CN111856005A

CN111856005A - 牛支原体分泌蛋白MbovP280的应用

Info

Publication number: CN111856005A
Application number: CN202010571847.0A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 赵刚; 伊赫萨努拉·希拉尼; 陈颖钰; 胡长敏; 陈曦; 陈建国
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: CN111856005B

Abstract

本发明公开了牛支原体分泌蛋白MbovP280在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，属于动物传染病防治技术领域。所述牛支原体分泌蛋白MbovP280具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，试验证明，牛支原体分泌蛋白MbovP280具有诱导宿主巨噬细胞活力下降和凋亡的能力，在研发新药和疫苗方面具有重要潜力。

Description

牛支原体分泌蛋白MbovP280的应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体分泌蛋白MbovP280的应用，该蛋白具有诱导宿主巨噬细胞活力下降和凋亡的能力。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种能在体外复制的最小病原微生物。牛支原体可以感染任何年龄的牛，2～6月龄的犊牛最易感(Stipkovits et al 2000)，肉牛发病后临床症状主要表现为肺炎、关节炎，奶牛主要表现为乳房炎。牛支原体感染犊牛后往往难以治愈，与机体免疫系统对抗平衡后转成慢性病。当牛支原体病发生后，又会导致机体的免疫力下降，其他条件致病菌如A型多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、呼吸道合胞体病毒等会乘机感染宿主加重临床症状，协同导致牛呼吸疾病综合征(Bovine respiratory diseases,BRD)(Radellie et al 2008)。

自从牛支原体从患乳房炎的乳汁中分离到后(Hale et al 1962)，牛支原体在世界范围内广泛流行。2008年，在湖北省从外地引进的肉牛中爆发呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，率先在全国确定该病为“传染性牛支原体肺炎”。此后牛支原体肺炎呈全国性流行，主要发生在新引入的育肥牛中，一般在引入后10～15天左右发病，发病率为80％以上。该病临床治疗效果差，死亡率高，平均死亡率为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。

细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，宿主细胞用来维持正常的细胞更替、胚胎发育和限制病原体的生存和繁殖。目前关于牛支原体诱导宿主巨噬细胞凋亡的机制研究还不清楚，而这一生物学过程对于牛支原体在机体内持续感染的意义还有待研究。参考结合分枝杆菌弱毒株诱导宿主巨噬细胞凋亡升高后产生保护性免疫反应，我们认为MbovP280蛋白具有制备免疫制剂的潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体MbovP280蛋白在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，该蛋白具有诱导宿主巨噬细胞活力下降和凋亡的能力。

为了实现本发明的目的，申请人所在的农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体基因组中筛选出Mbov_0280基因，通过实验验证该基因编码的MbovP280蛋白可以在体外环境下诱导牛巨噬细胞活力下降和凋亡。参考结合分枝杆菌弱毒株诱导宿主细胞凋亡后提升机体免疫保护力的研究，我们认为MbovP280是研发新药和疫苗的重要潜在靶点。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovisHB0801，本发明首先利用生物信息学工具预测牛支原体HB0801基因组中分泌脂蛋白，选取12个预测的分泌脂蛋白进行克隆表达纯化，通过检测各个蛋白刺激牛巨噬细胞和鼠巨噬细胞后的细胞活力，筛选出可以诱导巨噬细胞活力降低的MbovP280。Annexin-FITC/PI流式分析MbovP280蛋白可以诱导巨噬细胞凋亡。克隆过程中，根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行了基因修饰，以保证其在大肠杆菌中表达。

经过人工突变后的牛支原体基因Mbov_0280的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO:1的1-1020位碱基所示的序列，其长度为1020bp。

该牛支原体MbovP280蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，共编码339个氨基酸。

将本发明的牛支原体Mbov_0280基因的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30a-Mbov_0280转化大肠杆菌DH5α得到重组大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0280，Escherichia coli pET-30a-Mbov_0280。该菌株在IPTG诱导下，表达Mbov_0280基因编码的重组蛋白MbovP280。

经过验证，本发明纯化的重组蛋白MbovP280具有诱导牛巨噬细胞活力下降和凋亡的功能。

本发明所述的牛支原体rMbovP280诱导牛巨噬细胞凋亡的作用，包括下列步骤：

利用CCK-8试剂盒检测5个脂蛋白刺激牛巨噬细胞和鼠巨噬细胞24小时后的细胞活力，实验结果显示仅rMbovP280可以引起牛巨噬细胞和鼠巨噬细胞细胞活力降低，且引起牛巨噬细胞活力降低的能力高于诱导鼠巨噬细胞活力降低的能力。

利用Annexin-FITC/PI流式分析rMbovP280蛋白引起牛巨噬细胞凋亡的能力，实验结果发现将0.25μM、0.5μM、1μM的rMbovP280蛋白和牛巨噬细胞在37℃孵育24小时后，都可以检测到巨噬细胞的凋亡，其中1μM的rMbovP280蛋白刺激牛巨噬细胞24小时后细胞凋亡率为85.8％。

本发明具有以下优点：

1、本发明的牛支原体rMbovP280蛋白是从6个纯化的重组蛋白中筛选出的，相比其他5个蛋白rMbovP280可以引起牛和小鼠两种巨噬细胞细胞活力降低。

2、本发明利用流式细胞术验证出MbovP280蛋白可以诱导BoMac细胞凋亡。

因此该重组蛋白在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中具有广泛的应用前景。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是实施例中空质粒pET-30a的质粒图谱。pET-30a为商业化质粒，购自Novagen公司。

图2：是本发明制备的重组质粒pET-30a-Mbov_0280的图谱。重组质粒pET-30a-Mbov_0280是由pET-30a质粒和突变后的Mbov_0280基因全长经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

图3：是纯化的牛支原体rMbovP280诱导巨噬细胞活力降低。附图标记说明：4μg各个蛋白刺激1×10⁴个巨噬细胞24h后细胞活力的检测。RAW：小鼠单核巨噬细胞；BoMac：牛巨噬细胞。t检验使用GraphPad软件分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，“ns”表示无差别。

图4：是牛支原体MbovP280诱导牛巨噬细胞凋亡。附图标记说明：A：rMbovP280蛋白刺激BoMac细胞24h后Annexin-FITC/PI流式分析图；B：rMbovP280蛋白刺激BoMac细胞24h后凋亡细胞百分率。

具体实施方式

实施例1：牛支原体MbovP280蛋白的表达

1.牛支原体Mbov_0280基因克隆表达

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在本发明中牛支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体基因进行突变，使密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到牛支原体地方分离株，将其命名牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801，本发明以牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为CP002058)中的Mbov_0280基因为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，对该基因的核苷酸序列进行优化，将优化后的序列送公司合成。

回收Mbov_0280基因的扩增产物，用Xho I和BamH Ⅰ酶切，同时将pET-30a质粒(图1)(购自默克中国有限公司)用Xho I和BamH Ⅰ进行双酶切。将酶切后的Mbov_0280基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4 DNA ligase)(购自NEB公司)连接，得到重组质粒pET-30a-Mbov_0280(图2)。用该重组质粒pET-30a-Mbov_0280转化大肠杆菌DH 5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌BL21，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3小时。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液(1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

将本发明的蛋白的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30a-Mbov_0280转化到大肠杆菌DH5α中得到重组大肠杆菌，申请人将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0280；Escherichia coli pET-30a-Mbov_0280。

2.牛支原体MbovP280重组蛋白的纯化

将重组的大肠杆菌BL21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自上海罗氏制药有限公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定MbovP280蛋白大部分表达于上清中。

rMbovP280蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mL washing buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mL elute buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

实施例2：牛支原体rMbovP280功能验证

使用CCK-8方法检测不同蛋白刺激细胞24h后的细胞活力。以每孔1×10⁴个BoMac或者RAW细胞接种于96孔板中，37℃，5％CO₂培养至贴壁，设置空白孔(无细胞)和对照孔(只有细胞)，每组设定3个重复孔；置于37℃，5％CO₂孵育过夜，倒置显微镜下观察。取出细胞板，每孔加入4μg rMbovP280蛋白，37℃，5％CO2静置共培养24h，每孔加入10μL CCK-8(日本同仁),37℃，5％CO2孵育1h,测定450nm各孔的吸光值，按照以下公式计算各孔的细胞活力，即细胞活力％＝(OD_{加蛋白细胞}-OD_空白)/(OD_{无蛋白对照}-OD_空白)×100％。实验结果显示实验结果表明4μg MbovP280蛋白刺激1×10⁴RAW264.7细胞(p<0.05)和1×10⁴BoMac细胞(p<0.001)24h后细胞的活力均降低(图3)。

将BoMac细胞接种于6孔板中，每孔细胞为5×10⁵，37℃，5％CO2孵育过夜，至细胞完全贴壁。PBS洗涤细胞3次，换新鲜的细胞完全培养基，向培养的细胞中加入rMbovP280蛋白，使其终浓度分别为0.25μM，0.5μM，1μM，同时设置PBS处理组为阴性对照，凋亡诱导剂(购自碧云天生物技术有限公司)处理组为阳性对照，每个处理组重复3次，按照Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)说明书操作，使用500μLBinding Buffer(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)重悬细胞沉淀，加入5μL FITC染料(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，各管吹打混匀，再加入5μL PI染料(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，再次吹打混匀，1h内经流式细胞仪上机检测。实验结果显示MbovP280蛋白刺激24h后可以引起BoMac细胞凋亡，蛋白浓度为1umol/L时可以诱导85.8％细胞凋亡(图4)。

附录：说明书中名词术语说明：

牛支原体MbovP280重组蛋白以rMbovP280表示；

牛支原体MbovP280蛋白的编码基因以Mbov_0280表示；

牛支原体本地分离株以牛支原体HB0801表示。

<110> 华中农业大学

<120> 牛支原体分泌蛋白MbovP280的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1020

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 1

atgaagatga accggaaaat tctgtttagc attagcgcca ttagctccgt ggcaaccgtg 60

ccgctgctgg cagcaaaatg tggaaatacc cagggactgg ataaagtgat taaaacgctg 120

aatttaggcg aaatcaacgt ttatgaagac ttaaaactgg ataccccggg tgaaaaacat 180

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gttgcaaaac cgaaagatgg tagcaaagaa gcagaaatta gcattgattt tagcaattaa 1020

<210> 2

<211> 339

<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 2

Met Lys Met Asn Arg Lys Ile Leu Phe Ser Ile Ser Ala Ile Ser Ser

1 5 10 15

Val Ala Thr Val Pro Leu Leu Ala Ala Lys Cys Gly Asn Thr Gln Gly

20 25 30

Leu Asp Lys Val Ile Lys Thr Leu Asn Leu Gly Glu Ile Asn Val Tyr

35 40 45

Glu Asp Leu Lys Leu Asp Thr Pro Gly Glu Lys His Ile Leu Asn Ala

50 55 60

Leu Ala Lys Ala Asn Asp Thr Lys Glu Val Lys Ile Asp Leu Ser Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ala Lys Asp Ile Lys Ser Thr Gly Ala Val Ile Glu Ala Lys

85 90 95

Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Ser Gly Arg Ile Gln Val Thr Phe Thr Ser

100 105 110

Lys Lys Val Lys Arg Val Asp Ile Ser Thr Val Lys Lys Glu Asn Leu

115 120 125

Ser Gly Ile Ser Asn Tyr Thr Gly Val Lys Glu Met Ala Thr Ile Leu

130 135 140

Arg Lys Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu Ser Glu Lys Asp Ile Thr Ile

145 150 155 160

Thr Leu Asp Ser Ala Ala Thr Asn Asp Lys Glu Gly Lys Leu Ile Val

165 170 175

Ile Ser Asn Pro Asp Ser Glu Asn Ile Phe Gly Lys Leu Glu Ile Val

180 185 190

Leu Pro Lys Leu Ala Pro Leu Gly Asn Asn Val Lys Leu Val Ser Glu

195 200 205

Tyr Ile Thr Lys Phe Lys Ala Gln Ala Lys Lys Met Glu Asp Asn Leu

210 215 220

Arg Asn Ile Thr Lys Trp Glu Ala Ser Glu Glu Ser Lys Lys Gln Glu

225 230 235 240

Phe Glu Asn Leu Ala Thr Lys Ile Lys Glu Val Ala Thr Lys Leu Lys

245 250 255

Asp Lys Tyr Thr Lys Thr Val Glu Lys Leu Glu Gln Ala Ile Lys Gly

260 265 270

Lys Asn Asp Ile Asp Asn Asp Glu Phe Asn Lys Leu Asn Val Asp Ile

275 280 285

Ser Leu Val Ser Val Ala Tyr Asp Ser Ala Val Lys Pro Lys Val Asn

290 295 300

Gly Lys Val Thr Thr Asp Tyr Thr Lys Ile Met Lys Asp Leu Lys Lys

305 310 315 320

Val Ala Lys Pro Lys Asp Gly Ser Lys Glu Ala Glu Ile Ser Ile Asp

325 330 335

Phe Ser Asn

Claims

1.牛支原体分泌蛋白MbovP280在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，所述牛支原体分泌蛋白MbovP280具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛支原体分泌蛋白MbovP280是以牛支原体Mbov_0280基因为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG，然后合成突变后的序列并进行双酶切和与载体质粒连接，构建重组质粒并转化大肠杆菌后得到的重组蛋白，其中，所述牛支原体Mbov_0280基因其突变后的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛支原体分泌蛋白MbovP280具有诱导宿主巨噬细胞活力下降和凋亡的能力。