CN103436496A - 抗牛支原体的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗牛支原体的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用。通过本发明的单克隆抗体与不同支原体菌株菌体蛋白进行反应，Western Blotting结果表明，本发明的单克隆抗体3G11只与牛支原体分离株发生特异性免疫反应，而不与丝状支原体丝状亚种SC型（MmmSC）、丝状支原体丝状亚种LC型（MmmLC）、山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp)、无乳支原体(M.agalactiae)、绵羊肺炎支原体(M.ovipneumoniase)反应，说明本发明的抗牛支原体单克隆抗体具有良好的特异性，可用于牛支原体感染的诊断和检测，从而也为该病的防控提供了一种有效的手段。

Description

抗牛支原体的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

技术领域

本发明涉及一种对牛支原体有特异性的单克隆抗体，产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。属于疾病诊断和检测领域。

背景技术

支原体（Mycoplasma），又称霉形体，是目前已知的能在人工培养基中生长的最小原核微生物。支原体无细胞壁，细胞形态多形化；能够通过0.22μm的细菌滤器(Nicholas&Ayling,2003)。其基因组小，GC含量仅为27.8mol%-32.9mol%，生物合成及代谢能力低下。对青霉素等作用于细菌胞壁的抗生素有抵抗力。支原体在自然界中广泛存在，主要分布于污水、土壤、动植物和人体内。支原体最早于1700年在患有传染性胸膜肺炎的牛中发现，直到1898年法国科学家RouX和Nocard用含有动物血清的人工培养基首次分离成功，并将其命名为胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonia Organism，PPO)。此后，不断有新的类似的微生物被分离出来，统称为类胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonsa like organism，PPLO)。1967年，国际细菌命名委员会正式将这类微生物命名为支原体，并一直沿用至今。早期的支原体研究受限于培养条件，研究进展一直很缓慢。直至1962年，Hayflick采用无细胞的支原体培养基成功分离到肺炎支原体后，支原体的研究才逐渐取得极大进展。迄今为止，人们已经分离到190多种支原体，许多能够引起动植物多种疾病。

牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）在分类上属于支原体属，同其他支原体一样，牛支原体具有体型微小，基因组成分微量等特征(Caswell&Archambault,2007)。普通光学显微镜不能观察到牛支原体，只有在电镜下才能观察到其外表特征。与大部分支原体一样，牛支原体是一种宿主特异性粘膜常在菌，在牛的呼吸道黏膜、肠道黏膜，泌尿生殖到黏膜，乳腺黏膜、眼结膜均可存在，其主要生存方式是作为寄生或作为条件致病菌的共生关系(Gevaert,2006;Pfutzner&Sachse,1996)。健康牛上呼吸道黏膜的牛支原体，在应激条件下，如长途运输、天机骤变，管理不良等原因，可以转移到其他部位，引起多种疾病(Maunsell&Donovan,2009)。

自Nocard在1898年从患肺炎的病牛胸前积液这两个分离到丝状支原体丝状亚种（MmmSC）以来，人们一直认为MmmSC引起的牛传染性胸膜肺炎(CBPP)是危害养牛业最重要的传染病。然而，1961年康奈尔大学的hela发现的牛支原体逐渐引起全世界的重视。

牛支原体能够引起肺炎，中耳炎，乳房炎、角膜结膜炎等与M.bovis相关的疾病被简称为MbAD。MbAD在欧洲和北美广泛流行，造成了非常严重的经济损失。在英国每年超过190万头牛感染呼吸道疾病，约有157000头小牛死于肺炎和相关疾病，至少有1/4-1/3是由牛支原体引起的。在美国，由于牛支原体导致乳房炎引起的损失比呼吸道引起的损失更加严重，每年约为1.08亿美元。MbAD病原牛支原体于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到，1976确认为牛支原体感染。牛支原体在分类上地位上属于支原体科支原体目支原体属成员，目前由于缺乏牛支原体基因组的完整数据，所有研究工作仍然以全菌体蛋白组分与免疫血清的免疫结果为基础进行。

2008年中国湖北省首先出现牛支原体的病例报告，此后，宁夏，贵州等十多个省市自治区相继出现由牛支原体引起的死亡病例。据我们的统计，MbAD的死亡率可以达到38％，而且临床症状与已经在中国消灭的牛传染性胸膜肺炎（OIE规定必须报告的传染病CBPP）相似，所以最初是被当做CBPP卷土重来而引起了兽医界的广泛关注和焦虑。牛支原体病的快速诊断因而被提上日程。

2012年，任泽民、姜勇等以牛支原体湖北分离株HB0801作为抗原免疫8周龄BALB/C小鼠，利用杂交瘤技术筛选出了6株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞株，分别生产腹水并对单抗进行了纯化和特性鉴定。但是ELISA特异性分析结果表明，这6株单抗不仅与临床分离的牛支原体菌株以及ATCC标准株PG45显阳性反应，同时所有制备的单抗都与无乳支原体PG2有交叉反应，因此无法实现对牛支原体的特异性检测（任泽民、姜勇等，牛支原体单克隆抗体的制备与鉴定，中国畜牧兽医，2012年第39卷第7期）。

因此，建立一种快速、高通量的针对牛支原体感染的血清抗体检测方法就显得十分重要了。

发明内容

针对目前现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种能够实现对牛支原体进行快速且特异性检测的单克隆抗体。

本发明的目的之二在于提供一种能够稳定分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的目的之三在于提供所述的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株在制备检测或诊断牛支原体感染试剂中的应用，从而为牛支原体感染所引起疾病的防控提供了一种有效的途径。

为了达到以上所述的目的，本发明所采用的技术手段为：

本发明以牛支原体湖北分离株Hubei-1株作为抗原免疫6周龄SPF级雌性BALB/C小鼠，利用杂交瘤技术筛选出了1株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞株，分别生产腹水并对单抗进行了纯化和特性鉴定。ELISA特异性分析结果表明，这株单抗仅与临床分离的牛支原体菌株显阳性反应，而与丝状支原体丝状亚种SC标准株PG1、丝状支原体丝状亚种LC型标准株Y-goat、山羊支原体山羊肺炎亚种中国分离株87001、无乳支原体标准株PG2、绵羊肺炎支原体标准株Y-98均不反应，因此说明了本发明的单克隆抗体能够实现对牛支原体的特异性检测。

本发明的一株分泌抗牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3G11，分类命名为骨髓瘤杂交瘤细胞株，其菌种保藏编号为CGMCC No.7060，保藏时间为2013年1月16日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

此外，本发明还提供了由所述的杂交瘤细胞株所分泌的抗牛支原体的单克隆抗体。及所述的杂交瘤细胞株和所述的单克隆抗体在制备诊断或检测牛支原体感染试剂中的应用。

附图说明

图1为融合后的细胞形态示意图；

左图为融合后第3天的细胞形态；右图为融合后第9天的细胞形态；

图2为3G11株单克隆抗体与的牛支原体Hubei-1分离株Western Blotting分析结果；

泳道1：牛支原体Hubei-1分离株；M为蛋白分子量Marker0671；

图3为3G11株单克隆抗体的特异性分析结果；

1：牛支原体Hubei-1分离株；2：丝状支原体丝状亚种SC标准株PG1；3：丝状支原体丝状亚种LC型标准株Y-goat；4：山羊支原体山羊肺炎亚种分离株87001；5：无乳支原体标准株PG2；6：绵羊肺炎支原体标准株Y-98；M:蛋白分子量Marker0671；

图4为3G11株单克隆抗体对牛支原体各分离株的特异性分析结果。

1：牛支原体Hubei-1分离株；2：牛支原体内蒙分离株；3：牛支原体广西分离株；4：牛支原体吉林分离株；5：阴性对照（牛血清白蛋白）；M:蛋白分子量Marker0671

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 抗牛支原体的单克隆抗体的制备及其特性检测

1 实验材料

1.1 细胞、菌株、基因组、实验动物

SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室保存；大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21、牛支原体Hubei-1分离株、牛支原体内蒙分离株、牛支原体广西分离株、牛支原体吉林分离株、丝状支原体丝状亚种SC标准株PG1、丝状支原体丝状亚种LC型标准株Y-goat、山羊支原体山羊肺炎亚种分离株87001、无乳支原体标准株PG2、绵羊肺炎支原体标准株Y-98由本实验室保存；6周龄SPF级雌性Balb/c小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，具有合格证。

1.2 工具酶及其他试剂（盒）

FBS购自GIBCO公司；卡那青霉素、购自宏博生物技术有限公司，HT、HAT(50x)培养基冻干粉、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、二甲基亚飒、双抗(青霉素一链霉素)溶液购自Sigma公司；山羊抗鼠IgG-HRP、聚乙二醇50%(MW:1450)购自Sigma；DMEM基本培养基购自哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司。

1.3 牛支原体液体培养基配制

PPLO肉汤21g，灭活马血清200mL，新鲜酵母浸出液100mL，0.5g/mL的葡萄糖2mL，0.5g/mL的丙酮酸钠8mL，0.5%酚红3.2mL，用去离子水补足到1000mL，调节pH至7.4～7.6，经0.22μm滤膜过滤除菌分装，4℃保存备用。对于初代分离需加入青霉素100U/mL，醋酸铊终浓度为0.01%。加1%的琼脂糖制成固体培养基待用。

1.4 血清样品牛传染性胸膜肺炎（CBPP）阳性血清PS2、口蹄疫（FMD）阳性血清、牛结核分枝杆菌（MB）阳性血清、牛病毒性腹泻（BVDV）阳性血清、牛传染性鼻气管炎（IBRV）阳性血清各1份，牛支原体临床阳性血清20份，健康牛血清20份，以上血清均保存于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物细菌病研究室支原体课题组。

2 方法

2.1 抗原的制备

牛支原体Hubei-1株按1%(v/v)比例接种于500mL牛支原体液体培养基，37℃培养36h收获，菌数应达到10⁹CCU/ml以上。13000g离心30min收获支原体菌体沉淀。将牛支原体菌体沉淀用相当于原体积1/10的PBS重悬后，再13000g离心30min收获支原体菌体沉淀，即洗涤，洗涤3次后，冰浴超声破碎，功率为150w，有效时间为5min。再12000g离心20min收获支原体菌体破碎裂解物，用BCA蛋白定量试剂盒测总蛋白浓度。定量分装后保存于-70℃。

2.2 单抗的制备

2.2.1 动物的免疫

6周龄的SPF级雌性BALB/C小鼠，首免，背部皮下注射弗氏完全佐剂乳化的抗原100μg/只；2周后，用不完全弗氏佐剂乳化的抗原，背部皮下注射100μg/只，二免后14d再用不完全弗氏佐剂乳化的抗原同样计量加强免疫一次，三免14天后，通过断尾采取免疫鼠血液，分离血清，通过间接ELISA的方法测定小鼠血清抗体效价。在融合前三天通过腹腔注射进行加强免疫。

2.2.2 骨髓瘤细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存的SP2/0骨髓瘤细胞，迅速放入37℃水浴锅中快速晃动至完全融化；在1000r/min离心3min；吸弃上清，用完全DMEM细胞培养基(含20%FBS)将细胞沉淀吹散悬浮后加入有适量生长液的细胞培养瓶中，置5%CO₂37℃培养箱培养；培养3-5d后进行细胞传代，扩大培养。融合前一夜，更换培养液。

2.2.3 细胞融合

（1）制备饲养细胞

取一只未免疫的BALB/C小鼠，眼眶放血，收集血清，即为阴性血清。腹部向上，固定四肢后，先撕开皮肤，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管2-3mL(视老鼠大小而定)DMEM基础液注入小鼠腹腔，吹吸几次后将液体吸出放于50mL离心管中，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。用DMEM基础液清洗腹腔巨噬细胞2次，用含FBS10%的完全培养基重新悬起，调整细胞数量为10⁵个/mL，铺于96孔细胞培养板中，每孔100μl。

（2）制备免疫脾细胞

取已加强免疫的BALB/C小鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%酒精中浸泡5min消毒。腹部向下，固定四肢后，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮肤露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织，剪破脾脏外膜，放入灭菌的匀浆器中。加5mL DMEM基础液于匀浆器中，轻轻研磨，挤压出脾细胞，补加10mL DMEM基础液，静置2min，吸取上层细胞悬液于一无菌的50mL离心管，再补加10mL DMEM基础液于匀浆器中，同上重复2次。1000r/min离心10min，弃去上清，细胞重悬后计数。

（3）SP2/0细胞骨髓瘤细胞的准备

弃掉培养瓶中的培养液，用DMEM基础液将骨髓瘤细胞吹打下来。用DMEM基础液洗涤2次后，重悬计数。

（4）细胞融合

将SP2/0细胞与免疫脾细胞按照1:5～1:10比例加入到50mL离心管中，混合均匀后1000r/min，离心8min。弃净上清，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动，便于PEG充分的作用细胞。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50%PEG 1mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌。继续搅拌30s，静置30s。然后慢慢加入37℃预温的DMEM基础液10mL。具体方法为:第一分钟逐滴滴入1mL，第二分钟加2mL，第三至第四分钟加3mL，第5分钟加其余的6mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后缓慢加入30mLDMEM基础液。1000r/min离心7min，弃取上清，于37℃放置5-8min。用含20%FBS的HAT完全培养基轻柔重悬融合后的混合细胞，铺于96孔细胞培养板中，约100μL/孔。于37℃，5%CO₂培养箱中培养。分别在融合后第3、6天吸去100μL/孔培养基，加入100μL/孔，即半换液。培养至第9、12天用含20%FBS的HT完全培养基半换液培养。

2.2.4 间接ELISA方法筛选阳性克隆

2.2.4.1 筛选方法的建立

采用方阵滴定法确定抗原的最佳包被浓度。用样品包被液（0.5M碳酸盐包被液）将纯化的抗原按照0.25μg/mL、0.5μg/mL、0.75μg/mL、1.0μg/mL进行稀释，将稀释好的不同浓度的抗原纵向加入到96孔酶标板中，100μL/孔，37℃2h。用PBST洗板3次，每次将孔内液体弃净。用含5%(sigma)鱼明胶的PBST封闭，37℃ 2h。以免疫鼠血清作为阳性对照血清，空白鼠血清作为阴性对照血清，将血清按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行稀释，100μL/孔，横向加入酶标板中，37℃ 1h。洗涤后，加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG一HRP(sigma)，100μL/孔，37℃ 1h。然后100μL/孔，加入TMB底物显色液，显色10min，以终止液终止反应。在450nm波长下，用酶标仪读取其吸光值(OD值450)。选择OD值接近于1.0，P/N值接近最大的孔所对应的抗原稀释浓度作为抗原的最佳包被浓度。

2.2.4.2 阳性克隆的筛选

(1)以确定好的抗原的最佳包被浓度用包被液稀释抗原，100μL/孔，加入酶标板中，37℃孵育2h；

(2)用PBST洗涤3次，室温静置3min/次，每次弃净空中液体；用含5%鱼明胶的pBST封闭，100μL/孔，37℃孵育2h；

(3)用PBST洗涤3次，室温静置3min/次，每次弃净空中液体；加入按比例稀释好的待检样品，100μL/孔，37℃孵育1h；

(4)用PBST洗涤3次，室温静置3min/次，每次弃净空中液体；加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG一HRP(Sigma)100μL/孔，37℃孵育1h；

(5)用PBST洗涤3次，室温静置3min/次，每次弃净空中液体；加入TMB底物液，100μL/孔，避光显色10min。

(6)加入终止液50μL/孔。

(7)在450nm波长下，用酶标仪读取其吸光值。

2.2.5 阳性杂交瘤细胞的克隆

采用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞。克隆前按照饲养细胞的制备方法制备小鼠饲养细胞层，饲养细胞用含20%FBS的完全培养基悬浮后平铺于96孔细胞培养板中，细胞浓度为10⁵个/mL，100μL/孔。将细胞用培养基稀释到3个细胞/mL、5个细胞/mL、10个细胞/mL。将这三个浓度的细胞悬液分别加入96孔细胞培养板中，100μL/孔，使相应的每孔分别含0.3、0.5和1个细胞。放置37℃，5%CO₂培养箱中培养。分别在培养至第3、6、9天，半换液更新孔内培养基。在克隆后第7～9天，细胞克隆长满1/3～1/2个视野时，即可检测。如检出的杂交瘤细胞生长孔有特异性抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续同法再克隆或扩大培养，一般克隆3～4轮，直到该杂交瘤细胞株完全稳定后，扩大培养到24孔细胞培养板。待24孔细胞培养板中的细胞生长良好时，可通过腹腔注射接种小鼠的方法制备腹水，并做好标记，冻存4支以上的细胞。

2.2.6 单克隆抗体的大量制备

采用体内制备方案，即:预刺激BALB/C小鼠和杂交瘤细胞的腹腔注射的方法。操作过程如下:取8～10周龄的雌性BALB/C小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡0.5mL/只，7～10天后腹腔注射杂交瘤细胞5x10⁵～10⁶/只(或者一个24孔细胞板的细胞一长满后，收集细胞注射即可)。一般在9～15天后即可产生大量的腹水。抽取腹水后，离心取中间层，测定效价，并冻存细胞。

2.3 单抗的鉴定

2.3.1 单抗亚类鉴定

采用抗体类型及亚类鉴定试剂盒SBA Clonotyping System/AP(SouthernBiotechnology Associates,USA)，检测单抗类型。

（1）准备ABTS底物贮存液：1mL去离子水溶解15mgABTS，避光储存于2-8℃（4周）

（2）用pH7.4的PBS稀释捕获抗体浓缩物至5-10ug/mL,每孔100ul加入ELISA板（也可用免疫用的抗原包被）

（3）把板子放入湿盒孵化，2-8℃至少包被12小时

（4）用PBST洗板3次，每孔加满封闭液（含1%牛血清白蛋白的PBS）

（5）将板子放入室温至少封闭1小时

（6）PBST洗板3次

（7）每孔加入100ul杂交瘤上清，盖好，室温缓慢震荡1h或在2-8℃孵育过夜

（8）PBST洗板3次

（9）用封闭液1:250-1:500稀释HRP标记的抗体，每孔100ul，盖好，室温缓慢震荡1小时

（10）PBST洗板5次

（11）55mM柠檬酸盐：将525mg柠檬酸或804mg柠檬酸钠·2H₂O溶于50mL双蒸水，用3M NaOH调节pH为4.0。10mL 55mM柠檬酸盐加入200ul ABTS贮存液和10ul 30%的双氧水。

（12）每孔加100ul上述底物溶液

（13）分别在显色10min和20min 405nm读OD并记录数据。

2.3.2 单克隆抗体(腹水)效价的测定

按照建立的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定单克隆抗体(腹水)的效价。首先，按照最佳包被浓度包被蛋白，封闭洗涤后，将收集的腹水按照10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5及10^-6做连续稀释，一般做6个稀释度。并以骨髓瘤细胞SP2/0的培养上清按照同样稀释办法稀释作为阴性对照，按照2.2.4.1确定的ELISA方法进行检测。

2.3.3 单抗Western Blotting验证

取2.1制备的牛支原体沉淀的超声裂解物40μl与2×SDS凝胶电泳上样缓冲液和10μl 1mol/L DTT混匀，置于沸水浴中加热10min。离心10000r/min，1min。取5ul处理后的样品进行SDS凝胶电泳。电泳结束后，采用半干法转膜将蛋白转到硝酸纤维素膜上。用PBST洗三遍，每次10min。用5%鱼明胶封闭2h。用PBS将小鼠腹水做1:500倍稀释，将封闭后的硝酸纤维素膜侵入到稀释后的小鼠腹水中，孵育1h。PBST洗三遍同上。用PBS将羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)按1:5000进行稀释，用该液体在37℃孵育硝酸纤维素膜1h。PBST洗三遍同上。用DAB显色液显色后观察。

2.3.4 单抗的特异性检验

应用Western Blotting检测所制备的单克隆抗体针对不同支原体菌株的特异性。选取的测试菌株有：牛支原体Hubei-1分离株、牛支原体内蒙分离株、牛支原体广西分离株、牛支原体吉林分离株、丝状支原体丝状亚种SC标准株PG1、丝状支原体丝状亚种LC型标准株Y-goat、山羊支原体山羊肺炎亚种分离株87001、无乳支原体标准株PG2、绵羊肺炎支原体标准株Y-98。用1.5mL离心管称取0.03～0.04g各株支原体培养物沉淀，按照2.3.3方法进行检测。

2.4 间接阻断ELISA方法的建立

2.4.1 间接阻断ELISA方法的程序

用60mmol/L CBS将ELISA抗原稀释成0.2μg/孔，以每孔100μL的量加入酶标板中，4℃静置过夜；甩去板中的液体，用含0.05%Tween-20的PBS(PBST，pH7.2)洗板3次，加入封闭液(含2.5%脱脂奶粉的PBST)，每孔200μL，37℃作用1h；甩去液体、洗板，加入被检的牛血清，每孔100μL，37℃作用45min；甩去液体、洗板，加入单抗PD10，每孔100μL，37℃作用45min；甩去液体、洗板，加入HRP标记的羊抗猪二抗，每孔100μL，37℃作用45min；甩去液体、洗板,加入TMB，每孔100μL，室温作用15min；加入1mol/L H₂SO₄ 50μL终止反应，测定OD450nm值。

2.4.2 条件优化

将牛支原体牛阳性血清从10倍开始倍比稀释加入到包被好抗原的酶标板中，100μL/孔，37℃，1h；将单抗从500倍稀释，100μL/孔，37℃，1h；加入40000倍稀释羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，100μL/孔，37℃，1h；终止并显色；读取OD450值；计算待检血清对单抗的阻断率(%阻断率=100-100×被检血清OD值/阴性对照平均OD值)。取阴性对照值接近1.0，且阻断率最大的反应条件为最佳反应条件。

2.4.3 特异性检测用建立好的间接阻断ELISA方法检测一下血清样品：牛传染性胸膜肺炎（CBPP）阳性血清PS2、口蹄疫（FMD）阳性血清、牛结核分枝杆菌（MB）阳性血清、牛病毒性腹泻（BVDV）阳性血清、牛传染性鼻气管炎（IBRV）阳性血清各1份。阻断率≥50%的临床样品判定为阳性，阻断率＜50%的临床样品判定为阴性。

2.4.4 临床样品检测用建立好的间接阻断ELISA方法检测一下血清样品：牛支原体临床阳性血清20份，健康牛血清20份。阻断率≥50%的临床样品判定为阳性，阻断率＜50%的临床样品判定为阴性。

3 结果

3.1 杂交瘤细胞株的筛选

3.1.1 细胞融合

细胞融合后第3-6天，部分孔出现明显细胞群落，第9天细胞在培养板孔底覆盖到1/10～1/3的面积。融合后的细胞形态如图1所示。

3.1.2 阳性克隆的筛选

用间接ELISA方法对各孔培养上清进行筛选。经筛选并克隆后得到1株能够稳定分泌抗牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3G11，分类命名为骨髓瘤杂交瘤细胞株，其菌种保藏编号为CGMCC No.7060，保藏时间为2013年1月16日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

3.2 单抗的制备

3.2.1 间接ELISA方法的建立

采用方阵滴定法确定抗原的最佳包被浓度。ELISA方法的最佳反应条件为：抗原包被浓度为0.5μg/mL，37℃，孵育2h；用PBST洗板3遍；用含5%(sigma)鱼明胶的PBST封闭，37℃ 2h；阳性对照血清稀释倍数为1:1000，37℃ 1h；用PBST洗板3遍，加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG一HRP(sigma)，100μL/孔，37℃孵育1h。然后100μL/孔，加入TMB底物显色液，显色10min，以终止液终止反应。在450nm波长下，用酶标仪读取其吸光值(OD₄₅₀值)，ELISA检测结果如表1所示。

表1 间接ELISA方法建立结果

3.2.2 免疫小鼠血清抗体效价

经3免后，小鼠血清效价均达到10⁴以上。

3.3 单抗的鉴定

3.3.1 腹水效价的测定

通过间接ELISA方法检测，3G11抗体效价可达10⁵。

3.3.2 3G11抗体的Western Blotting验证

Western Blotting结果如图2所示。从图中可以看出，本发明的3G11抗体能够与牛支原体Hubei-1株抗原发生免疫反应。

3.3.3 抗体亚型鉴定

采用抗体类型及亚类鉴定试剂盒SBA Clonotyping System/AP(SouthernBiotechnology Associates,USA)，检测单抗类型，实验结果表明该细胞株产生的单克隆抗体为IgG3，轻链类型为λ。

3.3.4 单抗的特异性检验

通过用单克隆抗体与不同支原体菌株菌体蛋白反应，Western Blotting结果表明，3G11只与牛支原体内蒙分离株、牛支原体广西分离株、牛支原体吉林分离株发生免疫反应，而不与丝状支原体丝状亚种SC标准株PG1、丝状支原体丝状亚种LC型标准株Y-goat、山羊支原体山羊肺炎亚种分离株87001、无乳支原体标准株PG2、绵羊肺炎支原体标准株Y-98反应。实验结果说明，该株抗牛支原体单克隆抗体具有良好的特异性。Western Blotting检测结果如图3和图4所示。

3.4 应用单抗建立间接阻断ELISA方法

3.4.1 条件优化结果

将牛支原体牛阳性血清从10倍开始倍比稀释加入到包被好抗原的酶标板中，100μL/孔，37℃，1h；将单抗从500倍稀释，100μL/孔，37℃，1h；加入40000倍稀释羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，100μL/孔，37℃，1h；终止并显色；读取OD450值；计算待检血清对单抗的阻断率(%阻断率=100-100×被检血清OD值/阴性对照平均OD值)，结果如表2所示。取阴性对照值接近1.0，且阻断率最大的反应条件为最佳反应条件。结果表明，最佳反应条件为：待检血清1:20倍稀释，单抗稀释倍数为1:1000。

表2

3.4.2 特异性检测用建立好的间接阻断ELISA方法检测以下血清样品：

牛传染性胸膜肺炎（CBPP）阳性血清PS2、口蹄疫（FMD）阳性血清、牛结核分枝杆菌（MB）阳性血清、牛病毒性腹泻（BVDV）阳性血清、牛传染性鼻气管炎（IBRV）阳性血清各1份，检测结果均为阴性。结果见下表3所示。

表3

3.4.3 临床样品检测用建立好的间接阻断ELISA方法检测以下血清样品：

牛支原体临床阳性血清20份，健康牛血清20份。阻断率≥50%的临床样品判定为阳性，阻断率＜50%的临床样品判定为阴性。结果表明，牛支原体临床阳性血清20份的检测结果均为阳性，健康牛血清20份的检测结果均为阴性，结果如表4所示。

表4

4 结论

本发明获得了特异性良好的抗牛支原体单克隆抗体。建立了间接阻断ELISA检测方法，具体工作浓度为：待检血清1:20倍稀释，单抗稀释倍数为1:1000。具有良好的特异性及敏感性，适用于牛支原体抗体的检测，为该病的防控提供了一种有效的方法。

Claims (4)

1.一株分泌抗牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3G11，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNo.7060。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌的抗牛支原体的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测牛支原体感染试剂中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测牛支原体感染试剂中的应用。

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