CN104498417A - 猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用 - Google Patents

猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用。所述基因缺失株为含氯霉素抗性标记的CMS基因缺失株SS△CMS，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9735。本发明公开的猪链球菌血清7型重组菌SS△CMS，是采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的载体对猪链球菌7型菌株分支酸合酶编码的基因进行了缺失，同时在缺失位置标记了氯霉素抗性基因而得到的菌株，破坏了分支酸合酶蛋白的表达。本发明得到的基因缺失株比亲本株的毒力强，比国际标准7型和2型菌株的毒力强，可作为科研工作者使用的标准猪链球菌7型试验用强毒菌株。

Description

猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用
技术领域
本发明属于细菌基因工程技术领域，涉及一种含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用。
背景技术
猪链球菌(S.suis)属厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目中的链球菌科、链球菌属；该菌呈球状、多数成短链或成对排列，不形成芽孢，能形成荚膜。S.suis属于革兰氏阳性兼性厌氧球菌，根据其荚膜多糖抗原特性差异可将其分为35种血清型(1-34型，1/2型)。在养猪产业，S.suis感染是世界范围的问题，它能引起猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、流产以及仔猪的突然死亡。该病给养猪业造成的危害较大，是危害西方发达国家养猪业的三大细菌传染病之一，也是多年来一直困扰中国养猪业发展的主要传染病之一。同时，S.suis还是一个被忽视的新发人类病原体，能导致人类脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症及突然死亡的人兽共患病原体。在越南S.suis是导致成人脑膜炎的主要原因，其次是在泰国和香港。2005年，中国有一次重要的暴发，有200多人感染，死亡率达20％；病人表现为中毒性休克综合症，症状为高烧、全身乏力、恶心、呕吐；在严重病例里还出现皮下出血及昏迷等症状。
目前国内外对猪链球菌毒力因子的研究都有所拓展，不仅包括对传统毒素的研究，还包括对细胞壁蛋白(表面蛋白)的探索。有几类毒力因子已被确认与猪链球菌的致病性有关：(1)荚膜多糖：它能保护猪链球菌在非免疫动物体内不被免疫系统的各种吞噬细胞吞噬。(2)溶血素：可能在猪链球菌侵入和裂解细胞的过程中发挥着重要作用。(3)黏附素：Haataja等证实39ku黏附素以半乳糖为受体的猪链球菌能通过一个糖脂结合位点黏附于猪咽部上皮组织。(4)谷氨酸脱氢酶：是新发现的一个与猪链球菌毒力相关的潜在毒力因子。(5)纤连蛋白结合蛋白：介导细胞与细胞外基质的相互作用，在细胞黏附、迁移、生长、分化和活化过程中起重要作用。除上述毒力因子外，国内外近年来还发现了一些新的毒力因子，如De GreeffA研究发现了猪链球菌的第一个反应调节因子RevS，并认为其与猪链球菌的定居能力相关。44kb蛋白为猪链球菌2型的胞壁蛋白， 免疫斑点实验证明它具有很强的免疫原性，高致病株的基因缺失株丧失了对猪的致病能力。属于热休克蛋白家族的IgG结合蛋白，还有一些其它可能与毒力相关的物质，如细菌表面物质纤毛、粘着素等。但由于毒力因子的多样性以及复杂性，分离和鉴定更多的毒力因子已成为该领域研究的热点。
随着对S.suis研究的深入，对S.suis毒力因子的研究已成为热点。基因组学和蛋白质组学提供了发现新毒力因子的手段，基因功能研究最经典和最有效的手段，是对目的基因进行缺失突变分析。分支酸合酶是莽草酸代谢途径里的第7个酶，能催化5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸分支酸转化成分支酸。申请人前期研究工作发现，在不同毒力的7型猪链球菌的比较蛋白组学中其表达量差异显著，这个酶表达量的大小是否与猪链球菌的毒力强弱有关成为研究的焦点。
鉴于上述背景，采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的载体构建我国流行的S.suis 7型菌株的分支酸合酶基因缺失株，研究其遗传特性、生长特性、对细胞的粘附力和侵袭性、对动物的致病力等生物学特性，为S.suis的防治及揭示S.suis的致病机理奠定基础。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株，该缺失株是将猪链球菌菌株分支酸合酶编码的基因进行敲除，同时在缺失位置标记了氯霉素抗性基因而得到的菌株。
本发明的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株为含氯霉素抗性标记的CMS基因缺失株SSΔCMS，其分类命名为猪链球菌Streptococcus suis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9735，保藏日期为2014年9月25日。
本发明的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株，衍生于本试验室研究人员从发病猪的脑组织里分离到的S.suis血清7型WC-ss7株(保藏号为CGMCC No.3343，将其基因组上的分支酸合酶基因缺失，使CMS蛋白不表达，同时在缺失位置标记了氯霉素抗性基因，获得了含有氯霉素抗性标记的CMS基因缺失突变株。
本发明目的之二是提供一种构建所述的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株的方法，其特征是将含有待敲除的目的基因的上、下 游同源臂并融合了氯霉素抗性基因DNA片断的pSET4s质粒导入所述的猪链球菌血清7型菌株，经同源重组而实现的。其中，所述的DNA片断从上游至下游依次是CMS上游同源臂、氯霉素抗性基因、CMS下游同源臂，与所述的猪链球菌7型菌株的CMS蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组，同时将氯霉素抗性标记在突变株上，得到带有氯霉素抗性标记的CMS基因缺失株SSΔCMS。具体构建方法如下：
1.以S.suis血清7型WC-ss7株基因组为模板，以CMSKOP1/2为引物扩增上游同源臂，以CMSKOP5/6为引物扩增下游同源臂，以pSET1载体为模板，CM-F/R为引物扩增氯霉素抗性盒。切胶回收3个片段，并以3段为模板，以CMSKOP1/6为引物，通过重叠PCR方法扩增上下游同源臂中间嵌氯霉素抗性盒的融合片段。纯化该融合产物，克隆至pBLUE载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，经过PCR和酶切鉴定后测序。将测序正确的质粒酶切回收目的片段，连接pSET4s载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，再经PCR和酶切鉴定，最终获得敲除载体。pSET4s载体图谱如图1所示。
2.取5μL基因敲除载体电转化50μL WC-ss7感受态细胞，经30℃、CO2孵箱内培养48h，CmR的THB平板上长出几十个抗性克隆，挑选正确的克隆先后经过30℃双交换和40℃质粒丢失，最后通过点板的方法获得其因敲除突变体。提取突变株基因组作模板，分别用不同引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的定义为SSΔCMS。
在本发明的具体实施方式中，所述的CMS蛋白编码基因的序列如SEQNO.1所示。
在本发明的具体实施方式中，扩增上游同源臂序列的引物序列如下所示：
CMSKOP1：ATTGTCGACGCGGTCACTTGGATTTGG
CMSKOP2：CCTCGGAACCCATCGAATTATCCATGAGACTCACCAGC
在本发明的具体实施方式中，扩增下游同源臂序列的引物序列如下所示：
CMSKOP3：GCGGGATCCAATGAAGAGTTAAAACGGCG
CMSKOP4：GTGGTCGACAATAGTATCTCCATCTCGCT
在本发明的具体实施方式中，扩增氯霉素抗性基因的引物序列如下所示：
CM-F：TAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAA
CM-R：CACCGAACTAGAGCTTGATGAAAAT
本发明的目的之三是提供所述的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株为科研工作者在试验中作为标准的猪链球菌7型强毒菌株的应用。
本发明的目的之四是提供所述的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株的血清型分型、DNA分型、M1ST分型及该菌在小鼠体内的病理复制模型。
本发明的主要优点是：
1、本发明公开的猪链球菌血清7型重组菌SSΔCMS，是采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的载体对猪链球菌7型菌株分支酸合酶编码的基因进行了缺失，同时在缺失位置标记了氯霉素抗性基因而得到的菌株，破坏了分支酸合酶蛋白的表达。
2、本发明所用的材料是S.suis血清7型WC-ss7，是从发病猪的脑组织里分离到的S.suis血清7型流行株，是现地流行菌株的代表，因此，今后以该菌株构建的CMS基因缺失株为研究对象更具有针对性。
3、本发明得到的猪链球菌血清7型CMS基因缺失株比亲本株的毒力强，比国际标准7型和2型菌株的毒力强，可作为科研工作者使用的标准猪链球菌7型试验用强毒菌株。
4、通过该菌可了解该菌株的血清型分型、DNA分型、M1ST分型及该菌在小鼠体内的病理复制模型。
保藏信息： 
一、SSΔCMS：
分类命名：猪链球菌Streptococcus suis；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.9735；
保藏日期：2014年9月25日。
二、WC-ss7株：
分类命名：猪链球菌Streptococcus suis；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.3343；
保藏日期：2009年10月19日。
附图说明
图1为pSET4s载体图谱示意图；
图2为CMS上下游同源臂、氯霉素抗性基因及多重PCR产物，图中1和2：CMS上下游同源臂；3：DL-2000DNA Maker；4：氯霉素抗性基因Cm；5：多重PCR产物；6：DL-5000DNA Maker；
图3为重组质粒pBLUE-CMS的构建和鉴定，图中1-3：pBLUE-CMS双酶切鉴定；4：DL-5000DNA Maker；
图4为重组质粒pSET4s-CMS的构建和鉴定，图中1：DL-2000DNA Maker；2：pSET4s-CMS双酶切鉴定；3：DL-5000DNA Maker；
图5为突变株SSΔCMS的PCR鉴定结果，图中1：DL-2000DNA Maker；2-6：SSΔCMS基因组作模板，分别用5对引物GDH-F/R，CM-F/R，SPC1/2，CMSKOP3/4，CMSKOP1/6；7：阴性对照；8：阳性对照；9：DL-15000DNA Maker；
图6为WC-ss7株和SSΔCMS株的猪链球菌种鉴定和S.suis 7型鉴定，图中1和4：DL-2000DNA Maker；2：WC-ss7基因组作模板，gdh引物；3：SSΔCMS基因组作模板，gdh引物；5：WC-ss7基因组作模板，S.suis7引物；6：SSΔCMS基因组作模板，S.suis7引物；
图7为WC-ss7株与SSΔCMS突变株的革兰氏染色比较；
图8为WC-ss7株与SSΔCMS突变株的生长情况的比较；
图9为突变株和野生株对人喉癌上皮细胞Hep2的黏附情况；
图10为野生株与突变株的脉冲场凝胶电泳图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
1、本发明中所涉及的材料：
1.1菌株和质粒(表1)
表1所用菌株与质粒
菌株与质粒 相关特征或功能 来源或参考文献
E.coli DH5α 重组质粒克隆的宿主菌 TAKARA
WC-ss7 S.suis 7野生菌株 本试验室分离
SSΔCMS CMS基因敲除突变株，CmR 本文构建
pBLUE 克隆载体，AmpR 哈兽研诊断中心
pSET1 S.suis-E coil穿梭质粒，CmR Takamatsu et al.(2012)
pSET4s 温度敏感型自杀载体，SpcR Takamatsu et al.(2012)
pSET4s-CMS CMS基因敲除质粒，SpcRCmR 本文构建
注：AmpR：氨苄抗性，SpcR：壮观霉素抗性，CmR：氯霉素抗性。
1.2实验所用引物(表2)
表2所用引物
两对引物用于扩增待缺失区域的上游和下游各大约500bp序列，其中上游同源臂下游引物3′端带有20bp与抗性基因(氯霉素基因)融合的序列，下游同源臂上游引物5′端带有20bp与抗性基因(氯霉素基因)融合的序列。其中以CMSKOP1/2为引物扩增上游同源臂，以CMSKOP5/6为引物扩增下游同源臂，CMSKOP3/4为内部鉴定引物，位于目的基因内部；CM-F/R用于扩增质粒pSET1 上的Cm抗性盒；SPC-F/R用于扩增质粒pSET4s上的Spc抗性盒；GDH-F/R扩增S.suis谷氨酸脱氢酶的部分序列，用来鉴定菌株是否为S.suis。
1.3实验动物
ICR雌性小鼠，6～7周龄，SPF级，体重25±2g左右，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
2、方法
2.1亲本野生菌的培养
将实验室由临床分离到的S.suis 7型WC-ss7保存菌液在含5％羊血的平板上划线，37℃孵箱培养过夜。第2天挑取血平板上阳性单克隆置于链球菌液体培养基，37℃、160r/min培养过夜，经几次重复的操作可获得复苏WC-ss7菌液，以用于后续实验。
2.2融合片段的扩增
以细菌基因组DNA提取试剂盒提取WC-ss7的DNA作为模板，以CMSKOP1/2为引物扩增上游同源臂，以CMSKOP5/6为引物扩增下游同源臂；以pSET1载体为模板，CM-F/R为引物扩增氯霉素抗性盒。切胶回收3个片段，并以3段为共同模板，以CMSKOP1/6为引物，通过多重PCR方法扩增上下游同源臂中间嵌氯霉素抗性基因盒的融合片段。
扩增PCR50μL体系如下：
反应程序为：95℃预变性5min；94℃1min，X℃1min，72℃1min；30个循环，延伸72℃10min。其中扩增上游同源臂的退火温度为57℃，扩增下游同源臂的退火温度为59℃，扩增氯霉素抗性盒的退火温度为49℃，扩增融合片段的退火温度为59℃。
2.3融合片段的胶回收
以DNA快速回收试剂盒回收融合片段。具体操作方法如下：以1％琼脂糖凝胶电泳分离融合片段，切取含有融合片段的琼脂糖凝胶(在长波紫外灯下观察)，放入称重过的1.5mL EP管中，按照0.1g加入100μL溶胶液比例加入，于60℃水浴作用5min，期间轻弹EP管，使凝胶完全溶解。将溶化的液体转至一回收柱，室温静置2min，10000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，用洗涤液洗两次，最后12000r/min离心1min，将回收柱转至另一无菌的1.5mLEP管中，加50uL EB室温放置2min，12000r/min离心1min洗脱，收集管中即是回收的融合片段，可直接用于下一步与载体连接，也可放置于-20℃冰箱，保存备用。
2.4重组质粒pBLUE-CMS的连接和转化 
为提高连接效率和正确率，先将平端的融合片段连接至pBLUE载体，连接体系按照下面的比例进行：
经22℃连接2～3h，取连接好的重组质粒5μL加入到50μL的E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min后，迅速将离心管放入42℃水浴锅中热激90s，之后再次将EP管放入冰中2min，接下来在无菌操作台向EP管中加入800μLLB液体培养基，放入37℃摇床中轻摇50min，取出EP管4000r/min离心3min，弃去600μL上清液，余下用来悬起沉淀，之后向EP管中加入35μL X-gal和150μLIPTG，混匀后共同涂布于含氨苄抗性的LB平板，并倒置于37℃培养箱，培养过夜。
2.5重组质粒pBLUE-CMS的小量提取 
按照质粒小量提取试剂盒的说明书进行提取。
2.6重组质粒pBLUE-CMS的酶切鉴定 
提取的重组质粒pBLUE-CMS需进行鉴定，以确认是否连接成功。首先用Sal I和BamH I酶切鉴定含有酶切位点的重组质粒pBLUE-CMS，方法为在1.5mL EP管中依次加入：
放入37℃水浴锅中3h后，经1％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察结果。
2.7重组敲除质粒pSET4s-CMS的构建
参照上文方法酶切已连接成功的重组质粒pBLUE-CMS，胶回收酶切后变为粘端的融合片段，将其与经同样双酶切的pSET4s自杀载体连接，转化E.coli DH-5α感受态细胞，提取质粒经PCR和酶切鉴定，最终获得敲除载体pSET4s-CMS。并将重组质粒pSET4s-CMS送北京华大基因生物技术有限公司测序。
2.8敲除突变菌株SSΔCMS的筛选和鉴定
将电转化后在THB CmR单抗平板上长出的单菌落接种于THB CmR液体培养基中，在30℃、5％CO2孵箱内静置复苏，接着按1％比例转接于无抗的THB液体培养基，30℃、5％CO2孵箱培养12h。之后再按1％重复转接两次，放置于30℃、5％CO2孵箱培养6h后，马上放入40℃水浴摇床中，160r/min振荡培养6h，1％转接后继续在40℃水浴摇床160r/min培养12h，如此1％转接几代，每一代的菌液稀释103涂THB CmR SpcR双抗平板和THB CmR单抗平板，放置于37℃、5％CO2孵箱中培养。寻找在THB CmR单抗平板生长而THB CmR SpcR双抗平板不生长的代次菌液，将筛选到的菌液保种标记。同时挑与其对应的THB CmR单抗平板上的单菌落接入THB CmR液体培养基中，37℃、5％CO2孵箱内培养8h，并再次划线于THB CmR SpcR双抗平板和THB CmR单抗平板，反复几代，选择性提取在THB CmR SpcR双抗平板不长菌，而在与其对应的THB CmR单抗平板生长的菌落DNA，使用鉴定引物对所提取的基因组进行鉴定，成功敲除的突变株S.suis鉴定引物(GDH)阳性，CmR阳性，SpcR阴性，CMSKOP3/4阴性，CMSKOP1/6阳性。将鉴定成功的突变株连续传10代，用PCR方法进行鉴定，如果PCR扩增结果如上述说明本发明的突变株是能稳定遗传的。
3、突变株与亲本株的对比实验
3.1突变株与野生株的猪链球菌鉴定及分型
用gdh基因判定菌株是否为S.suis，用cps1、cps2、cps7、cps9基因做分型鉴 定，用细菌DNA提取试剂盒提取WC-ss7和SSΔCMS的基因组DNA作为检测模板，PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃总延伸10min。产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
3.2生物活性比较 
3.2.1溶血活性比较 
将平台期的野生菌株WC-ss7和突变菌株SSΔCMS分别在血平板上划线，在37℃、5％CO2孵箱内培养过夜，观察菌落形态和溶血环大小。
3.2.2革兰氏染色观察
按常规方法将WC-ss7和突变菌株SSΔCMS进行革兰氏染色，然后在显微镜下观察。
3.2.3生长曲线测定 
将处于对数生长期且OD600值相同的WC与ΔCMS按1％比例转接于THB液体培养基中，在37℃、5％CO2孵箱中培养，每隔1h取菌液测OD600，培养至13h，绘制生长曲线。
3.3野生株WC的生化鉴定及兰氏分群试验
3.4对Hep2细胞的黏附力实验
取基本长满单层细胞的细胞培养皿，弃去上清，分别向培养皿中加入用RPMI1640重悬的稀释菌液，使细胞与细菌比例约为1∶100；共孵育2h后，去掉液体，先将两种菌株的黏附+侵袭组用PBS洗1遍，之后加入01％saponin冰上裂解10min，取裂解液涂平板，第2天通过菌落数量计算到胞外和胞内的细菌黏附数量；两种菌株的入侵组用PBS清洗后，加含抗生素的培养液(庆大霉素100μg/mL，盘尼西林G 5μg/mL)培养2h以杀掉胞外菌，PBS洗1遍，加0.1％saponin冰上裂解15min，取裂解液涂平板，次日进行菌落计数，可检测到入侵到胞内的菌量。
3.5野生株与突变株PFGE分型
将野生株和突变株进行脉冲场凝胶电泳，进行PFGE分型。
3.6野生株与突变株的MLST分型
按照Samantha J.King方法分别对野生株与突变株7个看家基因aroA，gki，dpr，mutS，recA，thrA，cpn60进行扩增，并将看家基因的序列片段上传至MLST数据库以确定菌株的序列型。所用引物如表3。
表3
3.7野生株与突变株对ICR小鼠半数致死量(LD50)的测定
将同批次的7周龄64只ICR雌性小鼠随机分为两组，每组32只，其中一组为WC-ss7菌株的攻毒组，另一组作为SSΔCMS的攻毒组。再将各自32只随机分为4小组，做4个攻毒梯度，每小组8只。剂量：由预试验得出的结果确定正式攻毒的4个梯度，分别为原液浓度的0.5倍、0.3倍、0.2倍和0.1倍，并将4个梯度的菌液稀释涂板，第2天计算各组的菌量数(CFU)。在0-4d内每隔6h观察一次小鼠死亡情况。发生小鼠半数死亡现象的小组所对应的菌量数即为半数致死量。LD50的计算公式logLD50＝∑1/2(Xi+Xi+1)(Pi+2-Pi) 
公式中：Xi与Xi+1及Pi+2与Pi分别为相邻两组的剂量对数及动物死亡百分比。
4、结果
4.1重组敲除质粒pSET4s-CMS的构建
CMS基因的上游同源臂(512bp)、下游同源臂(530bp)、Cm基因(1056bp)及多重PCR产物如图2所示。将融合PCR产物连接pbluescriptII ks+载体，连接正确的质粒pBLUE-CMS经BamH I和Sal I鉴定，如图3所示，将融合片段与pSET4s连接，敲除质粒经酶切鉴定，如图4所示。
4.2猪链球菌7型CMS基因缺失突变株的筛选及测序结果
提取通过单双抗性平板的方法筛选获得的基因敲除突变株并连续传10代后，分别用6对引物GDHF/R，CM-F/R，SPC1/2，CMSKOP3/4，CMSKOP1/6进行PCR鉴定。鉴定结果如图5-6所示，说明此突变株是能稳定遗传的。
4.3突变株与野生株的猪链球菌及分型鉴定结果
4.4生物活性分析 
4.4.1溶血活性比较 
将突变株SSΔCMS和野生株WC-ss7菌液在血平板划线，于37℃、CO2孵箱内培养24h，观察发现野生株和突变株均为α溶血，菌落形态基本一致。
4.4.2革兰氏染色观察
将两种菌株涂片革兰氏染色显微镜下观察，菌体形态为圆形或椭圆形，呈成双球或链状排列，形态无明显差异，结果如图7所示。
4.4.3生长曲线测定 
将野生株WC-ss7和突变株，两种菌株按1％比例转接相同体积的THB液体培养基中，每隔1h测OD600，连着测12h，绘制生长曲线，结果如图8所示。可以看出，SSΔCMS的生长要明显快于WC-ss7，更早的进入生长平台期。
4.5猪链球菌生化鉴定及分群结果
经3次的生化试验，重复性良好，鉴定结果见表4，突变株与野生株的生化反应一致。经法国梅里埃公司提供的链球菌乳胶凝集试剂盒鉴定，突变株与野生株均为链球菌D群。
表4野生株和突变株的生化试验结果
生化反应项目 分离株 突变株
6.5％高盐肉汤 + +
棉子糖 + +
乳糖 + +
山梨糖 - -
甘露糖 + +
水杨素 + +
血清菊糖 - -
马尿酸盐 - -
七叶苷 + +
蕈糖 + +
注：+为阳性反应，-为阴性反应。 
4.6细胞黏附实验 
本实验利用抗生素平板保护法检测突变株和野生株对人喉癌上皮细胞Hep2的侵袭和黏附情况，结果发现，突变株SSΔCMS对Hep2细胞的黏附率为11.8％明显高于野生株WC-ss7的4.5％，统计学上差异显著(p＜0.01)，结果如图9所示。
4.7野生株与突变株PFGE分型
野生株与突变株的脉冲场凝胶电泳图谱无明显差异，结果如图10所示。
4.8野生株与突变株MLST分型
野生株与突变株的MLST分型是相同的，其MSLT分型为ST335型，等位基因图谱是8、30、5、34、9、3、25。
4.9半数致死量 
用不同浓度的WC-ss7和SSΔCMS对ICR小鼠攻毒，统计小鼠死亡情况如表5，分别计算半数致死量，结果显示WC-ss7的LD50为1.5×106CFU，而SSΔCMS的LD50为8.7×105CFU，约为亲本菌株的2倍。说明CMS基因缺失后，SSΔCMS菌株的毒力明显增强。
表5突变株与亲本株的LD50
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
 
<120> 猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用
 
<210>1
<211>1167bp
<212>DNA
<213>Sequence of CMS
 
<400>SEQ ID NO. 1
atgcgttatttaacagctggtgagtctcatggaccacgtctaacagccattattgagggagttccagcgggtcttccttt
aactgccgaggatattaatgaagagttaaaacggcgccaaggtggatacggtcgtggtagtcgtatgcagattgaaacag
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ttggcggagtgattgagactgttgttggaggagttccagctggcttggggtcttatgtgcaatgggataaaaagttagat
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caaagggagccaagtcatggacgaaattctctggtcccaagaaaaaggatatacacgccgaaccaataatctaggtggtt
ttgaaggtggtatgaccaatggcgaggccctaatcattcgtggtgttatgaaaccaattccgaccctctataagccattg
atgtcggttgacattgatactcatgagccttataaagctactgtggaacgttcagatccaacggctctcccagcagctgg
tgtagtcatggaatcagtcgtagctacaactctagcgacagaaatcctagagaagttctcttccgataatatggaggaat
Tgaaagctgcggtagccagtcatcgcgactatgtcaaaaatttctag
 
<210>2
<211>389AA
<212>PRT
<213>Amino Acids Sequence of CMS
 
<400>SEQ ID NO. 2
MRYLTAGESHGPRLTAIIEGVPAGLPLTAEDINEELKRRQGGYGRGSRMQIETD
RVEITAGVRHGKTTGAPITLNVTNKDHQKWLDIMAVEDIEEKLKSKRRIKHPR
PGHADLVGGMKYRFDDLRNSLERSSARETTMRVAVGAVAKRILAELDIEIANH
VVVFGGKEIDVPDGLSVAEIKERAAQSEVSIVNQEREEEIKAYIDQIKRDGDTI
GGVIETVVGGVPAGLGSYVQWDKKLDAKLAQAVVSINAFKGVEFGVGFQAG
YLKGSQVMDEILWSQEKGYTRRTNNLGGFEGGMTNGEALIIRGVMKPIPTLY
KPLMSVDIDTHEPYKATVERSDPTALPAAGVVMESVVATTLATEILEKFSSDN
MEELKAAVASHRDYVKNF.

Claims (7)

1.一种猪链球菌分支酸合酶基因缺失株，其特征在于所述基因缺失株为含氯霉素抗性标记的CMS基因缺失株SS△CMS，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9735。
2.一种权利要求1所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述构建方法步骤如下：
(1)以S.suis血清7型WC-ss7株基因组为模板，以CMSKOP1/2为引物扩增上游同源臂，以CMSKOP5/6为引物扩增下游同源臂，以pSET1载体为模板，CM-F/R为引物扩增氯霉素抗性盒；切胶回收3个片段，并以3段为模板，以CMSKOP1/6为引物，通过重叠PCR方法扩增上下游同源臂中间嵌氯霉素抗性盒的融合片段；纯化该融合产物，克隆至pBLUE载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，经过PCR和酶切鉴定后测序；将测序正确的质粒酶切回收目的片段，连接pSET4s载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，再经PCR和酶切鉴定，最终获得敲除载体；
(2)取5μL基因敲除载体电转化50μL WC-ss7感受态细胞，经30℃、CO2孵箱内培养48h，CmR的THB平板上长出抗性克隆，挑选正确的克隆先后经过30℃双交换和40℃质粒丢失，最后通过点板的方法获得其因敲除突变体；提取突变株基因组作模板，分别用不同引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的定义为SS△CMS。
3.根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述CMS蛋白编码基因的序列如SEQNO.1所示。
4.根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述扩增上游同源臂序列的引物序列如下所示：
CMSKOP1：ATTGTCGACGCGGTCACTTGGATTTGG；
CMSKOP2：CCTCGGAACCCATCGAATTATCCATGAGACTCACCAGC。
5.根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述扩增下游同源臂序列的引物序列如下所示：
CMSKOP3：GCGGGATCCAATGAAGAGTTAAAACGGCG；
CMSKOP4：GTGGTCGACAATAGTATCTCCATCTCGCT。
6.根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述扩增氯霉素抗性基因的引物序列如下所示：
CM-F：TAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAA；
CM-R：CACCGAACTAGAGCTTGATGAAAAT。
7.一种权利要求1所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株在试验中作为标准的猪链球菌7型强毒菌株的应用。
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