μg/mL时OD600读值由0.590下降到0.425，可见P9ly能明显抑制志贺氏菌BDS9菌株的生长。

表4志贺氏菌BDS9多重耐药性分析

抗生素	抑菌圈直径d(mm)	敏感性
			氨苄西林	12	++
头孢噻肟	26	+++
			庆大霉素	12	++
阿米卡星	21	+++
			链霉素	21.5	+++
四环素	7.5	-
			环丙沙星	15	++
磺胺甲恶唑	0	-
			阿莫西林	10.5	++
氯霉素	0	-

注：结果判定标准d>20mm为高度敏感；10<d≤20mm为中度敏感；d≤10mm为耐药；d＝0为完全耐药。

(2)采用牛津杯法测裂解酶P9ly对耐药性志贺氏菌BDS9以及其他菌株的抑制作用，先用双层平板法培养耐药性志贺氏菌BDS9、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、副溶血弧菌(ATCC7587)、大肠杆菌(CMCC(B)44102)，在未长出菌膜之前在平板上用镊子摆放好牛津杯，向牛津杯中加入200μL裂解酶P9ly酶液(蛋白含量为0.056mg/mL，0.112mg/μL)，阳性对照为等量的0.1mg/mL的Kan+溶液，阴性对照为等量的PBS，于37℃恒温培养箱培养过夜后观察，耐药性志贺氏菌BDS9、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、副溶血弧菌(ATCC7587)、大肠杆菌(CMCC(B)44102)经裂解酶P9ly处理后均能产生明显的抑菌圈，如图8的A-D所示。

综上所述，本发明提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的噬菌体裂解酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞生产噬菌体裂解酶P9ly，具有产物特异性高、生产周期短、不受场地、气候、季节影响及利用不同菌种和培养基开发商业化噬菌体裂解酶等优点；本发明应用基因工程技术构建特异性生产噬菌体裂解酶P9ly的转基因大肠杆菌，具有操作简单，成本低、可行性高等优点，为噬菌体裂解酶的工业化生产应用奠定基础；本发明通过构建重组载体并在基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)中表达所得到的裂解酶P9ly，可以很好的对治多重耐药性志贺氏菌感染，同时对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等病原菌也有一定的抑制作用。该噬菌体裂解酶在28-42℃范围内具有良好的裂解菌体活性，值得进一步的推广应用。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

<110> 昆明理工大学

<120> 一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用

<160> 4

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

atggatattt ttgatatgtt acgtcaagac gaaggtcttg atttaaatct ttataaagac 60

actgaaggtt attggactat tggtattggc caattgatta ctaagaaccc ttctaaagat 120

gttgctcgtg ctgaacttga taagcttatg ggtcgagttt gtaatggtcg tattactatg 180

gctgaagccg agcaactctt taatcgatcg gttgaaaatg ctcgtagagc tattctgcgt 240

aatcctaaat tgaaacctgt ttatgatgta ttggacgaag ttcgtcgttg tgcactgatt 300

aatatggtat tccaaatggg tgaagcaggt gtagcagggt tcactaactc tttacgtatg 360

ctccaacaga aacgttggaa cgatgcagca gttaacctgg ctcaatcccg ttggtataaa 420

caaactccta atcgtgctaa gcgtgttatc gccaccttta aaaccggcac atgggctgct 480

tatagataa 489

<210> 2

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

Met Asp Ile Phe Asp Met Leu Arg Gln Asp Glu Gly Leu Asp Leu Asn

1 5 10 15

Leu Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Trp Thr Ile Gly Ile Gly Gln Leu

20 25 30

Ile Thr Lys Asn Pro Ser Lys Asp Val Ala Arg Ala Glu Leu Asp Lys

35 40 45

Leu Met Gly Arg Val Cys Asn Gly Arg Ile Thr Met Ala Glu Ala Glu

50 55 60

Gln Leu Phe Asn Arg Ser Val Glu Asn Ala Arg Arg Ala Ile Leu Arg

65 70 75 80

Asn Pro Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Val Leu Asp Glu Val Arg Arg

85 90 95

Cys Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Glu Ala Gly Val Ala

100 105 110

Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asn Asp

115 120 125

Ala Ala Val Asn Leu Ala Gln Ser Arg Trp Tyr Lys Gln Thr Pro Asn

130 135 140

Arg Ala Lys Arg Val Ile Ala Thr Phe Lys Thr Gly Thr Trp Ala Ala

145 150 155 160

Tyr Arg

162

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

catgccatgg caatggatat ttttgatatg ttacg 35

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

cggaattctc tataagcagc ccatgtgc 28

Claims (7)

1.一种噬菌体裂解酶的编码基因，其特征在于，所述噬菌体裂解酶的编码基因的核苷酸序列如序列SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组表达载体，其包括权利要求1所述的噬菌体裂解酶的编码基因。

3.一种宿主细胞，其包括权利要求2所述的重组表达载体。

4.一种噬菌体裂解酶，其特征在于，所述噬菌体裂解酶由权利要求1所述的噬菌体裂解酶的编码基因编码得到，所述噬菌体裂解酶的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求4所述的噬菌体裂解酶在用于制备杀灭耐药性志贺氏菌(Shigella)药剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药剂为液剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药剂中噬菌体裂解酶的含量不低于10µg/mL。

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